專利名稱：小細胞肺癌生物標記物組的制作方法
技術領域：
本發(fā)明總體與癌癥診斷、預后、治療以及預防領域相關。更具體而言，本發(fā)明涉及 對患者的肺癌進行分型的方法。根據(jù)一組特殊的生物標記物，本發(fā)明提供了(早期)診斷 肺癌的方法，區(qū)分小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌(NSCLC)的方法，在NSCLC中區(qū)分鱗 狀細胞癌(SCC)、腺癌(AC)以及最終的大細胞癌的方法，辨別具有或不具有神經(jīng)內(nèi)分泌起 源的肺癌的方法，辨別G2和G3期的SCC腫瘤的方法以及確定肺癌異質(zhì)性程度的方法。本發(fā)明還提供了上述生物標記物組在監(jiān)控患者疾病進程中的應用，包括體外和體 內(nèi)成像技術。體外成像技術通常包括對取自該患者的樣本-如血清或組織樣本-進行的免 疫檢定。體內(nèi)成像技術通常包括胸片(X光)、計算機斷層掃描(CT)成像、螺旋CT、正電子 放射斷層造影術(PET)、PET-CT以及閃爍掃描術。因此另一個方面提供一套執(zhí)行上述成像技術的試劑盒，包括用以確定上述生物標 記物組表達的試劑。此外，還特別包括特異于下文所確定的生物標記物組的抗體。
背景技術：
肺癌是最多發(fā)的癌癥類型之一，而且在歐洲和美國均屬于癌癥相關死亡率的主要 導因。2004年，肺癌致死占歐洲所有癌癥相關死亡病例的20%，在美國占四％ (1，2)。肺癌通常分成兩大類，小細胞肺癌(SCLC)，占所有肺癌患者的15%到20%，和非 小細胞肺癌(NSCLC)，占所有肺癌的80%到85%左右。此外，還可以繼續(xù)細分為肺鱗狀細胞 癌(SCC)，肺腺癌(AC)以及大細胞肺癌(LC)。上述主要的兩大類在生長和治療特征方面均存在區(qū)別。SCLC腫瘤表現(xiàn)出一種侵襲 性的表型，便于使用化療和放射療法治療，而NSCLC是非化學敏感的，通常使用手術治療。 然而，目前對于不同類型的肺癌尚無充分的治療方案。使用傳統(tǒng)療法治療時，SCLC類型在 限制階段病情的中位生存時間為15個月，而對于擴散階段僅為9個月，而長期存活率非常 低。鑒于兩大類肺癌之間表現(xiàn)的不同，采取何種治療方案的決定尤其是以SCLC和NSCLC的 細分類為引導。與其它類型的肺癌不同，SCLC對于化療非常敏感。在大約75%的SCLC病例中， 可以發(fā)現(xiàn)對化療的初始響應，在所有病例中約有35%的存在臨床上的完全響應(Johnson DH等人，1987 ；Am J Med Sci 293 :377-389)。然而不幸的是，在大部分情況下，病情都會復 發(fā)，從而使存活三年的比例僅為5-10%，而存活五年的比例約為(Minna JD等人.1985， Cancer of the lung. In Cancer. Principles and practice of oncology第 2片反)；在SCLC 中，可以在典型的和變體的SCLC之間進行臨床相關的細分。SCLC的變體類型對化學療法和 放射療法表現(xiàn)出更低的敏感性，因此，患有變體類型SCLC的患者的中位生存時間大大短于 那些患有典型類型的SCLC的患者(Radice PA等人.1982, Cancer ；50 =2894-2902)。此外， 對于患有綜合性SCLC的患者，觀察到病情的預后也比患有典型SCLC的患者差(Hirsch FR 等人，1983，Cancer ；52 =2144-2150)。大約75%到80%的病例屬于NSCLC組織學病例，并 且大部分患者表現(xiàn)出局部晚期病情(III階段)或轉(zhuǎn)移病情(IV階段)。重要的是，因明顯 的局部病情而經(jīng)歷了治療性外科切除手術的患者的存活率介于50%和80%之間，這表明
5需要有更好的系統(tǒng)性治療方法以治療隱蔽的微轉(zhuǎn)移疾病。在NSCLC病例中，使用化學療法 進行的治療基本上都是不成功的(Minna JD等人.1985，Cancer of the lung. In Cancer. Principles and practice of oncology第2版)。因此，除了真正局部疾病的手術治療能 夠獲得高治愈率以外，NSCLC患者的預后情況非常嚴峻(Mulshine JL等人.1986.，J Clin Oncol ；4:1704-1715)。然而，在一小部分患者中可以觀察到對化學療法的響應。其中部分 原因是因為這些病例可能屬于具有SCLC成分的NSCLC，因為這種非均勻成分在肺癌中是非 常常見的(見上所述)。從這些數(shù)據(jù)中可以清楚的看出，尋找到其它的治療形式對于這些患者而言至關重 要，但成功治療和根除肺癌的一個重大障礙就是病情診斷的延遲，而且在對不同類型的肺 癌進行正確分類的技術方面也存在不足。肺癌通常通過胸片(X光)、計算機斷層掃描(CT)成像、螺旋CT、正電子放射斷層 造影術(PET)、閃爍掃描術、活組織檢查、生物標記物分析或痰細胞檢查進行診斷。與任何 其它診斷測試一樣，肺癌診斷測試使用對靈敏度(測試中正確確定的真陽性比例)和特異 性(測試中正確確定的真陰性比例)的測量來評估。但由于靈敏度和特異性較低，診斷測 試往往以失敗告終。胸部X光可以通過檢測鱗狀細胞癌形成的損傷或空洞對NSCLC進行診斷。但是， 在一般情況下，在癌癥已經(jīng)轉(zhuǎn)移并且無法進行完全的手術切除之前，胸部X光并不能檢測 到肺癌。CT用來跟蹤癌細胞的擴散，對于肺癌的早期檢測，可能比標準的胸部X光更有效。 螺旋CT是CT的一種形式，可以在早期階段更靈敏的對肺癌進行診斷，但是根據(jù)報告，在檢 測某些類型的肺癌時，其特異性和靈敏度都非常低。PET是一種靈敏的非損傷性的造影技 術，能夠檢測已經(jīng)擴散的肺癌，例如已經(jīng)擴散到胸腔縱隔膜以及肺內(nèi)的肺癌。但是，PET造 影的高昂成本使其無法用于篩選目的。閃爍掃描術也是一種造影技術，在該技術應用過程 中，患者服用與癌細胞結合的放射性試劑?；罱M織檢查是獲取肺部組織和細胞，用于診斷， 并且可以通過胸腔鏡檢查、支氣管鏡檢查(如通過支氣管肺泡灌洗或BAL)或者細針程序等 執(zhí)行。諸如pRb2/pl30、p53以及ras等生物標記物已經(jīng)被視為肺癌的診斷劑，但目前尚 缺乏適當?shù)囊唤M生物標記物，用于肺癌的早期診斷或?qū)Σ煌愋偷姆伟┻M行分類(肺癌分 型)。目前，肺癌主要使用神經(jīng)元特異性烯醇酶(NSE)、細胞角蛋白片段抗原21. 1(CYFRA 21-1)、細胞角蛋白組(CK4、CK5、CK6、CK7、CK8、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17、CK18、 CK19以及CK20)、癌胚抗原(CEA)、胃泌激素釋放肽(GRP-ProGRP)、嗜鉻粒蛋白(CHGA)、甲狀 腺轉(zhuǎn)錄因子I(TITF-I)、突觸囊泡蛋白(SYPH)以及神經(jīng)內(nèi)分泌特異性蛋白質(zhì)(NSP)等進行 診斷。在這一方面，一組典型的用于肺癌神經(jīng)內(nèi)分泌區(qū)分的生物標記物組由NSE、SYPH以及 CHGA組成。盡管上述已知肺癌標志物中每一種均具有一定的價值，但在肺癌抗原存在異質(zhì) 性的情況下，目前尚沒有一組適用的腫瘤標志物，能夠就非小細胞肺癌(NSCLC)的分型以 及小細胞肺癌(SCLC)在早期疾病階段的特異性檢測提供滿意的靈敏度和特異性。使用前 述的腫瘤標志物或腫瘤標記組將會在患有非惡性肺部疾病(如慢性阻塞性肺病(COPD))的 患者、患有非小細胞肺癌(NSCLC)的患者以及患有其它神經(jīng)內(nèi)分泌(NE)腫瘤的患者或患有 腦瘤的患者的診斷中產(chǎn)生很高比例的假陽性。目前的標志物的另一個缺點是大部分僅能進 行免疫組織化學染色法測試而無法進行血清學的確定。
