專利名稱：與再狹窄和動脈粥樣硬化有關(guān)的基因的鑒定的制作方法
1.發(fā)明背景冠狀動脈疾病是西方社會的一種地方性疾病。在該疾病中，向心肌供應(yīng)血液的動脈由于脂肪、纖維化或鈣化物質(zhì)在動脈內(nèi)部的沉積而變得狹窄。這些沉積的形成被稱為動脈粥樣硬化。動脈粥樣硬化減少了通向心臟的血流，使得心肌缺氧，導(dǎo)致心絞痛(胸痛)、或者心肌梗死(心臟病發(fā)作)、或者充血性心力衰竭。
一種通用的用于清理由于動脈粥樣硬化引起阻塞的動脈的治療方法是氣球血管成形術(shù)，正式一些的叫法為“經(jīng)皮冠脈腔內(nèi)成形術(shù)”(PTCA)。該治療方法通過插入一個充氣膨脹的小氣球，使其壓縮和重排動脈壁上的阻塞斑，從而打開被阻塞的動脈。當(dāng)使氣球放氣并移除后，動脈的內(nèi)腔得以擴大，因此改善了血流狀況。每年大約有一百萬例血管成形術(shù)手術(shù)在進行。
在大量的血管成形術(shù)病人中，經(jīng)治療的動脈在六個月內(nèi)再次發(fā)生狹窄，這一過程稱為再狹窄。再狹窄在血管成形術(shù)后很快開始，其中血管內(nèi)腔尺寸增加的部分(動脈內(nèi)打開的通道)由于平滑肌細胞的增殖而逐漸被堵塞。大約20％-30％的血管成形術(shù)病人經(jīng)歷再狹窄，達到了使他們必須進行重復(fù)的血管成形術(shù)甚至是冠狀搭橋(bypass)外科手術(shù)的程度。
再狹窄具有復(fù)雜的病理，在氣球膨脹期間，它由血管壁的牽張誘導(dǎo)的損傷所激發(fā)。其刺激平滑肌細胞的遷移和增殖，從而導(dǎo)致新內(nèi)膜(neointimal)積累(這構(gòu)成再狹窄損傷)。其他促使再狹窄的過程包括炎癥和胞外基質(zhì)的積累。導(dǎo)致血管狹窄的血管壁重建是促成再狹窄的至關(guān)重要的因素。但是，這可以通過在血管成形術(shù)的位點安置預(yù)防血管重建的支架(stent)而得以完全消除。安裝支架(Stenting)在很多醫(yī)療中心、在超過70％的血管成形術(shù)中幾乎成為一種常規(guī)手段。當(dāng)這些血管由于動脈粥樣硬化而狹窄并經(jīng)血管成形術(shù)治療時，再狹窄也會發(fā)生在向腿部供應(yīng)血液的動脈中。
通常，再狹窄通過顯現(xiàn)狹窄的血管得以診斷，通過檢測向血管注射的不透X線染料并完成電影脈搏描記圖(血管造影術(shù))。血管造影術(shù)是一種昂貴的侵入性技術(shù)，需要放射和特殊的裝置以顯現(xiàn)和解釋其結(jié)果。典型性地，如果血管成形術(shù)被認為是成功的，則并不是由于維持了手術(shù)后血管內(nèi)腔的增大，而是僅僅因為手術(shù)后的血管直徑在6-8個月的療程中其狹窄低于50％。
盡管一些因素看起來與再狹窄的發(fā)生相關(guān)，包括糖尿病、所進行治療的次數(shù)、或者是支架(stent)在血管中的位置，但是目前還沒有針對大量病人的可靠的、可預(yù)測的指示物用于指示受試病人是否處于再狹窄形成的高風(fēng)險期。如果可以得到可靠的風(fēng)險預(yù)測，將會對如何治療病人產(chǎn)生重要的影響。對一些被認為面臨發(fā)生再狹窄的高危病人可提供搭橋外科手術(shù)。其他人可以先進行血管成形術(shù)并且使用非常積極的醫(yī)療手段進行治療。另一些人中，短距離放射治療(血管內(nèi)放射)可以被加入到一般的血管成形術(shù)中，該方法通常是為已被鑒定為面臨再狹窄的高危病人保留的，更直接地估計-他們已經(jīng)多處(multipleepisodes)發(fā)生再狹窄。因此，明顯的，人們急切期盼一種新的、改進的用于檢測和治療再狹窄的方法。
最后，普遍共識的是再狹窄和動脈粥樣硬化具有許多共同的和重疊的過程和機制，這兩種情形的關(guān)鍵區(qū)別之一在于相關(guān)動脈的重要功能性狹窄的形成速度。因此，再狹窄可以被用作理解造成動脈粥樣硬化的多種機制的有效模式。
II.發(fā)明概述因此，本發(fā)明的一個目的是提供預(yù)測再狹窄形成風(fēng)險的方法。
本發(fā)明進一步的目的是提供治療再狹窄和減少其復(fù)發(fā)的方法。
為了達到這些目的，提供了一種在哺乳動物中檢測再狹窄的方法，包括測定來自哺乳動物樣品中的至少三個基因的表達水平。再狹窄的存在通過樣品中至少三個、五個、十個、二十個或五十個基因表達的增加或者通過樣品中至少三個、五個、十個、二十個或五十個基因表達的減少得以指示。再狹窄的存在也可以通過樣品中至少三個、五個、十個、二十個或五十個基因表達的改變(增加或減少)而得以指示。這些基因可以選自表1所列基因。
一種基因的基因表達的增加可以比參照水平至少高兩倍、四倍、或十倍。一種基因的基因表達的降低可以是參照水平的至少二分之一或至少十分之一。
一種基因表達的改變，與參照水平相比，當(dāng)增加時，可以比該基因的參照水平至少高兩倍，當(dāng)減少時，可以是該基因水平的二分之一。
在各種情況下，所說的參照水平可以是健康(未狹窄)血管組織的水平。換句話說，參照水平可以由狹窄前(pre-stenotic)水平確定。血管組織可以是血管動脈組織和/或血管靜脈組織。樣品也可以是血液和/或淋巴。
在其他實施方案中，測定方法是基因微陣列、定量PCR，和/或通過樣品中的蛋白表達水平的測定。當(dāng)測定蛋白表達時，一種或多種蛋白可能是可溶蛋白。蛋白表達水平可以通過ELISA確定。
根據(jù)本發(fā)明的另一個目的，本文還提供了一種抑制再狹窄的方法，所述方法包括給患有再狹窄的病人施用抑制平滑肌細胞增殖或新內(nèi)膜增生的組合物，該組合物改變至少一種列于表1中的基因的表達。該組合物可以誘導(dǎo)改善再狹窄效果的基因表達或基因轉(zhuǎn)錄。該組合物可以抑制促進平滑肌細胞增殖和新內(nèi)膜增生的基因。該組合物可以包括一個反義寡核苷酸序列和/或一個與mRNA結(jié)合形成三鏈體(triplex)的寡核苷酸序列。
在一個實施方案中，組合物抑制至少一種促進平滑肌細胞增殖或新內(nèi)膜增生的蛋白的活性。在另一個實施方案中，組合物包括結(jié)合于促進平滑肌細胞增殖或新內(nèi)膜增生的蛋白的抗體。組合物可以包含人抗體、和/或可溶性蛋白受體。在另一個實施方案中，組合物包括用于施用的蛋白，該蛋白補充在再狹窄過程中蛋白減量調(diào)節(jié)導(dǎo)致的蛋白損失。
在進一步的實施方案中，檢測通過使用適合于PCR的試劑盒進行，其中試劑盒包括特異于被表1所列基因鑒定的DNA或RNA序列的擴增的引物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個目的，本文提供了一種用于評價個體中動脈粥樣硬化或再狹窄形成風(fēng)險的方法，該方法包括檢測來自個體的樣品中至少三個、五個、十個、二十個或五十個基因中生物學(xué)意義上重要(biologically important)的多態(tài)性的存在。這些基因可以選自表1所列基因。樣品可以包括個體的淋巴、靜脈或動脈血和/或血管組織。血管組織可以是血管動脈組織。
在一個實施方案中，多態(tài)性通過使用基因微陣列得以檢測。在另一個實施方案中，多態(tài)性通過使用定量PCR得以檢測。
根據(jù)本發(fā)明的另一個目的，本文提供了用于進行上述任意方法的試劑盒。
