專利名稱：預(yù)測5－羥色胺再攝取抑制劑類藥物作用效果的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種預(yù)測5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物作用效果的試劑盒，屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
抑郁癥是最常見的精神障礙之一，對于抑郁癥的治療，目前最常用的方法仍然是藥物治療。抗抑郁藥效應(yīng)主要與這類藥物對5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素(NE)系統(tǒng)的作用有關(guān)。抗抑郁藥種類繁多，主要有以下幾類5-羥色胺再攝取抑制劑；去甲腎上腺素再攝取抑制劑；5-羥色胺/去甲腎上腺素雙重再攝取抑制劑；三環(huán)抗抑郁藥；其他環(huán)類抗抑郁藥；單胺氧化酶抑制劑(經(jīng)典/選擇性)；其他無法歸類的藥物。5-羥色胺再攝取抑制劑中包括選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(selective serotonin reuptake inhibitors，SSRI)和同時(shí)作用于其他途徑的抗抑郁藥兩類。SSRI由于其藥理活性的高度選擇性，臨床使用的安全性較好，不良反應(yīng)較少?？挂钟羲幍钠鹦Р⒎羌纯绦缘?，一般需要在服藥2～4周方能出現(xiàn)實(shí)質(zhì)性的臨床改善，這給臨床治療選藥，療效判定和換用藥物等帶來嚴(yán)重的困難。同時(shí)，抗抑郁藥在起效之前會由于其固有的藥理學(xué)特性，帶來一系列不良反應(yīng)，包括加重失眠、焦慮、激越，甚至?xí)捎谝钟舭Y臨床癥狀改善時(shí)間上的不一致導(dǎo)致一過性自殺危險(xiǎn)增加。
目前在臨床上最常應(yīng)用的抗抑郁藥是以氟西汀為代表的SSRI類藥物包括氟西汀(fluoxetine)、帕羅西汀(paroxetine)、舍曲林(sertralin)、西酞普蘭(citalopram)、氟伏沙明(fluvoxamine)和左旋西酞普蘭(escitalopram)。SSRI的主要作用機(jī)制是選擇性阻斷中樞5-羥色胺(5-HT)神經(jīng)元突觸前膜5-HT的再攝取，進(jìn)而升高突觸間隙中可資利用的5-HT水平。長期用藥過程中，在服藥約10～14天左右，會出現(xiàn)某些5-HT受體密度/活性改變(如功能下調(diào)或上調(diào))。這些受體功能在藥物治療過程中的變化，可能決定了抗抑郁治療的效果。SSRI類藥物的抗抑郁有效率一般在50％～70％。其主要不良反應(yīng)包括一過性焦慮、失眠、激越加重，胃腸道不良反應(yīng)，性功能障礙等。由于抗抑郁藥并非對于每個(gè)抑郁癥病人都有良好的療效，而且存在起效時(shí)間上的延擱，但在臨床上醫(yī)生仍只能憑經(jīng)驗(yàn)選擇藥物，一般需要治療觀察至少4～6周后才能確定所選擇藥物的治療是否有效，此后，對于療效不好的病人再憑借經(jīng)驗(yàn)換用第二個(gè)藥物，再觀察4～6周，所有實(shí)際上有大約30％～40％的病人不能及時(shí)得到最佳藥物治療，其后果是延誤治療時(shí)間，給病人帶來痛苦，導(dǎo)致更多的不良反應(yīng)，尤其可能因?yàn)橐钟舭Y狀沒有較快較徹底地克服而加重病人的自殺危險(xiǎn)性。
除SSRI類藥物之外，還有一些抗抑郁藥或具有抗抑郁作用的其他類藥物的抗抑郁療效也與其對5-HT再攝取的抑制作用或經(jīng)由其他方式影響5-HT系統(tǒng)功能有關(guān)。這些藥物包括(但不限于)萬拉法新(venlafaxine)，米氮平(mirtazapine)，曲唑酮(trazodone)，度洛西汀(duloxetine)，minacipran，tianeptine，氯米帕明(clomipramine)，阿米替林(amitriptyline)，多慮平(doxepine)，多塞平(doxepine)，米帕明(imipramine)，丁螺環(huán)酮(buspirone)。
遺傳背景不僅可能影響疾病的發(fā)生，而且影響藥物療效的個(gè)體差異。隨著藥物遺傳學(xué)研究的不斷深入和發(fā)展，在未來抑郁癥的藥物治療中，將可能利用遺傳學(xué)篩查方法，實(shí)現(xiàn)因人而異的個(gè)體化臨床用藥目標(biāo)，有效避免不合理用藥、錯(cuò)誤用藥乃至濫用藥物傾向，減少用于治療藥物不良反應(yīng)的費(fèi)用，避免無效用藥造成的浪費(fèi)。
藥物治療的有效性和安全性極其重要，很多人在有效性方面屬于無效用藥，或者療效較差；而在用藥安全性方面，會出現(xiàn)各種不良反應(yīng)、毒副作用甚至導(dǎo)致死亡。除外藥物本身的原因以及患者的性別、年齡、其他疾病相互作用、妊娠、飲食狀況和生活環(huán)境等，遺傳因素在個(gè)體化醫(yī)療、特別是個(gè)體化用藥方面起著極其重要的作用。臨床上用于預(yù)測藥物療效的方法常常僅僅憑借醫(yī)生的臨床經(jīng)驗(yàn)，嚴(yán)格遵守治療指南，根據(jù)患者常規(guī)的臨床檢查和既往治療，經(jīng)驗(yàn)性地選擇一種藥物治療，治療一段時(shí)期之后，根據(jù)病情變化和相應(yīng)的檢查判斷療效，如果提示療效不佳或副作用較大時(shí)才會考慮調(diào)整藥物治療，即改變藥物劑量或者聯(lián)合或更換其它藥物治療。這種預(yù)測方法具有明顯的滯后性及盲目性，并且不能真正預(yù)測某一藥物的療效，更不能給醫(yī)生選擇藥物提供準(zhǔn)確的個(gè)體化信息。因此，基于目前臨床藥物療效的預(yù)測方法，醫(yī)生在用藥時(shí)仍不能根據(jù)患者個(gè)體差異進(jìn)行藥物及其劑量的選擇以及藥物的配伍，不能迅速有效地控制或者治療疾病并且降低或避免毒副作用的發(fā)生，而且不同程度地增加患者的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
藥物療效和副作用的個(gè)體差異與遺傳因素有關(guān)。藥物遺傳多態(tài)性表現(xiàn)為藥物代謝酶的多態(tài)性、藥物作用受體的多態(tài)性和藥物靶標(biāo)的多態(tài)性等。這些多態(tài)性的存在可能導(dǎo)致許多藥物治療中藥效和不良反應(yīng)的個(gè)體差異Science，2000；2871977-1978J ClinInvest，1994；941872-1882。
藥物基因組學(xué)是繼人類基因組計(jì)劃完成之后出現(xiàn)的功能基因組學(xué)研究的一個(gè)分支，是基于基因多態(tài)性的DNA檢測手段，如對一些疾病相關(guān)基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測，或?qū)μ囟ㄋ幬锞哂忻舾行曰虻挚剐缘幕疾∪巳哼M(jìn)行SNP檢測，能夠預(yù)測患者將對某一特定的藥物產(chǎn)生怎樣的反應(yīng)(療效或副作用方面等)，從而解決藥物治療的安全和有效兩個(gè)問題，進(jìn)而優(yōu)選出最佳的治療方法，指導(dǎo)醫(yī)生為患者擬定個(gè)體化的給藥方案；另外，還有助于減少臨床用藥不當(dāng)，提高療效，降低毒副作用，降低醫(yī)療費(fèi)用，具有極高的社會效益和衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)意義。
