專利名稱：化妝品中克林霉素的高效液相色譜檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一項(xiàng)利用高效液相色譜儀檢測化妝品中克林霉素的新技術(shù)，尤其適用于化妝品中微量抗生素 -克林霉素的定性及定量分析。
背景技術(shù)：
克林霉素(Clindamycin)為大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物，作為一種廣譜高效的抗菌藥物被廣泛應(yīng)用到藥品、飼 料、和化妝品中?？肆置顾貙捬跣跃休^強(qiáng)的抑制作用；對敏感革蘭陽性菌也有相當(dāng)?shù)囊种谱饔谩Ｓ捎?其廣譜高效的抑菌作用，克林霉素被一些化妝品生產(chǎn)廠家，添加到祛痘類產(chǎn)品以達(dá)到消炎、祛痘、除螨及 抗粉刺的目的。但這種藥物同時也存在著很多不良反應(yīng)，如容易引起偽膜性腸炎，容易導(dǎo)致腸道菌群失 調(diào)，對神經(jīng)肌肉有阻滯作用，并且克林霉素耐藥性在國內(nèi)外都已比較明顯，不利人類疾病的治療。因此， 為保護(hù)化妝品消費(fèi)者的健康安全，建立靈敏、準(zhǔn)確、快速的化妝品中克林霉素的檢測方法是十分緊迫和必 要的。
目前藥品中克林霉素的檢測方法主要有微生物檢定法、紫外分光光度法、氣相色譜法、旋光法、毛細(xì) 管電泳高頻電導(dǎo)法、線性掃描伏安法。微生物檢定法是《中國藥典》(1990年版)規(guī)定的檢測藥品中克林 霉素的方法，該方法周期長，操作繁瑣，影響因素較多，靈敏度低，很難反映樣品中克林霉素的真實(shí)濃度。 紫外分光光度法、氣相色譜法雖然靈敏度高，但這兩種方法都需要油水兩相萃取分離，操作繁瑣，目標(biāo)成 分損失較大，不利于微量組分的檢測。旋光法對環(huán)境條件要求較高，特別是溫度的變化對其影響較大。毛 細(xì)管電泳高頻電導(dǎo)法和線性掃描伏安法靈敏度低，但步驟復(fù)雜，影響因素較多，重現(xiàn)性較差。高效液相色 譜方法是目前檢測克林霉素藥品較常用的方法，但也僅僅局限于各種克林霉素藥品制劑的含量檢測，而化 妝品、飼料、肉類中的克林霉素含量的檢測還沒有出臺相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)或方法，由于藥品組分較少，基質(zhì)簡單， 干擾因素較少，且樣品處理簡單，目標(biāo)檢測物損失小，因此藥品中的克林霉素易于檢測。與藥品不同，化 妝品種類繁多，基質(zhì)復(fù)雜，各成分的理化性質(zhì)差別較大，干擾因素較多，尤其是克林霉素作為化妝品禁用 成分添加到化妝品中，其含量較低，以上所述各種方法很難準(zhǔn)確的檢測出化妝品中微量的克林霉素成分， 而且使用高效液相色譜檢測化妝品中的克林霉素的方法還沒有文獻(xiàn)報(bào)道。針對以上現(xiàn)有技術(shù)的不足，我們 設(shè)計(jì)了一種用高效液相色譜方法檢測化妝品中克林霉素的方法，該方法效率高，專屬性好，靈敏度高，且 樣品預(yù)處理簡單。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測化妝品中克林霉素的分析方法，該項(xiàng)披術(shù)利用髙效液相色譜儀不僅可以 對化妝品中的克林霉素進(jìn)行準(zhǔn)確的定性分析，而且還可以進(jìn)行微量的定量分析。
本發(fā)明是用無水甲醇或乙腈提取化妝品中的克林霉素，經(jīng)超聲萃取、離心、過濾等一系列操作，濾除 固體雜質(zhì)，直至濾液澄清，取制備好的樣液上機(jī)，用磷酸二氫銨一乙腈緩沖溶液或磷酸二氫銨一甲醇緩沖
溶液進(jìn)行洗脫分離，在l恥一380nm波長下采集數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。所用高效液相色譜儀的主要配置包括十八 烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的反相色譜柱C8或C18柱、紫外檢測器或二極管陣列檢測器。
本發(fā)明方法的主要分析步驟如下.-
1樣品預(yù)處理
稱取一定量的化妝品(乳、膏、霜或水劑)于10ml刻度離心管中，加入4一7ml無水乙腈或甲醇(與 流動相保持一致)，渦旋混勻使基質(zhì)充分分散，定容至刻度，再超聲提取15 — 30min，將提取液轉(zhuǎn)移至 E卯endorf管中，12000rpm/min離心5min，如果有必要可以再用0. 45 u m濾膜過濾。
2色譜條件
(1) 色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的反相色譜柱C8或C18柱；
(2) 檢測器紫外檢測器或二極管陣列檢測器；
(3) 檢測波長選用190-380nm波長作為檢測波長；
(4) 流動相釆用0.01—0.50mol/L磷酸二氫銨溶液(用三乙胺調(diào)節(jié)pH值為4.0—8.0):乙腈=40 80% : 60 20%緩沖溶液或0. Ol—O. 50mol/L磷酸二氫銨溶液(用三乙胺調(diào)節(jié)pH值為4. 0_8. 0):甲醇 =40 80% : 60 20%緩沖溶液作為流動相，平衡色譜柱約20min,使基線平穩(wěn)，該條件下保留時間適合， 峰形對稱，分離度好(R〉1.5)。
(5) 流速0. 5 1. 5ml/min;