本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)點在下面的詳細描述中顯而易見。但是，應(yīng)該理解，盡管指出了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，詳細的描述和具體的實施方案只是通過圖例方式給出，因為對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說根據(jù)本發(fā)明詳細的描述，在其要旨和范圍內(nèi)各種變化和修改將是顯而易見的。
附圖
簡述表1列出了在再狹窄形成過程中，其表達發(fā)生可檢測到的改變的基因。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供用于預(yù)測、預(yù)防和治療再狹窄和動脈粥樣硬化的新的、改進的方法。在急性血管損傷的愈合反應(yīng)過程中以及由此在再狹窄和動脈粥樣硬化期間那些改變了表達水平的基因得以鑒定，并且基因表達的變化得以量化。在再狹窄過程中的不同時間點上，基因表達的相對變化得以測量，這些測定使得能夠進一步地了解再狹窄的進展和形成。再者，通過測定基因表達的變化，使得再狹窄(或動脈粥樣硬化)的風(fēng)險性得以測定。
由于血管損傷的愈合反應(yīng)涉及基因的差異表達，表達程度或者基因差異表達時間長度的變化導(dǎo)致異常的愈合模式。在血管壁損傷的前后效應(yīng)中(或如再狹窄中的急性或如動脈粥樣硬化中的慢性)，過度的愈合反應(yīng)促成再狹窄或動脈粥樣硬化的形成?；虮磉_程度或基因差異表達的時間長度的變化由基因中或者基因調(diào)控元件中的多態(tài)性引起的。因此，本發(fā)明鑒定那些其多態(tài)性能夠傳達再狹窄或動脈粥樣硬化形成的易感性的基因。
鑒定與急性血管損傷的愈合反應(yīng)相關(guān)的基因，使得那些部分由基因多態(tài)性引起的表達程度或持續(xù)時間發(fā)生變化的基因，被用作鑒定傳遞再狹窄或動脈粥樣硬化風(fēng)險性改變的遺傳異常性的目標(biāo)。與風(fēng)險性增加相關(guān)聯(lián)的多態(tài)性的鑒定使得可以在血管成形術(shù)程序進行之前對病人形成再狹窄的風(fēng)險性進行預(yù)測，血管成形術(shù)程序前的風(fēng)險性預(yù)測將對病人如何接受治療產(chǎn)生重大的影響。對一些被認為具有非常高的再狹窄風(fēng)險性的病人可提供旁外科手術(shù)。其他人可以先進行血管成形術(shù)并且被施以進攻性的醫(yī)療手段加以治療。在其它一些人中，短程放射治療(血管內(nèi)放射)可以被加入到通常的血管成形術(shù)中，該方法通常是為已被鑒定處于再狹窄的高風(fēng)險期的病人保留的，更直接地估計-他們已經(jīng)具有多種再狹窄癥狀。因此，本發(fā)明提供新的、改進的預(yù)測再狹窄風(fēng)險性的方法。
再者，鑒定在急性血管損傷的愈合反應(yīng)中被激活的基因，為通過有目標(biāo)的抑制那些適當(dāng)?shù)幕蚪M或亞組的表達從而預(yù)防、改善或治療疾病提供了新的方法。此外，本發(fā)明可以通過測定在治療期間基因表達的變化，監(jiān)控再狹窄治療的有效性。
而且，再狹窄和動脈粥樣硬化分享很多共同的和重疊的過程與機制。因此，許多在急性血管損傷的愈合反應(yīng)中差異的表達基因與導(dǎo)致動脈粥樣硬化的慢性血管損傷期間差異表達的基因相同。本發(fā)明因此可以在臨床上明顯的動脈粥樣硬化實際發(fā)生之前；即可檢測的或明顯的相關(guān)心臟動脈或外周動脈狹窄的形成之前檢測到具有動脈粥樣硬化的個人的風(fēng)險性特征。這些信息因此允許預(yù)防性地干預(yù)以防止動脈粥樣硬化，并促進檢測以延緩或改善疾病的進程。
本發(fā)明還允許分析鑒定基因的誘發(fā)動脈粥樣硬化風(fēng)險的多態(tài)性。由于不同的多態(tài)性在不同病人的動脈粥樣硬化形成中的作用不同，本發(fā)明允許可能是具體病人的特征的特異性異常的鑒定。本發(fā)明因此考慮到更多的特異性治療。對一個具有特異多態(tài)性特征的病人可能有效的治療方案，在第二個具有不同多態(tài)性特征的病人身上可能無效。這種特征允許治療被個性化，這樣能夠避免對具體病人無效的治療策略的不必要的副作用。
具體的，大約兩百個基因被鑒定，它們的表達在急性血管損傷愈合反應(yīng)過程中發(fā)生變化，所述反應(yīng)過程是導(dǎo)致再狹窄的內(nèi)在過程。
由于在血管損傷的愈合反應(yīng)中涉及這些基因的差異表達，表達程度上的變化或者差異表達時間長度上的變化可以導(dǎo)致異常的愈合模式。類似于瘢痕傷疤，其上的遺傳預(yù)處理導(dǎo)致皮膚上過多的纖維性組織形成以響應(yīng)皮膚的損傷。在血管壁損傷的前后效應(yīng)中(如再狹窄中的急性或如動脈粥樣硬化中的慢性)，過度的愈合反應(yīng)促成再狹窄或動脈粥樣硬化的形成。
基因表達程度上的變化或者基因差異表達時間長度上的變化能夠通過基因或基因調(diào)節(jié)元件上的多態(tài)性引起。這種傳遞增長的疾病形成風(fēng)險的多態(tài)性，已經(jīng)通過與一些疾病相關(guān)的基因得以鑒定。因此，本發(fā)明鑒定那些其多態(tài)性能夠傳達再狹窄形成的易感性的基因。因此，隨后的關(guān)于再狹窄(或動脈粥樣硬化-見下)預(yù)測的參考文獻，與通過本發(fā)明鑒定的基因或它們的調(diào)節(jié)單元的多態(tài)性相關(guān)。
再狹窄可以通過鑒定至少三個基因的多態(tài)性得以預(yù)測，這些基因的表達在急性血管損傷的愈合反應(yīng)中是增量調(diào)節(jié)的。那些在急性血管損傷的愈合反應(yīng)中至少三個減量調(diào)節(jié)的基因的多態(tài)性鑒定是可以用來預(yù)見再狹窄的。此外，至少三個基因的多態(tài)性鑒定，其中一些是增量調(diào)節(jié)的和一些是減量調(diào)節(jié)的，是再狹窄的預(yù)兆。進一步，一些基因的表達在急性血管損傷的愈合反應(yīng)過程中被改變。
一些被鑒定基因的表達變化是可以預(yù)見的，不僅預(yù)見再狹窄本身的風(fēng)險性，也診斷疾病的形成階段。通過鑒定大約200個基因，其表達在急性血管損傷的愈合反應(yīng)期間改變，并因此在再狹窄的形成過程中改變，發(fā)明人認識到那些基因的更多多態(tài)性分析導(dǎo)致預(yù)測再狹窄形成的能力、確定其形成的可能性的能力以及預(yù)測其最終嚴重性的能力大大提高。由于被鑒定的基因在再狹窄的病因?qū)W中可能起重要作用，操縱這些基因的表達的能力在再狹窄的治療中可能是有效的。治療再狹窄的方法可以包括基因療法以增加疾病過程中減量調(diào)節(jié)基因的表達。治療也可以包括在再狹窄過程中減少增量調(diào)節(jié)基因的表達的方法。減少基因表達的治療可以包括但不限于，反義mRNA的表達，三鏈體的形成或者通過共表達抑制。
涉及再狹窄形成的基因的鑒定也使得可以影響再狹窄形成的蛋白的鑒別成為可能。這種蛋白的鑒定使得使用影響它們的表達或改變它們的代謝的方法成為可能。改變表達蛋白效果的方法包括但不限制于結(jié)合所鑒定蛋白的特異抗體或抗體片段的使用、結(jié)合所鑒定蛋白的特異受體的使用，或者從影響其生理對象、施加其代謝和生物學(xué)作用方面抑制所鑒定蛋白的其它配體或小分子的使用。此外，在再狹窄過程中那些減量調(diào)節(jié)的蛋白可以通過外因的補充以改善其合成的下降。
涉及再狹窄形成基因的鑒定使得預(yù)防地使用影響基因表達或者蛋白功能的方法成為可能。那些方法可以用于治療在再狹窄形成風(fēng)險中的個體。