SNP是指不同個(gè)體間在基因水平上的單核苷酸變異，平均每1000對堿基出現(xiàn)一個(gè)SNP，兩個(gè)無關(guān)個(gè)體間大約有300萬個(gè)SNP。SNP在個(gè)體化用藥上可謂是舉足輕重。影響藥物有效性的主要因素包括藥物前體因代謝而激活，藥物與靶細(xì)胞的結(jié)合能力，藥物與藥靶的結(jié)合和活性，活性藥物被代謝、降解和排出；而安全性則取決于藥物在體內(nèi)的代謝、降解和排出環(huán)節(jié)以及藥物在體內(nèi)的非特異性結(jié)合和活性。不同個(gè)體在其中每一環(huán)節(jié)SNP的不同，最終都可能會造成對同一藥物反應(yīng)的差異，有時(shí)由于這種個(gè)體間遺傳學(xué)上的差別，同一藥物在不同個(gè)體內(nèi)的效果和毒副作用的差異可以達(dá)到300倍之多。
已經(jīng)證實(shí)抑郁癥與遺傳因素存在密切的關(guān)系。目前一致認(rèn)為抑郁癥為由遺傳和環(huán)境交互作用所引起的一類復(fù)雜疾病，其中遺傳因素決定了某些人具有易感性，在環(huán)境因素作用下導(dǎo)致最終疾病的發(fā)作。
近年來關(guān)于抑郁癥的抗抑郁藥物療效的藥物基因組學(xué)研究較多，主要集中于藥物代謝酶基因、與藥物作用受體有關(guān)的基因、與抑郁癥相關(guān)的各神經(jīng)遞質(zhì)的合成、代謝、受體等生物學(xué)通路基因。
口服氟西汀經(jīng)腸道吸收后主要在肝臟代謝，經(jīng)過CYP450 2D6同功酶代謝生成去甲氟西汀。去甲氟西汀具有與氟西汀類似的藥理學(xué)活性，但水溶性更強(qiáng)，容易經(jīng)過腎臟排泄。編碼P450酶2D6的基因位于22號常染色體，目前已發(fā)現(xiàn)的等位基因從2D6-1到2D6-44。在歐美白人中，最常見的是2D6-3A、2D6-4A、2D6-4B、2D6-5和2D6-6A。這些突變基因使酶的活性消失，并因此決定為慢代謝表型。中國人慢代謝型主要是2D6基因缺失，慢代謝型頻率很低，發(fā)生率不到1％。CYP 2D6酶活性的個(gè)體差異顯然會導(dǎo)致氟西汀等經(jīng)過CYP2D6代謝的抗抑郁藥的血藥濃度的差異。這樣也就有可能影響到藥物的療效和不良反應(yīng)。但是，迄今沒有研究發(fā)現(xiàn)氟西汀的血藥濃度與其抗抑郁臨床療效之間存在肯定的相關(guān)性。
由于存在藥物反應(yīng)的個(gè)體差異，醫(yī)生選藥時(shí)無法量體裁衣地進(jìn)行藥物選擇和藥物配伍，不能提高藥物療效并且降低毒副作用的發(fā)生，由此可能延誤治療時(shí)機(jī)，造成患者經(jīng)濟(jì)損失。因此迫切需要醫(yī)生特別在選擇降糖藥時(shí)能夠根據(jù)患者對特定的藥物產(chǎn)生的反應(yīng)選出最佳的治療方法，指導(dǎo)醫(yī)生為患者擬定個(gè)體化的給藥方案。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種從分子水平輔助預(yù)測5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物作用效果的試劑盒。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種預(yù)測5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物作用效果的試劑盒，由以下組分組成(1)紅細(xì)胞裂解液NH4Cl，KHCO3，EDTA；(2)白細(xì)胞裂解液蛋白酶K、RNase A、NaCl、Tris、EDTA、SDS；(3)蛋白沉淀液7.5M乙酸胺(pH 7.4)；(4)核酸儲存液1M三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl，pH8.0)；(5)2×PCR反應(yīng)混合液1.0ml[100mM Tris-HCl，100mM KCl，pH8.3(20℃)]；5.0uMMgCl2；各0.4mM dATP，dCTP，dGTP，dTTP，無菌雙蒸水配制，pH 7.0；5-羥色胺1A受體(HTR1A)基因的多態(tài)性位點(diǎn)基因型檢測引物；(6)Taq DNA聚合酶(5U/ul)保存緩沖液20mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mM KCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.5％NP40，0.5％(v/v)Tween 20，50％甘油；(7)陽性質(zhì)控含有HTR1A基因的多態(tài)性位點(diǎn)雜合型個(gè)體全血標(biāo)本，或者含有HTR1A基因的多態(tài)性位點(diǎn)雜合型的質(zhì)粒；(8)陰性對照經(jīng)DNAase I處理的雙蒸水；(9)內(nèi)切酶緩沖體系(10×)；(10)限制性內(nèi)切酶；(11)PCR用水；(12)6×電泳上樣緩沖液0.25％溴酚蘭，40％(w/v)蔗糖水溶液。
本試劑盒還可以進(jìn)一步含有檢測HTR1A的多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性熒光探針序列。
所述HTR1A基因的多態(tài)性基因型至少包含選自C1019G(rs6295)、C/T(rs878567)、A/G(rs6449693)中的一個(gè)或者一個(gè)以上的多態(tài)性位點(diǎn)。優(yōu)選為C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)。
所述的HTR1A基因的多態(tài)性位點(diǎn)基因型還可以包含選自與上述多態(tài)性基因型位點(diǎn)存在連鎖-不平衡的多態(tài)性位點(diǎn)，以及其他預(yù)測5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物作用效果的基因多態(tài)性位點(diǎn)包括無義突變位點(diǎn)、錯(cuò)義突變位點(diǎn)以及位于基因內(nèi)含子部位、基因調(diào)節(jié)部位的多態(tài)性位點(diǎn)。
本發(fā)明中的5-羥色胺再攝取抑制劑包括選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(SSRI)以及通過5-HT再攝取的抑制作用或其他方式影響5-HT系統(tǒng)功能有關(guān)的其他抗抑郁藥或具有抗抑郁作用的其他類藥物，這些藥物包括(但不限于)氟西汀(fluoxetine)、帕羅西汀(paroxetine)、舍曲林(sertralin)、西酞普蘭(citalopram)、氟伏沙明(fluvoxamine)、左旋西酞普蘭(escitalopram)、萬拉法新(venlafaxine)、米氮平(mirtazapine)、曲唑酮(trazodone)、度洛西汀(duloxetine)、minacipran、tianeptine、氯米帕明(clomipramine)、阿米替林(amitriptyline)、多慮平(doxepine)、多塞平(doxepine)、米帕明(imipramine)、丁螺環(huán)酮(buspirone)。本發(fā)明優(yōu)選為選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(SSRI)。本發(fā)明中的SSRI類藥物選自氟西汀(fluoxetine)、帕羅西汀(paroxetine)、舍曲林(sertralin)、西酞普蘭(citalopram)、氟伏沙明(fluvoxamine)和左旋西酞普蘭(escitalopram)。
