專利名稱：可以高效率地檢索5-羥色胺6受體配體的可穩(wěn)定表達ha-5-ht6r的細胞系的制作方法
可以高效率地檢索5-羥色胺6受體配體的可穩(wěn)定表達 HA-5-HT6R的細胞系
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種5-羥色胺6受體(5-HT6R)配體高效率檢索方法。背景技術(shù)：
5-羥色胺受體(5-HTR)包括5-ffl\R到5_HT7R的各種亞型，目前為止被發(fā)現(xiàn)的種 類共有15種，被認為與抑郁癥、精神分裂癥、焦慮癥(anxiety)及睡眠障礙等精神疾病及阿 爾茨海默病等有關(guān)。 其中，5-HTeR是最近探索出鹽基序列的5-HTR，雖然還沒有研究出其機制，但被 認為涉及到退化性腦疾病與精神疾病之類的疾病。根據(jù)最近的研究報告顯示，5-HTeR的 剌激在生物化學及行動學方面可以呈現(xiàn)出類似于抗抑郁劑的效果，而且各種報告均指 出腦發(fā)育(brain development)、記憶禾口學習(learning and memory)及老年癡呆癥 (Alzheimer disease)等很多重大腦部疾病都與其有密切關(guān)系(Grimaldi B et al.， Na皿ynSchmiedebergs Arch Pharmacol. 357 (4) :393-400,1999 ;Garcia-AllozaM et al.， Neuropsychopharmacology 29 (2) :410-416，2004 ;Lorke D etal. ， BMC Neurosci. 27 ; 7-36,2006 ;Greengard et al. ， J Neurosci. 27(15) :4201-4209，2007)。 以5-HTR作為 作用點的藥物包括非選擇性地結(jié)合于一切5-HTR的氯氮平(clozapine)，選擇性地結(jié)合于 5-HTeR的藥物為SB258585，但還無法作為疾病的治療劑使用。在研究抑郁癥或阿爾茨海默 病等疾病時，由于人們對于5-HTeR在腦細胞的具體功能及5-HTeR參與的信號傳達機制幾乎 沒有任何認識，為了研究其功能與機制并選擇性地開發(fā)配體，需要具備可以選擇性地研究 5_HT6R的系統(tǒng)。 本發(fā)明人們制作出可以表達出HA (Hemagglutinin)被連接到N端(N-terminal) 的5-HT6R的細胞系，上述HA-5-HT6R暴露于細胞表面外部，可以穩(wěn)定表達上述HA-5-HT6R并 維持上述5-HT6R的活性，確認了上述細胞系可以在5-HT6R的選擇性配體的開發(fā)過程中進行 高效率檢索。

發(fā)明內(nèi)容發(fā)明需要解決的技術(shù)問題
本發(fā)明的目的是提供一種可以穩(wěn)定表達5_HT6R的細胞系。 本發(fā)明的另一個目的是提供一種基于上述細胞系的5_HT6R配體高效率檢索方法。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種包含上述細胞系的5-HT6R配體高效率檢索用組 成物。解決問題的技術(shù)方案
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種含有N端連接HA (Hemagglutinin)的5_HT6R
基因構(gòu)建體的載體(vector)被轉(zhuǎn)導到宿主細胞而穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的細胞系。本發(fā)明提供的5-HTeR配體高效率檢索方法包括下列步驟步驟l，利用受檢化合物處理本發(fā)明穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的細胞系； 步驟2，檢查上述經(jīng)過處理的細胞系的5-HT6R活性；及 步驟3，和未經(jīng)過處理的細胞系進行比較，篩選出可以在上述細胞系中增加或減少 5-HT6R活性的受檢化合物。
本發(fā)明提供的5-HTeR配體高效率檢索方法包括下列步驟步驟l，利用受檢化合
物處理本發(fā)明穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的細胞系； 步驟2，精制上述經(jīng)過處理的細胞系的蛋白質(zhì)； 步驟3，測定上述經(jīng)過精制的蛋白質(zhì)的5-HT6R活性；及 步驟4，和未經(jīng)過處理的細胞系進行比較，篩選出可以在上述細胞系中增加或減少 5-HT6R活性的受檢化合物。 本發(fā)明還提供包含本發(fā)明穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的細胞系的5-HT6R配體高效率檢 索用組成物。 下面說明本發(fā)明所使用的術(shù)語。 術(shù)語"5_HT6R配體"表示結(jié)合在5_HT6R而調(diào)節(jié)活性的物質(zhì)。
