專利名稱：：三聚氰胺快速免疫檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及免疫檢測領域，具體地說，是涉及一種三聚氰胺快速免疫檢測試劑盒。
背景技術：
：三聚氰胺(英文名Melamine),是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機化合物，重要的氮雜環(huán)有機化工原料。三聚氰胺最主要的用途是作為生產三聚氰胺甲醛樹脂(MF)的原料。由于食品和飼料工業(yè)蛋白質含量測試方法的缺陷，三聚氰胺也常被不法商人用作食品添加劑，以提升食品檢測中的蛋白質含量指標，因此三聚氰胺也被人稱為"蛋白精"。蛋白質主要由氨基酸組成，其含氮量一般不超過30%,而三聚氰胺的分子式含氮量為66%左右。通用的蛋白質測試方法"凱氏定氮法"是通過測出含氮量來估算蛋白質含量，因此，添加三聚氰胺會使得食品的蛋白質測試含量偏高，從而使劣質食品通過食品檢驗機構的測試。但是食用添加了三聚氰胺的食品，會導致中毒和腎結石。2007年，美國爆發(fā)寵物食品受污染事件。事后調查表明摻雜了^6.6%三聚氰胺的小麥蛋白粉是寵物食品導致中毒的原因。2008年9月，中國爆發(fā)三鹿嬰幼兒奶粉受污染事件，導致食用了受污染奶粉的嬰幼兒產生腎結石病癥，其原因也是奶粉中含有三聚氰胺。2007年美國寵物飼料事件以及2008年三鹿奶粉事件發(fā)生之后，世界各國和地方政府對于食品和寵物飼料的三聚氰胺的檢測趨于高度重視?，F有的三聚氰胺檢測方法有高效液相色譜紫外檢測法(HPLC-UV)和氣相色譜-質譜(GC-MS)法。色譜技術是非常有效、準確、敏感的方法，但是待檢樣品要經過一系列的預處理，繁瑣費時，檢測費用很高。另外這些檢測方法的靈敏度受樣品的凈化、濃縮等步驟的影響較大，再者這些方法需要昂貴復雜的儀器，需要特定的專業(yè)技術人員才能應用，而且每次檢測樣品有限，不適應大量標本的篩查，也不適合現場快速的檢測?；诳乖贵w免疫反應的免疫學檢測技術為三聚氰胺的分析檢測提供了一個新的途徑。在公開號為CN101206233A的中國專利里面，提到一種"一種檢測三聚氰胺的直接竟爭法酶聯免疫試劑盒"，以及在公開號為CN101183105A的中國專利里面，提到一種"一種檢測三聚氰胺的酶聯免疫試劑盒"，它們都采用酶聯免疫吸附測定法(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,ELISA)4企測三聚氰胺。ELISA法檢測三聚氰胺，雖具有靈敏度高的優(yōu)勢，但也存在檢測時間長，需要專業(yè)的設備及專業(yè)人員操作，不能實現質量檢測部門在現場對待檢產品的檢測，也不夠快速便捷。三聚氰胺的快速診斷檢測試劑盒則能夠實現上述目的。目前，此類產品還未見報道。
發(fā)明內容發(fā)明目的本發(fā)明的目的就是為了解決目前三聚氰胺的檢測方法所存在的時間長，需要專業(yè)的設備及專業(yè)人員操作，不能實現快速、便捷的檢測等問題，提供一種三聚氰胺快速免疫檢測試劑盒。發(fā)明詳述一種三聚氰胺免疫^r測試劑盒，該試劑盒包含偶聯蛋白的三聚氰胺、三聚氰胺抗體，以其中之一成分包被固相支持物而另一成分結合納米顆粒標記物，采用竟爭法的方式來進行檢測。本發(fā)明的三聚氰胺免疫檢測試劑盒采用的檢測方法可以是免疫層析法或者免疫滲濾法。當采用免疫層析法時，采用偶聯蛋白的三聚氰胺包被固相支持物而三聚氰胺抗體結合納米顆粒標記物，也可以是采用三聚氰胺抗體包被固相支持物而偶聯蛋白的三聚氰胺結合納米顆粒標記物，本發(fā)明優(yōu)選第一方案。當采用免疫滲濾法時，采用三聚氰胺抗體包被固相支持物而偶聯蛋白的三聚氰胺結合納米顆粒;標記物。本發(fā)明的三聚氰胺免疫檢測試劑盒，其中的三聚氰胺抗體可以是單抗或者多抗，本發(fā)明優(yōu)選單抗。本發(fā)明的三聚氰胺免疫檢測試劑盒，其采用的納米顆粒標記物包括膠體金屬、分散型染料和染料標記的微球、乳膠。