專利名稱：一種檢測赭曲霉毒素a的無毒檢測試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種檢測赭曲霉毒素A的無毒檢測試劑盒及其檢測方法，用于糧食，伺料及其食品中赭曲霉毒素A (簡稱0TA)含量的檢測。
背景技術(shù)：
赭曲霉毒素是曲霉屬和青霉屬的某些菌種產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物。它包含7種結(jié)構(gòu)類似的化合物，其中以赭曲霉毒素A(0chratoxinA, OTA )的毒性最強(大鼠經(jīng)口 LD5。為20mg/kg)。 OTA易蓄積于組織中，其作用的主要靶器官是腎臟、肝臟，屬烈性的腎臟和肝臟毒素，實驗表明動物攝入被這種毒素污染的飼料后，會發(fā)生急性或慢性中毒癥。此外，據(jù)文獻報導(dǎo)OTA還具有致癌、致畸和致突變性。OTA的產(chǎn)毒菌株廣泛地存在于自然界中，在各種農(nóng)作物、食品、飼料和人類及動物的組織和血液中都能檢測到0TA的污染。
目前OTA的檢測主要有薄層層析法(TLC)、熒光光度計法、高壓液相色譜法(HPLC)以及質(zhì)譜聯(lián)合法等。HPLC等理化分析檢測方法可以精確地進行定性和定量分析，但是由于其設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜和對樣品的純度有較高的要求，導(dǎo)致檢測成本高、周期長，無法滿足大批量樣本快速篩查的需要，因而使用受到限制。免疫化學(xué)檢測方法具有較高的靈敏度和特異性，對樣品的純度要求不高且搡作簡單，特別適合于大批量樣本的檢測，被廣泛應(yīng)用于OTA的快速檢測。
當(dāng)前免疫學(xué)檢測方法是建立在以標(biāo)記毒素或偶聯(lián)毒素為竟?fàn)幙乖A(chǔ)上的有毒檢測體系，存在標(biāo)品毒素昂貴，進口受限，對生產(chǎn)及操作人員的健康有害以及偶聯(lián)反應(yīng)重復(fù)性差等缺陷，制約了其應(yīng)用和推廣。若能用毒素的替代品作為競爭抗原，建立無毒檢測體系，將克服上述缺陷，使之更好地為人類服務(wù)。
近年來新興的噬菌體隨機肽庫展示技術(shù)為這一問題的解決提供了新思路。該技術(shù)是以一組隨機多肽編碼序列插入噬菌體展示載體，形成噬菌體展示文庫。每個噬菌體粒子只展示一種序列的外源肽鏈，不同噬菌體粒子展示不同序列的外源肽鏈?？刹捎糜H和選擇方法，高效挑選出能與配體分子相結(jié)合的噬菌體，并利用這些噬菌體再感染大腸桿菌，擴增。還可從重組噬菌體DM中切出外源基因再克隆到其它宿主細(xì)胞中，經(jīng)表達以獲得大量外源基因產(chǎn)物。利用噬菌體隨機肽庫確定蛋白質(zhì)抗原的表位、篩選蛋白質(zhì)抗原模擬表位的技術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)相當(dāng)成熟，其在非蛋白質(zhì)抗原模擬表位的應(yīng)用已初現(xiàn)端倪。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種健康安全的用于檢測赭曲霉毒素A的試劑盒及其檢測方法，用于糧食，飼料及食品中赭曲霉毒素A含量的檢測。
本發(fā)明主要采用免疫分析方法來檢測0TA。主要包括采用噬菌體展示庫技術(shù)淘選出能模擬出與抗赭曲霉毒素A單克隆抗體特異性結(jié)合的噬菌體粒子，以此粒子替代赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品，用競爭ELISA的方法來檢測OTA;運用了單克隆抗體技術(shù)制備出抗赭曲霉毒素A單克隆抗體。
本發(fā)明所述的試劑盒是由96或48孔包被板、緩沖液、赭曲霉毒孝A標(biāo)準(zhǔn)替代物、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗M13酶標(biāo)二抗、洗滌液、顯色液組成。
本發(fā)明所述的赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)替代物是從噬菌體展示七肽庫(Ph. D,7TMPhageDisplay Peptide Library Kit,購自New England Biolabs公司)中淘選得到的嗡菌體粒子，具有能和抗赭曲霉毒素A單克隆抗體特異性結(jié)合的特征，其外殼蛋白含有特征性結(jié)合抗赭曲霉毒素A單克隆抗體的氨基酸順序，氨基酸共有序列為異亮氨酸-
精氨酸-脯氨酸-蛋氨酸-纈氨酸-x-X, X為任意氨基酸。
具體地說，由以下步驟組成