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在臨床實踐中，準確診斷各種子類型的癌癥非常重要，因為治療方法的選擇、預后 以及治療反應的可能性均在很大程度上取決于診斷結果。準確的預后或確定未曾遠程轉(zhuǎn)移 的患者存活率使腫瘤專家能夠定制輔助化學療法的實施，而預后較差的患者則會獲得更具 損害性的治療。此外，對不良預后的準確預測將對新肺癌療法的臨床試驗產(chǎn)生巨大的影響， 因為潛在的研究患者可以根據(jù)預后進行分組。試驗可以限定于具有不良預后的患者，從而 能夠更輕易的識別出實驗療法是否有效。迄今為止，尚未確定成套的能獲得滿意結果的單 獨以臨床資料作為依據(jù)的預后預測劑。因此，如果能夠提供具體的方法和試劑，用于肺癌的(早期)診斷、分型、區(qū)分、分 期、預后、監(jiān)控以及治療跟進，并進而克服目前診斷工具的缺點(如上所述)，將帶來很大的利益。在本發(fā)明中，我們展示使用經(jīng)過特別挑選的單克隆抗體的組合對腫瘤特異性抗原 進行血清學檢測，為肺癌的診斷和分型提供了很高的靈敏度和特異性。由于腫瘤的生長超 出腫瘤供血范圍而導致的腫瘤部位壞死、由于免疫響應而導致的腫瘤排斥；超出噬菌細胞 能力范圍的細胞死亡或由于有效的腫瘤治療等原因，這些腫瘤特異性抗原被釋放到外周循 環(huán)中。發(fā)明概述本發(fā)明的目的之一是提供用于對受試者肺癌進行(早期)診斷、分型以及分化確 定的體外方法，該方法包括以下步驟(a)從該受試者獲取樣本；以及(b)確定選自NCAM 剪接變體NCAM 120、NCAM140和/或NCAM 180、細胞角蛋白(CK)、神經(jīng)內(nèi)分泌特異性蛋白 質(zhì)(NSP)-reticulon(RTm)、突觸囊泡蛋白(SYPH)、嗜鉻粒蛋白A(CHGA)、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子 1 (TITF-I)、γ神經(jīng)元特異性烯醇化酶(YNSE)以及熱休克蛋白_47(HSP47)的至少兩種腫 瘤標記物基因的表達；其中所述基因的表達或所述蛋白質(zhì)的存在允許檢測和/或診斷和/ 或分型和/或確定所述受試者中肺癌的異質(zhì)性程度或分期。在一個具體的實施方案中，以及如下文其它實施方案所表現(xiàn)出的，上述方法中提 到的至少兩種基因中有一種由表達NCAM外顯子18的NCAM剪接變體的NCAM 180組成。因此，本發(fā)明的目的之一是提供對受試者內(nèi)肺癌進行(早期)診斷、分型以及確 定分化或分期的體外方法，該方法包括以下步驟(1)從該受試者獲取樣本；( 確定NCAM 180或表達NCAM外顯子18的NCAM剪接變體的表達；以及( 確定選自NCAM剪接變體NCAM 120或NCAM 140、細胞角蛋白(CK)、神經(jīng)內(nèi)分泌特異性蛋白質(zhì)(NSP)-reticulon(RTNl)、突 觸囊泡蛋白(SYPH)、嗜鉻粒蛋白A(CHGA)、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1 (TITF-I)、γ神經(jīng)元特異性烯 醇化酶(YNSE)以及熱休克蛋白_47(HSP47)中的至少一種腫瘤標記基因的表達；其中上述 基因的表達或上述蛋白質(zhì)的存在允許檢測和/或診斷和/或分型和/或確定所述受試者中 肺癌的異質(zhì)性程度或分期。在本發(fā)明的一個特定實施方案中，該方法包括以下步驟(a)從該受試者獲取樣 本；以及(b)確定選自NCAM、表達NCAM外顯子18的NCAM剪接變體、細胞角蛋白(CK)以及 神經(jīng)內(nèi)分泌特異性蛋白質(zhì)(NSP)-reticulon(RTm)的腫瘤標記基因的表達；其中上述基因 的表達或上述蛋白質(zhì)的存在與否允許檢測和/或診斷和/或分型和/或確定所述受試者中 肺癌的異質(zhì)性程度或分期。本發(fā)明中所使用的細胞角蛋白(CK)通常選自CK4、CK5、CK6(有兩種細胞角蛋白基因 / 蛋白質(zhì)，CK6a 和 CK6b)、CK7、CK8、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17、CK18、CK19 以 及CK20。在依照本發(fā)明的方法的一個具體實施方案中，確定至少兩種細胞角蛋白的表達。 而在一個更進一步的實施方案中，使用上述CK基因/蛋白質(zhì)中的至少3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13或14種的表達/存在。如以下舉例說明的，在本發(fā)明的一個實施方案中，所使用 的細胞角蛋白選自CK6(有兩種細胞角蛋白基因/蛋白質(zhì)，CK6a和CK6b)、CK16以及CK17。在對不同類型肺癌進行的分型或分期中，使用了 2種或更多種上述基因的表達； 在一個具體實施方案中，確定上述基因中至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14種的表 達。而在一個更進一步的實施方案中，在對受試者肺癌進行分型的方法中，使用了上述所有 基因的表達。在依照本發(fā)明的方法的一個實施方案中，NCAM 180的表達，尤其是表達NCAM外顯 子18-抗原的NCAM剪接變體的表達，與以上第C3)步中提到的一種或多種腫瘤標記配合使 用，以對SCLC和NSCLC進行區(qū)分。在一個更具體的實施方案中，NCAM 180，尤其是表達NCAM 外顯子 18 的 NCAM 剪接變體的表達與選自 CK4、CK5、CK6、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17 以及CK20中一種或多種(即2、3、4、5、6、7、8、9或所有)細胞角蛋白基因配合使用，以對 SCLC和NSCLC進行區(qū)分。