當采用膠體金屬時，可以選擇膠體金、膠體銀、膠體硒其中的一種，或者它們其中兩者以上的組合物。因為三聚氰胺是小分子化合物，本身沒有免疫原性，必需將其與大分子載體蛋白偶聯得到具有免疫原性的人工抗原。按照小分子類單克隆抗體的一4殳制備方式進行，將三聚氰胺分子分別偶聯不同的惰性蛋白，這些惰性蛋白可以選自卵清蛋白(OVA)、牛血清白蛋白(BSA)、血藍蛋白(KLH)等，偶聯之后，經過純化，獲得三聚氰胺-惰性蛋白偶聯物。優(yōu)選方案選取一種三聚氰胺-惰性蛋白偶耳關物(本發(fā)明優(yōu)選三聚氰胺-KLH)作為免疫原免疫小鼠，融合骨髓瘤細胞，用另外一種三聚氰胺-惰性蛋白偶聯物(本發(fā)明優(yōu)選三聚氰胺-OVA)包被ELISA板，用間接ELISA法來篩選雜交瘤細胞抹，經過多次的亞克隆之后，選出最好的三聚氰胺單克隆抗體雜交瘤細胞^^朱，生產和純化三聚氰胺單克隆抗體。制備合適顆粒大小的膠體金，隨后將其與三聚氰胺單克隆抗體標記，標記好的三聚氰胺單克隆抗體-膠體金標記物，浸泡或噴點玻璃纖維，凍干，制成金標墊。將三聚氰胺-惰性蛋白偶聯物(本發(fā)明優(yōu)選三聚氰胺-OVA偶聯物)，以及抗鼠二抗(本發(fā)明優(yōu)選羊抗鼠IgG抗體)，稀釋到工作濃度，固定在固相載體上面，本發(fā)明優(yōu)選用劃線儀劃到硝酸纖維素濾膜(NC膜)上面，千燥。這兩條線分別作為檢測線(T線)和質控線(C線)。按照小分子檢測的竟爭法免疫層析試劑盒的一般制備方式，將上述金標墊、包被好的硝酸纖維素膜以及吸水紙、聚酯板、樣品墊等輔料組裝成三聚氰胺金標檢測試劑盒，并配備標準比色卡作為檢測時的參照。樣品在檢測之前，需要預處理對于奶粉或者飼料，稱取0.2g樣品，加入裝有2mL60%曱醇/水溶液的A管中，并攪拌至溶液均勻。將裝有上述溶液的A管反復搖動lmin，靜置10min，然后12000rpm離心10分鐘。用塑料吸管小心吸取上層液體，然后滴加1滴(約50UL)到裝有0.95mL10%曱醇/20mMPBS溶液的B管中，蓋上管子，充分混勻，用新的塑料吸管吸取該樣品溶液，滴加2滴到試劑盒的樣品孔中進行檢測。加樣之后，室溫反應20分鐘，將T線顏色深度跟標準比色卡對照，結果判定標準如下①陽性當C線顯示出紅色線條，而T線不顯色時；或者當C線顯示出紅色線條，T線顏色淺于標準比色卡時，判為陽性。②陰性當C線顯示出紅色線條，T線同時顯示出紅色線條，且T線顏色接近或者深于標準比色卡時，判為陰性。③無效當C線不顯示出紅色線條，則無論T線顯示出紅色線條與否，該試紙卡判為無效。發(fā)明優(yōu)點本發(fā)明的試劑盒與現有的HPLC-UV和GC-MS檢測法以及ELISA檢測法相比，具有方便、快捷的優(yōu)勢，可以節(jié)省檢測時間，提高效率，降低成本，節(jié)約人力物力。本發(fā)明的檢測靈敏度可以達到50ppb水平，不低于液相色譜法的靈敏度。具體實施例方式本發(fā)明的目的、特征及優(yōu)點將結合實施例，作進一步詳細闡述。應當中未注明具體條件之處，通常按照免疫層析法或者免疫滲濾法的常規(guī)實驗條件，或者試劑盒生產廠家推薦的方法進行，在此不必贅述。實施例l三聚氰胺單克隆抗體的制備1.1三聚氰胺-KLH偶聯物、三聚氰胺-OVA偶聯物的制備預先準備化學試劑:三聚氰胺(Melamine,Sigma-Aldrich公司，貨號240818);氯霉素琥珀酸鈉(CAP-SU,Chloramphenicolsuccinatesodiumsalt,FM=445.2，Sigma-Aldrich公司，貨號C3787);N-羥基丁二酰亞胺(NHS，N-hydroxysuccinimide,MW=115.09,Sigma-Aldrich公司，貨號13067-2);1一乙基一(3一二曱基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC，l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochloride(CgHi7N3xHCl),MW=191.7，Sigma-Aldrich公司)；PB緩沖液(0.1Msodiumphosphatebuffer,pH7.4)。