專利名稱：一種三聚氰胺配基的瓊脂糖親水吸附色譜介質(zhì)的合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種色譜介質(zhì)的合成方法，具體地是涉及一種三聚氰胺配基的瓊脂糖 親水吸附色譜介質(zhì)的合成方法。
本發(fā)明屬于生物工程的生化分離領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
生物藥物生產(chǎn)過程中分離純化的費用占成本的絕大部分，其中使用最普遍的是色 譜技術(shù)及其組合，目前所用介質(zhì)主要是凝膠過濾、離子交換、疏水相互作用、親和、 反相介質(zhì)，其基質(zhì)材料有瓊脂糖、葡聚糖、聚苯乙烯和硅膠等。瓊脂糖介質(zhì)是在生物 藥物生產(chǎn)中使用最為廣泛的基質(zhì)材料。它是一種天然多糖，具有高孔度；具有高的連 通性有效保證了分子內(nèi)物質(zhì)傳遞；大比表面積提供很高的吸附能力；易制備成不同瓊 脂糖濃度、不同尺寸的球形顆粒以滿足不同領(lǐng)域的需求；低的非特異性吸附使應(yīng)用面 較廣；在氫氧化鈉中穩(wěn)定可滿足苛刻的在位清洗步驟；可通過交聯(lián)使介質(zhì)具有剛性； 可被大量配基取代而應(yīng)用于多種色譜技術(shù)。
瓊脂糖介質(zhì)已經(jīng)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域被使用了 40余年，利用瓊脂糖基質(zhì)介質(zhì)生產(chǎn)的生 物藥物種類繁多，例如，干擾素、人生長激素、人血清白蛋白、胰島素、促紅細胞 生成素、各種單克隆抗體和疫苗等。這些產(chǎn)品的開發(fā)和生產(chǎn)有助于保障公共衛(wèi)生安全、 提高人民生活質(zhì)量。美國公司GE Healthcare Bio-Sciences (原Pharmacia,瑞典)的瓊 脂糖介質(zhì)產(chǎn)品均獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局的認證，表明瓊脂糖基質(zhì)具有優(yōu)異的安 全性和可靠性。瓊脂糖介質(zhì)5.7億美元約120萬升的世界市場被該公司控制了 60%， 而我國生物制藥所使用的瓊脂糖介質(zhì)98%以上依賴進口，每年約耗資5億元人民幣， 隨著生物藥物需求的快速增長、新生物藥物種類的增加，對瓊脂糖基質(zhì)介質(zhì)的需求也 將迅猛增長。目前國內(nèi)有一些企業(yè)、研究院所及高校從事該介質(zhì)的研究開發(fā)，但產(chǎn)品 種類少、質(zhì)量穩(wěn)定性較差、市場占有率非常低，是我國生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展急待解決的戰(zhàn)略問題。
氫鍵吸附色譜屬于親水相互作用色譜的一種，是近年來在中藥活性成分分離純化 研究過程中提出的概念，常用的氫鍵吸附色譜介質(zhì)包括瓊脂糖凝膠和聚酰胺，已成功 應(yīng)用于多種中藥多酚類化合物的分離純化，對強極性有機小分子化合物能夠?qū)崿F(xiàn)較好 的保留，可分離獲得高純度的中藥活性成分。
瓊脂糖凝膠適于作為氫鍵色譜吸附劑。目前國內(nèi)外市場上沒有專用的瓊脂糖基質(zhì) 氫鍵吸附色譜介質(zhì)。
30 pm平均粒徑的瓊脂糖凝膠微球因粒徑小，剛性不足，為了能將其灌裝工業(yè)色 譜柱，需要通過交聯(lián)提高剛性。國內(nèi)外瓊脂糖介質(zhì)產(chǎn)品因其主要用于生物大分子蛋白 質(zhì)的分離純化，大多介質(zhì)粒徑在60-120 pm，采用一步或兩步交聯(lián)即可，本項目的純 化目標是分子量明顯低于蛋白質(zhì)的多肽，需要更高的分辨率，也就要求更小的微球粒 徑， 一步或兩步交聯(lián)提供的剛性不能完全滿足本項目的需要。