(6) 柱溫15 35°C。 3濃度計(jì)算方法
用克林霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制成一定梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，體積進(jìn)樣，按外標(biāo)法，以峰面積一濃度作 線性回歸，得出線性回歸方程，利用該方程和樣品中克林霉素的峰面積計(jì)算樣品中的克林霉素含量。 4樣品檢測
(1) 按照l中的方法進(jìn)行樣品預(yù)處理，取處理好的樣品2(^1進(jìn)樣；然后再取適當(dāng)濃度的克林霉素標(biāo) 準(zhǔn)溶液2(^1進(jìn)樣。
(2) 依照2中的檢測條件進(jìn)行檢測，分別得到樣品的色譜圖和克林霉素標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖；將樣品的 色譜圖和標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖進(jìn)行比較，樣品色譜圖中與標(biāo)準(zhǔn)品保留時間相近(誤差范圍標(biāo)準(zhǔn)品保留時間土 0.5分鐘)的色譜峰即為相應(yīng)的克林霉素成分，為了確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，可對初步確定的色譜峰進(jìn)行光 譜分析(光譜分析僅適用于二極管陣列檢測器)，若與標(biāo)準(zhǔn)品的最大吸收波長及光譜圖特征相似，可進(jìn)一 步確定樣品中的克林霉素成分。
(3) 將樣品中克林霉素的色譜峰面積帶入3中的線性回歸方程中，計(jì)算樣品中克林霉素的濃度。 由于化妝品種類繁多、基質(zhì)復(fù)雜，不能完全排除干擾成分與克林霉素在同一時間出峰的可能。采用二
極管陣列檢測器可獲得克林霉素的紫外吸收光譜圖，與標(biāo)準(zhǔn)品的光譜圖對照，通過分析二者的最大吸收波 長和光譜圖特征，可進(jìn)一步進(jìn)行確認(rèn)。
本發(fā)明的分析方法準(zhǔn)確、簡便、快捷，靈敏度高，選擇性、重復(fù)性好，適用于任何膏霜劑、乳劑、及 水劑等各種劑型的化妝品。


圖1樣品色譜圖
圖2克林霉素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖
圖3樣品光譜閣
圖4克林霉素標(biāo)準(zhǔn)品樣品光譜圖
圖5克林霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施實(shí)例對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但不限制本發(fā)明 1材料 1. 1儀器
島津自動進(jìn)樣高效液相色譜系統(tǒng)Hypersil-ODS (150mmx4.6mm， 5nm，柱號E1720574)色譜柱， SPD-M20A紫外可見光檢測器，SPD-M20A 二極管陣列檢測器，LC-20AB 二元高壓梯度泵，SIL-20A自動進(jìn) 樣系統(tǒng)，CT0"20A柱溫箱及LCSolution色譜工作站。
1. 2試劑和樣品
乙腈(色譜純)、無水甲醇(色譜純)為Merck公司產(chǎn)品；磷酸二氫銨(分析純)、三乙胺(分析純) 為天津科密歐試劑廠產(chǎn)品；超純水由Milli-Q system制取。
克林霉素標(biāo)準(zhǔn)品購于中國生物制品檢定所，批號為130422-200404。
供試樣品為抗痘清新冰妍啫喱。
1. 3標(biāo)準(zhǔn)品儲備液
精密稱取100. 00fflg克林霉素標(biāo)準(zhǔn)品置于50ml容量瓶中，加少許無水甲醇溶解，并用甲醇定容至刻度， 搖勻，配制成濃度為2mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)液作為儲備液，于4'C冰箱中存放備用。 2方法
2. 1色譜條件
色譜柱Shim-packVP-ODS (150mmx4.6mm, 5jim) 檢測器SPD"M20A 二極管陣列檢測器
流動相采用0.05mol/L磷酸二氫銨溶液(用三乙胺調(diào)節(jié)pH值為6.30):乙腈=60: 40，磷酸二氫 銨溶液一 乙腈緩沖體系的基線噪音比磷酸二氫銨溶液一甲醇的基線噪音小，且在pH值為6. 30 時峰性對稱，分離度好。
檢測波長210nm。經(jīng)190-400波長掃描，克林霉素在197ran附近有最大吸收，考慮到197nm接近末 端吸收,溶劑吸收較強(qiáng),干擾較大,而210nm波長處溶劑吸收相對較小,故選擇210nm作為檢測 波長。
流速lml/min
柱溫25。C
2. 2樣品預(yù)處理 稱取l.OOg的化妝品(抗痘清新冰妍啫喱)于10ml刻度離心管中，加入5ml無水甲醇，渦旋混勻使 基質(zhì)充分分散，再超聲提取20inin，將提取液轉(zhuǎn)移至Eppendorf管中'12000rpm/min離心5min'如果有必 要可以再用0. 45 u m濾膜過濾，制成供試樣品溶液。
2. 3樣品檢測
取20nl供試液進(jìn)樣，利用2.1中的色譜條件進(jìn)行檢測，獲得樣品的色譜閣(閣l)和光譜圖(圖3); 再取1.3中的克林霉素標(biāo)準(zhǔn)品儲備液稀釋至為5jxg/ml濃度，2(^1進(jìn)樣，同樣檢測條件F，得到克林霉素標(biāo) 準(zhǔn)品的色譜圖(圖2)和光譜圖(圖4)。