偶聯步驟如下稱取三聚氰胺63.06mg(0.5mmol)溶于5ml吡。定溶液中，加入琥珀酸酐50mg室溫攪拌反應6小時，旋轉蒸發(fā)除去吡啶，得到粘稠液體。以乙酸乙酯洗滌后再旋轉蒸發(fā)干。將上步反應產物(0.5mmol)溶解于6ml去離子水中；稱取80mg(0.7mmo1)NHS溶于2ml去離子水中；155mg(0.8mmo1)EDC溶于2ml去離子水中；將NHS、EDC溶液分別加入攪拌中的上步產物水溶液中。室溫攪拌20-30min,過程中用6N的HCl/NaOH調節(jié)，保持pH5-5.5。將KLH約180mg(0.5umo1)或OVA約22.5mg(0.5umo1)溶于2ml0.1MPBS中，在攪拌中逐滴加入0.2-1.6ml的上步反應液。室溫攪拌反應2小時后靜置于4度過夜。最后，以0.02MPB7.4透析此偶聯物粗品，將上述三聚氰胺-KLH偶聯物或者三聚氰胺-OVA偶耳關物粗品過經5倍柱體積的PBS平衡過的SephadexG-25M層析柱(Pharmacia公司，貨號17-0851-01)，收集三聚氰胺-KLH偶聯物或者三聚氰胺-OVA偶聯物的峰。1.2三聚氰胺的免疫將三聚氰胺-KLH偶聯物溶液用PBS透析之后，用PBS稀釋到1.0mg/ml作為免疫原，與福氏完全佐劑(Sigma-Aldrich公司，貨號F5881)等體積混合，并充分乳化，背皮下注射免疫6周齡的純系BALB/c小鼠，劑量50pg/只。2周后，將免疫原與福氏不完全佐劑(Sigma公司，貨號F5506)等體積混合，并充分乳化，腹腔注射，劑量50嗎/只。2周后，將免疫原不加佐劑，腹腔注射，劑量50pg/只。第三次免疫后7天，取小鼠尾血，分離血清，用三聚氰胺-OVA偶聯物10pg/ml包被96孔ELISA板(深圳金杣華實業(yè)有限公司輻照酶標板)，間接ELISA法測定效價，效價高于1:10000即可用于融合。融合前3天，第四次免疫，將免疫原不加佐劑，尾靜脈注射，50pg/只。1.3抗三聚氰胺單克隆抗體細胞林制備準備融合前一周復蘇小鼠骨髓瘤細胞Sp2/0(ATCC,貨號CRL-1581)，用含10%胎牛血清(HyClone公司，貨號SH30406.01)的1640培養(yǎng)基(GIBCO公司，貨號23400-021)培養(yǎng)。融合前24h^!巴細胞濃度調至3xl05/mL。次日收集骨髓瘤細胞，1200g離心5min，用無血清培養(yǎng)基洗滌3次，細胞計數。處死免疫小鼠，取出脾臟，制備成細胞懸液，用無血清培養(yǎng)基洗滌3次，細胞計數，取&108脾細胞，和2><107骨髓瘤細胞混合，用50%PEG1500(Roche產品，貨號12809400)融合，在HAT培養(yǎng)基(GIBCO公司，貨號400639)上選擇培養(yǎng)雜交瘤。1.4三聚氰胺單克隆抗體細胞林的篩選融合后培養(yǎng)第10天，各取lOOjxl的融合細胞培養(yǎng)上清液，加入到96孔ELISA板孔中，其中每孔包被有l(wèi)Opg/ml的三聚氰胺-OVA偶聯物。反應在37。C進行1小時，然后用含有0.05%的Tween20的PBS(洗滌液)洗滌5次，在各孔中加入1:5000稀釋的HRP標記的羊抗小鼠IgG抗體(Sigma-Aldrich公司，貨號A4416)。反應在37度進行30min小時，用上述洗滌液洗板5次，然后每孔加入含0.5%。過氧化氫尿素(生工，貨號UB1753)、4.76。/6o三水合乙酸鈉、0.9°/。。水醋酸的顯色劑A及含0.32%oTMB(生工，貨號TB0514)、5mM檸檬酸、0.5mMEDTA-2Na、5%甲醇、2%0二曱基甲酰氨的顯色劑B各50pl，37。