下面詳細說明本發(fā)明。 本發(fā)明提供一種通過含N端連接HA (Hemagglutinin)的5_HT6R基因構(gòu)建體的載 體被轉(zhuǎn)導到宿主細胞而穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的細胞系。 在本發(fā)明的較佳實施例中，把含有HA基因與取自人類絨毛膜癌細胞系的5_HT6R 基因連接而成的HA-5-HT6R構(gòu)建體的載體(參照圖1)轉(zhuǎn)導到人胚腎細胞系(human embryonic kidney cell line ;HEK293細胞系)。利用PCR方法對特異表達HA-5-HT6R基 因的細胞系進行篩選后(參照圖2a)，把上述選定轉(zhuǎn)基因細胞系從第一代培養(yǎng)到第六代。 然后利用PCR方法驗證各代的HA-5-HT6R基因是否出現(xiàn)特異表達(參照圖2b)。檢查結(jié) 果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的細胞系可穩(wěn)定表達HA-5-HT6R，2008年09月12日把上述經(jīng)過驗證的細胞 系寄托到韓國細胞系研究基金會(Korean Cell Line ResearchFoundation)(寄托編號 KCLRF-BP-00187)。 在本發(fā)明的較佳實施例中，按照時間順序?qū)Ρ景l(fā)明穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的細胞系 進行了5_羥色胺(5-HT)處理，確認了 ERK(Extracellular signal-regulated kinases) 的磷酸化增加(參照圖3a)，可知上述細胞系所表達的HA-5-HT6R在細胞內(nèi)部正常地發(fā)揮功 能。上述細胞系受到5-HT與EMD386088的剌激后增加了 ERK的磷酸化現(xiàn)象，SB258585則 減少其效果(參照圖3b)。把可以表達嵌合體Gal5蛋白質(zhì)的載體與脂質(zhì)體基因感染到本 發(fā)明穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的細胞系后利用5_HT給與剌激，然后再與表達5_HT6R的細胞系 的細胞內(nèi)部鈣流入情形進行比較，確定HA-連接沒有改變5-HT6R的功能(參照圖5a及圖 5b)，還確定了上述活性具有5-HT濃度依賴性(參照圖5c)。 在本發(fā)明的較佳實施例中，分別在HA及大韓民國公開專利第2008-0004994號確 認為5-HT6R的結(jié)合蛋白質(zhì)的Fyn使用特異抗體，可以觀察到本發(fā)明穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的 細胞系細胞膜內(nèi)部的5-HT6R的N端所連接的HA位于細胞表面的外部(參照圖4a)，可以在 細胞膜觀察到HA-5-HT6R(參照圖4b及圖4c)。 在本發(fā)明的較佳實施例中，對于本發(fā)明穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的細胞系與臨時表 達HA-5-HT6R的細胞系的細胞內(nèi)部鈣流入情形進行比較后發(fā)現(xiàn)，由于本發(fā)明穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的細胞系可以穩(wěn)定表達HA-5-HT6R，因此其實驗重現(xiàn)性優(yōu)于臨時表達的細胞系 (參照圖6)。本發(fā)明的細胞系是寄托編號為KCLRF-BP-00187的可穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的細胞系。 上述HA在細胞系以連接5-HT6R的形態(tài)表達并位于細胞表面的外部，可以利用上 述HA選擇性地檢查表達在細胞表面的5-HT6R。 上述轉(zhuǎn)導可以在下列方法中選擇一個方法后進行在脂質(zhì)體(Lipofectamine)、 Dojindo公司的Hilymax、 Fugene、 jetPEI、 Effectene及DreamFect所組成的群中選 擇某一商業(yè)化的轉(zhuǎn)導用試藥的方法；利用磷酸鈣(calcium-phosphate)、正電荷型高分 子、微脂粒、納米粒子、核轉(zhuǎn)染(皿cleofection)、電穿孔法(electroporation)、熱沖擊 (heatshock)、磁珠轉(zhuǎn)染(magnetofection)的方法；以及利用反轉(zhuǎn)病毒的方法。
本發(fā)明提供的5_HT6R配體高效率檢索方法包括步驟l，利用受檢化合物處理本 發(fā)明穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的細胞系； 步驟2，測定上述經(jīng)過處理的細胞系的5-HT6R活性；及 步驟3，和未經(jīng)過處理的細胞系進行比較，篩選出可以在上述細胞系中增加或減少 5-HT6R活性的受檢化合物。 在本發(fā)明的較佳實施例中，本發(fā)明穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的細胞系中細胞膜內(nèi)部 的5-HT6R的N端所連接的HA位于細胞表面的外部(參照圖4a)，可以在細胞膜觀察到 HA-5-HT6R(參照圖4b及圖4c)。 在本發(fā)明的較佳實施例中，把穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的細胞系的細胞內(nèi)部鈣流入情 形與表達5-HT6R的細胞系進行比較，確定HA-連接沒有改變5-HT6R的功能(參照圖5a及 圖5b)，還確定了上述活性具有5-HT濃度依賴性(參照圖5c)。 