本發(fā)明中5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物的作用效果主要為抗抑郁癥的療效、起效時(shí)間、抗抑郁癥伴發(fā)癥狀的療效和性功能障礙的不良反應(yīng)。其中，抑郁癥伴發(fā)癥狀包括抑郁癥伴發(fā)的核心癥狀、抑郁癥伴發(fā)的遲滯/軀體化癥狀、抑郁癥伴發(fā)的睡眠癥狀、抑郁癥伴發(fā)的精神焦慮癥狀和抑郁癥伴發(fā)的軀體焦慮癥狀，尤其指抑郁癥伴發(fā)的睡眠癥狀和抑郁癥伴發(fā)的焦慮癥狀。本發(fā)明中的睡眠癥狀尤其包括失眠。本發(fā)明中的性功能障礙包括性高潮延遲或缺乏，性欲減退等。
本發(fā)明中所述的預(yù)測是指(1)所述的HTR1A基因的C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型為GG純合突變型和/或CG雜合型時(shí)，預(yù)測5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物抗抑郁癥的療效強(qiáng)；所述的HTR1A基因的C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型為CC純合野生型時(shí)，預(yù)測5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物抗抑郁癥的療效弱；(2)所述的HTR1A基因的C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型為GG純合突變型和/或CG雜合型時(shí)，預(yù)測5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物抗抑郁癥的起效快；所述的HTR1A基因的C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型為CC純合野生型時(shí)，預(yù)測5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物抗抑郁癥的起效慢；(3)所述的HTR1A基因的C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型為GG純合突變型和/或CG雜合型時(shí)，預(yù)測5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物抗抑郁癥伴發(fā)癥狀的療效強(qiáng)；所述的HTR1A基因的C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型為CC純合野生型時(shí)，預(yù)測5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物抗抑郁癥伴發(fā)癥狀的療效弱；(4)所述的HTR1A基因的C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型為GG純合突變型和/或CG雜合型時(shí)，預(yù)測應(yīng)用5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物相關(guān)的性功能障礙的不良反應(yīng)發(fā)生率較低；所述的HTR1A基因的C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型為CC純合野生型時(shí)，預(yù)測應(yīng)用5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物相關(guān)的性功能障礙的不良反應(yīng)發(fā)生率較高。
本發(fā)明的生物樣品選自血液樣品、體液樣品、組織樣品和培養(yǎng)細(xì)胞，優(yōu)選的，所述樣品為血液樣品。其中血液樣品包括外周血細(xì)胞、白細(xì)胞、血清等，體液樣品包括尿液、唾液、組織液、腦脊液、體腔滲出液等，組織樣品包括口腔粘膜試子、毛發(fā)、皮膚、活檢組織、組織樣分泌物、排泄物樣本等。
本發(fā)明提到的試劑盒至少包括測定HTR1A基因的C1019G(rs6295)、C/T(rs878567)、A/G(rs6449693)中一個(gè)或者一個(gè)以上的多態(tài)性位點(diǎn)，還可以進(jìn)一步包括測定上述的HTR1A基因的其他多態(tài)性位點(diǎn)中的一個(gè)或者一個(gè)以上的多態(tài)性位點(diǎn)，也包括上述多態(tài)性位點(diǎn)的不同的排列組合。該試劑盒用于預(yù)測5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物的作用效果。所述的5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物選自氟西汀、帕羅西汀、舍曲林、西酞普蘭、氟伏沙明、左旋西酞普蘭、萬拉法新、米氮平、曲唑酮、度洛西汀、minacipran、噻奈普汀、氯米帕明、阿米替林、多慮平、多塞平、米帕明、丁螺環(huán)酮。所述的5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物優(yōu)選為選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物，選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物包括氟西汀、帕羅西汀、舍曲林、西酞普蘭、氟伏沙明、左旋西酞普蘭。所述試劑盒除了包含測定上述多態(tài)性位點(diǎn)所需要的特定引物或者探針之外，還包含運(yùn)用PCR擴(kuò)增而進(jìn)行檢測的試劑盒的常規(guī)組件、試劑、緩沖液等，或者包含運(yùn)用芯片、微檢測系統(tǒng)等方法進(jìn)行檢測的試劑盒的常規(guī)組件、試劑、緩沖液等，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉這些常規(guī)組件和檢測方法。
基于HTR1A基因，針對其不同的多態(tài)性位點(diǎn)，可以設(shè)計(jì)并且獲得各種診斷劑和試劑盒以用于預(yù)測5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物的作用效果。基于本發(fā)明的預(yù)測方法和用途獲得的各種診斷劑和試劑盒也屬于本發(fā)明范圍。
