非小細(xì)胞肺癌標(biāo)記物,其檢測方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種非小細(xì)胞肺癌標(biāo)記物及其應(yīng)用，尤其涉及使 用包括至少兩種選自四種在人血清/血漿中穩(wěn)定存在且可檢測的微小核糖核酸成熟體作 為非小細(xì)胞肺癌標(biāo)記物，進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了用于檢測所述非小細(xì)胞肺癌標(biāo)記物的 探針組合、試劑盒和生物芯片以及所述非小細(xì)胞肺癌標(biāo)記物的應(yīng)用，具體地，通過檢測受試 者血清中所述標(biāo)記物的表達(dá)水平和變化，達(dá)到在體外輔助診斷非小細(xì)胞肺癌，預(yù)測并發(fā)癥 發(fā)生及癌癥復(fù)發(fā)幾率，以及非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后等效果。
【背景技術(shù)】
[0002] 在全球范圍內(nèi)，肺癌是發(fā)病率和死亡率都最高的癌癥。中國的肺癌發(fā)病率高于全 球平均水平。
[0003] 根據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，2009年，在中國腫瘤登記地區(qū)，肺癌的粗發(fā)病率為54. 75/10萬(男 性為73. 12/10萬并且女性為36. 08/10萬；城鎮(zhèn)人口中為57. 96/10萬并且農(nóng)村人口中為 42. 80/10萬)。中國人口（CASR)和世界人口（WASR)的發(fā)病年齡標(biāo)準(zhǔn)化率分別為24. 98/10 萬和34. 07/10萬。在中國和城鎮(zhèn)地區(qū)，這是最常見的癌癥，在農(nóng)村地區(qū)為第二常見的癌癥。 肺癌粗死亡率為46. 07/10萬（男性為62. 47/10萬并且女性為29. 39/10萬；城鎮(zhèn)人口中為 48. 76/10萬并且農(nóng)村人口中為36. 03/10萬)。CASR和WASR的死亡率分別為20. 09/10萬 和27. 68/10萬。在男性和女性中，城鎮(zhèn)地區(qū)和農(nóng)村地區(qū)，肺癌均為癌癥死亡的首要原因。 對于肺癌的發(fā)病率和死亡率，男性高于女性，城市地區(qū)高于農(nóng)村地區(qū)。年齡特異性發(fā)病率 和死亡率表明，在50歲之前，發(fā)病率和死亡率相對較低，隨后顯著增加，并在80-84年齡組 達(dá)到峰值（Chen,W.，Zheng,R.，Zhang,S.，Zou，X.，Zhao,P.andHe,J. (2013)，Lungcancer incidenceandmortalityinChina, 2009.ThoracicCancer, 4:102 - 108. )〇
[0004] 其中，非小細(xì)胞肺癌為最常見的肺癌病理類型，約占肺癌總數(shù)的85%。而針對肺癌 來說，準(zhǔn)確的早期診斷是取得良好治療效果的關(guān)鍵。
[0005] 但是，現(xiàn)有的肺癌診斷技術(shù)仍不理想。非小細(xì)胞肺癌的傳統(tǒng)診斷方法，包括影像 學(xué)、支氣管鏡、肺組織活檢等，由于這些技術(shù)各自的局限性，在實(shí)際應(yīng)用中通常還需多項(xiàng)技 術(shù)合并使用，反復(fù)檢測。
[0006] 肺癌的影像分析診斷方法，包括超聲、胸部X線、胸部CT、PET顯像等。超聲為常規(guī) 無創(chuàng)傷性檢查，但僅對周圍型肺部腫塊的診斷效果最好。一些發(fā)病率低、早期胸部X線、CT 表現(xiàn)和臨床表現(xiàn)均缺乏特征性的病例，如細(xì)支氣管肺泡癌（BAC，NSCLC的一種)，其被誤診或 漏診的概率相當(dāng)高。為提高診斷準(zhǔn)確率，還需將纖維支氣管鏡檢查與CT引導(dǎo)下活體組織檢 查相結(jié)合使用。CT檢查的敏感度、特異度、準(zhǔn)確度都較低，其應(yīng)用的基于結(jié)節(jié)體積的判讀體 系存在局限，常導(dǎo)致誤診。PET技術(shù)存在固有缺陷，包括無法檢測腫瘤體積及其對胸壁、縱膈 及其他臨近組織的浸潤程度，故常與成熟的CT技術(shù)聯(lián)用。PET/CT聯(lián)用，方可提高敏感度、特 異度、準(zhǔn)確度。纖維支氣管鏡肺活檢被認(rèn)為是一種安全簡便的檢測肺疾病的方法，但是其對 不同病因確診率不一，對部分肺疾病也難以提供有價(jià)值的診斷信息。為彌補(bǔ)影像分析技術(shù) 的不足，還常聯(lián)用穿刺活檢技術(shù)。但穿刺活檢的診斷準(zhǔn)確率也有限，且受病變類型和部位影 響很大。
[0007] 現(xiàn)在，越來越多的疾病標(biāo)記物已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于臨床疾病的普查、診斷和療效 的監(jiān)控，但是它們的臨床應(yīng)用效果還存在著明顯不足。例如，腫瘤標(biāo)記物甲胎蛋白，乳酸脫 氫酶，癌胚抗原等已被廣泛應(yīng)用于臨床，但是這些疾病標(biāo)記物還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足對癌癥早期 診斷的需要，其主要原因有兩個(gè)方面：（1)上述疾病標(biāo)記物的靈敏度和特異性相對較低，它 們的檢測結(jié)果還不能作為疾病確診的指標(biāo)；（2)疾病的早期診斷率應(yīng)與治療的效果呈現(xiàn)正 相關(guān)，而上述任何一種疾病標(biāo)記物還難以滿足疾病的早期診斷的這種要求。以癌癥為例，由 于存在著腫瘤分化類別特異性過強(qiáng)、腫瘤整體敏感性較低、送檢標(biāo)本難以反復(fù)采取、標(biāo)本保 存要求條件高等缺陷，同時(shí)價(jià)格昂貴，因此在現(xiàn)有條件下難以廣泛推廣應(yīng)用現(xiàn)有的腫瘤標(biāo) 記物。