在本發(fā)明的較佳實施例中，對于可穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的細胞系與臨時表 達HA-5-HT6R的細胞系的細胞內(nèi)部鈣流入情形進行比較后發(fā)現(xiàn)，由于本發(fā)明穩(wěn)定表達 HA-5-HT6R的細胞系可以穩(wěn)定表達HA-5-HT6R，因此其實驗重現(xiàn)性優(yōu)于臨時表達的細胞系 (參照圖6)。 本發(fā)明穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的細胞系利用位于細胞表面外部的HA選擇性地檢查
表達在細胞表面上的5-HT6R，因此可以有效地運用到5-HT6R配體的高效率檢索作業(yè)。 步驟1的受檢化合物以天然化合物、合成化合物、RNA、 DNA、多肽、酶、蛋白質(zhì)、配
體、抗體、抗原、細菌或真菌的代謝產(chǎn)物及生物活性分子較佳，但不限于此。 步驟2在測定5_HT6R活性時可以采取通過5_HT6R測定細胞內(nèi)部鈣濃度流入情形
的方法，但不限于此。此時測定細胞內(nèi)部鈣濃度流入情形的目標細胞系可以在進行受檢化
合物的處理之前先利用表達嵌合體G。^蛋白質(zhì)的載體與脂質(zhì)體進行基因感染。 本發(fā)明5_HT6R配體高效率檢索方法包括下列步驟步驟1，利用受檢化合物處理
本發(fā)明穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的細胞系； 步驟2，上述經(jīng)過處理的細胞系的蛋白質(zhì)精制步驟；
步驟3，測定上述經(jīng)過精制的蛋白質(zhì)的5-HT6R活性；及 步驟4，和未經(jīng)過處理的細胞系進行比較，篩選出可以在上述細胞系中增加或減少 5-HT6R活性的受檢化合物。
在本發(fā)明的較佳實施例中，利用5-HT， EMD386088及SB258585剌激本發(fā)明穩(wěn)定表 達HA-5-HT6R的細胞系后，確定了上述轉(zhuǎn)基因細胞系所表達的HA-5-HT6R在細胞內(nèi)部發(fā)揮 正常功能(參照圖3a及圖3b)。 在本發(fā)明的較佳實施例中，本發(fā)明穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的細胞系中細胞膜內(nèi)部 的5-HT6R的N端所連接的HA位于細胞表面的外部(參照圖4a)，可以在細胞膜觀察到 HA-5-HT6R(參照圖4b及圖4c)。 本發(fā)明穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的細胞系利用位于細胞表面外部的HA (HA)選擇性地
檢查表達在細胞表面上的5-HT6R，因此可以有效地運用到5-HT6R配體的高效率檢索作業(yè)。 步驟1的受檢化合物以天然化合物，合成化合物，RNA， DNA，多肽，酶、蛋白質(zhì)、配
體、抗體、抗原、細菌或真菌的代謝產(chǎn)物及生物活性分子較佳，但不限于此。 步驟2的5_HT6R活性測定不限于此，但可以利用測定上述5_HT6R所磷酸化的ERK
的方法進行測定。 本發(fā)明還可以提供包含本發(fā)明穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的細胞系的5-HT6R配體高效 率檢索用組成物。 在本發(fā)明的較佳實施例中，本發(fā)明穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的細胞系中細胞膜內(nèi)部 的5-HT6R的N端所連接的HA位于細胞表面的外部(參照圖4a)，可以在細胞膜觀察到 HA-5-HT6R(參照圖4b及圖4c)。 在本發(fā)明的較佳實施例中，確定HA-連接沒有改變5_HT6R的功能(參照圖5a及圖 5b)，還確定了上述活性具有5-HT濃度依賴性(參照圖5c)。在本發(fā)明的較佳實施例中，由 于本發(fā)明細胞系可以穩(wěn)定表達HA-5-HT6R，因此其實驗重現(xiàn)性優(yōu)于臨時表達的細胞系(參 照圖6)。本發(fā)明穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的細胞系利用位于細胞表面外部的HA (HA)選擇性地 檢查表達在細胞表面上的5-HTeR，因此可以作為5-HT6R配體高效率檢索用組成物使用。
本發(fā)明的細胞系是寄托編號為KCLRF-BP-00187的可穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的細胞系。 上述組成物可以另外添加Gal5基因、脂質(zhì)體、熒光鈣標記物及洗滌緩沖液，上述熒 光型f丐標記物可以使用對f丐濃度敏感的Fluoro-4/AM與普朗尼克(Pluronic)F-127等。
發(fā)明效果
本發(fā)明的細胞系可以穩(wěn)定地表達HA-5-HT6R，進而提高選擇性地作用在5-HT6R的 配體的檢索效率，對于和5-HT6R結(jié)合的蛋白質(zhì)研究做出貢獻。本發(fā)明可以有效地預防及診 斷出5-HTeR相關(guān)抑郁癥、阿爾茨海默之類的腦疾病及精神疾病，進而開發(fā)出其治療劑。


