專利名稱：直接分析植物組織切片化學(xué)成分的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化學(xué)成分分析技術(shù)領(lǐng)域，屬于植物組織切片化學(xué)成分的直 接分析方法。
背景技術(shù)：
對于中藥化學(xué)成分的研究，傳統(tǒng)的方法是采用溶劑分配和柱色譜方法 將其逐一分離為純的單一化合物，然后進行結(jié)構(gòu)鑒定。有效成分的分離主 要靠色譜法，如氣相色譜、高效液相色譜等。(陳耀祖，陳紹瑗。中藥現(xiàn)
代化研究的化學(xué)法導(dǎo)論，科技出版社，北京2003年，5-6)。應(yīng)用這種方 法，很多中藥成分得以闡明。這一技術(shù)在中藥化學(xué)成分的研究上取得了豐 碩成果，但這樣的分離分析由于步驟多、分離效率低、自動化程度低，一 方面比較費時，另一方面由于每一步的操作都會損失化合物，這樣對微量 組分分析常十分困難。并且在提取分離過程中加熱和酸堿處理都可能造成 化合物結(jié)構(gòu)的改變。近年來，隨著分離分析技術(shù)的發(fā)展，高效液相色譜技 術(shù)與NMR和MS聯(lián)用技術(shù)得到廣泛應(yīng)用，實現(xiàn)了對植物化學(xué)成分在線分離 分析。相對于傳統(tǒng)的分離分析方法節(jié)省了時間。但是此種方法也必須經(jīng)過
對化學(xué)成分的提取，也有可能由于超聲，加熱，酸堿處理造成化合物結(jié)構(gòu) 的改變。川烏和草烏均是中國常用中藥，目前，國內(nèi)常采用酸水滲漉(李
正邦等，天然產(chǎn)物研究與開發(fā)Vol. 9(1)， 1997， 9-14)或乙醇(丁立生等， 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)Vo1.6( 3), 1994,50-54)提取烏頭屬植物中生物 堿。由于各類生物堿具有不同極性，所以一種溶劑很難提取完全。并且用 酸水滲漉法提取得生物堿不全面，脂類生物堿收率較低。近來有研究用不 同溶劑體系進行硅膠柱層析(劉淑瑩等，專利申請?zhí)?00410010819.2); 或乙醇冷浸后，用酸水處理，再用硅膠柱層析得到烏頭屬植物中脂類生物 堿，利用電噴霧電離-質(zhì)譜分析(劉淑瑩等，專利申請?zhí)?00410010820. 5)。 以上提取方法都不能同時對多種不同種類生物堿進行分析。文獻報道利用 電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜分析附子中生物堿用乙醇冷浸48小時(Wang, Rapid Co畫n. Mass Spect匿76, 2002， 2075-2082)，用時較長。對于馬錢 子的研究，利用溶劑提取，柱層析，NMR技術(shù)已經(jīng)分離鑒定了多個化合物
(蔡寶昌等，藥學(xué)學(xué)報29 (1)， 1994， 44-48)，近年來色譜和質(zhì)譜技術(shù) 被廣泛用于分析馬錢子中生物堿，如高效液相色譜(HPLC) (YoimgH. ,J. Ethnopharmacol. , 2004， 93: 109-112)毛細管電泳色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)
(CE-MS) (FengH. ， Journal of Chromatography A. ， 2003,1014: 83-91)。 對于防己也多采用溶劑提取分離，柱層析等方法分離鑒定(肖崇厚等，中 藥化學(xué)，上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，146-147)。這些方法都必須首先利用各種 溶劑對植物有效成分進行提取，然后進行分析。大多樣品需求量較大，靈 敏度較低而且需要繁瑣的鑒定過程。并且對于微量成分或穩(wěn)定性差的成分 的鑒定分析較困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是公開一種直接分析植物組織切片化學(xué)成分的方法，無 需費時較長，且可能破壞化學(xué)成分的樣品預(yù)處理，可以直接快速分析植物 化學(xué)成分，利用這一方法達到快速分析植物化學(xué)成分，特別是分析微量成
分；快速鑒別藥材真?zhèn)?；對植物所含化學(xué)成分進行預(yù)測給出分子量等應(yīng)用。 為達到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)解決方案是提供一種直接分析植物組
織切片化學(xué)成分的方法，其包括步驟
51、 將待檢植物切成10-20Wn厚的切片，將切片放到基質(zhì)輔助激光解 析飛行時間質(zhì)譜儀的靶上；
52、 用移液器將基質(zhì)溶液加到植物組織切片上，用量為《30W/cm2;
53、 將耙和點有基質(zhì)溶液的組織切片，放到真空干燥器中，干燥后待
測；
54、 將干燥后的靶和待檢植物組織切片，放入基質(zhì)輔助激光解析電離 -飛行時間質(zhì)譜儀進行直接分析，用基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜 測定，方法是在切片上順時針選取10個點，每個點采集30次，累加IO
個點采集的數(shù)據(jù)為測定質(zhì)譜圖，即可得到植物切片所含化學(xué)成分的信息。
所述直接分析植物組織切片化學(xué)成分的方法，其所述待檢植物，為川 烏、草烏、馬錢子或防己的植物組織切片。