在上述實施方案中SCLC 的特點是缺少細胞角蛋白基因 CK4、CK5、CK6、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16、 CK17以及CK20，而表達NCAM 180 (即表達NCAM外顯子18的NCAM剪接變體)、CK8以及 CK18。并且NSCLC的特點是缺少NCAM 180 (即表達NCAM外顯子18的NCAM剪接變體)，而表 達 CK19、CK6/CK16/CK17(即 CK6、CK16 禾口 CK17 中的幾個)和 / 或 CK8/CK18 (即 CK8 禾口 CK18 中的幾個)；尤其是缺少NCAM 180(即表達NCAM外顯子18的NCAM剪接變體)，尤其是表達 CK19、CK6/CK16/CK17 或 CK8/CK18。在第二個實施方案中，NCAM 180 (即表達NCAM外顯子18的NCAM剪接變體)的表 達與細胞角蛋白基因 CK4、CK5、CK6、CK7、CK8、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17、CK18、 CK19和/或CK20中的一種或多種(即2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或所有)共同使用，用于 檢測和/或診斷受試者中的NSCLC和/或確定或分型NSCLC(即區(qū)分腺癌和鱗狀細胞癌亞 型)。在上述第二種實施方案的一個目標中，NSCLC的腺癌分化或定型的特點是表達至 少 CK7、CK8/CK18 (即 CK8 和 CK18 對)以及 CK19，并且缺少 CK20、NCAM180 (即表達 NCAM 外 顯子 18 的 NCAM 剪接變體)以及選自 CK4、CK5、CK6、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16 以及 CK17 中的一種或多種細胞角蛋白基因(即2、3、4、5、6、7、8或所有)。在上述第二種實施方案的另一個目標中，NSCLC的鱗狀細胞癌(SCC)的分化或定 型的特點是表達選自 CK4、CK5、CK6、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17 以及 CK19 中的一 種或多種(即2、3、4、5、6、7、8、9或所有)細胞角蛋白基因，同時缺少NCAM180、CK20以及 CK7。而在此第二種實施方案的再另一個目標中，NSCLC的SCC亞型的G2和非G3期鱗狀細 胞癌的特點是表達細胞角蛋白基因CK17，缺少NCAM 180、CK20以及CK7。在第三種實施方案中，NSP-reticulon (又名 RTm)、NCAM、NSE、SYPH和 / 或 CHGA 的
8表達還用于確定肺癌的神經(jīng)內(nèi)分泌分化。在該替代性實施方案中，神經(jīng)內(nèi)分泌分化的特點 是表達選自NSE、SYPH和/或CHGA中的至少兩種基因；尤其是表達NSE、SYPH和/或CHGA ； 更具體而言，NSP和/或NSE被用于區(qū)分具有和不具有神經(jīng)內(nèi)分泌分化的肺癌。這種具有 和不具有神經(jīng)內(nèi)分泌起源的肺癌的亞分類可能具有很大的重要性，因為靶向療法將會變得 越來越常用。與此相似，選自CK4、CK5、CK6、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17 以及 CK19、NSE 和HSP47中的至少一種基因的額外表達以及CK20和NCAM 180的缺乏可以用來區(qū)分鱗狀和 非鱗狀NSCLC (包括腺癌或其它亞型的NSCLC)。在上述第三種實施方案的再另一個目的中，CK8、CK18以及CK20的表達可以用來 檢測和/或診斷神經(jīng)內(nèi)分泌的梅克爾細胞癌。另外還有一個目標是提供一種用于對受試者的肺癌進行(早期)診斷、分型以及 確定分化的體外方法，該方法包括以下步驟(a)從該受試者獲取樣本；以及(b)確定選 自NCAM、NCAM外顯子18、NSP的腫瘤標記基因以及兩項或更多項細胞角蛋白抗原(尤其是 CK6、CK16以及CK17)的表達；其中所述基因的表達或所述蛋白質(zhì)的存在或缺失可以檢測和 /或診斷和/或分型和/或確定該受試者所患肺癌的異質(zhì)性程度或分期。在上述任何一種方法中，樣本選自血液、血清、血漿、尿液、唾液、精液、乳汁、腦脊 液、淚液、痰涎、黏液、淋巴液、胸腔積液、腫瘤組織以及支氣管肺泡灌洗液等。以上所提及的標記基因的表達水平使用本領域已知的操作確定，通常在蛋白質(zhì)或 核酸水平進行。確定表達水平的方法包括-免疫測定法，其中表達水平使用特異性結合由該基因所編碼的蛋白質(zhì)的抗體確 定；或者-雜交測定法，其中表達水平使用與編碼該基因的核酸分子雜交的探針確定。-免疫組織化學法，其中描述的標記物組用于腫瘤組織中該腫瘤抗原的體外診斷 /分型和分期。-成像法，其中描述的標記物組用于體內(nèi)診斷以及疾病進程或治療反應的監(jiān)控。例如，對于NCAM 180而言，基因或基因產(chǎn)物的表達特別通過特異于NCAM外顯子18 區(qū)的抗體或DNA-探針檢測。如此后實施例中所示，NCAM外顯子18的特異性抗體包括但不 限于單克隆抗體MUMI21B1、MUM1、MUM4以及MUM6。在另一方面，本發(fā)明提供了將此前所鑒定的基因用于監(jiān)控受試者對肺癌治療的反應。在一種實施方案中，所述基因用于肺癌的體內(nèi)成像，更具體而言，選自NCAM、NCAM 外顯子18、CK6/16/CK17、RTNU SYPH, CHGA以及NSE的基因被用于這些體內(nèi)成像技術?？梢允褂帽绢I域已知的體內(nèi)成像技術，例如使用計算機斷層掃描(CT)、正電子放 射斷層造影術(PET)和/或PET-CT等。本發(fā)明的又一個方面還涉及用于受試者肺癌分型或分期的試劑盒，其中包括用來 確定本發(fā)明中確定的基因的表達的試劑。在以下將更詳細的說明本發(fā)明的這些及其它方面。序列說明
SEQ ID NO 1是人類NCAM外顯子18的核苷酸序列。SEQ ID NO 2是人類NCAM外顯子18的氨基酸序列。SEQ ID NO 3是人類NCAM 180的核苷酸序列。SEQ ID NO 4是人類NCAM 180的氨基酸序列。SEQ ID NO 5是人類NCAM外顯子18片段的核苷酸序列。SEQ ID NO 6是由SEQ ID NO 5編碼的人類NCAM外顯子18片段的氨基酸序列。附圖簡要說明