圖1是包括N端連接HA的人類5_HT6R基因在內(nèi)的質(zhì)體的序列圖。 圖2是利用逆轉(zhuǎn)錄PCR方法檢查HA-5-HT6R轉(zhuǎn)導的細胞系的結(jié)果 a :HA-5-HT6R轉(zhuǎn)導的細胞系的篩選；及 b :從Pl到P6對穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的鑒定。 圖3是本發(fā)明的HA-5-HT6R被轉(zhuǎn)導的HEK293細胞系的HA-5-HT6R的功能檢查結(jié) 果圖
6
a :5-羥色胺(5-HT)的剌激所造成的ERK磷酸化；及b :5-HT6R的活性劑5-HT及EMD386088及對抗藥SB258585的效果確認。 圖4是本發(fā)明的HA-5-HT6R被轉(zhuǎn)導的HEK293細胞系的細胞表面的HA-5-HT6R表
達形態(tài)分析結(jié)果(整體在細胞內(nèi)部及表面檢查表達形態(tài)) a :5-HT6R的N端所連接的、位于細胞表面外部的HA的模式圖； b :Fyn過表達之前的Fyn及HA-5-HT6R的分布；及 c :Fyn過表達時的Fyn及HA-5-HT6R的分布. 圖5是本發(fā)明的細胞系表達的HA-5-HT6R的功能沒有被HA_連接影響的鑒定結(jié) 果 a :細胞內(nèi)部f丐量的變化；b :細胞內(nèi)部f丐量的平均；及
c :HA-5-HT6R的濃度-依存活性。 圖6是臨時或穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的細胞系的重現(xiàn)性差異圖。發(fā)明的具體實施方式
下面詳細描述本發(fā)明的較佳實施例。 但下列實施例僅為本發(fā)明的舉例，本發(fā)明的內(nèi)容不受下列實施例的限定。
〈實施例1>轉(zhuǎn)基因細胞系的制備
〈1-1>野生型細胞系的培養(yǎng) 在含有10%胎牛血清及1 %青霉素/鏈霉素(v/v)的 DMEM(Dulbecco， smodified-Eagle' s medium)培養(yǎng)池上以37°C，5% C02的加濕條件培養(yǎng) HEK293細胞系(ATCC CRL 1573)。上述培養(yǎng)液3-4日交換一次，細胞則每星期進行一次傳 代培養(yǎng)(sub-culture)。把上述HEK293細胞系涂敷在10cm培養(yǎng)皿上5. OX 106左右后培養(yǎng) 12小時。 〈l-2〉HA-5-HT6R細胞系的制備 禾U 用BglII限制酶處理HA-5-HT6R-pcDNA3. 1 (+)質(zhì)體(圖1; MissouriS&T cDNA Resource Center, USA)而使其線性化后，以1 : 3的比率(線 性化的HA_5_HT6R_pcDNA3. 1 (+) 12ii g， Lipofectamine 36 yl)禾口 Lipofectamine 2000(Invitrogen， USA) —起投入Opti-MEM(Invitrogen， USA)培養(yǎng)池并混合5分鐘，30 分鐘后把上述混合液投入培養(yǎng)皿使細胞系發(fā)生基因感染。6小時后利用匿EM培養(yǎng)池更換 培養(yǎng)池，再培養(yǎng)細胞24小時后添加800iig/ml的G418(Invitrogen， USA)篩選出轉(zhuǎn)基因 細胞。選擇性地培養(yǎng)14天后，分別在24孔板針對已形成了集落的細胞群進行傳代培養(yǎng) (subculture)使其成長，篩選出成長速度最快的細胞群，得到了可穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的 細胞系。得到了穩(wěn)定的細胞系后，逐漸降低G418濃度后在添加了 400i! g/ml的培養(yǎng)池里進 行培養(yǎng)。 〈l-3〉5-HTeR細胞系的制備 利用5-HT6R_pcDNA3. 1 (+)質(zhì)體(Missouri S&T cDNA ResourceCenter，USA)按照 實施例1-2的方法得到轉(zhuǎn)基因的細胞系。
〈實施例2>轉(zhuǎn)基因細胞系的確認
〈2-1>轉(zhuǎn)基因細胞系的篩選 把實施例1-2中得到的轉(zhuǎn)基因細胞系按照各集落區(qū)分后在DMEM培養(yǎng)池以37°C、5% C02細胞培養(yǎng)池培養(yǎng)，然后使用三環(huán)唑試藥分離RNA。利用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶制備cDNA，使用序列號為1的正向引物(forwardprimer) (5' -CCACTCTTCATGCGGGACTTC-3)及序列號為2的逆向引物(5' -TCAGTTCGTGGGGATGCCAAG-3')放大HA-5-HT6R基因。對照組則使用序列號為3的正向引物(5' -GTCACCAACTGGGACGACATG-3')及序列號為4的逆向引物(5'-GCCGTCAGGCAGCTCGTAGC-3')放大P-actin基因。PCR條件為，在95"C進行預變異4分鐘后，以95°CT 1分鐘、6(TC下30秒鐘、72t:下30秒鐘的順序反復進行30次，最后在72°C的溫度下反應10分鐘，然后在4t:下冷卻。 