不同的多態(tài)性可在不同病人的再狹窄形成過程中起作用。所以，本發(fā)明使得作為具體病人特征的特異異常性的鑒定成為可能，其考慮到治療的更大特異性。對一個具有特異多態(tài)性特征的病人可能有效的治療方案在第二個具有不同多態(tài)性特征的病人身上可能無效。那些特征允許治療被個性化，這樣能夠避免對具體病人無效的治療策略的不必要的副作用。
最后，再狹窄和動脈粥樣硬化分享許多共同的、重疊的過程和機制。這兩種病癥的關(guān)鍵區(qū)別之一是相關(guān)動脈功能上重要的狹窄的形成速度。因此，再狹窄可用作理解造成動脈粥樣硬化的多種機制的一種有效模式。所以，在這里公開的每一種方法可以用于預(yù)測動脈粥樣硬化以及再狹窄的發(fā)生。類似的，在這里所公開的治療方法可以用于治療、預(yù)防和/或改善動脈粥樣硬化以及再狹窄的癥狀。
再狹窄中基因表達變化的說明本發(fā)明人鑒定了在急性血管損傷的治愈反應(yīng)過程中表達變化的基因，以及因此在再狹窄過程中發(fā)生變化的基因。那些基因列于表1。發(fā)明者使用如下更詳細的描述對大鼠心臟組織進行了核酸排序分析。
大鼠是一種用于人血管研究的被廣泛接受的模型，從大鼠中所獲得的結(jié)果被認為是在人方面具有高度的可預(yù)見性結(jié)果。因此，人們希望，在急性血管損傷愈合反應(yīng)期間人的基因表達的變化相似于或基本上相同于在大鼠中所觀察到的結(jié)果。這些基因表達程度上的過度變化或者基因差異表達的時間長度上的過度變化將預(yù)示再狹窄。這種過度變化通常由基因或基因調(diào)節(jié)元件上的多態(tài)性引起，因此，在急性血管損傷愈合反應(yīng)期間被認為是受到不同調(diào)節(jié)的大鼠基因?qū)⑴c那些其多態(tài)性被認為是傳遞了再狹窄的易感性的人的基因同源。再者，對于表1中所描述的每一種基因來說大鼠和人兩者的同源性是已知的，進一步顯示，在大鼠研究中所獲得的結(jié)果將會在人中產(chǎn)生高的預(yù)見性結(jié)果。
由于再狹窄和動脈粥樣硬化分享很多過程和機制，以及兩者分享來自血管損傷的結(jié)果，在大鼠急性血管損傷愈合反應(yīng)模型中被鑒定的異常表達的基因也將是易感動脈粥樣硬化的異常表達的基因。特異異常性通過鑒定這些與動脈粥樣硬化相聯(lián)系的基因的多態(tài)性而確定。那些基因也作為治療性干涉的靶目標(biāo)-那些在急性血管損傷愈合反應(yīng)期間增量調(diào)節(jié)的基因通過被設(shè)計用于降低基因表達或降低由這些基因編碼的蛋白的功能的療法而目標(biāo)化(targeted)；那些在急性血管損傷愈合反應(yīng)期間減量調(diào)節(jié)的基因可以通過被設(shè)計用于增加基因表達或增加編碼這些基因的蛋白功能的療法而目標(biāo)化。
在實驗誘導(dǎo)急性血管損傷期間大鼠頸動脈中基因表達的變化得以研究，模型通常被作為模擬在人中同樣發(fā)生的再狹窄的合理的動物模型而被接受。獲得樣本和對照大鼠頸動脈組織，RNA從組織中制備，被標(biāo)記的cRNA從中產(chǎn)生，使用Affymetrix Genechip大鼠基因組U34A組分析。樣本和對照組織進行比較，并且那些在基因表達中經(jīng)歷明顯變化的基因得以鑒定。為了這一研究目的，在基因表達中兩倍的增加或者降低被認為是有顯著的，盡管本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認識到在某些環(huán)境中基因表達中的更小的變化也可以是顯著的。與確定具有表達顯著變化的各個基因相應(yīng)的人類基因得以鑒定。
既然在急性血管損傷愈合反應(yīng)過程里在表達中產(chǎn)生變化的基本上完整的一套基因得以鑒定，通過研究那些基因的更小的亞組的變化從而預(yù)測再狹窄和/或動脈粥樣硬化形成的風(fēng)險性是可能的。所以，盡管大約200個基因顯示出在再狹窄中表達的改變，通過分析這些包含少至三個成員的基因亞組從而獲得再狹窄風(fēng)險性的可靠預(yù)測是有可能的。在其他實施方案中，至少五個、十個、十五、二十或者五十個基因可以被用于研究或者，如果希望，所有或者大部分列于表1的基因都能夠被用于研究。再者，這些基因也能夠被用于分析與再狹窄和動脈粥樣硬化相聯(lián)系的多態(tài)性。所有這些基因能夠被用于最初的分析，而可靠的預(yù)測能夠通過分析包含少至三個基因的基因亞組而獲得。在其他實施方案中，至少三個、五個、十個、十五、二十或者五十個基因可以被用于研究或者，如果希望，全部或者大部分列于表1的基因能夠被用于研究，例如，使用排序的、短的串聯(lián)重復(fù)聯(lián)合研究，單核苷酸多態(tài)性聯(lián)合研究等等。但是，在各種情況下，通常更加便利的是研究更小的亞組基因的基因表達或者多態(tài)性。
通過測定一組基因的表達變化(或者通過鑒定影響基因組表達的多態(tài)性)，而不是單個基因，本發(fā)明提供了提高的統(tǒng)計學(xué)上的可信度觀察到的變化可預(yù)測形成中的再狹窄和動脈粥樣硬化的風(fēng)險性--即提供可靠的個體風(fēng)險性特征。從而單個基因表達上的變化，或者單個基因的多態(tài)性，可不增加對疾病的易感性，足以跨過疾病形成的閾值。另一方面，由于多重多態(tài)性的存在，多個特異基因表達的協(xié)同變化更加有可能增加再狹窄和動脈粥樣硬化的風(fēng)險性。這就類似于個體只有一個誘發(fā)動脈粥樣硬化風(fēng)險性因素的狀態(tài)(增高的膽固醇)。隨著風(fēng)險因子數(shù)目的增加，風(fēng)險性顯著增加(增高的膽固醇加上高血壓、肥胖、吸煙、糖尿病等等)。
通過測定基因表達和/或影響這些基因表達的多態(tài)性的存在，在進行血管成形術(shù)步驟之前預(yù)測再狹窄形成的風(fēng)險性以及在臨床上可檢測得到的動脈粥樣硬化形成之前預(yù)測動脈粥樣硬化的風(fēng)險性是可能的。這種早期預(yù)測提供給臨床醫(yī)生減緩或停止再狹窄或動脈粥樣硬化形成的時機。進一步，本發(fā)明提供了能夠用于抑制、減緩或預(yù)防再狹窄以及動脈粥樣硬化的新組合物。
提高對再狹窄和動脈粥樣硬化的易感性的多基因的調(diào)節(jié)異常導(dǎo)致基因表達中生物學(xué)意義上重要的過度變化的基因多態(tài)性能夠直接在病人樣本中測定，其表達的基因是在急性血管損傷愈合反應(yīng)期間不同差異表達的基因，并且由此誘發(fā)再狹窄或動脈粥樣硬化。這些樣品包括最方便地從外周血中獲得的DNA。本發(fā)明者使用核酸陣列方法鑒定一套完整的在急性血管損傷愈合反應(yīng)期間顯現(xiàn)明顯表達變化的基因。但是，其他測定基因表達變化的方法在本領(lǐng)域中是已知。例如，蛋白水平能夠使用定量免疫分析如ELASA在組織樣本分離物中以測定。使用ELISA方法測定許多蛋白水平的試劑盒可以從供應(yīng)者商業(yè)購得，如R&D系統(tǒng)(Minneapolis，MN)并且ELISA方法也能夠使用已知的技術(shù)得以開發(fā)。例如參見抗體實驗室手冊(AntibodiesA Laboratory Manual(Harlow and Lane Eds.Cold SpringHarbot Press))。那些用于ELISA方法中的抗體或者從商業(yè)上獲得或者使用已知方法制備。