本發(fā)明中的“試劑盒”不限于試劑盒的固有形式，可以表現(xiàn)為微芯片、微檢測系統(tǒng)或者依賴于各種載體的檢測系統(tǒng)，以及包括前述檢測系統(tǒng)的統(tǒng)一包裝形式，如微孔板系統(tǒng)、紙質(zhì)載體、玻璃載體、尼龍膜載體，塑料載體、硅膠載體、凝膠載體、膜質(zhì)載體等。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本試劑盒運(yùn)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性酶切片段長度多態(tài)性方法(PCR-RFLP)，檢測抑郁癥患者外周血液樣本中HTR1A基因多態(tài)性。本試劑盒采用外周微量全血提取基因組DNA作為PGR模板，制備方法簡單可靠，無需特殊設(shè)備，PCR擴(kuò)增后采用RFLP方法檢測PCR產(chǎn)物，根據(jù)電泳結(jié)果確定HTR1A基因的多態(tài)性位點(diǎn)基因型。根據(jù)HTR1A基因的多態(tài)性結(jié)果，結(jié)合個(gè)體的其他生物學(xué)指標(biāo)對于5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物的作用效果進(jìn)行預(yù)測，本發(fā)明中5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物的作用效果包括抗抑郁癥的療效、起效時(shí)間、抗抑郁癥伴發(fā)癥狀的療效和性功能障礙的不良反應(yīng)，而抑郁癥伴發(fā)癥狀包括抑郁癥伴發(fā)的核心癥狀、抑郁癥伴發(fā)的遲滯/軀體化癥狀、抑郁癥伴發(fā)的睡眠癥狀、抑郁癥伴發(fā)的精神焦慮癥狀和抑郁癥伴發(fā)的軀體焦慮癥狀，尤其指抑郁癥伴發(fā)的睡眠癥狀和抑郁癥伴發(fā)的焦慮癥狀。本發(fā)明克服了臨床選擇5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物的盲目性，在多態(tài)性基因型分析的基礎(chǔ)上可以預(yù)測患者使用5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物的有效性和安全性，指導(dǎo)臨床用藥，使患者能夠進(jìn)行個(gè)體化醫(yī)療，提高抗抑郁癥的療效，減少毒副作用，減少醫(yī)療成本。本發(fā)明特別針對HTR1A C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型分別設(shè)計(jì)了用于PCR-RFLP方法的特異性擴(kuò)增引物以及用于TaqMan方法的特異性擴(kuò)增引物和等位基因特異性探針，與常規(guī)的擴(kuò)增引物和探針相比較，擴(kuò)增效率高、特異性好、省時(shí)，有更好的使用價(jià)值。
由于HTR1A C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)本身缺乏限制性酶切位點(diǎn)，為了能夠采用簡便快捷可靠的PCR-RFLP方法進(jìn)行該多態(tài)性位點(diǎn)的基因型檢測，我們特意在PCR擴(kuò)增的正向引物中成功設(shè)計(jì)并引入了Bsl I限制性酶切位點(diǎn)，HTR1A C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型的PCR擴(kuò)增引物如下正向引物5’-GAACGGAGGTAGCTCCTTAAAAA-3’反向引物5’-AAAAGGAAGCATAGGGAGCC-3’其中，BslI的限制性酶切位點(diǎn)為5’-CCNNNNNNNGG-3’另外，采用TaqMan方法檢測的HTR1A C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型的擴(kuò)增引物和等位基因特異性探針如下正向引物5’-TGTTGTCGTCGTTGTTCGTTTG-3’反向引物5’-CAATTATTGCTAATTGATGGAAGAAGACCG-3’等位基因特異性探針的序列為VIC-5’-AGTGTGTCTTCGTTTTTA-3’-NFQ，對應(yīng)于“G”等位基因，攜帶VIC熒光報(bào)告基團(tuán)。
FAM-5’-AGTGTGTCTTCCTTTTTA-3’-NFQ對應(yīng)于“C”等位基因，攜帶FAM熒光報(bào)告基團(tuán)。
下面結(jié)合具體實(shí)施方式
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具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1測定HTR1A C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型預(yù)測5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物作用效果的試劑盒(PCR-RFLP方法)(一)試劑盒的組成成分(1)紅細(xì)胞裂解液NH4Cl，KHCO3，EDTA；(2)白細(xì)胞裂解液蛋白酶K、RNase A、NaCl、Tris、EDTA、SDS；(3)蛋白沉淀液7.5M乙酸胺(pH 7.4)；(4)核酸儲存液1M三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl，pH8.0)；(5)2×PCR反應(yīng) 混合液1.0ml[100mM Tris-HCl，100mM KCl，pH8.3(20℃)]；5.0uM MgCl2；各0.4mM dATP，dCTP，dGTP，dTTP，無菌雙蒸水配制，pH 7.0；HTR1A基因的多態(tài)性位點(diǎn)基因型檢測引物；內(nèi)標(biāo)；其中引物序列根據(jù)HTR1A C1019G(rs6295)基因序列設(shè)計(jì)，包括PCR正向引物和PCR反向引物，由上海生工公司合成正向引物5’-GAACGGAGGTAGCTCCTTAAAAA-3’反向引物5’-AAAAGGAAGCATAGGGAGCC-3’(6)Taq DNA聚合酶(5U/ul)保存緩沖液20mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mM KCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.5％NP40，0.5％(v/v)Tween 20，50％甘油；購于上海生工公司；(7)陽性質(zhì)控含有HTR1A基因的多態(tài)性位點(diǎn)雜合基因型個(gè)體全血標(biāo)本，或者含有HTR1A基因的多態(tài)性位點(diǎn)雜合基因型的質(zhì)?；蛘逷CR產(chǎn)物片段；(8)陰性對照經(jīng)DNAase I處理的雙蒸水；(9)內(nèi)切酶緩沖體系(10×)75μl NEB buffe#3；(10)限制性內(nèi)切酶Bsl I內(nèi)切酶(10U/μl)；(11)PCR用水；(12)6×電泳上樣緩沖液0.25％溴酚蘭，40％(w/v)蔗糖水溶液。
其中陽性質(zhì)控包括含有HTR1A C1019G(rs6295)雜合基因型個(gè)體全血標(biāo)本或者含有HTR1A C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)雜合基因型的質(zhì)粒或者PCR產(chǎn)物片段，其具體的靶序列如下5’-GAACGGAGGTAGCTTTTTAAAAACGAAGACACACTCGGTCTTCTTCCATCAATTAGCAATAATTGGGAGACTGACCCAGGACTGTTCACCTTCCCATTCAGGCTCCCTATGCTTCCTTTT-3’
(二)檢測的步驟(1)微量全血基因組DNA的抽提a)取400ul紅細(xì)胞裂解液加入1.5ml離心管中，加入100ul左右新鮮全血或者抗凝全血。注意將移液器吸頭內(nèi)壁殘留血樣盡量清洗到離心管中。
b)37℃水浴5分鐘，期間輕輕搖勻3次；15000g離心1分鐘。
c)用移液器輕輕吸去上清液，殘留約10ul液體，注意移液器吸頭不可接觸離心管底部可見的白色沉淀。
d)高速振蕩10秒至離心管底部的白色沉淀消失；加入100ul白細(xì)胞裂解液，高速振蕩30秒至液體均一，37℃水浴5分鐘。