(1) 抗OTA單克隆抗體包被于酶標(biāo)板，封閉液封閉后用鹽酸洗滌液洗滌，洗滌完畢后每孔加入噬菌體肽庫，室溫下結(jié)合后再用TBS洗滌，每孔加入洗脫液洗脫。
(2) 中和洗脫液后留一部分作滴度測定，其余加到接種有& co// ER2738的LB培養(yǎng)液中進行擴增培養(yǎng)。
U)測完滴度后，再進行數(shù)次親和篩選。每次加入的噬菌體量保持相同，包被的抗體量分別減少，洗滌液中Tween-20的濃度逐步增加，其余步驟與第一輪篩選相同。
(4) 最后一輪篩選后的洗脫產(chǎn)物經(jīng)滴度測定后，用滅菌牙簽挑選藍色噬菌斑，分別置于接種有處于對數(shù)生長前期的￡ co7/ER2738的LB培養(yǎng)液中進行擴增培養(yǎng)、純化并測定滴度。
(5) ELISA鑒定特異性結(jié)合的陽性噬菌體克隆，用原始肽庫包板作為陽性對照，單抗包板加原始肽庫作陰性對照，單抗包板加PBST作空白對照。按測試樣品OD值與參考陰性0D值的比值(S/N) > 2. 1判斷為陽性。
(6) 將陽性克隆用無菌牙簽挑出，置入LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)液中進行擴增培養(yǎng)、擴增、純化、測序，溶于TBST中，用于試劑盒以替代OTA毒素標(biāo)準(zhǔn)品。
所述抗OTA單克隆抗體的制備由以下步驟組成
OTA溶解于四氫吹喃中，加入NHS (N-羥基琥祐酰亞胺)和DCC(N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺)，室溫反應(yīng)，離心去沉淀，上清真空干燥得活化產(chǎn)物，活化產(chǎn)物溶解于二甲基亞砜中，緩慢滴入KLH溶液中。室溫下振蕩，得到OTA與蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，同樣可將OTA與BSA (牛血清白蛋白)偶聯(lián)得檢測人工抗原OTA-KLH。
用弗氏完全佐劑與OTA-KLH (血藍蛋白)免疫原充分乳化，達到油包水抗原乳化劑，取此油包水抗原乳化劑，在BALB/C小鼠皮下多點注射，在免疫三到四次后，取小鼠脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP20型進行細(xì)胞融合，選陽性克隆進行再次克隆化，得到分泌抗赭曲霉毒素A的單克隆抗體細(xì)胞株,用此細(xì)胞株注射到BALB/C小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)腹水，純化后得抗赭曲霉毒素A單克隆抗體。
本發(fā)明所述的包被板的制備NaHC(V溶液將抗赭曲霉毒素A單克隆抗體稀釋作為包被液，包被于酶標(biāo)板上，2-8匸過夜，棄包被液，千凈紙上拍千，洗板，加脫脂牛奶的緩沖液封閉，棄封閉液，真空抽干，密封后置于-2(TC冷凍保存。
本發(fā)明所述的試劑盒的檢測方法取包被有抗赭曲霉毒素A單克隆抗體的微孔包被板，加入赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)替代物及樣品到各自的微孔中輕微震蕩，洗滌液洗滌，再加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗M13酶標(biāo)二抗，進行標(biāo)記免疫反應(yīng)，顯色，2MH2S04終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀下測量各自的吸光值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中的OTA含量。
本發(fā)明的有益效果該試劑盒結(jié)構(gòu)簡單、不含有對人體健康有危害作用的赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品、使用方便、快速、成本低廉、靈敏度高，可以達到150pg/mL以上。


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附圖為本發(fā)明赭曲霉毒素A無毒ELISA試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實施例方式
實施例1制備試劑盒和檢測玉米樣品
運用噬菌體展示庫技術(shù)淘選出能模擬出與抗赭曲霉毒素A單克隆抗體特異性結(jié)合
的噬菌體粒子。
赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)替代物淘選過程