其他多蛋白定量分析方法包括，例如，proteomics技術(shù)如同位素編碼的親和標(biāo)簽試劑，MALDI TOF/TOF串聯(lián)質(zhì)譜，以及二維-凝膠/質(zhì)譜技術(shù)。這些技術(shù)可以商業(yè)獲得，例如從Large Scale Proteomics Inc(Germantown MD)以及Oxford Glycosystems(Oxford UK)。
可選地，定量mRNA擴增方法，例如定量RT-PCR，能夠用于測定在信息水平基因表達的變化。進行這些方法的系統(tǒng)也可以從商業(yè)上獲得，例如TaqMan系統(tǒng)(Roche Molecular系統(tǒng)，Alameda，CA)以及Light Cycler系統(tǒng)(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)。設(shè)計用于RT-PCR的合適引物的方法以及相關(guān)方法是本領(lǐng)域已知的，尤其是，一些商業(yè)上可獲得的軟件包可用于設(shè)計PCR引物序列。
核酸陣列的提出提供了一種研究多基因表達的引人注目的方法。特別是，陣列為大量基因表達的同時測定提供了一種方法。這些方法現(xiàn)已為本領(lǐng)域所熟知，商品化的系統(tǒng)也是可以獲得的。例如從Affymetrix(Santa Clara，CA)，Incyte(Palo Alto，CA)，Research Genetics(Huntsville，Al)以及Agilent(Palo Alto，CA)。也可參見美國專利5445934、5700637、6080585、6261776，它們由此被全部引入作為本文的參考。
基因表達程度的變化或者基因差異表達時間長度的變化可由基因或基因調(diào)節(jié)元件上的多態(tài)性引起。對于與一些疾病有關(guān)的基因，這種傳遞疾病形成增加的風(fēng)險性的多態(tài)性已被鑒定。因此，本發(fā)明鑒定那些其多態(tài)性能夠傳遞再狹窄或動脈粥樣硬化形成的易感性的那些基因。
利用核酸陣列研究再狹窄中改變表達的一組基因，總RNA或mRNA樣品從心臟組織獲得，并使用本領(lǐng)域中已知的方法進行分析。例如，合適的心臟組織樣品，如頸動脈，能夠通過活組織檢查獲得。總RNA能夠使用商業(yè)購買的試劑盒獲得，例如Triazol試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA)以及mRNA能夠通過在寡(dT)纖維素上層析從樣品中獲得。反轉(zhuǎn)錄RNA，得到的cDNA用于擴增的步驟。在一個實施方案中，擴增通過線性RNA擴增方法，像美國專利US5716785和5891636，它們由此被全部引入作為本文的參考。制備擴增的RNA的詳細說明是可以獲得的，例如，在使用AffymetrixGeneChip系統(tǒng)制備用于分析的樣品的生產(chǎn)商的說明中。
一旦獲得了合適的核酸樣品，基因表達特征按照制造商的說明通過核酸陣列得以確定。在該樣品中，它為陣列上的每一個基因探針提供了定量的基因表達水平。然后各個基因的表達水平與基準(zhǔn)值進行比較以確定是否表達被改變了。因此，在研究中組織里的基因表達水平能夠與在沒有發(fā)生再狹窄的健康組織里的那些基因的參照水平進行比較。優(yōu)選地，這些參照水平從同樣的基因獲得，盡管使用來自不同主體的參照水平是可能的。在這種情況下，優(yōu)選的是使用來自盡可能與測試主體接近的主體的參照水平，例如，在人口統(tǒng)計學(xué)標(biāo)準(zhǔn)中的像年齡、性別、種族等。
盡管測定絕對的基因表達水平是有可能的，測定相對基因表達水平往往更為方便。因此，陣列上的具體基因的表達水平與相同陣列上的參照基因進行比較，參照基因的表達已知在再狹窄中不受影響，。例如，一種沒有在表1中顯示的基因。這為陣列提供了一種內(nèi)在控制機制，降低了由于陣列、測定條件等的變異性導(dǎo)致的任何結(jié)果的差異。
在各種情況下，基因表達水平與適當(dāng)?shù)谋磉_基準(zhǔn)水平比較。表達基準(zhǔn)水平是能夠在健康血管組織中發(fā)現(xiàn)的水平，是先于血管成形術(shù)而測定的水平，從健康個體庫中測定的整體濃度或其他一些客觀基準(zhǔn)。
鑒定基因多態(tài)性的方法在本領(lǐng)域中是已知的。例如，參見美國專利6235480和6268146，它們被引入作為參考。一旦多態(tài)性被鑒定，利用核酸陣列檢測基因特異多態(tài)性的方法也是本領(lǐng)域中已知的。
因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種方法，其中對選自表1所列基因中的至少三個基因的表達進行測定。這些基因能夠以組合的方式選擇，例如(i)所有三個基因表達的提高指示再狹窄；(ii)所有三個基因表達的降低指示再狹窄；(iii)一些基因表達下降與剩余的所選基因表達的提高相結(jié)合指示再狹窄，或(iv)在血管成形術(shù)初期或稍稍之后，一些基因表達的降低和其他一些基因表達的增加，隨后那些減量調(diào)節(jié)基因表達的增加以及起初增量調(diào)節(jié)的基因表達的下降，指示再狹窄的形成。在本發(fā)明的其他實施方案中，至少5個基因或者至少大約5個基因的表達被測定以確定再狹窄的形成。在進一步的實施方案中被測定的基因數(shù)為10個。在其他實施方案中，被測定的基因數(shù)是20或者至少約為20。在其他實施方案中，被測定的基因數(shù)是50或至少約為50。不論被分析的基因亞組中基因數(shù)目多少，表達特征滿足診斷上文陳述的疾病的標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)(i)一些基因的表達在整個疾病過程中增加；(ii)一些基因的表達在整個疾病過程中下降；(iii)一些基因的表達增加，而其它基因的表達降低；或(iv)在疾病形成過程中一些基因的表達發(fā)生改變。
本發(fā)明還提供了一種方法，其中選自表1所列基因的至少三個基因的多態(tài)性的存在得以測定。然后多態(tài)性的合計數(shù)目能夠用來提供再狹窄或動脈粥樣硬化的風(fēng)險性評價。有越多的具有生物學(xué)顯著性的多態(tài)性存在，就有越大的風(fēng)險性。由于更多的表1所列基因的多態(tài)性得以鑒定，甚至更大的風(fēng)險性征兆將是可能的。因此，在本發(fā)明的其他實施方案中，至少五個基因或至少大約五個基因的表達被測定以確定再狹窄或動脈粥樣硬化形成的風(fēng)險性。在進一步的實施方案中被測定的基因數(shù)目是十。在其他實施方案中被測定的基因數(shù)目是20或至少大約是20。在其他實施方案中被測定的基因數(shù)目是50或至少大約50。
當(dāng)基因的多態(tài)性集合數(shù)目列于表1時，這些基因以生物學(xué)顯著性的方式過度基因表達并且誘發(fā)再狹窄或動脈粥樣硬化的形成，則不論用于分析的基因亞組中基因數(shù)目的多少，多態(tài)性特征滿足用以確定上文陳述的形成再狹窄或動脈粥樣硬化的風(fēng)險性的標(biāo)準(zhǔn)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會認識到由于再狹窄和動脈粥樣硬化的不同性質(zhì)，并不是所有具有再狹窄或動脈粥樣硬化的個體都將表現(xiàn)出表1所列出的每一種基因的改變的表達。因此，可能一種、幾種或很多基因不表現(xiàn)出顯著的改變的表達(并且由此將不包含具有生物學(xué)意義上重要的多態(tài)性)，并且不同的個體將表現(xiàn)出不同的多態(tài)性結(jié)合。但是，在所有基因的表達中，多態(tài)性誘導(dǎo)的協(xié)同變化對再狹窄和動脈粥樣硬化的形成的存在具有高度的預(yù)見性。