從檢出文獻看，國內(nèi)已有多家單位采用瓊脂糖為基質(zhì)制備色譜柱填料，如中科 院過程所、北京化工大學、清華大學、中國藥科大學、北京理工大學、上海醫(yī)藥工業(yè) 研究院、北京大學、中科院生物物理所、南京醫(yī)科大學、中科院大連化物所、北京北 清創(chuàng)業(yè)科技開發(fā)有限公司、西安交大保賽生物技術(shù)股份有限公司、北京東凱元醫(yī)藥生 物技術(shù)研究院等。但我國目前瓊脂糖基質(zhì)介質(zhì)產(chǎn)品的種類少、市場占有率低，98%以 上的國內(nèi)市場被國外產(chǎn)品占據(jù)，研制具有自主知識產(chǎn)權(quán)的瓊脂糖介質(zhì)是急待解決的戰(zhàn) 略問題。
瓊脂糖凝膠介質(zhì)表面有大量可供反應(yīng)的羥基，可以通過直接法、間接法引入高密 度的配基，作為親水吸附色譜的分離介質(zhì)。三聚氰胺分子量小，有3個氨基可供參與 氫鍵形成，是親水吸附色譜的良好供體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種以高濃度、高交聯(lián)度瓊脂糖凝膠微球為基質(zhì)，制備具 有高剛性的、高選擇性的、以三聚氰胺為配基的親水吸附色譜分離材料的合成方法。 用于多酚蛋白質(zhì)、親水性多肽和天然有機小分子的分離純化。
本發(fā)明的目的是通過如下的技術(shù)方案實現(xiàn)的。
本發(fā)明提供的使用以高濃度、高交聯(lián)度瓊脂糖凝膠為基質(zhì)、以三聚氰胺為配基的親水吸附介質(zhì)的合成方法，包括如下步驟
1) 12%濃度、30 pm平均粒徑瓊脂糖凝膠微球100 ml,在砂芯漏斗上用水洗后替 換成丙酮，轉(zhuǎn)入反應(yīng)瓶或反應(yīng)器，加100ml丙酮；
2) 加入10-30 g縮水甘油醚，攪拌60-120 min;
3) 加入3ml的20。/。氫氧化鈉，攪拌8-12h;
4) 加丙酮攪拌l-2h;
5) 用5倍體積的丙酮洗10-20 min，用5倍體積的水洗10-20 min;
6) 加200ml水，加入5-15g硫酸鈉，攪拌2-3 h;
7) 加入3ml的20。/。氫氧化鈉，攪拌l-2h;
8) 加入10-30 ml表氯醇，35-60 。C攪拌3-5 h;
9) 用5倍體積的水洗；
10) 加入200ml水，加5-15g硫酸鈉，攪拌2-3 h;
11) 加入3 ml的20%氫氧化鈉，攪拌1-2 h;
12) 加入30-60 ml表氯醇，35-60 。C攪拌10-15 h;
13) 用IO倍體積的水洗；
14) 加入3 ml的20%氫氧化鈉，攪拌1-2 h;
15) 加入10-20 ml烯丙基溴攪拌6-8 h;
16) 用鹽酸調(diào)pH4-6;
17) 加入5-10ml溴水，攪拌2-3h;
18) 加入3-10g三聚氰胺，10-20ml的20氫氧化鈉，攪拌12-20h;
19) 用鹽酸調(diào)pH4-6;
20) 用IO倍體積水洗。


圖1為三聚氰胺結(jié)構(gòu)式
圖2為三聚氰胺配基的瓊脂糖凝膠親水吸附色譜介質(zhì)純化胸腺五肽的色譜圖(色 譜峰3為胸腺五肽)。
圖3為三聚氰胺配基的瓊脂糖凝膠親水吸附色譜介質(zhì)純化丹參水提取物的色譜圖。
具體實施例方式
實施例1、三聚氰胺配基的瓊脂糖凝膠親水吸附色譜介質(zhì)合成方法1
1) 12%濃度、30 pm平均粒徑瓊脂糖凝膠微球100 ml，在砂芯漏斗上用水洗后替 換成丙酮，轉(zhuǎn)入反應(yīng)瓶或反應(yīng)器，加100ml丙酮；
2) 加入10g縮水甘油醚，攪拌60min;
3) 加入3ml的20。/。氫氧化鈉，攪拌8h;
4) 加丙酮攪拌lh;
5) 用5倍體積的丙酮洗10 min，用5倍體積的水洗10 min;
6) 加200ml水，加入5g硫酸鈉，攪拌2h;
7) 加入3ml的20%氫氧化鈉，攪拌lh;
8) 加入10ml表氯醇，35-60。C攪拌3h;
9) 用5倍體積的水洗；
10) 加入200ml水，加5g硫酸鈉，攪拌2h;
11) 加入3 ml的20%氫氧化鈉，攪拌1 h;
12) 加入30ml表氯醇，35-60 。C攪拌10 h;
13) 用IO倍體積的水洗；
14) 加入3 ml的20%氫氧化鈉，攪拌1 h;
15) 加入10 ml烯丙基溴攪拌6 h;
16) 用鹽酸調(diào)pH4;