1、 抗OTA單克隆抗體100ul U00iag/ml) 4。C包被過夜，3%脫脂牛奶4°C封閉2h,用Tris-鹽酸洗滌液(TBST, 50 mM Tris—HC1 pH 7. 5, 150mMNaCl， 0. l%Tween20 )洗滌6次，每孔加入噬菌體肽庫100nl，室溫下結(jié)合lh,再用TBST洗滌10次，每孔加入洗脫液(Gly-HCL pH2. 2) 100 n 1洗脫。
2、 中和洗脫液后留一部分作滴度測定，其余加到20ml接種有處于對數(shù)生長前期的￡ ^//ER2738的LB培養(yǎng)液中進行擴增培養(yǎng)，37。C震蕩培養(yǎng)4. 5h后，4。C 10000r/min離心10min，上清液加入1/6體積的聚乙二醇沉淀劑(PEG/ NaCl), 4°C沉淀過夜。4°C 10000r/min離心15min,去上清，再用1 ml TBST懸浮^菌體，加入1/6體積的PEG /NaCl冰上孵育60 min。 4°C離心15min，去上清，沉淀用200 p 1 TBST懸浮。
3、 測滴度后，進行第二次、第三次和第四次親和篩選。每次加入的噬菌體量都為2xl()Upfu，包被的抗體量分別為75、 50和25)jg/ml， TBST中Tween20的濃度增至
0. 5%,其余步驟與第一輪篩選相同。
4、 第4輪篩選后的洗脫產(chǎn)物經(jīng)滴度測定后，用滅菌牙簽從總量不到IOO個噬菌斑的平板上挑選37個藍色噬菌斑，分別置1 ml接種有處于對數(shù)生長前期的ER2738的LB培養(yǎng)液中進行擴增培養(yǎng)、純化并測定滴度。
5、 ELISA鑒定特異性結(jié)合的陽性嗛菌體克隆，抗OTA單克隆抗體100ML/孔(10Mg/ml) 4。C包被過夜，3y。脫脂牛奶封閉后加入TBST系列稀釋的噬菌體，每孔100jn
1, 37°C lh,用PBST洗滌6次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗M13單克隆抗體(100Ml/孔);37。C作用lh,洗滌6次。鄰苯二胺(0PD)顯色，2M貼04終止反應(yīng)，測定492nm波長光密度(OD值)。用原始肽庫包板作為陽性對照，單抗包板加原始肽庫作陰性對照，單抗包板加PBST作空白對照。按測試樣品OD值與參考陰性O(shè)D值的比值(S/N) > 2. 1判斷為陽性。6、將陽性克隆用無菌牙簽挑出，置入LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)液中進行擴增培養(yǎng)、擴增、純化、測序，溶于TBST中，用于試劑盒?？筄TA單克隆抗體的制備
0TA 2mg溶解于0. 5ml四氫吹喃中，加入2mg NHS和3mg DCC，室溫反應(yīng)24小時，10000rpm離心15分鐘去沉淀，上清真空干燥得活化產(chǎn)物，活化產(chǎn)物溶解于0. 5 ml 二甲基亞砜(DMSO)中，緩慢滴入KLH溶液中(15 mg溶于2 ml 0. 13 M NaHC03 ) 室溫下振蕩反應(yīng)4小時，得到OTA與蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，同樣可將OTA與BSA偶聯(lián)得檢測人工抗原OTA-KLH，反應(yīng)結(jié)束后，0. 01MPBS4。C透析72小時。偶聯(lián)產(chǎn)物進行紫外掃描，根據(jù)其在280mn, 379nm的吸光值和OTA的摩爾消光系數(shù)分析測定OTA偶聯(lián)產(chǎn)物的摩爾比。
用弗氏完全佐劑500uL與OTA-KLH 100ug充分乳化，達到油包水抗原乳化劑，取此油包水抗原乳化劑，在BALB/C小鼠皮下多點注射，在免疫三到四次后，取小鼠脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP20型進行細(xì)胞融合，選陽性克隆進行再次克隆化，得到分泌抗赭曲霉毒素A的單克隆抗體細(xì)胞株，用此細(xì)胞株注射到BALB/C小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)腹水，純化后得抗赭曲霉毒素A單克隆抗體。
包被板的制備
用0. 1 M的NaHC03溶液將抗赭曲霉毒素A單克隆抗體稀釋到10y g/mL作為包被液，在96孔包被板上每孔100uL,輕微震蕩，混勻41C過夜，棄包被液，干凈紙上拍干，沖洗6次，加1.5'/i(W/V)脫脂牛奶的緩沖液(2) 37'C封閉l小時，棄封閉液，真
空抽干，密封后置于-20i:冷凍保存。
試劑的配制