概括地說，當(dāng)對僅相對少量的基因表達進行研究時，必須觀察大部分或者所有基因表達的變化以提供對再狹窄和動脈粥樣硬化的可靠診斷。例如，當(dāng)只有三個基因被測定時，所有三個基因必須顯示表達中的相關(guān)變化以允許進行再狹窄和動脈粥樣硬化的可靠診斷。當(dāng)僅研究五個基因時，至少四個基因的典型變化將提供可靠的診斷。當(dāng)十個基因被測定時，觀察到至少七個基因變化時獲得了可靠的診斷。當(dāng)超過十個基因被測定時，被測定基因的90％、80％、70％、60％或50％變化可預(yù)測再狹窄和動脈粥樣硬化。當(dāng)這些百分比降低時，診斷的可靠性也下降，但是熟練的技術(shù)人員將認識到，當(dāng)觀察到表1所列基因中的20或30個基因表達的協(xié)同變化時，則具有高度的再狹窄預(yù)見性。一般地，隨著基因數(shù)量的增加，通過觀察被研究的相對較小的基因亞組中表達的協(xié)同變化來提供有效的診斷是可能的。
一般地，當(dāng)僅研究相對少量的基因的生物學(xué)意義上重要的多態(tài)性時(導(dǎo)致誘發(fā)再狹窄或動脈粥樣硬化)，必須觀察大多數(shù)或者所有基因的多態(tài)性以提供可靠的形成再狹窄和動脈粥樣硬化的風(fēng)險性的評價。例如，當(dāng)只有三個基因被測定，所有三個基因一定要顯示相關(guān)多態(tài)性以允許進行再狹窄或動脈粥樣硬化形成風(fēng)險的可靠評價。當(dāng)五個或者十個相關(guān)多態(tài)性得以鑒定，這種多態(tài)性的數(shù)目越多，個體形成再狹窄或動脈粥樣硬化的評價的風(fēng)險性就更大。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認識到，當(dāng)在列于表1基因的20或30個基因的表達中觀察到協(xié)同變化(作為生物學(xué)意義上重要的多態(tài)性結(jié)果)，則具有高度的再狹窄或動脈粥樣硬化形成風(fēng)險的預(yù)見性。
組織取樣以確定改變的基因表達以及在相關(guān)基因表達中引起生物學(xué)意義上重要的改變的多態(tài)性的存在盡管包含核酸的任意樣品適用于該目的，取樣的最簡單組織是外周靜脈或動脈血。但是，組織像血管組織，尤其是動脈血管組織或靜脈血管組織可以被使用。
改變的基因表達的意義術(shù)語增加的表達、降低的表達或者改變的表達意味著在所鑒定的基因中，與對照或非再狹窄動物中的基因表達相比，有至少兩倍或者大約兩倍的差別?；虮磉_的變化可以比參照水平高至少4倍或大約4倍。在其他實施方案中，基因表達的變化高于參照水平至少是十倍或大約十倍。因為一些被鑒定的基因是減量調(diào)節(jié)的，術(shù)語降低表達意味著在表達上那些基因與對照值相比降低了至少兩倍或至少大約兩倍。在其他實施方案中，術(shù)語降低的表達意味著在表達上那些基因與參照值相比降低了至少十倍降低或大約十倍。
參照水平的確定用于本發(fā)明方法中的參照水平是在相對健康血管組織中的基因表達水平。這可以意味著在狹窄前(pre-stenotic)組織的基因表達水平，或可以意味著在血管成形術(shù)之前基因表達的水平。參照水平可以通過由健康個體測定得來的整體值加以確定。
研究基因表達和列于表1的基因多態(tài)性的方法基因表達可以在核酸(RNA)水平或者蛋白水平進行研究。盡管每個細胞核攜帶完整一套基因，只有那些在每個細胞中表達的基因被轉(zhuǎn)錄成mRNA，mRNA然后被翻譯成蛋白。因此，基因表達是組織或者甚至是細胞特異的。一般的，認為被轉(zhuǎn)錄的RNA分子數(shù)量越多，從中翻譯成蛋白分子的數(shù)量越多。因此，使用RNA或者蛋白質(zhì)分析獲得的結(jié)果是相同的，至少根據(jù)基因表達水平的相對變化是相同的。因此，基因表達的分析可以通過具體的mRNA轉(zhuǎn)錄量或者由此翻譯成的蛋白量指示。
多態(tài)性能夠通過一些方法包括測序、短的串聯(lián)重復(fù)結(jié)合研究、單核苷酸多態(tài)性結(jié)合研究等得以鑒定。這些方法在本領(lǐng)域中是已知的。
基因表達也能夠在蛋白水平進行研究。盡管每個細胞核攜帶一整套基因，只有那些在每個細胞中表達的基因被轉(zhuǎn)錄成mRNA，mRNA然后被翻譯成蛋白質(zhì)。因此，基因表達是組織或者甚至是細胞特異的。一般的，認為被轉(zhuǎn)錄的RNA分子越多，從中翻譯成蛋白分子的數(shù)量越多。因此，至少在基因表達水平的相對變化方面，使用蛋白分析獲得的結(jié)果應(yīng)是相同的。因此，基因表達的分析可以通過具體的mRNA轉(zhuǎn)錄量或者由此翻譯成的蛋白量指示。但是，盡管基因多態(tài)性可以使用來自各種來源的組織包括外周血進行可靠地檢測，用以確定基因表達水平相應(yīng)變化的mRNA或者由表1所列任何基因編碼的蛋白的測定精密地依賴于所采的組織樣本。盡管對于一些發(fā)生在再狹窄或動脈粥樣硬化形成位點的改變的基因表達的認識可以從采集和測定外周血樣品獲得，改變的基因表達的更可靠的評價從采集事實上形成再狹窄或動脈粥樣硬化的動脈樣品獲得。
RNA表達從組織中分離RNA的方法在本領(lǐng)域中是已知的。例如，參見Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual(Third Edition)Cold spring Harbor Press，2001。也可使用商品試劑分離RNA。
簡要地講，例如，細胞或組織被溶解，溶解的細胞離心至移走細胞核沉淀?；厥丈锨逡翰⑶矣帽椒?氯仿抽提核酸，接著用乙醇沉淀。該方法提供能夠通過260-280nM光密度定量測定的總RNA。
mRNA能夠通過使用一些商品上可獲得的試劑盒利用mRNA的“PolyA”尾從總RNA中分離獲得。QIAGEN mRNA Midi試劑盒(Cat.No.70042)；Promaga PolyATtractmRNA分離系統(tǒng)(Cat.No.Z5200)。QIAGEN試劑盒提供了使用被設(shè)計用于分離polyA mRNA的Oligotex Resin的旋轉(zhuǎn)柱(spin column)，在30分鐘內(nèi)從總RNA中獲得了基本上純的mRNA。Promega系統(tǒng)使用生物素化的寡dT探針與mRNA polyA尾雜交，需要大約45分鐘分離并獲得純的mRNA。
還可以使用氯化銫墊層(cushion)梯度方法分離mRNA。簡言之，如果瞬間冷凍組織在Guanethedium異硫氰酸鹽中均化，在氯化銫墊上分層，并超離心24小時獲得總RNA。
基因微陣列分析微陣列技術(shù)是鑒定單個mRNA樣品中多基因表達的非常有效的方法。例如，從Affymetrix Inc.(Santa Clara，Ca)商業(yè)獲得的基因芯片(Gene Chip)技術(shù)使用了由針對數(shù)以千計的已知基因和表達序列標(biāo)簽(ESTs)的探針鋪敷的芯片。制備生物素化的cRNA(線性擴增的RNA)并與芯片上的探針雜交。然后顯現(xiàn)互補序列并且信號的強度與由基因表達的mRNA的拷貝數(shù)量相當(dāng)。
定量PCR