所述直接分析植物組織切片化學(xué)成分的方法，其所述基質(zhì)溶液的配 制，是用50: 50的乙腈/O. 1%三氟乙酸液體，將a-氰基_4-羥基肉桂酸
(CHCA、 a—cyano—4—hydroxycinnamic acid)酉己成t包禾口溶液備用。
所述直接分析植物組織切片化學(xué)成分的方法，其所述飽和溶液，是含 有《30mg/ml的a-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)溶液。
所述直接分析植物組織切片化學(xué)成分的方法，其所述用基質(zhì)輔助激光 解析電離-飛行時間質(zhì)譜測定，是在測定過程中盡量使用較小的激光能量， 為9-13pJ。
本發(fā)明方法通過對植物組織的直接分析，避免了利用各種溶劑費時的 提取步驟，節(jié)省時間，降低分析費用，減少或消除了化合物的損失，有利 于分析微量成分。利用本發(fā)明方法對烏頭屬植物川烏，草烏和馬錢子，防 己等植物進行直接分析，對已知化合物的鑒別率達70%以上，并且確定多 個未知化合物的分子量。測定了植物川烏，草烏，馬錢子和防己組織切片 的化學(xué)成分。并同時檢測了各類生物堿，用傳統(tǒng)方法必須通過不同極性的 溶劑和不同pH值的酸堿處理才能得到不同類的生物堿。 一些含量較低， 分離較難的生物堿也被檢測到。本發(fā)明方法用時僅幾分鐘，提供了直接測 定不同極性不同類別的生物堿的整體檢測和快速。從而達到區(qū)分藥材，和 質(zhì)量監(jiān)督的目的。
本發(fā)明的直接分析方法和其它方法相比具有高效快速，靈敏度高，尤 其適用于含量少、不易分離得到或在分離過程中易丟失的組分，因此在藥 用植物研究中具有重要意義。


圖1為植物組織切片置于基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜分析革巴上待測圖2為川烏切片基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜圖，由圖可以
看出通過組織切片分析化學(xué)成分可以直接分析大部分(70%)生物堿成分 和一些未知化合物的分子量，說明此種分析方法較好；
圖3為草烏切片基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜圖，由圖看出 通過組織切片可以直接快速分析烏頭屬植物的化學(xué)成分；
圖4為馬錢子切片基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜圖，由圖看 出通過組織切片可以直接分析植物的化學(xué)成分；
圖5為防己切片基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜圖，由圖看出 通過組織切片可以直接分析植物的化學(xué)成分。
具體實施例方式
本發(fā)明直接分析植物組織切片化學(xué)成分的方法，無需對植物樣品進行 化學(xué)處理。利用基質(zhì)輔助激光解析電離-質(zhì)譜技術(shù)對植物組織切片進行直 接分析。此種方法處理步驟少，切片至分析僅用幾分鐘，節(jié)省了時間，降 低了分析成本。這樣盡量減少了植物化學(xué)成分結(jié)構(gòu)改變的因素。由于避免 了不同提取方法可能對化學(xué)成分造成的損失，特別是有利于微量成分的分 析。
實施例1
選取川烏1顆，用水浸潤10分鐘。用切片機將植物切成10-20Wn厚 的切片。放到基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-T0F-MS)
的靶上，如圖1所示。實驗前新鮮配制基質(zhì)溶液乙腈/0. 1%三氟乙酸(50:
50)將a-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA、 a-cyano-4-hydroxycinnamic acid) 配成飽和溶液( 30mg/ml)備用。將基質(zhì)溶液用移液器加到植物組織切片 上，用量約為3(H4/cm2。將基質(zhì)溶液點到組織切片上后，將靶放到真空干 燥器中，干燥后待測。利用基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜儀 (MALDI-T0F-MS)進行直接測定，在測定過程中盡量使用較小的激光能量， 如9-13pJ，在切片上順時針選取IO個點，每個點釆集30次，累加10個 點采集的數(shù)據(jù)為測定質(zhì)譜圖，如圖2所示。
實施例2:
選取草烏1顆，用水浸潤10分鐘。用切片機將植物切成10-20Wn厚 的切片。放到基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF-MS) 的靶上，如圖1所示。實驗前新鮮配制基質(zhì)溶液乙腈/0. 1%三氟乙酸(50: 50)將a-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA、 a-cyano-4-hydroxycirm柳ic acid) 配成飽和溶液( 30mg/ml)備用。將基質(zhì)溶液用移液器加到植物組織切片 上用量約為3Cmi/cm2。將基質(zhì)溶液點到組織切片上后，將靶放到真空干燥 器中，千燥后待測。利用基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜儀 (MALDI-TOF-MS)進行直接測定，在測定過程中盡量使用較小的激光能量， 在切片上順時針選取IO個點，每個點采集30次，累加10個點采集的數(shù) 據(jù)為測定質(zhì)譜圖，如圖3所示。