e)加入35ul蛋白沉淀液，高速振蕩20秒后15000g離心90秒，離心管底可見褐色沉淀。
f)將上清液全部移入裝有100ul異丙醇的1.5ml離心管中，來回輕柔的搖勻數(shù)次，至有白色絮狀物出現(xiàn)；15000g離心90秒，離心管底部可見白色沉淀。注意吸取上清液時(shí)避免吸入褐色沉淀。
g)棄上清液，注意保留白色沉淀，加入100ul 75％乙醇(以無水乙醇配制)，15000g離心90秒。
h)棄上清液，注意保留白色沉淀，輕輕在吸水紙上敲干殘液，于空氣中干燥3分鐘。
i)加入提前預(yù)熱至65℃的核酸儲存液100ul，中速振蕩5秒后低速離心2秒以收集液體于離心管底部；65℃孵化5分鐘；所得溶液即為高質(zhì)量高產(chǎn)量的全血基因組DNA。(產(chǎn)量大約為20～40ng/ul)。
(2)使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性酶切片段長度多態(tài)性分析方法(PCR-RFLP)檢測HTR1A基因的C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)PCR反應(yīng)體系樣品DNA 3ul(25ng～150ng)，PCR反應(yīng)混合液(2×)12.5ul，Taq DNA聚合酶0.05～0.125ul，ddH2O補(bǔ)足總體積至25ul。
PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性3分鐘后；94℃變性30～45秒，55℃±5℃退火45秒，72℃延伸60秒，共30～38個(gè)循環(huán)周期；最后72℃延伸7min。得到120bp的片段。
酶切條件及體系(15ul)HTR1A基因的C1019G(rs6295)位點(diǎn)PCR產(chǎn)物目的片段長度為120bp，總的酶切體系為15ul，其中PCR產(chǎn)物10ul，10×NEBuffer#3 1.5ul，Bsl I內(nèi)切酶5U(0.5ul，10U/ul)，3ul ddH2O補(bǔ)足體積至15ul，55℃酶切60分鐘(不得少于60分鐘，可以55℃酶切過夜)。酶切反應(yīng)的終止80℃20分鐘滅活，終止反應(yīng)。
注酶切后如立即進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳溴化乙啶染色鑒別基因型，則無需此滅活步驟。
(三)基因型測定的結(jié)果判定將DNA酶切后的產(chǎn)物點(diǎn)樣在3.0％瓊脂糖膠上，200V電壓下電泳1小時(shí)后，在紫外燈下讀取膠圖并進(jìn)行基因型分析。個(gè)體基因型鑒定如下酶切片段為120bp，HTR1A C1019G(rs6295)基因型為CC純合野生型；酶切片段為120+99+21bp，HTR1A C1019G(rs6295)基因型為CG雜合型；酶切片段為99+21bp，HTR1A C1019G(rs6295)基因型為GG純合突變型。
(四)對于5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物作用效果的預(yù)測HTR1A基因的C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型為GG純合突變型和/或CG雜合型時(shí)，預(yù)測5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物抗抑郁癥的療效強(qiáng)；所述的HTR1A基因的C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型為CC純合野生型時(shí)，預(yù)測5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物抗抑郁癥的療效弱。
所述的HTR1A基因的C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型為GG純合突變型和/或CG雜合型時(shí)，預(yù)測5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物抗抑郁癥的起效快；所述的HTR1A基因的C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型為CC純合野生型時(shí)，預(yù)測5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物抗抑郁癥的起效慢。
所述的HTR1A基因的C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型為GG純合突變型和/或CG雜合型時(shí)，預(yù)測5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物抗抑郁癥伴發(fā)癥狀的療效強(qiáng)；所述的HTR1A基因的C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型為CC純合野生型時(shí)，預(yù)測5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物抗抑郁癥伴發(fā)癥狀的療效弱。
所述的HTR1A基因的C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型為GG純合突變型和/或CG雜合型時(shí)，預(yù)測應(yīng)用5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物相關(guān)的性功能障礙的不良反應(yīng)發(fā)生率較低；所述的HTR1A基因的C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型為CC純合野生型時(shí)，預(yù)測應(yīng)用5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物相關(guān)的性功能障礙的不良反應(yīng)發(fā)生率較高。
在本發(fā)明的實(shí)施例中，5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物的作用效果包括抗抑郁癥的療效、起效時(shí)間、抗抑郁癥伴發(fā)癥狀的療效和性功能障礙的不良反應(yīng)。
本發(fā)明的實(shí)施例中所述的抑郁癥伴發(fā)癥狀包括抑郁癥伴發(fā)的核心癥狀、抑郁癥伴發(fā)的遲滯/軀體化癥狀、抑郁癥伴發(fā)的睡眠癥狀、抑郁癥伴發(fā)的精神焦慮癥狀和抑郁癥伴發(fā)的軀體焦慮癥狀，尤其指抑郁癥伴發(fā)的睡眠癥狀和抑郁癥伴發(fā)的焦慮癥狀。
實(shí)施例2測定HTR1A C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型預(yù)測5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物作用效果的試劑盒(Taqman方法)(一)試劑盒的主要組成成分(1)紅細(xì)胞裂解液NH4Cl，KHCO3，EDTA；(2)白細(xì)胞裂解液蛋白酶K、RNase A、NaCl、Tris、EDTA、SDS；(3)蛋白沉淀液7.5M乙酸胺(pH 7.4)；(4)核酸儲存液1M三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl，pH8.0)；(5)Taqman 2×Universal PCR Master Mix No AmpErase UNG反應(yīng)混合液含有dUTP的dNTPs，已優(yōu)化的緩沖液，0.72uM的正向引物，0.72uM的反向引物及兩段帶熒光報(bào)告基團(tuán)的等位基因特異性探針各0.16uM。