定量PCR(qPCR)利用靶序列與系列稀釋的參照模板的共擴增。通過將靶定的擴增產(chǎn)物插入?yún)⒄障♂屛锏那€圖，可以估計靶序列的濃度值。定量反轉(zhuǎn)錄PCR(RTPCR)可以使用試劑盒以及商業(yè)上可獲得的方法在mRNA上進行。例如，Applied BioSystems(Foster City，CA)和Stratagene(La Jolla，CA)。也參見Kochanowsi，“定量PCR方案”(Quantitative PCR Protocols)Humana Press，1999。例如，可以使用任意六聚體和TaqMan反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Perkin Elmer)根據(jù)操作流程進行總RNA反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)操作流程，使用包含AmpErase UNGdNTP、AmpliTaq Gold、引物以及TaqMan探針的TaqMan PCR主混合物擴增cDNA。TaqMan探針是靶基因序列特異的并且使用熒光報告基因(FAM)在5’末端標(biāo)記并且在3’末端淬滅(舉例來說，TAMRA)。可構(gòu)建內(nèi)源對照和靶基因兩者的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖并且靶基因的CT(極限循環(huán)數(shù)量)比率同處理和未處理的細胞中對照的比較得以確定。該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于描述基因表達的特征。
蛋白表達基因表達也可以在蛋白水平上研究。目標(biāo)組織首先被分離，然后總蛋白通過已知的方法被抽提出來。
完成定量分析，例如，使用利用一對特異于靶蛋白的抗體的ELASA方法。
列于表1的蛋白亞組是可溶解或分泌的。在這種情況下，蛋白可以發(fā)現(xiàn)于血液、血漿或淋巴，那些蛋白的分析可以通過任意一種描述用于在這種組織中進行蛋白分析的方法獲得。其提供了獲得用于評價再狹窄和動脈粥樣硬化形成風(fēng)險性的病人樣本的最低限度的侵入性方法。用于鑒別分泌蛋白的方法在本領(lǐng)域中是已知的。
再狹窄的治療急性血管損傷的愈合反應(yīng)期間，改變表達的一組基因的鑒定為治療再狹窄和動脈粥樣硬化提供了新的機會。急性血管損傷的愈合反應(yīng)期間增量調(diào)節(jié)的基因的鑒定提供了使用負面影響它們的轉(zhuǎn)錄和翻譯的方法的能力。類似的，在急性血管損傷的愈合反應(yīng)過程中減量調(diào)節(jié)的基因的鑒定提供了正面影響它們的表達的能力。最后，這些基因編碼的蛋白質(zhì)的確定允許使用合適的方法改善和加強蛋白質(zhì)的活性，因此能夠影響再狹窄和動脈粥樣硬化的形成。
增強基因表達的方法對于在急性血管損傷的愈合反應(yīng)期間表現(xiàn)為表達下降的基因，通過增強一種或多種這些基因的表達從而改善或預(yù)防再狹窄或動脈粥樣硬化是可能的?？梢酝ㄟ^多種方式對基因轉(zhuǎn)錄進行有目的的修飾。例如，基因的外源拷貝可以通過同源重組以基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方式插入到血管組織的細胞基因組中。盡管通過基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方式獲得的表達是相對穩(wěn)定的，但表達也是低效率的。一種可選擇的方法是基因被插入到載體中的瞬時轉(zhuǎn)導(dǎo)方式，考慮到基因組等位基因的轉(zhuǎn)錄獨立性，使用載體特異性啟動子。盡管瞬時轉(zhuǎn)導(dǎo)通常具有更高的表達，但是基因維持的時間周期很短，即使使用包含真核轉(zhuǎn)錄起始的游離型載體為載體提供更長的持續(xù)時間。還有另一種方法是用裸露DNA轉(zhuǎn)染。但是，該方法通常導(dǎo)致極低的表達，并且DNA似乎被快速降解。
抑制基因表達的方法本發(fā)明提供一種對在急性血管損傷的愈合反應(yīng)期間增量調(diào)節(jié)的基因表達產(chǎn)生負面影響的能力。減量調(diào)節(jié)基因的方法是已知的。已顯示導(dǎo)入細胞的反義RNA將結(jié)合互補mRNA并由此抑制分子的翻譯。以類似的方式，反義單鏈cDNA可以導(dǎo)入細胞，產(chǎn)生同樣的結(jié)果。進一步的，因為異位整合的序列破壞內(nèi)源基因的表達，可影響通過同源轉(zhuǎn)基因的基因共抑制。(Cogoni等，Antonie van Leeuwenhoek，1994；65(3)205-9)，也可以導(dǎo)致反義RNA的轉(zhuǎn)錄(Hamada and Spanu，Mol.Gen Genet 1998)。最近報道了使用短的干擾RNA(RNAi)特異地抑制基因在真核細胞中的表達的方法。參見Tuschl等，Nature411494-498(2001)。
此外，穩(wěn)定的三螺旋結(jié)構(gòu)能夠通過寡聚脫氧核糖核酸(ODNs)與雙鏈DNA的多嘌呤區(qū)結(jié)合而形成。(例如，參見Rininsland，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 945854-5859(1997))。三鏈體的形成能夠通過抑制轉(zhuǎn)錄延伸而抑制DNA復(fù)制并且它是非常穩(wěn)定的分子。
抑制特異蛋白活性的方法當(dāng)特異蛋白被牽連在再狹窄和動脈粥樣硬化的路徑中，其活性可以通過幾種方法改變。首先，可使用特異型抗體與蛋白結(jié)合，而阻礙其活性。這種抗體可以通過常規(guī)的雜交技術(shù)獲得或者可以從商業(yè)購得的文庫中分離獲得，所述文庫購自Dyax(Cambridge，MA)，MorphoSys(Martinsried，Germany)，Biosite(San Diego，CA)和CambridgeAntibody Techmology(Cambridge，UK)。此外，蛋白通常通過連接到細胞受體而發(fā)揮其細胞作用。識別受體與本發(fā)明所包含的促成再狹窄和動脈粥樣硬化的蛋白結(jié)合，允許特異配體拮抗物的設(shè)計，該拮抗物阻斷調(diào)節(jié)導(dǎo)致再狹窄和動脈粥樣硬化形成的作用的通路。
急性血管損傷愈合反應(yīng)期間減量調(diào)節(jié)的基因的鑒定導(dǎo)致鑒定其蛋白產(chǎn)物的能力，減量調(diào)節(jié)蛋白然后被補充，由此改善其降低合成的作用。
可預(yù)防性地使用本發(fā)明的方法以防止處在風(fēng)險中的個體形成再狹窄和動脈粥樣硬化。
本發(fā)明還提供了具有芯片的試劑盒，該芯片包含對表1中鑒定的基因有生物學(xué)意義上重要的多態(tài)性的DNA(DNA of the biologicallyimportant polymorphisms for the genes identified in Table 1)。這種芯片允許多態(tài)性的快速檢測，提供快速檢測那些處于再狹窄或動脈粥樣硬化形成的低或高風(fēng)險中的個體的便利方法。在具體的病人中，特異多態(tài)性的檢測將允許對各個病人設(shè)計高度特異性和個性化的治療方案，以預(yù)防或削弱再狹窄或動脈粥樣硬化。
這樣一般描述的本發(fā)明，將通過參考如下的實施例更容易地理解，這些實施例以圖例的方式提供，并無意于限制本發(fā)明。