緩沖液的配制TBS: 50 raM Tris-HCl(pH 7.5)、 150 mM NaCl。洗滌液的配制含0. 5"/。(V/V)吐溫20的TBS， TBS (50 mM Tris-HCl (pH 7. 5) 、 150mM NaCl)。
顯色液的配制需新鮮配置，40mg鄰苯二胺、100mL50mM檸檬酸鈉溶液(pH7.4)、500U LHA
試劑盒提供的試劑
每個試劑盒中的材料足夠進行96次測量，盒中的材料如下
(1) lx96孔板(8條xl2孔，可以拆分為單孔)包被有抗OTA單克隆抗體。
(2) lx赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)替代物(溶于TBST) 10mL, 2xl012 pfu/mL。
(3) lx辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗M13酶標(biāo)二抗，50uL。
(4) lx緩沖液，50mL， lx洗滌液，500mL。
(5) lx鄰苯二胺，40mg， lx檸檬酸鈉緩沖液(pH 7.4) 100mL。具體檢測步驟
樣品的處理取玉米樣品，粉碎后用二倍體積的70%甲醇提取樣品，渦旋振蕩10min， 5000g離心10min后定性濾紙過濾，加入同等體積的TBS稀釋，備用。取包被有抗赭曲霉毒素A單克隆抗體的微孔包被板，加入赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)替代物及樣品各5(HiL到各自的微孔中，37'C反應(yīng)1小時，用洗滌液洗6次，每次1分鐘，加入用緩沖液l: 5000稀釋的辣根過氧化物酶(服P)標(biāo)記的抗M13酶標(biāo)二抗，37。C輕微震蕩反應(yīng)l小時，用洗滌液洗6次，每次l分鐘，加入顯色液IOO叱每孔，37'C顯色15分鐘，2MH2S04， 50uL每孔終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀下測量各自的-吸光值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線(附圖)計算樣品中的OTA含量。
實施例2制備試劑盒
抗OTA單克隆抗體的制備同實施例l
赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)替代物淘選同實施例l
包被板的制備
用0. 1 M的NaHCOr溶液將抗赭曲霉毒素A單克隆抗體稀釋到10 Pg/mL作為包被液，在48孔包被板上每孔100ixL，輕微震蕩，混勻4'C過夜，棄包被液，干凈紙上拍干，沖洗6次，加1.5。/。(W/V)脫脂牛奶的緩沖液(2) 37。C封閉1小時、，棄封閉液，
真空抽干，密封后置于-2ox:冷凍保存。
試劑的配制
緩沖液的配制TBS: 50 raM Tris-HCl(pH 7.5)、 150 mM NaCl。洗滌液的配制含0. 5。/UV/V)吐溫20的TBS， TBS (50 raM Tris-HC1 (pH 7. 5) 、 150mM NaCl)。
顯色液的配制需新鮮配置，40mg鄰苯二胺、100mL50mM檸檬酸鈉溶液(pH7.4)、500uLH202
試劑盒提供的試劑
每個試劑盒中的材料足夠進行96次測量，盒中的材料如下(1) lx48孔板(4條xl2孔，可以拆分為單孔)包被有抗OTA單克隆抗體。(2 ) 1 x赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)替代物(溶于TBST ) 10mL, 2 x 1012 pfu/mL。
(3) 1 x辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗M13酶標(biāo)二抗，50ML。
(4) lx緩沖液，50mL, lx洗滌液，500mL。
(5) lx鄰苯二胺，40mg, lx檸檬酸鈉緩沖液(pH 7.4) 100mL。實施例3制備試劑盒
抗OTA單克隆抗體的制備同實施例l赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)替代物淘選同實施例l包被板的制備
用0.1 M的NaHC03溶液將抗赭曲霉毒素A單克隆抗體稀釋到100u g/mL作為包被液，在96孔包被板上每孔10G吣，輕微震蕩，混勻4。C過夜，棄包被液，干凈紙上拍干，沖洗6次，
加1.5。/。(W/V)BSA的緩沖液37'C封閉l小時、，棄封閉液，真空抽干，密封后置于-2(TC冷凍保存。實施例4檢測飼料樣品
試劑盒提供的試劑與實施例l相同，用于檢測飼料樣品。
具體檢測步驟如下
先將飼料樣品處理取伺料樣品，粉碎后用二倍體積的70%甲醇提取樣品，渦旋振蕩10min, 5000g離心10min后定性濾紙過濾，加入同等體積的TBS稀釋，備用。