圖1 差異表汰PCR原理示意圖。對于A組引物，正向引物設計在外顯子17中，逆 向引物在外顯子19中。對于B組引物，正向以及逆向引物均設計在NCAM外顯子18中。對 表達NCAM 140的細胞的PCR擴增，采用A組引物得到了一個180bp的PCR產(chǎn)物，采用B組 引物無擴增子。表達NCAM 180的細胞采用B組引物獲得600bp的PCR擴增子。表達NCAM 140以及NCAM 180的細胞采用兩組引物均得到PCR產(chǎn)物。圖2 作為NCAM 180 一部分的NCAM外顯子18，在源自小細胞肺癌(SCLC，N = 4) 的細胞培養(yǎng)物中過度表達，在非小細胞肺癌(NSCLC，N =幻和健康對照組的外周血單個核 細胞(PBMC)中沒有表達，而在源自神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(SH-SYSY以及CCI)的細胞系中有低度 到中度表達。表達NCAM外顯子18的細胞在NCAM外顯子18特異性PCR中產(chǎn)生了 604bp的 PCR產(chǎn)物。表達NCAM 140 kDa剪接變體的細胞在NCAM外顯子17-19PCR擴增反應中產(chǎn)生 180bp的產(chǎn)物。圖3 肺癌患者(N = 7，黑色條)和對照組(N = 7，灰色條)血清中的NCAM抗原 檢測。使用夾心式ELISA測量血清抗原水平。ELISA板使用NCAM特異性單克隆捕獲抗體 (1230)包被并使用BSA封閉。以經(jīng)過1 4稀釋的血清進行孵育并添加生物素標記的NCAM 特異性檢測抗體(RNL-I)。使用過氧化物酶偶聯(lián)的鏈霉親和素和TMB底物進行NCAM血清抗 原水平檢測。分別顯示患者和對照組在血清樣本中測得的代表NCAM抗原水平的OD450值。圖4 在免疫組織化學法中顯示的原發(fā)性人類肺部腫瘤的NSP表達。圖5 肺癌患者(N = 7，黑色條)和對照組(N = 7，灰色條)血清的NCAM外顯子 18-抗原檢測。使用夾心式ELISA測量血清NCAM外顯子18-抗原水平。ELISA板使用捕 獲抗體包被并使用BSA封閉。所使用的捕獲抗體為A-C :MUMI21B2，以及D=RNL-I。將經(jīng)過 1 4稀釋的血清樣品進行孵育并添加生物素標記的檢測抗體。所使用的檢測抗體為A MUMLB :MUM4，C :MUM6以及D :MUMI21B2。使用過氧化物酶偶聯(lián)的鏈霉親和素和TMB底物進 行抗原檢測。對于NCAM外顯子18-抗原檢測，我們使用了 4對不同的抗體對。圖6 對組織陣列的免疫組織化學分析表明在鱗狀細胞癌(SCC)中發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì) 的過度表達。針對每一種抗體顯示了支氣管上皮、鱗狀細胞癌、腺癌以及大細胞癌染色的代 表性圖片。使用肺癌亞型特異性生物標記物的診斷指引。陽性血清抗原滴度黑色； 無血清抗原滴度白色；不同的抗體對之間可能有差異的疾病階段特異性反應淺灰色。 Adeno 腺癌；NE 神經(jīng)內(nèi)分泌；LC 大細胞癌；COPD 慢性阻塞性肺病；SCLC 小細胞肺癌； NSCLC 非小細胞肺癌。發(fā)明詳述本發(fā)明提供生物標記物，如核酸分子及其表達產(chǎn)物，其中與取自非癌癥受試者的健康細胞相比，這些生物標記物在取自肺癌患者的健康細胞和/或惡性肺癌細胞中差異表 達。這些生物標記物可以用于快速多因子測定中，以進行肺癌的早期檢測，區(qū)分不同亞型的 肺癌以及確定已知肺癌的異質(zhì)性程度。癌癥“癌癥”或“瘤(neoplasm)，，是指任何不具備生理功能的不需要的生長。一般情況 下，瘤細胞已經(jīng)脫離其正常的細胞分裂控制，即是生長不被細胞環(huán)境中一般生物化學和物 理影響所調(diào)控的細胞。在大部分情況下，瘤細胞會增殖形成細胞克隆，該細胞克隆可以是惡 性的。癌癥這一術語包括在技術上屬于良性但也具有轉(zhuǎn)為惡性風險的細胞生長。“惡性” 是指任何細胞類型或組織的不正常生長。惡性這一術語包括惡性前的細胞生長。該術語還包括任何癌癥、癌(carcinoma)、瘤、瘤形成或腫瘤(tumor)。大部分癌 癥屬于三種廣義的組織學分類癌(carcinoma)，其為最常見的癌癥，是上皮細胞或覆蓋器 官、腺體或其它身體結構(如皮膚、子宮、肺、乳腺、前列腺、胃、腸)的外表面或內(nèi)表面的細 胞的癌癥，而且往往會發(fā)生轉(zhuǎn)移；肉瘤(sarcoma)，產(chǎn)生于結締組織或支持組織(如骨骼、軟 骨、肌腱、韌帶、脂肪和肌肉等)；以及血液系統(tǒng)腫瘤，其產(chǎn)生于骨髓和淋巴組織。癌可以是 腺癌(一般在具備分泌功能的器官或腺體中生長，如乳腺、肺、結腸、前列腺或膀胱)或者鱗 狀細胞癌(產(chǎn)生于鱗狀上皮并且通常在身體的大部分部位生長)。癌癥也可以根據(jù)其產(chǎn)生的器官(即“原發(fā)部位”)來命名，例如，乳腺癌、腦癌、肺 癌、肝癌、皮膚癌、前列腺癌、睪丸癌、膀胱癌、結腸直腸癌、宮頸癌以及子宮癌等等。即使當 癌癥轉(zhuǎn)移到原發(fā)部位以外的其它身體部位時，這種命名方式仍然沿用。根據(jù)原發(fā)部位命名 的癌癥可能與組織學分類相關聯(lián)。例如，肺癌或支氣管肺癌通常發(fā)生在肺部上皮細胞，并且 一般被歸類為“小細胞肺癌”或“SCC”和“非小細胞肺癌”或“NSCLC”。NSCLC包括腺癌、鱗 狀細胞癌以及大細胞肺癌。如之前所概述的，本發(fā)明的生物標記物特別適用于對患者中不 同類型的肺癌進行表征。生物標記物本發(fā)明提供生物標記物，如核酸分子及其表達產(chǎn)物，其中與取自非癌癥受試者的 正常細胞相比，這些生物標記物在取自肺癌患者的組織學正常細胞和/或惡性肺癌細胞中 差異表達?！吧飿擞浳铩笔侵妇哂刑囟ㄉ飳傩缘姆肿訕擞浳?，在本發(fā)明中所使用的是核酸 分子(如基因或基因片段)或其表達產(chǎn)物(如多肽或肽片段或其變體)，該生物標記物在細 胞或組織中的差異表達(存在、缺乏、相對于參照物的過量表達或表達不足等)可以表明是 否存在肺癌。本發(fā)明中所使用的“表達產(chǎn)物”是經(jīng)過轉(zhuǎn)錄的有義或反義RNA分子(如mRNA)， 或者對應于或衍生自多核苷酸序列的翻譯多肽。在一些實施方案中，表達產(chǎn)物可以指與轉(zhuǎn) 錄自多核苷酸序列的RNA表達產(chǎn)物相對應的擴增產(chǎn)物(擴增子)或cDNA?！耙唤M”生物標 記物是指選擇兩項或更多項生物標記物的組合。“差異表達(differential expression)” 或“差異地表達(differentially expressed)”是指與參考細胞或組織或樣本相比，取自肺癌患者的細胞或組織或樣本中生 物標記物的頻率或數(shù)量或兩者均有的差異，例如取自肺癌患者的惡性肺癌細胞和/或正常 細胞(即具有與惡性腫瘤相關改變的細胞)與參照或正常細胞(例如取自未患癌癥或患有不可檢測的癌癥的患者的細胞或取自已經(jīng)經(jīng)過成功切除肺癌手術的患者的正常細胞)相 比。在一些實施方案中，對照或參照細胞可以是SCLC或NSCLC。在一些實施方案中，差異表 達是指惡性肺癌細胞與參照細胞相比，生物標記物的頻率或數(shù)量或兩者皆有的差異。