實施例頸動脈再狹窄的微陣列分析RNA的分離大鼠被分成兩組。一種使用頸動脈血管成形術(shù)治療，對照組通過假外科手術(shù)治療。外科手術(shù)和假外科手術(shù)之后大鼠頸動脈被收集并被瞬時冷凍。合并的頸動脈(30-50mg)用研缽和杵研磨成粉末(用液氮收集)然后在2.5ml異硫氰酸胍中均化。4℃下，使用氯化銫墊層梯度超速離心24小時抽提總RNA。參見上文Sambrook等。
靶物制備和DNA微陣列雜交對于第一鏈cDNA合成反應(yīng)，5.0-8.0μg總RNA用T7-(dT)24引物在70℃下孵育10分鐘，然后置于冰上。對于溫度調(diào)節(jié)步驟，加入5倍第一鏈cDNA緩沖液、0.1M DTT、和10mM dNTP混合物，該反應(yīng)在42℃溫度下孵育1小時。SSII反轉(zhuǎn)錄被加入，該反應(yīng)在42℃溫度下孵育1小時。隨著第一鏈合成的完成，5X第二鏈反應(yīng)緩沖液，10mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP、DNA連接酶、DNA聚合酶I以及RNaseH被加入到反應(yīng)試管中。樣本在16℃中孵育。加入0.5M的EDTA后，使用鎖相凝膠-苯酚/氯仿抽提清洗cDNA，隨后乙醇沉淀。
生物素標(biāo)記的cRNA的合成(體外轉(zhuǎn)錄)使用購自(ENZO Biochem，Inc.，New York，NY)的ENZO BioArrayRNA轉(zhuǎn)錄標(biāo)記試劑盒，根據(jù)廠商手冊完成生物素標(biāo)記的cRNA的合成。為了建立反應(yīng)，1μg的cDNA、10倍HY反應(yīng)緩沖液、10倍的生物素標(biāo)記核苷酸、10倍DTT、10倍RNA酶抑制劑混合物以及20倍T7 RNA聚合酶在37℃溫度下孵育4-5小時。使用購自QIAGEN的RNeasy旋轉(zhuǎn)柱純化標(biāo)記的RNA，隨后乙醇沉淀并定量。
用于靶物制備的cRNA片段片段將5倍的片段緩沖液(200m Tris-醋酸，pH 8.1，500mM KOAc，150mM Mg)Ac)加入cRNA。樣品在94℃溫度下孵育35分鐘，然后置于冰上。片段化的cRNA儲存在-70℃。
靶物雜交雜交混合物制備如下片段化的cDNA(調(diào)成15μg)、對照寡核苷酸B2(Affymetrix)、20倍真核雜交對照(Affymetrix)、鯡精DNA、乙?；疊SA、2倍雜交緩沖液(Affymetrix)混合，加熱至99℃5分鐘。
雜交混合物然后以最大速度離心5分鐘以從混合物中除去任何不溶物質(zhì)。離心后，混合物在45℃加熱5分鐘。然后將澄清的雜交混合物加入Affymetrix U34A探針陣列柱體，該柱體用1倍的雜交緩沖液預(yù)濕。然后將探針陣列置于設(shè)定在60rpm的45℃烘箱爐中雜交16小時。
沖洗、染色和掃描探針陣列GeneChipFluidics Station 400被用于洗滌和染色該陣列。該裝置使用GeneChip軟件運行。簡言之，陣列用非嚴格洗滌緩沖液在25℃下洗滌10個循環(huán)，接下來用嚴格洗滌緩沖液50℃洗滌4個循環(huán)。然后該陣列用藻紅蛋白鏈霉胍在25℃下染色10分鐘。然后用非嚴格洗滌緩沖液在25℃下洗滌10個循環(huán)。該探針陣列用藻紅蛋白鏈霉胍在25℃下染色10分鐘，然后用非嚴格洗滌緩沖液在30℃下洗滌15個循環(huán)。通過將探針陣列置于HP Gene ArrayTM掃描儀中檢測雜交信號，該掃描儀用GeneChip軟件操縱。
數(shù)據(jù)分析根據(jù)廠商說明使用GeneChip軟件(3.3版)進行數(shù)據(jù)分析。Lockhart，D.J.等，Nat.Biptechnol.141675-80(1996)。簡言之，每個基因通過芯片上的1-3個探針組得到描述和分析。每個探針組包括16個最佳匹配(PM)和16個錯配(MM)的25個核苷酸堿基探針。錯配在25個堿基對探針中具有單個堿基變化。比較了來自PM和MM探針的雜交信號，這使之可以測定特異性的信號強度，并從兩個對照芯片中的消除非特異性雜交。每個探針對的強度差別以及強度比率被用于“存在”或“缺失”的命名。對照被用做基線，并且用于實驗的GeneChip測定值與基線比較得出4個矩陣(matrixes)，該矩陣用于確定顯示具體基因的轉(zhuǎn)錄水平是否改變的不同命名。
使用電子制表軟件分析(Microsoft Excel)進行重復(fù)的比較。每個實驗數(shù)據(jù)在特定時間點設(shè)定，測定各個基因的對照和試驗之間表達的差異。與所有四對比較交叉的具有一致差異的基因被提出用于進一步分析。
GeneSpring分析將從每個GeneChip測定獲得的數(shù)據(jù)加入GeneSpring軟件，并分析基于瞬時表達特征收集的基因。0.97或者更高的相關(guān)系數(shù)被視為建立具有顯著表達同源性的基因簇的界限。
本申請要求美國申請60326210的優(yōu)先權(quán)，其全文被引入作為參考。
權(quán)利要求
1.一種在哺乳動物中檢測再狹窄的方法，包括測定來自所述哺乳動物樣品中至少三個基因的表達水平。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中再狹窄的存在通過在所述樣品中至少三個基因的增加的表達顯示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中再狹窄的存在通過在所述樣品中至少五個基因的增加的表達顯示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中再狹窄的存在通過在所述樣品中至少十個基因的增加的表達顯示。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中再狹窄的存在通過在所述樣品中至少二十個基因的增加的表達顯示。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中再狹窄的存在通過在所述樣品中至少三個基因降低的表達顯示。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中再狹窄的存在通過在所述樣品中至少五個基因的降低的表達顯示。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中再狹窄的存在通過在所述樣品中至少十個基因的降低的表達顯示。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中再狹窄的存在通過在所述樣品中至少二十個基因的降低的表達顯示。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中再狹窄的存在通過在所述樣品中至少三個基因的改變的表達顯示。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中再狹窄的存在通過在所述樣品中至少五個基因的改變的表達顯示。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中再狹窄的存在通過在所述樣品中至少十個基因的改變的表達顯示。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中再狹窄的存在通過在所述樣品中至少二十個基因的改變的表達顯示。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中再狹窄的存在通過在所述樣品中至少五十個基因的改變的表達顯示。