其結(jié)果為，如圖2a所示得到了可以特異放大HA-5-HT6R基因(363bp)的細胞系(lane 1)。 〈2_2>可穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的轉(zhuǎn)基因細胞系的鑒定 每3-4日就為按照實施例2-1的方法培養(yǎng)出來的細胞系更換一次培養(yǎng)液，每星期進行一次傳代培養(yǎng)而在42天內(nèi)得到l(Pl)到6(P6)代，在使用之前一直在-7(TC的溫度下妥善保管。對照組則使用了野生型細胞系的1到6代。 利用上述方法到的細胞系按照實施例2-1的方法得到RNA，形成cDNA，放大HA-5-HT6R基因。對照組則放大P -actin基因。 其結(jié)果如圖2b所示，可以在Pl到P6特異放大HA-5-HT6R基因。2008年09月12日把上述經(jīng)過驗證的細胞系寄托到韓國細胞系研究基金會(KoreanCell Line ResearchFoundation)(寄托編號KCLRF-BP-00187)。
〈2_3>可以臨時表達HA-5-HT6R的轉(zhuǎn)基因細胞系的制備 以1 : 3的比率把HA-5-HT6R-pcDNA3. 1 (+)質(zhì)體與Lipofectamine2000 一起投入0pti-MEM培養(yǎng)池并混合5分鐘，30分鐘后把上述混合液投入培養(yǎng)皿使細胞系發(fā)生基因感染。6小時后利用DMEM培養(yǎng)池更換培養(yǎng)池，再培養(yǎng)細胞24小時后制成可以臨時表達HA-5-HT6R的轉(zhuǎn)基因細胞系?！磳嵤├?>HA-5-HT6R的細胞信號傳達過程分析 〈3-1>對于5_HT6R的活性劑5_羥色胺(5-HT)的反應性檢查 〈3-l-l〉5-HT處理 在含有無血清DMEM培養(yǎng)池的6_孔培養(yǎng)皿里把按照實施例2的方法篩選的、可穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的轉(zhuǎn)基因細胞系以IX 106細胞/孔分注后進行培養(yǎng)。3小時后，按照預設(shè)為0 60分鐘的間隔(0， 1，5， 15，30及60分鐘)處理20 ii M 5_HT (Sigma， USA)。
〈3_l_2>Western免疫印跡(Western blot) 針對各5-HT的處理時間而收集試料，把上述細胞保管在-20°C的溫度下，然后和包含蛋白質(zhì)酶抑制齊U (protease inhibitor, CompleteMini， Roche Diagnostics GmbH，Germany)的冰涼RIPA溶解緩沖液(upstate biotechnology, USA) —起投入均質(zhì)化器加以粉碎后進行均質(zhì)化。均質(zhì)化的試料以13， 000rpm的轉(zhuǎn)速進行離心分離10分鐘，使上層清液與不溶型凝集物分離。分離后的上層清液的蛋白質(zhì)濃度通過伯樂蛋白定量試劑盒(Bio-Rad protein assay kit,Bio-Rad，USA)進行測定。以l : 4的比率混合上層清液與5XSDS(0.156M Tris-HCl，pH 6. 8， 2. 5% SDS， 37. 5%甘油，37. 5mM DTT)后在10(TC的溫度下煮10分鐘。把煮過的試料加載到10% SDS-PAGE凝膠的孔(well)里，在125V的電壓下電泳(electrophoresis) 2小時并根據(jù)分子量進行分 離，在20V、400A以下的條件下把上述蛋白質(zhì)電泳1小時后移到PVDF膜。然后利用5%的脫脂牛奶把接受了蛋白質(zhì)的膜遮蔽12小時，再使用第一階段抗體(抗-ERK/p-ERK抗體；Cell signaling, USA)處理4小時后用TBST(Tris Buffered Saline+0. 1% tween)清洗3次，每次清洗10分鐘，用第二階段抗體(抗兔-IgG-HRP ;Amersham Bioscience, UK)處理1小時。再用TBST清洗4次，每次清洗IO分鐘，然后利用ECL檢測試劑盒(Amersham Biosciences, UK)引起發(fā)光反應，再暴露于Hyperfilm-MP(Amersham Biosciences, UK)并觀察其結(jié)合反應。 其結(jié)果如圖3a所示，受到5-羥色胺(5_HT)的剌激而增加了 ERK的磷酸化程度，其影響在5分鐘時達到最高值。 〈3-2〉對于5-HT6R的活性劑EMD386088與對抗藥SB258585的反應性檢查
在含有無血清DMEM培養(yǎng)池的6_孔培養(yǎng)皿里把按照實施例2的方法篩選的、可穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的轉(zhuǎn)基因細胞系以1 X 106細胞/孔分注后進行培養(yǎng)。3小時后，利用20iiM 5-HT，liiM EMD386088(Tocris，USA)及10 ii MSB258585 (Tocris， USA)分別按照預設(shè)的間隔處理5分鐘。對于EMD386088/SB258585，首先對SB258585進行30分鐘的預處理后再處理EMD386088。按照實施例3_1_2的Western免疫印跡方法檢查了上述化學物質(zhì)處理對ERK磷酸化的影響。 其結(jié)果如圖3b所示，受到5-HT與EMD386088的剌激后增加了 ERK的磷酸化程度，SB258585則降低其效果?！磳嵤├?>HA-5-HT6R的細胞表面表達分析