例如， 生物標記物的差異表達可以指與參照受試者的樣本相比，生物標記物在肺癌患者樣本中的 表達水平增加或減少，例如，取自肺癌患者的血液、尿液、唾液、血清、胸腔積液或支氣管肺 泡灌洗液樣本中測得的蛋白質(zhì)水平或抗體滴度與取自非肺癌對照組(包括健康受試者和 患有支氣管炎和毛細支氣管炎等呼吸道感染的受試者)的血液、尿液、唾液、血清、胸腔積 液或支氣管肺泡灌洗液樣本中測得的蛋白質(zhì)水平或抗體滴度。或者或另外，生物標記物的 差異表達可以指與參照受試者樣本相比，在肺癌患者樣本中以較高或較低頻率檢測到生物 標記物。生物標記物可以在數(shù)量、頻率或兩者上均有差異地存在。在一些實施方案中，本 發(fā)明所述的生物標記物差異表達可以在不同的時間點測量，例如在治療之前和之后?！氨磉_ 水平”是指細胞中由基因編碼的mRNA以及pre-mRNA新生轉(zhuǎn)錄本、轉(zhuǎn)錄本處理中間體、成熟 mRNA以及降解產(chǎn)物的水平，和/或細胞中蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段和降解產(chǎn)物的水平。生物標記物在數(shù)量或頻率或兩者方面的差異可以使用任何適用的技術測量，如統(tǒng) 計技術。例如如果在肺癌樣本中檢測到生物標記物的頻率顯著高于或低于參考樣本，則在 肺癌樣本和參考樣本之間生物標記物可能是差異表達，如使用標準的統(tǒng)計分析測量的，例 如Student-t檢驗，其中一般認為ρ < 0. 05具有統(tǒng)計學的顯著意義。在一些實施方案中， 如果與參考樣本相比，在肺癌中以至少大約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、 100%或更多或2-、5-、10倍或更多倍的更高或更低頻率檢測到，則該生物標記物是差異表 達的?；蛘呋蛄硗猓绻伟┲猩飿擞浳锏臄?shù)量在統(tǒng)計學上具有顯著不同，例如與例如 參考樣本中生物標記物的數(shù)量相比有至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、 100%或更多或者多2-、5-、10倍或更多倍不同，或者在一種樣本中可檢測，而在其它樣本 中無法檢測，則該生物標記物是差異表達的。在一些實施方案中，差異表達是指測試樣本 與參考樣本相比，在表達增加或減少上達到至少20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、 90%、100%或更多或者2-、5-、10倍或更多倍?！皹颖尽笨梢允欠蛛x自受試者的任何器官、組織、細胞或者細胞提取物，例如分離自 患有肺癌或者具有患肺癌風險(如根據(jù)家族病史或者個人病史，如較重的吸煙習慣)的哺 乳動物的樣本。例如，樣本可以包括但不限于取自患有肺癌的哺乳動物的肺實體腫瘤細胞 或組織(如通過活組織檢查或尸體解剖獲得的)、痰涎、咳嗽物、支氣管肺泡灌洗液、支氣管 刷洗液、口腔粘膜、外周血液、全血、紅細胞濃縮物、血小板濃縮物、白細胞濃縮物、血液細胞 蛋白、血漿、富含血小板的血漿、血漿濃縮物、血漿的任何分餾沉淀物、血漿的任何分餾上清 液、血漿蛋白級分、純化或部分純化的血液蛋白或其它成分、血清、組織或細針活組織檢查 樣本以及胸腔積液等，或取自患者(人類或動物)、測試受試者、健康志愿者或?qū)嶒瀯游锏?任何其它樣本或其任何提取物。受試者可以是人類、大鼠、小鼠、非人類靈長類動物等。樣 本還可以包括組織切片，如用于組織學用途的冷凍切片。“樣本”還可以是依照實驗條件創(chuàng) 建的細胞或細胞系，其并非直接取自受試者?！皩φ?組)”或“參照(組)”包括為確定基線表達或活性而獲取的樣本。因此， 可以從許多不同的途徑獲取對照樣本，包括從非癌癥細胞或組織中獲取，例如從受試者的 腫瘤或癌癥細胞周邊細胞中獲取；從無癌癥的受試者中獲?。粡姆菓岩删哂邪┌Y風險的受試者中獲??；或者從源自這些受試者的細胞或細胞系中獲取。對照組還包括預先確定的標 準，例如預先表征的SCLC、NSCLC，包括SQC、AC以及具有或不具有神經(jīng)內(nèi)分泌起源的NSCLC。 因此，依照本發(fā)明進行的任何測試或測定可以與確定的標準進行對比，并且并非每次都必 須獲取對照樣本用于對比。依照本發(fā)明用于不同類型的肺癌分型的生物標記物包括NCAM120、NCAM 140,NCAM 180、細胞角蛋白(CK)、神經(jīng)內(nèi)分泌特異性蛋白質(zhì)(NSP)-teticulon(RTm)、突觸囊泡蛋白 (SYPH)、嗜鉻粒蛋白(CHGA)、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子(TITF-I)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和 HSP47。這些生物標記物中的兩項或更多項，即2、3、4、5、6、7種生物標記物至所有生物標記 物，可以以任何組合共同用于依照本發(fā)明進行的測定。在一些實施方案中，一種或多種生 物標記物可以從測定中明確排除(如上)。在一些實施方案中，可以使用特定的組合，例如 在區(qū)分SCLC和NSCLC時。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，NCAM 180與選自NCAM 120、 NCAM 140、細胞角蛋白(CK)、reticulon IA(RTm)、CD45、突觸囊泡蛋白(SYPH)、嗜鉻粒蛋 白(CHGA)、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子(TITF-I)、γ神經(jīng)元特異性烯醇化酶(YNSE)和HSP47中的至 少一種或多種生物標記物配合使用。在該實施方案中，NCAM 180 kDa剪接變體表達由針對 NCAM外顯子-18區(qū)的抗體或探針具體確定。本發(fā)明所述的生物標記物包括核酸分子的基本上相同的同系物和變體以及如本 文所述的表達產(chǎn)物，例如，包括編碼在功能上與本發(fā)明所述生物標記物等同之多肽的核苷 酸序列的分子，如具有一個或多個核苷酸置換、添加或缺失的序列的分子，例如等位基因變 體或剪接變體或物種變體或由于遺傳密碼簡并性而與本文表格所列的核酸分子和多肽不 同的分子。物種變體是指在一種與另一種物種之間不同的核酸序列，但由其產(chǎn)生的多肽通 常相互之間具有很高的氨基酸相同性和功能類似性。多態(tài)變體(如單核苷酸多態(tài)性或SNP) 是在指定物種的受試者之間，特定基因的核酸序列的差異?！盎鞠嗤钡男蛄惺侵赴被峄蚝塑账嵝蛄信c參照序列的差別僅在于一個或多 個保守型置換(如本文所述)或者一個或多個位于序列上不破壞氨基酸或核酸分子生物 學功能的位置處的非保守型置換、缺失或插入。