實施例3:
選取馬錢子1顆，用水浸潤10分鐘。用切片機將植物切成10-20Mm 厚的切片。放到基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-T0F-MS) 的靶上，如圖1所示。實驗前新鮮配制基質(zhì)溶液乙腈/0. 1%三氟乙酸(50: 50)將a _氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA、 a -cyano-4-hydroxycinnamic acid) 配成飽和溶液( 30mg/ml)備用。將基質(zhì)溶液用移液器加到植物組織切片 上用量約為30W/cm2。將基質(zhì)溶液點到組織切片上后，將靶放到真空干燥 器中，干燥后待測。利用基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜儀 (MALDI-TOF-MS)進行直接測定，在測定過程中盡量使用較小的激光能量。 在切片上順時針選取10個點，每個點采集30次，累加10個點采集的數(shù) 據(jù)為測定質(zhì)譜圖，如圖4所示。
實施例4:
選取防己1塊，用水浸潤10分鐘。用切片機將植物切成10-20剛厚 的切片。放到基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF-MS) 的靶上，如圖1所示。實驗前新鮮配制基質(zhì)溶液乙腈/0. 1%三氟乙酸(50: 50)將a-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA、 a-cyano-4-hydroxycinimmic acid) 配成飽和溶液( 30mg/ml)備用。將基質(zhì)溶液用移液器加到植物組織切片 上用量約為30W/cm2。將基質(zhì)溶液點到組織切片上后，將靶放到真空干燥 器中，干燥后待測。利用基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜儀 (MALDI-T0F-MS)進行直接測定，在測定過程中盡量使用較小的激光能量， 在切片上順時針選取IO個點，每個點采集30次，累加10個點采集的數(shù) 據(jù)為測定質(zhì)譜圖，如圖5所示。
權(quán)利要求
1.一種直接分析植物組織切片化學(xué)成分的方法，其特征在于包括步驟S1、將待檢植物用切片機切成10-20μm厚的切片，將切片放到基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜儀的靶上；S2、用移液器將基質(zhì)溶液加到植物組織切片上，用量為≤30μl/cm2；S3、將靶和點有基質(zhì)溶液的組織切片，放到真空干燥器中，干燥后待測；S4、將干燥后的靶和待檢植物組織切片，放入基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜儀進行直接分析，用基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜測定，方法是在切片上順時針選取10個點，每個點采集30次，累加10個點采集的數(shù)據(jù)為測定質(zhì)譜圖，即得到植物切片所含化學(xué)成分的信息。
2. 如權(quán)利要求書1所述直接分析植物組織切片化學(xué)成分的方法，其特 征在于所述待檢植物，為川烏、草烏、馬錢子或防己的植物組織切片。
3. 如權(quán)利要求書1所述直接分析植物組織切片化學(xué)成分的方法，其特征在于所述基質(zhì)溶液的配制，是用50: 50的乙腈/0. 1%三氟乙酸液體，將a _氰基-4-羥基肉桂酸配成飽和溶液備用。
4. 如權(quán)利要求書3所述直接分析植物組織切片化學(xué)成分的方法，其特征 在于所述飽和溶液，是含有《30mg/ml的a-氰基-4-羥基肉桂酸溶液。
5. 如權(quán)利要求書1所述直接分析植物組織切片化學(xué)成分的方法，其特征 在于所述用基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜測定，是在測定過程中使用的激光能量為9-13uJ。
全文摘要
本發(fā)明一種直接分析植物組織切片化學(xué)成分的方法，涉及化學(xué)成分分析技術(shù)，包括步驟S1、將待檢植物切成10-20μm厚的切片，取一片切片放到基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜儀的靶上；S2、配制基質(zhì)溶液；S3、用移液器將基質(zhì)溶液加到植物組織切片上；S4、將靶和點有基質(zhì)溶液的組織切片，放到真空干燥器中干燥；S5、將干燥后的靶和待檢植物組織切片，直接放入基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜儀進行分析，即得到植物切片所含化學(xué)成分的信息。本發(fā)明的分析方法快捷，方便，高效，全面，無需樣品化學(xué)處理，避免了傳統(tǒng)樣品處理和分析方法耗時長，微量成分難于分析，可能破壞化學(xué)成分的缺點。
文檔編號G01N27/64GK101196491SQ20061016487
公開日2008年6月11日 申請日期2006年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月7日
發(fā)明者巍 吳, 梁之桃, 蔡宗葦, 趙中振 申請人:蔡宗葦