〈4-l>Fyn過表達之前的分析 為了在本發(fā)明穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的細胞系中觀察細胞膜外部的5_HT6R的N端所連接的HA是否位于細胞表面的外部(圖4a)，使用了在大韓民國公開專利第2008-0004994號中確認為5-HT6R的結(jié)合蛋白質(zhì)的Fyn。 具體地說，整體細胞或表面蛋白質(zhì)分析時使用免疫熒光細胞化學法(immunofluorescence)。利用把涂層蓋玻片(cover glass)中生育的實施例2所篩選的、可穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的轉(zhuǎn)基因細胞系清洗3次，利用溶于PBS的4 %多聚甲醛在4°C的溫度下把細胞固定30分鐘，再使用冰涼的PBS清洗3次。之后，把抗體投入細胞內(nèi)部后，為了觀察整體細胞而利用PBST(PBS+0. 2% Triton X-100)處理20分鐘，或者省略上述PBST處理步驟而注入抗體并阻止抗體流入細胞內(nèi)部，然后分析細胞表面。之后利用5%的BSA遮蔽1小時，再利用第一階段抗體，anti-HA(l : 500 ;Cell Signaling, USA)與anti-Fyn(l : 500 ;Cell Signaling,USA)反應6小時后，利用PBS清洗3次，每次10分鐘，第二階段抗體則處理1小時。利用PBS清洗3次后，利用CRYSTAL/MOUNT(Biomeda Corp.，USA)把蓋玻片固定在Slide上。為了觀察抗體標記的兩種特定蛋白質(zhì)的細胞內(nèi)部位置，使用confocal LSM 5101asersca皿ing microscope (Zeiss, Gottingen， Germany)對影像進行分析。 其結(jié)果如圖4b所示，可以在本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因細胞系中穩(wěn)定表達的HA-5-HT6R的宿主細胞HEK293細胞系中觀察到獨自表達Fyn蛋白質(zhì)的分布。而且，如果阻止HA抗體滲透細胞表面膜，可以在細胞膜觀察到HA-5-HT6R。
〈4-2>Fyn過表達之后的分析在含有無血清DMEM培養(yǎng)池的100mm板上把按照實施例2的方法篩選的、可穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的轉(zhuǎn)基因細胞系以1 X 106細胞/孔分注后進行培養(yǎng)，然后以1 : 3的比率把Fyn-pcDNA3. 1 (+)與Lipofectamine 2000投入Opti-MEM培養(yǎng)池并混合5分鐘，30分鐘后把上述混合液投入培養(yǎng)皿使細胞系發(fā)生基因感染。6小時后利用匿EM培養(yǎng)池更換培養(yǎng)池，再培養(yǎng)細胞24小時后使Fyn過表達。 之后，為了按照實施例4-1的方法觀察整體細胞而添加PBST(PBS+0. 2% TritonX-100) 20分鐘并觀察整體細胞，或者省略該步驟后觀察細胞表面。 其結(jié)果如圖4c所示，如果阻止HA抗體滲透細胞表面膜，即使Fyn過表達時也沒有在細胞膜觀察到Fyn而只觀察到了 HA-5-HT6R。
〈實施例5>HA-5-HT6R的活性測定
〈5-1>細胞處理條件 在含有無血清DMEM培養(yǎng)池的100mm板上把按照實施例2的方法篩選的、可穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的細胞系與臨時表達HA-5-HT6R的細胞系、野生型HEK293細胞系及表達5-HT6R的細胞系以5X 106細胞/孔把單一 96-孔板分成3個區(qū)塊后分別分注并進行培養(yǎng)。24小時后以1 : 3的重量比把表達6。15蛋白質(zhì)的載體(Evi Kostenis， Institute forPharmaceutical Biology, Germany)與Lipofectamine 2000加以混合后使上述細胞系發(fā)生基因感染，然后在含有1 % FBS的DMEM培養(yǎng)16小時以上。在進行活性檢索的前一天，以每孔5乂104的密度把上述基因感染的細胞分注到經(jīng)過多聚賴氨酸(0. 05mg/ml)處理的96-孔板上。為了抑制受體內(nèi)化(internalization)而使用了血清饑餓(serum starvation)條件。上述受體內(nèi)化內(nèi)化到細胞質(zhì)內(nèi)部時，將被分解或非活化而進行受體下調(diào)。
〈5-2〉利用FDSS6000測定熒光牽丐 使用高通量細胞篩選器FDSS6000(Hamamatsu Photonics, JP)測定熒光鈣。熒光鈣標記物使用了對鈣濃度敏感的Fluoro-4/AM與0. 001%普朗尼克F-127 (Sigma， USA)。讓細胞選擇性地暴露于480nm，利用CCD攝像機拍攝通過515nm的放射熒光后得到相關(guān)數(shù)據(jù)。