當使用例如比對程序(Myers and Miller, CABIOS, 1989,4 :11-17)或FASTA與用于比較的序列在氨基酸或核苷酸水平上進行最佳 比對時，此類序列可以是10%至99%的任何整數(shù)百分比，或者更為一般的情況下是至少 10%、20%、30%、40%、50、55%或 60%，或至少是 65%、75%、80%、85%、90%或 95%，或 達到96 %、97 %、98 %或99 %的同一性。對于多肽而言，對比序列的長度可以至少是2、5、10 或15個氨基酸，或者至少是20、25或30個氨基酸。在另外的實施方案中，對比序列的長度 可以至少是35、40或50個氨基酸，或者在60、80或100個氨基酸以上。對于核酸分子而言， 對比序列的長度可以至少為5、10、15、20或25個核苷酸，或者至少30、40或50個核苷酸。 在其它實施方案中，對比序列的長度可以是至少60、70、80或90個核苷酸，或者在100、200 或500個核苷酸以上。序列相同性可以使用可公共獲取的序列分析軟件(如威斯康星大學 生物科技中心的Genetics Computer Group提供的序列分析軟件包，地址1710University Avenue, Madison, Wis. 53705，或者國家醫(yī)藥圖書館提供的BLAST軟件，或如本文所述的軟 件)容易地進行測量。有用的軟件的例子包括Pile-up和ft~ettyB0X程序。此類軟件通過 對各種缺失、置換及其它修飾指定同源性的程度來匹配相似的序列。或者或另外，如果兩種 核酸序列在高度嚴格的條件下雜交，則它們也可以是“基本相同”的。在一些實施方案中，
13高度嚴格的條件是例如能夠允許發(fā)生在以下條件發(fā)生的雜交相當?shù)碾s交的條件使用長度 為至少 500 個核苷酸的 DNA 探針，在含有 0.5M NaHP04, pH 7. 2,7% SDS, ImM EDTA ^P 1 % BSA(級分V)的緩沖液中，在60攝氏度的溫度；或者在含有48%甲酰胺，4. 8x SSC,0. 2M Tris-Cl,pH 7. 6，Ix Denhardt' s溶液，10%硫酸葡聚糖以及0. SDS的緩沖液中，在42 攝氏度的溫度。(這些是典型的高度嚴格的Northern或Southern雜交條件。)執(zhí)行雜交 的時間可以是大約20至30分鐘，或大約2至6小時，或大約10至15小時，或M小時以上 或更長。高度嚴格的雜交還依賴于分子生物學家日常執(zhí)行的各種成功的技術，例如高度嚴 格的PCR、DNA測序、單鏈構象多態(tài)分析以及原位雜交。與Northern和Southern雜交不同， 這些技術通常使用相對較短的探針進行(如PCR的探針通常為16個核苷酸或更長，原位雜 交的探針通常約為40個核苷酸或更長)。這些技術中所使用的高度嚴格的條件是分子生物 學領域技術人員所熟知的，它們的實例也可以在諸如Ausubel等人Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons，New York, N. Y.，1998)中查找到，現(xiàn)將這些文獻 通過引用并入本文。使用生物標記物制備試劑本文所述的生物標記物可以用于制備寡核苷酸探針和抗體，這些探針和抗體與本 文表格所列的生物標記物及其同系物和變體雜交或特異性結合?？贵w“抗體”包括具有抗原結合區(qū)的分子，例如任何同種型的完整抗體(IgG、IgA、IgM、 IgE等等)及其片段。抗體片段包括Fab'、Fab、F(ab' ) 2、單域抗體、Fv、scFv等?？贵w 可以使用標準的制備技術來制備，例如Harlow and Lane中所述的制備技術(Harlow and Lane Antibodies ；A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor, N. Y. , 1988)或本領域技術人員已知的制備技術。例如，本發(fā)明中的多肽生物標記 物的編碼序列可以純化至兔子免疫所必需的程度。為盡力將抗血清潛在的低親和力或特異 性的問題降至最低，可以針對每一種蛋白質(zhì)生成兩種或三種多肽構建體，并且每一種構建 體均可注射到至少兩只兔子體內(nèi)?？寡蹇梢酝ㄟ^一系列注射來產(chǎn)生，最好包括至少三次 加強注射。初次免疫可以使用弗氏完全佐劑進行，而后續(xù)的免疫可以使用弗氏不完全佐劑 進行?？贵w滴度可以通過使用純化蛋白質(zhì)進行的Western印跡法以及免疫沉淀分析進行監(jiān) 控?？梢允褂肅NBr-瓊脂糖偶聯(lián)的蛋白質(zhì)對免疫血清進行親和純化。可以使用一組非相關 蛋白確定抗血清的特異性。抗體片段可以重組制備，也可以通過蛋白水解切割制備?？梢援a(chǎn) 生與本發(fā)明所述的多肽生物標記物的相對獨特的免疫原區(qū)相對應的肽，并且通過引入的C 末端賴氨酸與匙孔戚血藍蛋白(KLH)偶聯(lián)。針對這些肽中每一種的抗血清可以在與BSA綴 合的肽上獲得親和力純化，并且使用肽綴合物在ELISA和Wfestern印跡中以及通過Wfestern 印跡法和免疫沉淀法進行特異性測試。與本發(fā)明所述的任何一種多肽生物標記物特異性結合的單克隆抗體可以依照標 準的雜交瘤技術進行制備(見，例如，Kohler等人，Nature 256 :495，1975 ；Kohler等人， Eur. J. Immunol. 6 :511,1976 ；Kohler 等人’ Eur. J. Immunol. 6 :292,1976 ；Hammer ling 等 人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y. , 1981)?；蛘呖?以使用本發(fā)明所述的多肽和噬菌體展示庫(Vaughan等人，Nature Biotech 14:309-314， 1996)制備單克隆抗體。一經(jīng)產(chǎn)生，還可以使用Western印跡法或免疫沉淀反應法測試單克