2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線
用無水甲醇將克林霉素儲備液稀釋成如下梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列5ng/ml、l(Vg/nil、20ng/nil、5(Hig/ral、 iOOHg/ml、 200jig/ml、 5(KHtg/tn1,取各濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液20fil進(jìn)樣，得到各濃度的峰面積(見表l)，作峰 面積一濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖5),得到其線性回歸方程(由高效液相色譜工作站完成計(jì)算工作)。
冋歸方程A(area)=3.6383 C+5. 7668R2=0. 9999
表1克林霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)濃度及峰面積
標(biāo)曲各點(diǎn)濃度 (jig/ml)峰面積 (mmO標(biāo)準(zhǔn)曲線公式
520. 3059
1038. 2943
2077.1244
50188. 2844A (area) =3. 6388 C+5. 7668 (R2=0.9999)
100373.2703
200742. 2076
500l咖.7863
3結(jié)果分析
由克林霉素標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖(圖2)可以看出，利用2. 1中的色譜檢測條件得到克林霉素標(biāo)準(zhǔn)品的保 留時間為8.376min,將樣品的色譜圖(圖l)和標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖(圖2)進(jìn)行比較，可見樣品色譜圖中在 8. 284min處有一色譜峰與克林霉素標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰的保留時間8. 376min相近，誤差在土O. 5分鐘范圍之內(nèi)， 因此可以初步確定樣品色譜圖中8.284min處的色譜峰為克林霉素，該峰面積為388.2816咖2。將樣品色譜 圖中8.284min處峰的光譜圖(圖3)與克林霉素標(biāo)準(zhǔn)品的光譜圖(圖4)進(jìn)行對比，可以發(fā)現(xiàn)樣品的光譜 圖與標(biāo)準(zhǔn)品的光譜圖的最大吸收波長及光譜圖特征均相似，可進(jìn)一步確定樣品中保留時間為8.284min的 組分為克林霉素。
將樣品中克林霉素的色譜峰面積388.2816咖2代入線性回歸方程中，即可得到樣品處理液中克林霉素 的含量(由高效液相色譜工作站完成計(jì)算T.作)，經(jīng)計(jì)算可得抗痘清新冰妍啫喱樣品中克林霉素得含量為 0. 11fflg/g。
該發(fā)明具有高分辨率，高靈敏度'重現(xiàn)性、選擇性好且樣品預(yù)處理方法簡單的特點(diǎn)，適宜化妝品中克
林霉素的定性、定量分析。
本發(fā)明以大量實(shí)驗(yàn)和理論分析，找到了一種利用高效液相色譜儀檢測化妝品中克林霉素的分析方法， 填補(bǔ)了化妝品中克林霉素液相色譜分析方面的研究空白。
權(quán)利要求
1一種化妝品中克林霉素的高效液相色譜檢測方法，其特征在于采用紫外檢測器或二極管陣列檢測器，以外標(biāo)法定量，采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的C18柱或C8柱，以磷酸二氫銨溶液-乙腈緩沖液或磷酸二氫銨溶液-甲醇緩沖液為流動相，采用180-380nm的檢測波長，樣品預(yù)處理采用無水甲醇或乙腈溶解樣品，超聲萃取，0.45μm濾膜過濾備用。
全文摘要
本發(fā)明是一種采用高效液相色譜儀檢測化妝品中克林霉素的分析方法，其特點(diǎn)在于采用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的C18柱或C8柱；使用紫外檢測器或二極管陣列檢測器在190-380nm處進(jìn)行檢測；流動相采用磷酸二氫銨溶液-乙腈緩沖液或磷酸二氫銨溶液-甲醇緩沖液；樣品用無水甲醇或乙腈溶解萃取，經(jīng)超聲提取20min后，再12000rpm/min離心約5min，取上清液作為供試樣液，如有必要可再用0.45μm濾膜過濾備用；根據(jù)樣品的保留時間和光譜圖進(jìn)行定性分析，根據(jù)其峰面積進(jìn)行定量分析。該發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于分辨率、靈敏度高，重現(xiàn)性、選擇性好，樣品預(yù)處理方法簡單，適宜化妝品中克林霉素的微量分析。
文檔編號G01N30/02GK101169394SQ20071002685
公開日2008年4月30日 申請日期2007年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月9日
發(fā)明者鄭偉東 申請人:廣東省?；瘷z測中心有限公司