專利名稱：作為動脈粥樣硬化診斷標(biāo)記的核心2β(1，6)-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶的制作方法
作為動脈粥樣硬化診斷標(biāo)記的核心2(5 (1,6)-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶本發(fā)明涉及血管疾病特別是動脈粥樣硬化的診斷方法領(lǐng)域。 已知動脈粥樣硬化(AS)具有炎性成分，核心2 GlcNAc-T (也叫做 UDP-GlcNAc:Gaipi,3GalNAc-R (GlcNAc—GalNAc)卩l(xiāng)，6-N-乙酰氨難移酶或 核心鄰l,6-N-乙酰氨基轉(zhuǎn)移酶-EC2.4丄102)被認為與炎性過程相關(guān)(WO 0031109)。曾有人推測核心2 GlcNAc-T抑制劑在AS中可能有用(例如 WO0185748),然而，目前還沒有公開的研究檢測過動脈粥樣硬化病人的核心2 GlcNAc-T的水平，也沒有提示該酶的水平可以作為受試者動脈粥樣5更化的標(biāo) 記。本發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，患有動脈粥樣硬化的病人，其血樣中的核心2 GlcNAoT活性水平相對于非患病健康個體顯著上升，因此，核心2 GlcNAc-T 的水平可以用于指示受試者中是否存在動脈粥樣5更化。具體的，血樣可以是包括多形核細胞-PMNs以及其他淋巴細胞亞群的分離 制品，更具體的，可以是包括PMNs和外周血單核細胞-PBMCs的制品。動脈粥樣5更化包括(冠狀動脈粥樣硬俗冠狀動脈疾病-CAD/缺血性心臟病 -1 0/動脈硬化性心血管疾病-八8(:\1)/冠狀動脈性心臟病-(:00)。因此，本發(fā)明第一方面提供了一種指示受試者中是否存在動脈粥樣石更化的 方法，其包括將來自受試者的組織樣本中的核心2 GlcNAc-T水平與相同組織中 測定的參照水平進行比較。如果來自^i式者的組織樣本中的核心2GlcNAc-T的 水平高于參照水平，則表明該受試者患有動脈粥樣硬化。通常，組織中的參照水平M檢測由一個或更多與不存在AS相關(guān)的個體 (one or more individuals associated with an absence of AS)組成的人群的組織樣本 中的核心2GlcNAc-T的平均水平來建立；ftit的，組織中的參照水平M31檢測 由五個或更多與不存在AS相關(guān)的個體組成的人群的組織樣本中的核心2 GlcNAc-T的平均水平來建立；更itt的，組織中的參照水平Mil檢測由十個或 更多與不存在AS相關(guān)的個體組成的人群的組織樣本中的核心2 GlcNAc-T的平 均水平來建立。
方便地，組織樣本是血液樣本。方便地，可以采用本領(lǐng)域公知方法，在可從血液中分離得到的淋巴細胞中測定核心2 GlcNAc-T水平。具體而言，核心2 GlcNAc-T水平可通過檢測包括PMNs以及其它淋巴細 胞亞群的分離制品來確定；更具體的，該分離制品包括PMNs以及PBMCs。核心2 GlcNAc-T水平可以是核心2 GlcNAc-T的RNA轉(zhuǎn)錄本水平，也可 以是核心2GlcNAc-T蛋白水平或者是核心2GlcNAc-T酶活水平；{雄的，它 是核心2 GlcNAc-T的酶活7JC平。^ft測核心2 GlcNAc-T酶活的合適方法包括采用方M性標(biāo)記的底物或者受 體化合物，采用熒光標(biāo)記的底物或受體化合物，或者在分析(例如通過HPLC) 之前衍生已形成的產(chǎn)品的那些方法，例如本發(fā)明描述的或者Chibber等，Diabetes 49 1724-1730 (2000); Palmenni C.A.等，Glycoconj J.Aug; 13 (4) :631-6 (1996); 或KuhnsW.