14隆抗體的特異性識別。在一些實施方案中，可以使用可能具有免疫原性的的多肽片段來制造抗體，所采 用的標準如高頻率的帶電殘基?？贵w可以經(jīng)過定制，例如通過使用含有來自一種物種的抗 原結合結構域和來自另一種物種的Fc部分的嵌合抗體，或使用由適當物種的雜交瘤制成 的抗體，從而將負面宿主免疫應答降至最低。例如，在使用NCAM 180時，抗體被定制成特異 于NCAM外顯子18區(qū)，也稱為MUM蛋白質(zhì)或NCAM-MUM (見PCT公開WO 2007-104511)。當抗體識別并結合一種抗原(如本文所述的生物標記物)，但并非充分識別和結 合樣本中的其它分子時，該抗體“特異性結合”該抗原。這種抗體例如對于該抗原具有親和 性，比該抗體對于樣本中其它參照分子的親和性高出至少2、5、10、100、1000或10000倍。 在此類條件下進行的抗體特異性結合可能要求該抗體是經(jīng)選擇對特定生物標記物具有特 異性。例如，可以對針對來自特定物種例如大鼠、小鼠或人類的生物標記物而產(chǎn)生的多克隆 抗體進行選擇，以僅獲得那些對該生物標記物具有特異免疫反應性而對其它蛋白質(zhì)(除該 生物標記物的多態(tài)變體和等位基因以外)沒有特異免疫反應性的多克隆抗體。在一些實施 方案中，可以對針對來自特定物種例如大鼠、小鼠或人類的生物標記物產(chǎn)生的多克隆抗體 進行選擇，以僅獲得那些對來自該物種的生物標記物具有特異免疫反應性而對其它蛋白質(zhì) (包括該生物標記物的多態(tài)變體和等位基因)沒有特異免疫反應性的多克隆抗體。通過將 樣本與抗體接觸并檢測樣本中是否存在與生物標記物結合的抗體復合體，特異性結合本文 所述任何生物標記物的抗體可以用于免疫測定中。免疫測定中使用的抗體可以按本文所述 的方法或本領域已知的方法制造，或者可以通過例如Dako Canada, Inc.，Mississauga，ON 等供應商購買獲得。在與樣本接觸之前，抗體可以固定在固體基質(zhì)(如尼龍、玻璃、陶瓷、塑 料等)上，從而方便后續(xù)的測定程序。抗體-生物標記物復合體可以使用各種標準程序進 行可視化或檢測，例如檢測放射性、熒光性、發(fā)光、化學發(fā)光、吸光度或通過顯微鏡檢查、醫(yī) 學成像等方法檢測。免疫測定法包括免疫組織化學法、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA) ,western 印跡法、免疫放射測定法(IRMA)、側向流、消散法(evanescence) (DiaMed AG,Cressier sur Morat, Switzerland，如歐洲專利公開 EP1371967，EP1079226 以及 EP1204856 所述)、免疫 組織/細胞化學法以及本領域技術人員所知的其它方法?？梢允褂妹庖邷y定法來確定樣本 中是否存在生物標記物，以及該生物標記物在樣本中的量。抗體-生物標記物復合體的量 可以通過與參照物或標準(例如樣本中存在的已知多肽)進行對比來確定?？贵w-生物標 記物復合體的量還可以通過與參照物或標準(例如參照或?qū)φ諛颖局猩飿擞浳锏牧?進 行對比來確定。因此，樣本中生物標記物的量無需絕對量化，而是可以針對參照或?qū)φ战M進 行相對測量。探針和引物“探針”或“引物”是指具有確定序列的單鏈DNA或RNA分子，其能夠與含有互補序 列(靶標)的另一 DNA或RNA分子堿基配對。形成的雜合分子的穩(wěn)定性取決于發(fā)生的堿基 配對的程度，并且受諸如探針和靶標分子間互補性程度以及雜交條件的嚴格性等參數(shù)的影 響。雜交嚴格性的程度受諸如溫度、鹽濃度以及有機分子(如甲酰胺)濃度等參數(shù)的影響， 并且可以使用本領域技術人員已知的方法確定。本文所述核酸生物標記物或其部分的特異 性探針或引物的長度可以在至少8個核苷酸到超過500個核苷酸之間變化，可以是其中任 何整數(shù)值，其長度取決于該探針或引物使用的目的和條件。例如，探針或引物的長度可以是8、10、15、20或25個核苷酸，或者可以至少有30、40、50或60個核苷酸，或者可以是100、 200、500或1000個核苷酸以上。對于本文所述的核酸生物標記物具有特異性的探針或引物 可以與本文所述的核酸生物標記物具有20-30%以上的序列一致性，或者至少55-75%的 序列一致性，或者至少75-85%的序列一致性，或者至少85-99%的序列一致性，或者100% 的序列一致性。探針或引物可以通過例如擴增從基因組DNA或cDNA中產(chǎn)生，或者從克隆DNA 片段中產(chǎn)生，并且可以含有代表來自單一受試者的單個基因的全部或部分的基因組DNA或 cDNA序列。探針可以擁有獨特的序列(如與核酸生物標記物100%—致)和/或擁有已知 的序列。探針或引物可以通過化學方式合成。探針或引物可以在如本文所述的高度嚴格的 條件下與核酸生物標記物雜交。探針或引物可以通過本領域技術人員已知的方法進行放射性或非放射性地可檢 測性標記。探針或引物可用于涉及核酸雜交的肺癌檢測方法，例如核酸測序、通過聚合酶 鏈反應(如RT-PCR)進行的核酸擴增、單鏈構象多態(tài)分析(SSCP)、限制性片段多態(tài)性分析 (RFLP)、Southern雜交、northern雜交、原位雜交、電泳遷移率變動分析(EMSA)、熒光原位 雜交(FISH)以及本領域技術人員所知的其它方法?！翱蓹z測性地標記”是指任何標記或鑒別分子例如寡核苷酸探針或引物，基因或其 片段，或者cDNA分子存在的方法。對分子進行可檢測性地標記的方法為本領域技術人員所 熟知，包括但不限于放射性標記(例如，使用如32P或％等同位素)和非放射性標記如酶 標記(例如，使用辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)、化學發(fā)光標記、熒光標記(例如，使用熒 光素)、生物發(fā)光標記或附著于探針的配體的抗體檢測等。此外，本定義還包括使用間接途 徑進行可檢測性地標記的分子，例如，與第一部分(如生物素)結合的分子，該第一部分進 而與可觀察或檢測的第二部分(如使用熒光素標記的鏈霉親和素)結合。標記還包括地高 辛、螢光素酶以及發(fā)光蛋白質(zhì)。陣列和試劑盒使用本發(fā)明中的生物標記物制備的抗體、探針、引物以及其它試劑可用于制備肺 癌檢測中所使用的陣列?！瓣嚵小被颉熬仃嚒笔侵缚蓪ぶ肺恢没颉暗刂贰钡哪Ｊ交虬才牛恳?個位置或地址代表表面上一個獨立的點。陣列通常要求核酸分子、多肽、抗體、組織等以指 定的空間排列在上面附著的固體支撐(如尼龍、玻璃、陶瓷、塑料等)，從而可以輕易的確定 與探針的雜交模式。一般而言，探針(如抗體、核酸探針或引物、多肽等等)被固定在陣列表面上，并 且在適合結合的條件下與含有目標結合伴侶(如果是抗體，即指與該抗體特異性結合的多 肽；或者，如果是探針，則為與該探針雜交的核酸分子)的樣本接觸。如果需要，可以清除樣 本中未結合的材料。結合的靶標接受檢測，并且使用適當?shù)慕y(tǒng)計或其它方法對結合結果進 行分析。探針或靶標可以進行可檢測的標記，以方便檢測及以后的分析?？梢允褂门c本發(fā) 明所述的生物標記物相對應的多個探針。所述多個探針可以對應于本發(fā)明所述生物標記物 中的一個或多個。除了能夠結合本發(fā)明所述的生物標記物的探針以外，陣列還可以含有對 照和參照核酸分子、多肽或抗體，以允許進行不同實驗之間結果的標準化以及在定量水平 上對多個實驗進行對比。因此，本發(fā)明提供了使用核酸、多肽、抗體或細胞學陣列的生物學 檢定方法。本發(fā)明還提供了用于檢測肺癌的試劑盒。該試劑盒可以包括一種或多種與本發(fā)明所述的生物標記物相對應的試劑，如與體液中作為抗原分泌的生物標記物特異性結合的抗 體、與生物標記物特異性抗體結合的重組蛋白、與生物標記物雜交的核酸探針或引物等。在 一些實施方案中，該試劑盒還可以包括多種試劑，如在陣列上，對應于本發(fā)明所述生物標記 物。