其中引物序列根據(jù)HTR1A C1019G(rs6295)基因序列設(shè)計(jì)，包括PCR正向引物和PCR反向引物，由上海生工公司合成正向引物5’-TGTTGTCGTCGTTGTTCGTTTG-3’反向引物5’-CAATTATTGCTAATTGATGGAAGAAGACCG-3’其中等位基因特異性探針包括檢測HTR1A C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)的野生型和突變型探針，本試劑盒中優(yōu)選為Taqman探針，等位基因特異性探針的序列為VIC-5’-AGTGTGTCTTCGTTTTTA-3’-NFQ，對應(yīng)于“G”等位基因，攜帶VIC熒光報(bào)告基團(tuán)。
FAM-5’-AGTGTGTCTTCCTTTTTA-3’-NFQ對應(yīng)于“C”等位基因，攜帶FAM熒光報(bào)告基團(tuán)。
(6)Taq DNA聚合酶(5U/ul)保存緩沖液20mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mM KCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.5％NP40，0.5％(v/v)Tween 20，50％甘油；購于上海生工公司。
(二)檢測的步驟(1)提取微量全血中宿主細(xì)胞的基因組DNA。
(a)在全血中加入30ml紅細(xì)胞裂解液，緩慢搖勻，室溫靜置10分鐘，期間，搖動數(shù)次，徹底裂解紅細(xì)胞。
(b)于4℃、2000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，去上清，將沉淀之白細(xì)胞在旋轉(zhuǎn)震蕩器上打散，加蛋白酶40ul、RNA酶50ul，搖勻，加白細(xì)胞裂解液置15ml，混勻37℃水浴20分鐘后取出，置冷水中。
(c)加冷的蛋白沉淀液4ml，混勻后放在-20℃冰箱5分鐘，取出于4℃、3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。將上清液倒入已加好15ml異丙醇的50ml離心管中緩慢搖動數(shù)次，至DNA絮狀物析出。
(d)將析出的DNA絮狀物移至另一1.5ml離心管中，加入0.5ml 75％乙醇洗沉淀，棄去乙醇，室溫空氣干燥。
(e)加DNA水化液1.5ml，置搖床，搖動過夜，備用。
(f)DNA濃度的測定采用紫外分光光度法，分別測定260nm及280nm兩個(gè)波長下的OD值，以O(shè)D260nm×50所得值為DNA濃度。并以O(shè)D260nm/OD280nm比值估計(jì)DNA純度。
(2)使用Taqman方法檢測HTR1A基因的C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型(a)用PCR儀擴(kuò)增HTR1A功能基因多態(tài)位點(diǎn)及其側(cè)翼序列，在5ul PCR反應(yīng)體系中含有基因組DNA 10ng，2.5ul的Taqman 2×Universal PCR Master Mix No AmpEraseUNG(組成成份包括AmpliTaq Gold DNA Polymerase，dNTPs with dUTP，PassiveReference，已優(yōu)化的緩沖液)，及0.72uM的正向引物，0.72uM的反向引物及兩段帶熒光報(bào)告基團(tuán)的等位基因特異性探針各0.16uM。
引物序列為正向引物5’-TGTTGTCGTCGTTGTTCGTTTG-3’反向引物5’-CAATTATTGCTAATTGATGGAAGAAGACCG-3’等位基因特異性探針的序列為VIC-5’-AGTGTGTCTTCGTTTTTA-3’-NFQ，對應(yīng)于“G”等位基因，攜帶VIC熒光報(bào)告基團(tuán)。
FAM-5’-AGTGTGTCTTCCTTTTTA-3’-NFQ對應(yīng)于“C”等位基因，攜帶FAM熒光報(bào)告基團(tuán)。
PCR反應(yīng)條件95℃10min，1個(gè)循環(huán)；92℃15s，60℃1min，50個(gè)循環(huán)。
(三)基因型測定的結(jié)果判定在7900型熒光定量PCR儀上檢測熒光信息。
將完成PCR反應(yīng)的PCR板放入7900型熒光定量PCR儀上，選用“AllelicDiscrimination”程序，進(jìn)行掃描與結(jié)果的判斷
發(fā)出FAM熒光者的基因型為CC(rs6295)純合野生型；發(fā)出VIC熒光者的基因型為GG(rs6295)純合突變型；發(fā)出兩種熒光者的基因型為CG(rs6295)雜合型。
(四)對于5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物作用效果的預(yù)測HTR1A基因的C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型為GG純合突變型和/或CG雜合型時(shí)，預(yù)測5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物抗抑郁癥的療效強(qiáng)；所述的HTR1A基因的C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型為CC純合野生型時(shí)，預(yù)測5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物抗抑郁癥的療效弱。
所述的HTR1A基因的C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型為GG純合突變型和/或CG雜合型時(shí)，預(yù)測5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物抗抑郁癥的起效快；所述的HTR1A基因的C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型為CC純合野生型時(shí)，預(yù)測5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物抗抑郁癥的起效慢。
所述的HTR1A基因的C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型為GG純合突變型和/或CG雜合型時(shí)，預(yù)測5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物抗抑郁癥伴發(fā)癥狀的療效強(qiáng)；所述的HTR1A基因的C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型為CC純合野生型時(shí)，預(yù)測5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物抗抑郁癥伴發(fā)癥狀的療效弱。