17) 加入5ml溴水，攪拌2h;
18) 加入3g三聚氰胺，10-20ml的20氫氧化鈉，攪拌12h;
19) 用鹽酸調(diào)pH6;
20) 用IO倍體積水洗。
實施例2、三聚氰胺配基的瓊脂糖凝膠親水吸附色譜介質(zhì)合成方法2
1) 12%濃度、30 pm平均粒徑瓊脂糖凝膠微球100 ml，在砂芯漏斗上用水洗后替 換成丙酮，轉(zhuǎn)入反應(yīng)瓶或反應(yīng)器，加100ml丙酮；
2) 加入30g縮水甘油醚，攪拌120min;3) 加入3ml的20%氫氧化鈉，攪拌12h;
4) 加丙酮攪拌2h;
5) 用5倍體積的丙酮洗20min，用5倍體積的水洗20 min;
6) 加200ml水，加入15g硫酸鈉，攪拌3h;
7) 加入3ml的20%氫氧化鈉，攪拌2h;
8) 加入10-30 ml表氯醇，40。C攪拌5h;
9) 用5倍體積的水洗；
10) 加入200ml水，加15g硫酸鈉，攪拌3h;
11) 加入3 ml的20%氫氧化鈉，攪拌2 h;
12) 加入60 ml表氯醇，35 °C攪拌15 h;
13) 用IO倍體積的水洗；
14) 加入3 ml的20%氫氧化鈉，攪拌2 h;
15) 加入20ml烯丙基溴攪拌8h;
16) 用鹽酸調(diào)pH6;
17) 加入10ml溴水，攪拌3h;
18) 加入10g三聚氰胺，20ml的20氫氧化鈉，攪拌20 h;
19) 用鹽酸調(diào)pH6;
20) 用IO倍體積水洗。
權(quán)利要求
1、一種以三聚氰胺為配基、以高濃度、高交聯(lián)度瓊脂糖凝膠為基質(zhì)的親水吸附色譜介質(zhì)的合成方法。
2、 如權(quán)利要求l所述的以三聚氰胺為配基、以高濃度、高交聯(lián)度瓊脂糖凝膠為基質(zhì)的親水吸附色譜介質(zhì)的合成方法，包括如下的步驟1) 12%濃度、30 pm平均粒徑瓊脂糖凝膠微球100 ml，在砂芯漏斗上用水洗后替 換成丙酮，轉(zhuǎn)入反應(yīng)瓶或反應(yīng)器，加100ml丙酮；2) 加入10-30 g縮水甘油醚，攪拌60-120 min;3) 加入3ml的20n/。氫氧化鈉，攪拌8-12h;4) 加丙酮攪拌l-2h;5) 用5倍體積的丙酮洗10-20 min，用5倍體積的水洗10-20 min;6) 加200ml水，加入5-15g硫酸鈉，攪拌2-3h;7) 加入3ml的20。/。氫氧化鈉，攪拌l-2h;8) 加入10-30 ml表氯醇，35-60 。C攪拌3-5 h;9) 用5倍體積的水洗；10) 加入200ml水，加5-15g硫酸鈉，攪拌2-3 h;11) 加入3 ml的20%氫氧化鈉，攪拌1-2 h;12) 加入30-60 ml表氯醇，35-60 。C攪拌10-15 h;13) 用IO倍體積的水洗；14) 加入3 ml的20%氫氧化鈉，攪拌1-2 h;15) 加入10-20 ml烯丙基溴攪拌6-8 h;16) 用鹽酸調(diào)pH4-6;17) 加入5-10ml溴水，攪拌2-3h;18) 加入3-10g三聚氰胺，10-20ml的20氫氧化鈉，攪拌12-20 h;19) 用鹽酸調(diào)pH4-6;20) 用IO倍體積水洗。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以三聚氰胺為配基、以高濃度、高交聯(lián)度瓊脂糖凝膠為基質(zhì)的親水吸附色譜介質(zhì)的合成方法。高濃度、高交聯(lián)度瓊脂糖凝膠介質(zhì)表面有高密度的可供反應(yīng)的羥基，用烯丙基溴活化，與溴水反應(yīng)，加入三聚氰胺作為配基，所制備的介質(zhì)在親水吸附反應(yīng)中作為氫鍵供體。本合成方法制備的介質(zhì)剛性強，配基密度高，選擇性強，適宜分離多酚蛋白質(zhì)、親水性多肽和天然有機小分子。
文檔編號G01N30/56GK101504398SQ20091008031
公開日2009年8月12日 申請日期2009年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月19日
發(fā)明者孟桂鳳, 邢思亮 申請人:北京康銘優(yōu)盛生化技術(shù)有限公司