15.根據(jù)任一權(quán)利要求1-14的方法，其中所述基因選自表1所列的基因。
16.根據(jù)任一權(quán)利要求1-14的方法，其中所述樣品包括所述哺乳動物的血管組織。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-16的方法，其中所述血管組織是血管動脈組織。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-16的方法，其中所述血管組織是血管靜脈組織。
19.根據(jù)權(quán)利要求2-5任一項的方法，其中所述增加的表達比參照水平至少高兩倍。
20.根據(jù)權(quán)利要求2-5任一項的方法，其中所述增加的表達比參照水平至少高四倍。
21.根據(jù)權(quán)利要求2-5任一項的方法，其中所述增加的表達比參照水平至少高十倍。
22.根據(jù)權(quán)利要求6-9任一項的方法，其中所述降低的表達至少是參照水平的一半。
23.根據(jù)權(quán)利要求6-9任一項的方法，其中所述降低的表達至少是參照水平的十分之一。
24.根據(jù)權(quán)利要求10-14任一項的方法，其中所述改變的表達，當(dāng)增加時，比該基因的參照水平至少高兩倍，當(dāng)降低時，與參照水平相比是該基因水平的一半。
25.根據(jù)權(quán)利要求19-24任一項的方法，其中所述的參照水平是健康血管組織中的水平。
26.根據(jù)權(quán)利要求19-24任一項的方法，其中所述的參照水平由狹窄前的水平確定。
27.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中測定方法是基因微陣列。
28.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中測定方法是定量PCR。
29.根據(jù)權(quán)利要求1-24任一項的方法，其中基因表達的水平通過測定樣品中蛋白質(zhì)表達水平而確定。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述蛋白是可溶蛋白。
31.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述樣品是血液。
32.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述樣品是淋巴。
33.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中蛋白表達水平通過ELISA確定。
34.一種抑制再狹窄的方法，包括給患有再狹窄的病人施用抑制平滑肌細胞增殖或者新內(nèi)膜增生的組合物，其中所述組合物改變了表1所列的至少一種基因的表達。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述組合物誘導(dǎo)改善再狹窄作用的基因的表達或者基因轉(zhuǎn)錄。
36.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述組合物抑制促進平滑肌細胞增殖或者新內(nèi)膜增生的基因。
37.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述組合物包括反義寡核苷酸。
38.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述組合物包括與mRNA結(jié)合形成三鏈體的寡核苷酸。
39.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述組合物抑制至少一種促進平滑肌細胞增殖或者新內(nèi)膜增生的蛋白的活性。
40.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述組合物包括與促進平滑肌細胞增殖或者新內(nèi)膜增生的蛋白結(jié)合的抗體。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中所述組合物包括人抗體。
42.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述組合物包括可溶蛋白受體。
43.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述組合物包括一種蛋白，施用該蛋白可以補充在再狹窄過程中減量調(diào)節(jié)的蛋白的損失。
44.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中檢測使用適于PCR的試劑盒進行，并且所述試劑盒包括特異于由表1所列基因鑒別的DNA或RNA序列擴增的引物。
45.一種評價個體中再狹窄或動脈粥樣硬化形成風(fēng)險性的方法，包括檢測從所述個體獲得的樣品中的至少三個基因的生物學(xué)意義上重要的多態(tài)性的存在。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，包括檢測從所述個體獲得的樣品中的至少五個基因的生物學(xué)意義上重要的多態(tài)性的存在。
47.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，包括檢測從所述個體獲得的樣品中的至少十個基因的生物學(xué)意義上重要的多態(tài)性的存在。
48.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，包括檢測從所述個體獲得的樣品中的至少五十個基因的生物學(xué)意義上重要的多態(tài)性的存在。
49.根據(jù)權(quán)利要求45-48任一項的方法，其中所述基因選自表1所列基因。
50.根據(jù)權(quán)利要求45-49任一項的方法，其中所述樣品包括所述個體的動脈或靜脈血。
51.根據(jù)權(quán)利要求45-49任一項的方法，其中所述樣品包括所述個體的血管組織。
52.根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中所述血管組織是血管動脈組織。
53.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中所述多態(tài)性通過基因微陣列檢測。
54.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中所述多態(tài)性通過定量PCR檢測。
55.根據(jù)權(quán)利要求45-49任一項的方法，其中所述樣品是血液。
56.根據(jù)權(quán)利要求45-49任一項的方法，其中所述樣品是淋巴。
57.根據(jù)權(quán)利要求45-56任一項的方法，其中檢測使用適于檢測表1中所列基因的生物學(xué)意義上顯著的多態(tài)性的試劑盒進行。
全文摘要
本發(fā)明提供了在個體中評估形成再狹窄或動脈粥樣硬化的風(fēng)險的方法。還提供了治療或預(yù)防再狹窄或動脈粥樣硬化的方法和組合物。
文檔編號G01N33/68GK1599799SQ02824192
公開日2005年3月23日 申請日期2002年10月2日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月2日
發(fā)明者S·E·埃普斯泰因, S·杜爾拉尼 申請人:醫(yī)療星研究院