具體地說，實驗當天使用HEPES緩沖溶液把附在96-孔板上的細胞清洗3次，使用溶于HEPES緩沖溶液的4 ii M Fluoro-4/AM與0. 001 %普朗尼克F-127在培養(yǎng)池反應1小時后，利用HEPES緩沖溶液重新清洗2次后，讓細胞選擇性地暴露于480nm，利用CCD攝像機拍攝通過515nm的放射熒光后得到相關(guān)數(shù)據(jù)。
〈5-3〉調(diào)查HA-連接的影響 把實施例5-l中利用表達G。^蛋白質(zhì)的載體進行了基因感染的、可穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的細胞系與表達5-HT6R的細胞系分別利用10 y M 5-HT加以處理后，按照實施例4-2的方法測定活性。陰性對照組則是使用僅具備HA標簽的空載體進行了轉(zhuǎn)基因的細胞系。F表示480nm的熒光強度，F(xiàn)。表示初始值。 其結(jié)果如圖5a所示，位于N端的HA-連接沒有改變5-HTeR的功能。而且，上述熒光強度變化(F/F。)的平均值如圖5b所示，可穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的細胞系為0. lll士O. 003，表達5-HT6R的細胞系為0. 105±0. 003，使用僅具備HA標簽的空載體進行了轉(zhuǎn)基因的細胞系則是0. 014±0. 007 (n = 4)。
〈5-4>5-HT濃度-依存活性 針對實施例5-l中利用表達G。w蛋白質(zhì)的載體進行了基因感染的、可穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的細胞系，除了 96-孔板以外，還另外準備了一個可以使5_HT6受體活化的、含
10有不同濃度(10—11 10—5M)的5-HTe受體活性劑的96-孔藥物板。大部分的高通量細胞篩選器雖然具備了注入藥物時所需要的液體應用系統(tǒng)(Liquid Application system)，但不具備液體吸入系統(tǒng)，把需要檢索的5-HT及其它活性劑藥物以5倍的高濃度在分別HEPES緩沖溶液制備20iU，在最終體積100iU(粘附狀態(tài)的培養(yǎng)細胞80+5X 5-HT及其它活性劑藥物)稀釋1/5后進行測定。最后，以25秒為基準進行測定，在90秒鐘的藥物處理條件下把5_HT6受體活性劑5-HT在10—1Q 10—SM濃度范圍內(nèi)利用熒光標記染料Fluoro-4以％形式求得5-HTe受體活性的Ca"信號(signal)。把480nm的最大比率值的面積作為100%求得5-HT的活性效果后，得到細胞的濃度-依存性曲線并導出ECs。值(圖5c)。此時，對于5-HT的EC5。值使用y/y隨=1/ (l+(K1/2/[5-HT]nH)計算(y隨是最大反應，K1/2是EC5。值，Nh是Hill常數(shù))。 〈5-5>檢查穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的細胞系 把實施例5-l中利用表達G。^蛋白質(zhì)的載體進行了基因感染的、可穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的細胞系與表達HA-5-HT6R的細胞系(Sl S3)與臨時表達HA-5-HT6R的細胞系(Tl T3)分別利用10iiM 5-HT加以處理后，按照實施例4_2的方法測定活性，利用Integration Ratio Max(HamamatsuPhotonics program, JAPAN)計算了細胞內(nèi)部牽丐流入值(Integrate ratiomax values)。 其結(jié)果如圖6所示，由于本發(fā)明穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的細胞系可以穩(wěn)定地表達HA-5-HT6R，因此其實驗重現(xiàn)性優(yōu)于臨時表達的細胞系。
0124]IA088981序列表
0125]〈110〉韓國科學技術(shù)研究院
0126]〈120>可以高效率地檢索5-羥色胺6受體配體的可穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的細胞系
0127]〈130>IA088981
0128]〈150>KR10-2008-0095258
0129]〈151>2008-09-29
0130]〈160>4
0131]〈170〉Kopatentln 1.71
0132]〈210>1
0133]〈211>21
0134]〈212>DNA
0135]〈213〉人工序列
0136]〈220〉
0137]〈223>HA-5-HT6R正向引物
0138]〈400>1
0139]ccactcttca tgcgggactt c21
0140]〈210>2
0141]〈211>21
0142]〈212>DNA
0143]〈213〉人工序列
0144]〈220〉
〈223>HA-5-HT6R反向引物〈400>2tcagttcgtg gggatgccaa g〈210>3〈211>21〈212>DNA<213>人工序列〈220〉〈223〉 13肌動蛋白正向引物〈400〉3gtcaccaact gggacgacat g〈210>4〈211>20<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉 P肌動蛋白反向引物〈400>4gccgtcaggc agctcgtagc