C避光顯色30分鐘。每孔加50[11,含2M硫酸的終止液終止反應，酶標儀4僉測每孔450nm波長。檢測陽性值較高的，換液次日重新檢測，經過多次亞克隆篩選，選取一林最好的能穩(wěn)定分泌抗三聚氰胺的雜交瘤細胞抹5E8，進行下一步工作。1.5三聚氰胺單克隆抗體的制備與純化取8周齡BALB/c小鼠，腹腔注射液體石蠟(國藥集團化學試劑，貨號30139828)0.5mL/只。1周后腹"空注射"106個三聚氰胺單克隆抗體雜交瘤細胞林5E8。接種細胞7天后采集腹水，3000g離心10min,取上清用0.01MpH7.4的PBS稀釋3倍。按照Pharmacia公司提供的單克隆抗體純化方案，樣品經FPLC系統(tǒng)上ProteinA免疫親和層析柱，pH2.8甘氨酸洗脫。收集特異性蛋白峰流出液，立即用pH9.0的Tris溶液矯正至pH7.0,過濾除菌后分裝，于-8CTC保存。實施例2三聚氰胺單克隆抗體-膠體金偶聯物的制備2.1膠體金溶液制備在三角燒瓶中加入100ml超純水，磁力加熱攪拌器上加熱至沸騰，加入lml1%氯金酸(Sigma-Aldrich公司，貨號16961-25-4)溶液,沸騰后立刻加入lml1%檸檬酸三鈉(Sigma-Aldrich公司，貨號6132-04-3)水溶液，繼續(xù)沸騰10分鐘，然后自然冷卻即制備成膠體金溶液。2.2膠體金標記取10ml上述膠體金放入燒杯中，攪拌中加入150|il的0.2M&2(:03調節(jié)pH至7.0,繼續(xù)攪拌20秒；加入一定量的三聚氰胺單克隆抗體，繼續(xù)攪拌30分鐘；加入0.1ml10%BSA，繼續(xù)攪拌5分鐘；5000g離心10分鐘，吸出上清，將沉淀收集至一合適容器；對上清再用10000g離心15分鐘，重復第一次離心的操作；對上清再用12000g離心30分鐘，棄掉上清，將三次離心的沉淀收集到同一離心管中，用膠體金稀釋液(20mMPB,150mMNaCl，1%BSA，0.1%TritonX-100,2%Sucrose,0.01%Proclin300)定容至lml此即三聚氰胺單克隆抗體-膠體金標記物。實施例3三聚氰胺快速診斷試劑盒的組裝3.1金標墊制備將上述三聚氰胺單克隆抗體-膠體金偶聯物用膠體金稀釋液(20mMPB，150mMNaCl，1%BSA，0.1%TritonX-100,2%Sucrose,0.01%Proclin300)IO倍稀釋后浸泡或噴點玻璃纖維(Watman公司)，凍干，即制成金標墊。3.2硝酸纖維素膜(NC)膜包被用檢測線稀釋液(10mMPBS+2。/。蔗糖)稀釋三聚氰胺-OVA偶聯物至0.5mg/ml制成檢測線(T線)工作液，用同一稀釋液稀釋羊抗鼠IgG多抗至0.5mg/ml制成對照線工作液，用點膜儀將這兩種工作液劃到硝酸纖維素膜(MilIipore公司，貨號HF135002)的相應位置上，37度干燥1小時。3.3三聚氰胺檢測試劑盒組裝將上述金標墊、包被好的硝酸纖維素膜以及吸水紙、聚酯板、樣品墊等輔料組裝成三聚氰胺檢測試劑盒。實施例4三聚氰胺快速診斷試劑盒的檢測4.1樣品的預處理對于奶粉或者飼料，稱取0.2g樣品，加入裝有2mL60o/c)曱醇/水溶液的A管中，并攪拌至溶液均勻。將裝有上述溶液的A管反復搖動lmin，靜置10min，然后12000rpm離心10分鐘。用塑料吸管小心吸取上層液體，然后滴加1滴(約50UL)到裝有0.95mL10。/。曱醇/20mMPBS溶液的B管中，蓋上管子，充分混勻。此稀釋的樣品可直接用于試驗。4.2檢測方式力口100pl預處理好的樣品到樣品墊處，室溫放置20分鐘之后，判定結果。結果判定標準如下①陽性當C線顯示出紅色線條，而T線不顯色時；或者當C線顯示出紅色線條，T線顏色淺于標準比色卡時，判為陽性。陽性結果表明三聚氰胺含量超過50ng/g(50ppb)。②陰性當C線顯示出紅色線條，T線同時顯示出紅色線條，且T線顏色接近或者深于標準比色卡時，判為陰性。