該試劑盒還可以包括檢測試劑，如被可檢測性地標記的試劑。該試劑盒還可以包括用 于肺癌(早期)檢測和分型的書面說明書，并且也可以包括其它試劑和資料，如對照或參考 標準、清洗溶液、分析軟件等。診斷及其它方法可以通過免疫測定(如免疫組織化學法)、ELISA、Western印跡法或本領域技術人 員已知的任何其它方法檢測本發(fā)明所述的一種或多種生物標記物的差異表達來進行肺癌 的診斷。檢測可以在體外或體內(nèi)進行。雖然單個的生物標記物是有用的診斷劑，但本發(fā)明所提議的生物標記物組合能夠 對肺癌進行精確的(早期)診斷和分型。多種生物標記物在不同樣本中差異表達的變化可以用來診斷或預測是否存在特 定類型的肺癌、對于特定肺癌療法的反應，或者更好的評估患上肺癌的風險。例如，NCAM 180 禾口 / 或 CK8 以及 CK18 的表達，以及 CK4、CK5、CK6、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17 和CK20的缺乏，可以用來檢測樣本中是否存在SCLC。NSCLC的特點是缺少NCAM 180，而存 在CK19，CK6/CK16/CK17和/或CK8/CK18。可以使用適當?shù)慕y(tǒng)計方法和算法，如邏輯回歸 算法，進行分析并且將多種生物標記物用于診斷、預后、治療或其它目的。生物標記物(或 生物標記物的特定組合)可以多次進行檢測和測量，例如，在肺癌治療之前、期間以及之后 進行。本文所述的生物標記物檢測可以作為肺癌(早期)檢測和分型的初步篩選和/或 可以與傳統(tǒng)的肺癌診斷方法配合使用，例如痰細胞檢查、胸部X光、CT掃描、螺旋CT、PET、具 有特定追蹤劑(如89^V1C)的PET-CT、熒光染色、閃爍掃描術、活組織切片檢查、傳統(tǒng)形態(tài) 學MAC分析等。本文所述的生物標記物檢測還可以與預先認定的肺癌生物標記物(如pRb2/ pl30、p53和/或ras)配合進行。本文所述的生物標記物的檢測可以作為日常檢查的一部 分來進行，例如，對于特定年齡(如60歲以上)的重度吸煙者進行的檢查；或者可以進行該 檢測以確定具有肺癌風險的受試者(如重度吸煙者)中生物標記物的基線水平。一般情況下，本發(fā)明中的生物標記物組將用于分子成像(包括以上所述的體內(nèi)成 像技術)，用于分子診斷和/或檢測和/或監(jiān)控肺癌的治療。對本文所述生物標記物的檢測使醫(yī)師能夠根據(jù)診斷結果為受試者確定適當?shù)奶?理方案(如繼續(xù)測試、手術、不采取措施等等)。對本文所述生物標記物的檢測還可以幫助 確定肺癌的存在或不存在、進行肺癌的早期診斷、肺癌的預后、肺癌的分型、對肺癌療法的 有效性進行評估、對受試者接受的肺癌治療進行監(jiān)控、或者檢測經(jīng)歷肺癌治療并且處于病 情減退的受試者中，肺癌的復發(fā)。在其它方面，生物標記物以及使用生物標記物制備的試劑 可以用來鑒定肺癌治療劑。試劑盒和陣列可以用來衡量根據(jù)本發(fā)明的生物標記物，對肺癌 進行診斷和分型。試劑盒還可以用來監(jiān)控受試者對肺癌療法的反應，使醫(yī)師能夠根據(jù)測試 結果對治療方法進行修改。試劑盒還可以用來鑒定并驗證肺癌治療劑，如小分子、肽等等。通過參照以下所列的實驗細節(jié)，將可以更好的理解本發(fā)明。但是，本領域技術人員 將會輕易的發(fā)現(xiàn)，這些實驗細節(jié)僅僅是本發(fā)明的舉例說明，不應被解釋為限制本發(fā)明的范圍。此外，在本申請文件的全文中引用了各種出版物。這些出版物的公開內(nèi)容現(xiàn)通過引用 并入本申請文件中，從而更詳盡的說明本發(fā)明所屬技術領域的狀態(tài)。
實施例以下實施例對本發(fā)明進行了舉例說明。所屬技術領域的技術人員根據(jù)這些實施例 將知曉其它實施方案。實施例1 檢查NCAM 180(NCAM外顯子180)在各種細胞譜系中的差異表達的實驗。在不同的癌細胞系和健康對照組中對NCAM-180的差異表達進行評估，使用的已 知技術流程包括-根據(jù)標準方案進行的RNA提取和cDNA合成；以及-根據(jù)圖1所示原理進行PCR擴增以評估NCAM外顯子18的表達。作為NCAM-180的一部分，在取自神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(SH-SYSY和CCI)的細胞培養(yǎng)物 中發(fā)現(xiàn)了 NCAM外顯子18的表達，尤其是在小細胞肺癌(SCLC)細胞系中發(fā)現(xiàn)了明顯的過量 表達(圖幻。在健康對照組的外周血單個核細胞(PBMC)中沒有發(fā)現(xiàn)NCAM 180 kDa剪接變 體的表達。其它細胞系的結果如表1所示。
權利要求
1.一種檢測和/或診斷和/或分型和/或分期和/或確定受試者中肺癌的異質(zhì)性程 度的方法，該方法包括以下步驟(1)從該受試者獲取樣本；(2)確定NCAM 180或含有NCAM 外顯子18-抗原區(qū)的NCAM剪接變體的表達；以及(3)確定選自NCAM剪接變體NCAM 120或 NCAM 140;細胞角蛋白(CK)；神經(jīng)內(nèi)分泌特異性蛋白(NSP)-reticulon(RTm)；突觸囊泡蛋 白(SYPH)；嗜鉻粒蛋白A(CHGA)；甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子_1 (TITF-I) ； γ神經(jīng)元特異性烯醇化酶 (YNSE)以及熱休克蛋白_47(HSP47)中的至少一種腫瘤標志基因的表達；其中，所述基因 的表達或所述蛋白質(zhì)的存在可以檢測和/或診斷和/或分型和/或分期和/或確定所述受 試者中肺癌的異質(zhì)性程度。
2.權利要求1所述的方法，其中細胞角蛋白(CK)選自下述組中CK4、CK5、CK6(有兩 種細胞角蛋白基因 / 蛋白質(zhì)，CK6a 和 CK6b)、CK7、CK8、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17、 CK18、CK19 以及 CK20。
3.權利要求2所述的方法，其中確定至少兩種細胞角蛋白基因/蛋白質(zhì)的表達。
4.權利要求1或2所述的方法，其中確定所述CK基因/蛋白質(zhì)中至少3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13或14種的表達/存在情況。
5.權利要求1所述的方法，其中NCAM180、表達NCAM外顯子18 (NCAM-MUM外顯子，見 PCT
發(fā)明者A·梵德博爾吉特, F·C·S·拉馬克斯, F·W·法爾肯貝格, G·普馳曼, G·科洛普, H·E·梅爾, K·斯圖爾, M·哈姆斯馬, S·M·梵登艾杰德 申請人:穆比奧產(chǎn)品有限公司