[0008] 目前，臨床常用的檢測肺癌的5種血清腫瘤標(biāo)志物包括NSE、pm-GRP、CYFRA21-1、 P53抗體和CEA，但即使優(yōu)化聯(lián)合使用數(shù)種標(biāo)志物，檢測的敏感性、特異性和有效性都有限。
[0009] 微小核糖核酸（microRNA，簡寫作miRNA)，是一類長約19至23個(gè)核苷酸的非編碼 單鏈小核糖核酸分子。它們在進(jìn)化上高度保守，廣泛存在于動(dòng)植物細(xì)胞中。近五年來在人 類、小鼠、大鼠等多種生物物種中鑒別出數(shù)百種微小核糖核酸分子。
[0010] 微小核糖核酸通過識(shí)別靶mRNA的3'端非翻譯序列，與之不完全互補(bǔ)，從而抑制靶 mRNA的翻譯，是mRNA強(qiáng)有力的調(diào)節(jié)因子，并在基因表達(dá)調(diào)控領(lǐng)域中起重要作用。
[0011] 微小核糖核酸與動(dòng)物的許多正常生理活動(dòng)密切相關(guān)，與許多疾病的發(fā)生及發(fā)展 存在密切聯(lián)系。疾病發(fā)生時(shí)，總有一些微小核糖核酸表達(dá)量是上調(diào)的，一些是下調(diào)的。最 近研究發(fā)現(xiàn)，慢性淋巴細(xì)胞性白血病以及Burkitt淋巴瘤中幾種微小核糖核酸的表達(dá)水 平均有不同程度的下調(diào)（LawrieCH,GalS,DunlopHMetal.Detectionofelevated levelsoftumor-associatedmicroRNAsinserumofpatientswithdiffuselarge B-celllymphoma.BrJHaematol2008; 141:672 - 675);分析比較人肺癌、乳腺癌組織中 微小核糖核酸表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)有若干組織特定的微小核糖核酸的表達(dá)水平相對于正常組織 發(fā)生了變化（GarofaloM，QuintavalleC，DiLevaGetal.MicroRNAsignaturesof TRAILresistanceinhumannon-smallcelllungcancer. 0ncogene2008)〇 也有石開究 證明微小核糖核酸影響了心肌肥厚、心衰、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展并且 與II型糖尿病等代謝性疾病有密切關(guān)聯(lián)（TryndyakVP，RossSA，BelandFA，Pogribny IP.Down-regulationofthemicroRNAsmiR-34a,miR-127,andmiR_200binrat liverduringhepatocarcinogenesisinducedbyamethyl-deficientdiet.Mol Carcinog. 20080ct21)。
[0012] 這些結(jié)果提示微小核糖核酸表達(dá)與疾病發(fā)生和發(fā)展之間存在必然聯(lián)系。微小核糖 核酸完全可以作為一類新的疾病標(biāo)志物，相比于傳統(tǒng)的病理切片或單一使用的生化指標(biāo)等 手段，能更加準(zhǔn)確地輔助診斷疾病，判斷疾病的發(fā)展階段，預(yù)測并發(fā)癥發(fā)生和惡性疾病復(fù)發(fā) 的幾率，以及疾病的預(yù)后，并評(píng)價(jià)藥效和療效。
[0013] 微小核糖核酸在作為疾病標(biāo)志物方面的優(yōu)勢，使其成為近年研究的熱點(diǎn)，相關(guān)技 術(shù)及產(chǎn)品也相繼涌現(xiàn)。
[0014] 2011年，RosettaGenomics推出了miRview衣:ilung診斷服務(wù)，該診斷技術(shù)通過 檢測受試者肺部組織樣本，對受試者所患肺癌進(jìn)行分型，以輔助制定治療方案。
[0015] 在專利號(hào)為200980148847. 1的在先申請中，公開了微小核糖核酸在血清/血漿 中穩(wěn)定存在，且可作為生物標(biāo)記物，協(xié)助診斷包括非小細(xì)胞肺癌在內(nèi)的疾病，并公開了以26 種微小核糖核酸中任意一種或多種的組合作為非小細(xì)胞肺癌輔助診斷方法的申請。但是該 申請需要使用的標(biāo)記物的種類多，相應(yīng)的探針庫比較大，并且準(zhǔn)確率還不夠理想。因此，在 該申請的基礎(chǔ)上，發(fā)明人繼續(xù)研究并形成了本申請的技術(shù)方案。與在先申請相比，本申請中 的標(biāo)記物種類大大減少，相應(yīng)的探針庫得到極大簡化，同時(shí)還能實(shí)現(xiàn)高診斷準(zhǔn)確率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016]為克服上述缺陷，本申請人將研究目光投向較易獲得，甚至常規(guī)體檢中就可以收 集到的血液。由于血液會(huì)循環(huán)至全身所有組織，并向細(xì)胞輸送營養(yǎng)并清除廢物，因此血液能 夠反映出整個(gè)機(jī)