陰性結果表明三聚氰胺含量低于50ng/g(50ppb)。③無效當C線不顯示出紅色線條，則無論T線顯示出紅色線條與否，該試紙卡判為無效。4.3標準品檢測將三聚氰胺(Melamine,Sigma-Aldrich公司，貨號240818)用60%甲醇/水溶液稀分別釋到0.2、0.5、1、2、4、10、20、40、100、200、400、1000、2000ug/L，分別對應為1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10000ppb原始濃度(因為按照本發(fā)明的樣品預處理方式，相當于將樣品預稀釋了200倍。)，之后按照本發(fā)明的試劑盒的樣品預處理和檢測標準操作步驟，來檢驗本發(fā)明的試劑盒靈敏度。結果發(fā)現，1、2、5、10ppb時，為陰性結果；20ppb時，與標準比色卡對比，顏色深度差異不明顯；50ppb時，與標準比色卡對比，顏色淺，差異明顯；100ppb及其以上的樣品，T線都無條帶出現，如表l所示表1本發(fā)明的試劑盒才企測三聚氰胺標準品三聚氰胺濃度(ppb)12510205010020050010002000500010000本發(fā)明試劑盒4企測結果--一一+++++++++++++++++++++結果備注-為陰性；士為不確定；十為弱陽性；++為中陽性；+++為強陽性。結果說明，本發(fā)明的試劑盒靈敏度可以達到50ppb。4.4實際檢測選市場上幾種產品，按照本發(fā)明的試劑盒標準操作步驟檢驗，其結果如表2所示表2本發(fā)明的試劑盒實際檢測結果產品企業(yè)產品名稱批號國家質4t總局結果(ppb)本發(fā)明的試劑盒結果石家莊三鹿集較大嬰兒及幼兒200807021504000+++<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>結果說明，本發(fā)明的試劑盒，其檢測結果和國家質檢總局的檢測結果基本符合。權利要求1.一種三聚氰胺免疫檢測試劑盒，該試劑盒包含偶聯蛋白的三聚氰胺、三聚氰胺抗體，其特征在于以其中之一成分包被固相支持物而另一成分結合納米顆粒標記物，采用競爭法的方式來進行檢測。2.根據權利要求1的三聚氰胺免疫檢測試劑盒，其采用的檢測方法為免疫層析法或者免疫滲濾法。3.根據權利要求2的三聚氰胺免疫檢測試劑盒，其中免疫層析法是采用偶聯蛋白的三聚氰胺包被固相支持物而三聚氰胺抗體結合納米顆粒標記物，也可以是采用三聚氰胺抗體包被固相支持物而偶聯蛋白的三聚氰胺結合納米顆粒標記物，優(yōu)選第一方案。4.根據權利要求2的三聚氰胺免疫檢測試劑盒，其中免疫滲濾法是采用三聚氰胺抗體包被固相支持物而偶聯蛋白的三聚氰胺結合納米顆粒標記物。5.根據權利要求1-4中任一項的三聚氰胺免疫檢測試劑盒，其中的三聚氰胺抗體可以是單抗或者多抗。6.根據權利要求1-4中任一項的三聚氰胺免疫檢測試劑盒，其特征在于所述的納米顆粒標記物包括膠體金屬、分散型染料和染料標記的微球、乳膠。7.根據權利要求6的三聚氰胺免疫檢測試劑盒，其特征在于所述的膠體金屬為膠體金、膠體銀、膠體硒其中的一種，或者它們其中兩者以上的組合物。全文摘要一種三聚氰胺免疫檢測試劑盒，該試劑盒包含偶聯蛋白的三聚氰胺、三聚氰胺抗體，以其中之一成分包被固相支持物而另一成分結合納米顆粒標記物，采用競爭法的方式來進行檢測。本發(fā)明的三聚氰胺免疫檢測試劑盒與現有的HPLC-UV和GC-MS檢測法以及ELISA檢測法相比，具有方便、快捷的優(yōu)勢，可以節(jié)省檢測時間，提高效率，降低成本，節(jié)約人力物力。文檔編號G01N33/543GK101363850SQ20081021640公開日2009年2月11日申請日期2008年9月24日優(yōu)先權日2008年9月24日發(fā)明者何志強,孫興寶,鵬崔,亮彭,菲曹,李泓彥,鵬胡,顏文豪申請人:深圳市菲鵬生物股份有限公司