等，Glycoconjugate Journal 10 381-394 (1993)(這些都以援引的方 式為本發(fā)明所包括)的方法。血樣中淋巴細胞的分離以及核心2 GlcNAc-T活性 的測定，可以采用Chibber等(2000)中描述的方法，或者采用本發(fā)明實施例1 中所記載的方法。本發(fā)明人采用Chibber等(2000)中描述的方法或者實施例1中所詳述的 方法，測定了來源于健康個體的淋巴細胞制品的核心2 GlcNAc-T酶活7X平為 40-1000 pmols/hr/mg蛋白，典型地在50-500 pmols/hr/mg蛋白之間。平均值可以在50到1000之間，典型i也在100到500之間，更為典型地是 在200400 pmol^hr/mg。當(dāng)采用Chibber等(2000)中描述的方法或者實施例1中所詳述的方法處 理血樣以及檢測淋巴細胞時，患有動脈粥樣5更化個體的核心2 GlcNAc-T水平所 處的范圍至少為健康非患病個體參照水平的兩倍，優(yōu)選的是至少四倍，更tt^ 的是至少六倍，最優(yōu)選的是至少八倍。方便地，本發(fā)明所述的方法可以采用包含實施本發(fā)明所述的方法所必須的 成分的試劑盒來實現(xiàn)。因此，本發(fā)明的第二個實施方案中提供一種用于指示受 試者中是否存在動脈粥樣硬化的試劑盒。優(yōu)選盼瞎況下，該試劑盒包含受體化 合物。楊。、2GlcNAc-T能轉(zhuǎn)運單糖殘基至該受體化合物。優(yōu)選的，該受體化合 物是Gal卩(1,3 )GalNAcoc的衍生物。適宜的受體化合物如Gal(3 (1,3 )GalNAc-Bn，
Galp (1，3) GaINAc-; -硝基苯酚，或者Gaip (1,3) Ga]NAcot-p-NHdansylphenyL任選的，試劑盒還可以包含有UDP-GlcNAc，其可以被方M性標(biāo)記。方便 地，采用MC或者3H標(biāo)記UDP《lcNAc。任選的，試劑盒還可以帶有N-乙酰葡 糖胺(GlcNAc)以及淋巴細lfiia軍試劑，如表面活性劑(如Tnton-X100)。試劑盒還可以帶有指導(dǎo)使用的說明書。本發(fā)明將M參考以下的實施例、方案以及附圖進行進一歩詳述。根據(jù)這 些描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員能想到落入權(quán)利要求范圍內(nèi)的更多實施方案。


圖1圖^i兌明來自健駒照個體與患有缺血性心臟病(腸)的患者的淋 巴細胞中的核心2GlcNAc-T的活性。對照組，n=19， IHD患者組，n=13。實施例1、測定分離自被診斷患有缺血性心臟病病人血液的淋巴細胞的核心2 GlcNAc-T活性本實驗中使用了 13個患有IHD的兩種性別的中年患者以及19個年齡匹配 的健^X寸照?；加刑悄虿〉幕颊弑慌懦?。本研究中包括的IHD患者患有穩(wěn)定性 心絞痛以及非穩(wěn)定性心絞痛，或者最近出現(xiàn)過心肌t體。血液采集入肝素化的試管中。血樣被置于等體積的Histo-Paque 1077 (Pharmacia,百丁購自Sigma， Poole， Dorset,英國)層上，400g離心30分鐘。 取淡黃色的薄層(Buflfycoat)(其中含有外周血單核細胞(PBMNC)以及多形 核(PMN)淋巴細胞)，在磷酸鹽緩沖液中洗滌。分離得到的淋巴細胞冷凍，并 在0.9%的NaCl、 0.4%Tnton-X100、 1 mMPMSF中裂解，檢測核心2 GlcNAc-T。 反應(yīng)體系為50 mmo1/1的2- (N-嗎啉代)乙磺酸，pH為7.0; 1 mmo1/1的 UDP-GlcNAc， 0.5 iiCi UDP-6[3H]-N-乙酰葡糖胺(16000 dpm/腿o1， NEN Life Science Products, Hounslow，英國)；0.1 mol/I GlcNAc; 1 mmol/l (3Dgal (1-3) Da-GalNAc-p-石肖基苯酚以及15ul的細)l^解液(100-200昭蛋白)，終體積為 30|nl?