權(quán)利要求
一種細胞系，含有N端連接HA的5-HT6R基因構(gòu)建體的載體被轉(zhuǎn)導到宿主細胞而穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的細胞系。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的細胞系，其特征在于上述細胞系以寄托編號 KCLRF-BP-00187寄托。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的細胞系，其特征在于上述轉(zhuǎn)導可以在下列方法中選擇一個 方法后進行在月旨質(zhì)體、Dojindo公司的Hilymax， Fugene， jetPEI、Effectene及DreamFect 所組成的群中選擇某一商業(yè)化的轉(zhuǎn)導用試藥；利用磷酸鈣、正電荷型高分子、微脂粒、納米 粒子、核轉(zhuǎn)染、電穿孔法、熱沖擊、磁珠轉(zhuǎn)染的方法；以及利用反轉(zhuǎn)病毒的方法。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的細胞系，其特征在于上述宿主細胞在HEK293、C0S7、CH0-K1 及CH0-G5A所組成的群中選擇。
5. —種5-HTeR配體高效率檢索方法，包括下列步驟 步驟l，利用受檢化合物處理權(quán)利要求1的細胞系； 步驟2，測定上述經(jīng)過處理的細胞系的5-HT6R活性；及步驟3，和未經(jīng)過處理的細胞系進行比較，篩選出可以在上述細胞系中增加或減少 5-HT6R活性的受檢化合物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的高效率檢索方法，其特征在于權(quán)利要求5中步驟1的受檢 化合物在天然化合物、合成化合物、RNA、 DNA、多肽、酶、蛋白質(zhì)、配體、抗體、抗原、細菌或真 菌的代謝產(chǎn)物及生物活性分子所組成的群中選擇一個。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的高效率檢索方法，其特征在于測定5-HTeR的活性時，通過上 述5-HT6R測定細胞內(nèi)部鈣濃度流入情形。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的高效率檢索方法，其特征在于測定細胞內(nèi)部鈣濃度流入情 形的目標細胞系在進行受檢化合物處理之前，先利用可以表達G。w蛋白質(zhì)的載體與脂質(zhì)體 進行基因感染。
9. 一種5-HTeR配體高效率檢索方法，包括下列步驟 步驟l，利用受檢化合物處理權(quán)利要求1的細胞系； 步驟2，上述經(jīng)過處理的細胞系的蛋白質(zhì)精制步驟； 步驟3，測定上述經(jīng)過精制的蛋白質(zhì)的5-HT6R活性；及步驟4，和未經(jīng)過處理的細胞系進行比較，篩選出可以在上述細胞系中增加或減少 5-HT6R活性的受檢化合物。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的高效率檢索方法，其特征在于權(quán)利要求9中步驟1的受檢 化合物在天然化合物、合成化合物、RNA、 DNA、多肽、酶、蛋白質(zhì)、配體、抗體、抗原、細菌或真 菌的代謝產(chǎn)物及生物活性分子所組成的群中選擇一個。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的高效率檢索方法，其特征在于測定5-HT6R的活性時，測定 上述5-HT6R所磷酸化的ERK。
12. —種5-HT6R配體高效率檢索用組成物，其特征在于包含權(quán)利要求的細胞系。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的高效率檢索用組成物，其特征在于上述細胞系以寄托編 號KCLRF-BP-00187寄托。
14. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的高效率檢索用組成物，其特征在于上述組成物另外包括 可以表達G。w蛋白質(zhì)的載體、脂質(zhì)體，熒光鈣標記物及洗滌緩沖溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種5-羥色胺6受體配體的高效率檢索方法，尤其是一種利用可穩(wěn)定表達HA-5-HT6R的細胞系的5-羥色胺6受體配體高效率檢索方法。本發(fā)明的細胞系可穩(wěn)定地表達HA-5-HT6R，因此有效地提高了針對選擇性地作用于5-HT6R的配體的檢索效率，可以對結(jié)合5-HT6R的蛋白質(zhì)的研究做出貢獻。本發(fā)明可以有效地預防及診斷出5-HT6R相關(guān)抑郁癥、阿爾茨海默之類的腦疾病及精神疾病，進而開發(fā)出其治療劑。
文檔編號G01N33/50GK101712950SQ20081018254
公開日2010年5月26日 申請日期2008年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月29日
發(fā)明者尹炯文, 崔己賢, 文東民, 林惠媛 申請人:韓國科學技術(shù)研究院