所述的HTR1A基因的C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型為GG純合突變型和/或CG雜合型時(shí)，預(yù)測應(yīng)用5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物相關(guān)的性功能障礙的不良反應(yīng)發(fā)生率較低；所述的HTR1A基因的C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型為CC純合野生型時(shí)，預(yù)測應(yīng)用5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物相關(guān)的性功能障礙的不良反應(yīng)發(fā)生率較高。
在本發(fā)明的實(shí)施例中，5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物的作用效果包括抗抑郁癥的療效、起效時(shí)間、抗抑郁癥伴發(fā)癥狀的療效和性功能障礙的不良反應(yīng)。
本發(fā)明的實(shí)施例中所述的抑郁癥伴發(fā)癥狀包括抑郁癥伴發(fā)的核心癥狀、抑郁癥伴發(fā)的遲滯/軀體化癥狀、抑郁癥伴發(fā)的睡眠癥狀、抑郁癥伴發(fā)的精神焦慮癥狀和抑郁癥伴發(fā)的軀體焦慮癥狀，尤其指抑郁癥伴發(fā)的睡眠癥狀和抑郁癥伴發(fā)的焦慮癥狀。
實(shí)施例3采用小試生產(chǎn)的試劑盒對于服用5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物的抑郁癥患者的藥物作用效果進(jìn)行預(yù)測我們應(yīng)用小試生產(chǎn)的試劑盒，對服用5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物的抑郁癥患者的HTR1A C1019G(rs6295)的多態(tài)性位點(diǎn)基因型進(jìn)行檢測，同時(shí)檢測其他生理參數(shù)，如年齡、性別、身高、體重、吸煙史、飲酒史、職業(yè)、教育程度、基線HAMD總分、本次病程、既往抗抑郁藥物治療史、合并用藥、是否復(fù)發(fā)抑郁癥等。通過測定個(gè)體基因型參數(shù)及其他生理參數(shù)，預(yù)測5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物的作用效果1、獲得個(gè)體的HTR1A C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型參數(shù)和基本生理參數(shù)年齡、性別、身高、體重、吸煙史、飲酒史、職業(yè)、教育程度、基線HAMD總分、本次病程、既往抗抑郁藥物治療史、合并用藥、是否復(fù)發(fā)抑郁癥等。
2、根據(jù)多元線性回歸分析，得到用來預(yù)測5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物的作用效果的預(yù)測模型。
3、根據(jù)預(yù)測方程計(jì)算得到的結(jié)果定量預(yù)測5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物的作用效果。
5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物的總體療效判定標(biāo)準(zhǔn)為定義抗抑郁藥治療結(jié)束時(shí)HAMD總分小于或等于7分為臨床緩解。
按照上述療效判定標(biāo)準(zhǔn)，將根據(jù)預(yù)測方程計(jì)算得到的預(yù)測抗抑郁療效的數(shù)據(jù)結(jié)果與實(shí)際根據(jù)上述療效標(biāo)準(zhǔn)判定的抗抑郁療效的數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果見表1。
表1 HTR1A C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型對5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物抗抑郁療效的預(yù)測結(jié)果

敏感性＝172/198×100％＝86.9％特異性＝51/74×100％＝68.9％PPV＝172/195×100％＝88.2％ NPV＝51/77×100％＝66.2％由表1可見，測定個(gè)體HTR1A C1019G(rs6295)的多態(tài)性位點(diǎn)基因型，并且同時(shí)測定個(gè)體的某些生理參數(shù)，根據(jù)預(yù)測方程，預(yù)測對于5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物的抗抑郁癥的療效的敏感性為86.9％，特異性為68.9％，陽性預(yù)測值(PPV)為88.2％，陰性預(yù)測值(NPV)為66.2％，有很好的準(zhǔn)確性，因此有很高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
權(quán)利要求
1.一種預(yù)測5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物作用效果的試劑盒，含有下述組分(1)紅細(xì)胞裂解液NH4Cl，KHCO3，EDTA；(2)白細(xì)胞裂解液蛋白酶K、RNase A、NaCl、Tris、EDTA、SDS；(3)蛋白沉淀液7.5M乙酸胺(pH 7.4)；(4)核酸儲存液1M三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl，pH8.0)；(5)2×PCR反應(yīng)混合液1.0ml[100mM Tris-HCl，100mM KCl，pH8.3(20℃)]；5.0uM MgCl2；各0.4mM dATP，dCTP，dGTP，dTTP，無菌雙蒸水配制，pH 7.0；HTR1A基因的多態(tài)性位點(diǎn)基因型檢測引物；(6)Taq DNA聚合酶(5U/ul)保存緩沖液20mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mM KCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.5％NP40，0.5％(v/v)Tween 20，50％甘油；(7)陽性質(zhì)控含有HTR1A基因的多態(tài)性位點(diǎn)雜合基因型個(gè)體全血標(biāo)本，或者含有HTR1A基因的多態(tài)性位點(diǎn)雜合型的質(zhì)粒；(8)陰性對照經(jīng)DNAase I處理的雙蒸水；(9)內(nèi)切酶緩沖體系(10×)；(10)限制性內(nèi)切酶；(11)PCR用水；(12)6×電泳上樣緩沖液0.25％溴酚蘭，40％(w/v)蔗糖水溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的預(yù)測5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物作用效果的試劑盒，其特征在于還可以進(jìn)一步含有檢測HTR1A基因的多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性熒光探針序列。
3.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述的HTR1A基因的多態(tài)性位點(diǎn)基因型至少包含選自C1019G(rs6295)、C/T(rs878567)、A/G(rs6449693)中的一個(gè)或者一個(gè)以上的多態(tài)性位點(diǎn)，優(yōu)選為C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)。