；旌弦涸?7。C溫育1小時之后，加入1 ml的冰水終止反應(yīng)，然后在C18 Sep-Pak柱(Waters-Millipore， Watford,英國)上處理。用20ml水洗滌柱子后， 以5 ml甲im脫產(chǎn)物并觀糧鵬寸性。在不存在加入受體的情況下測量內(nèi)源核心2GlcNAc-T活性。結(jié)果示于圖l。健康個體中核心2 GlcNAc-T活性為287± 147.2pmols/hr/mg蛋白質(zhì)，而患 有IHD的患者中為2376士461。這些數(shù)值與Clubber等(2000)的文獻中的三組 健康個體的核心2GlcNAc-T活性相吻合，其中的值為249±35.9 (n=25)， 334 ±86 (n=ll)以及283士37 (n=31) pmols/hr/mg。
權(quán)利要求
1、一種指示受試者中是否存在動脈粥樣硬化的方法，其包括將來自受試者的組織樣本中的核心2 GlcNAc-T水平與相同組織中測定的參照水平進行比較。來自受試者的組織樣本中的核心2 GlcNAc-T的水平高于參照水平，則表明該受試者患有動脈粥樣硬化。
2、 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的組織樣本是血樣。
3、 權(quán)利要求1或2所述的方法，其中在淋巴細胞中檢測所述的核心2 GlcNAc-T的水平。
4、 權(quán)利要求l-3任一項所述的方法，其中所述的淋巴細胞從血液中分離。
5、 權(quán)利要求1-4任一項所述的方法，其中所述的核心2 GlcNAc-T水平是 核心2 GlcNAc-T酶活水平。
6、 權(quán)利要求l所述的方法，其中受試者淋巴細胞的核心2GlcNAc-T酶活 7JC平是參照7jC平至少2倍表明該受試者具有動脈粥樣硬化。
7、 一種Mil檢觀賅心2 GlcNAc-T的酶活來指示受試者中是否存在動脈粥 樣硬化的試劑盒，其包含有化合物，核心2 GlcNAc-T能夠轉(zhuǎn)運單糖殘基至該化 合物。
8、 權(quán)利要求7所述的試劑盒，其中核心2GlcNAc-T能夠轉(zhuǎn)運單糖殘基至 其上的化合物是G鄧(1,3) GalNAc的衍生物。
9、 權(quán)利要求7或8任一項所述的試劑盒，其中核心2 GlcNAc-T會^多轉(zhuǎn)運 單糖殘基至其上的化合物是Gal卩(U) GalNAc-Bn， Gaip (1,3) GalNAc-，氨 基苯基，Gaip (1,3) GalNAc-戶硝基苯酚，或者是Gaip (1,3) Ga!NAcot-p-NH 丹磺酰苯酚。
10、 權(quán)利要求3-5任一項所述的試劑盒，還包括UDP-GlcNAc。U、權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的UDP-GlcNAc是方夂射性標(biāo)記的。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種指示受試者中是否存在動脈粥樣硬化(特別是冠狀動脈粥樣硬化)的方法，其包括將來自受試者的組織樣本中的核心2GlcNAc-T水平與相同組織中測定的參照水平進行比較。如果來自受試者的組織樣本中的核心2GlcNAc-T的水平高于參照水平，則表明該受試者患有動脈粥樣硬化(特別是冠狀動脈粥樣硬化-冠狀動脈疾病-CAD)。在優(yōu)選實施方式中，樣本由淋巴細胞組成，通過使用放射性標(biāo)記的UDP-GlcNAc以及Galβ(1，3)-GalNAc衍生物將蛋白水平確定為酶活性。
文檔編號G01N33/68GK101213309SQ200680024415
公開日2008年7月2日 申請日期2006年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月6日
發(fā)明者R·奇伯 申請人:英國技術(shù)集團國際有限公司