取包被有抗赭曲霉毒素A單克隆抗體的微孔包被板，加入赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)替代物及樣品各50uL到各自的微孔中，37'C反應(yīng)1小時，用洗滌液洗6次，每次1分鐘，加入用緩沖液l: 5000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗M13酶標(biāo)二抗，37。C輕微震蕩反應(yīng)l小時，用洗滌液洗6次，每次1分鐘，加入顯色液IOOML每孔，37TC顯色15分鐘，2M H2S04, 50uL每孔終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀下測量各自的吸光值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線(附圖)計算樣品中的OTA含量。
權(quán)利要求
1、一種檢測赭曲霉毒素A的無毒檢測試劑盒，其特征是由96或48孔包被板、緩沖液、赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)替代物、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗M13酶標(biāo)二抗、洗滌液、顯色液組成。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是所述的赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)替代物是從噬菌體展示七肽庫中淘選得到的噬菌體粒子，其外殼蛋白含有特征性結(jié)合抗赭曲霉毒素A單克隆抗體的氨基酸順序，氨基酸共有序列為異亮氨酸-精氨酸-脯氨酸-蛋氨酸-纈氨酸-X-X, X為任意氨基酸。
3、 一種用權(quán)利要求1所述的試劑盒檢測赭曲霉毒素A的方法，其特征是取包被有抗赭曲霉毒素A單克隆抗體的微孔包被板，加入赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)替代物及樣品到各自的微孔中輕微震蕩，洗滌液洗滌，再加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗M13酶標(biāo)二抗，進行標(biāo)記免疫反應(yīng)，顯色，2M H2S(^終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀下測量各自的吸光值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中的赭曲霉毒素A含量。
全文摘要
一種檢測赭曲霉毒素A的無毒檢測試劑盒及其檢測方法，屬生物技術(shù)領(lǐng)域，試劑盒由96或48孔包被板、緩沖液、赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)替代物、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗M13酶標(biāo)二抗、洗滌液、顯色液組成；檢測時，取包被有抗赭曲霉毒素A單克隆抗體的微孔包被板，加入赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)替代物及樣品到各自的微孔中輕微震蕩，洗滌液洗滌，再加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗M13酶標(biāo)二抗，進行標(biāo)記免疫反應(yīng)，顯色，2M H₂SO₄終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀下測量各自的吸光值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中的赭曲霉毒素A含量。本發(fā)明試劑盒結(jié)構(gòu)簡單、不含有對人體健康有危害作用的赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品、使用方便、快速、成本低廉、靈敏度高，可以達到150pg/mL以上。
文檔編號G01N33/52GK101566628SQ20091011546
公開日2009年10月28日 申請日期2009年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月1日
發(fā)明者何慶華, 劉仁榮, 夏 許, 楊 許 申請人:南昌博恒生物制品有限公司