4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述的HTR1A基因的多態(tài)性位點(diǎn)基因型可以包含選自與上述多態(tài)性基因型位點(diǎn)存在連鎖-不平衡的多態(tài)性位點(diǎn)，以及其他預(yù)測5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物作用效果的基因多態(tài)性位點(diǎn)包括無義突變位點(diǎn)、錯(cuò)義突變位點(diǎn)以及位于基因內(nèi)含子部位、基因調(diào)節(jié)部位的多態(tài)性位點(diǎn)。
5.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述的5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物選自氟西汀、帕羅西汀、舍曲林、西酞普蘭、氟伏沙明、左旋西酞普蘭、萬拉法新、米氮平、曲唑酮、度洛西汀、minacipran、噻奈普汀、氯米帕明、阿米替林、多慮平、多塞平、米帕明、丁螺環(huán)酮。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述的5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物優(yōu)選為選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物，選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物包括氟西汀、帕羅西汀、舍曲林、西酞普蘭、氟伏沙明、左旋西酞普蘭。
7.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述的5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物的作用效果包括抗抑郁癥的療效、起效時(shí)間、抗抑郁癥伴發(fā)癥狀的療效和性功能障礙的不良反應(yīng)。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述的抑郁癥伴發(fā)癥狀包括抑郁癥伴發(fā)的核心癥狀、抑郁癥伴發(fā)的遲滯/軀體化癥狀、抑郁癥伴發(fā)的睡眠癥狀、抑郁癥伴發(fā)的精神焦慮癥狀和抑郁癥伴發(fā)的軀體焦慮癥狀，尤其指抑郁癥伴發(fā)的睡眠癥狀和抑郁癥伴發(fā)的焦慮癥狀。
9.如權(quán)利要求1或2所述的預(yù)測5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物作用效果的試劑盒，其特征在于(1)所述的HTR1A基因的C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型為GG純合突變型和/或CG雜合型時(shí)，預(yù)測5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物抗抑郁癥的療效強(qiáng)；所述的HTR1A基因的C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型為CC純合野生型時(shí)，預(yù)測5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物抗抑郁癥的療效弱；(2)所述的HTR1A基因的C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型為GG純合突變型和/或CG雜合型時(shí)，預(yù)測5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物抗抑郁癥的起效快；所述的HTR1A基因的C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型為CC純合野生型時(shí)，預(yù)測5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物抗抑郁癥的起效慢；(3)所述的HTR1A基因的C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型為GG純合突變型和/或CG雜合型時(shí)，預(yù)測5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物抗抑郁癥伴發(fā)癥狀的療效強(qiáng)；所述的HTR1A基因的C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型為CC純合野生型時(shí)，預(yù)測5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物抗抑郁癥伴發(fā)癥狀的療效弱；(4)所述的HTR1A基因的C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型為GG純合突變型和/或CG雜合型時(shí)，預(yù)測應(yīng)用5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物相關(guān)的性功能障礙的不良反應(yīng)發(fā)生率較低；所述的HTR1A基因的C1019G(rs6295)多態(tài)性位點(diǎn)基因型為CC純合野生型時(shí)，預(yù)測應(yīng)用5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物相關(guān)的性功能障礙的不良反應(yīng)發(fā)生率較高。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種預(yù)測5－羥色胺再攝取抑制劑類藥物作用效果的試劑盒，含有下述組分(1)紅細(xì)胞裂解液；(2)白細(xì)胞裂解液；(3)蛋白沉淀液；(4)核酸儲存液；(5)PCR反應(yīng)混合液(含MgCl2、dNTP、PCR擴(kuò)增引物和內(nèi)標(biāo))；(6)DNA聚合酶；(7)陽性質(zhì)控；(8)陰性對照；(9)內(nèi)切酶緩沖體系；(10)限制性內(nèi)切酶；(11)PCR用水；(12)10×電泳上樣緩沖液0.25％溴酚蘭，40％(w/v)蔗糖水溶液。本發(fā)明通過提取生物樣品中的基因組DNA，經(jīng)過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)－限制性酶切片段多態(tài)性(PCR－RFLP)分析方法，檢測個(gè)體生物樣品中HTR1A基因的多態(tài)性情況，預(yù)測5－羥色胺再攝取抑制劑藥物的作用效果。屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域。
文檔編號G01N33/53GK101029336SQ20061005795
公開日2007年9月5日 申請日期2006年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月1日
發(fā)明者劉平, 王玉, 洪秀梅, 張善春, 王濱燕, 王燕, 徐希平 申請人:北京華安佛醫(yī)藥研究中心有限公司, 安徽省生物醫(yī)學(xué)研究所