本發(fā)明涉及墨旱蓮化學(xué)成分的新用途領(lǐng)域，特別涉及墨旱蓮化學(xué)成分作為植物雌激素的用途。

背景技術(shù)：

女性絕經(jīng)后，雌激素分泌會(huì)減少，并導(dǎo)致記憶力下降、潮熱、疲勞、易怒以及骨密度降低等問題。雌激素替代療法等傳統(tǒng)療法曾一度流行，但其副作用較大，長(zhǎng)期使用可增加子宮癌及乳腺癌的發(fā)病率，因而被限制使用。而后科學(xué)家發(fā)現(xiàn)植物中存在一類與內(nèi)源性雌激素結(jié)構(gòu)類似的雜環(huán)多酚類的活性成分。其能夠與哺乳動(dòng)物或人的雌激素受體(estrogen receptor，ER)結(jié)合，產(chǎn)生雌激素樣或抗雌激素樣活性效應(yīng)，被稱為植物雌激素(phytoestrogen，PE)。植物雌激素具雙向調(diào)節(jié)作用，一方面，當(dāng)機(jī)體內(nèi)雌激素水平低于正常水平時(shí)，可發(fā)揮擬雌激素樣作用，這一作用可以防治女性更年期綜合征、前列腺癌、骨質(zhì)疏松癥和心血管疾病等；另一方面，在體內(nèi)雌激素水平高于正常水平(如乳腺增生、子宮肌瘤等病癥)時(shí)，可產(chǎn)生雌激素拮抗作用，有效減弱靶細(xì)胞對(duì)雌激素的應(yīng)答。尋找具有雌激素活性而又沒有雌激素副作用的植物雌激素，作為膳食補(bǔ)充劑，或者為臨床提供新的治療選擇，仍是本領(lǐng)域技術(shù)人員所期待的。

墨旱蓮為菊科植物鱧腸Eclipta prostrata L.的地上部分，別名旱蓮草，具有補(bǔ)血，涼血止血，清熱解毒，滋陰補(bǔ)肝腎的作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，墨旱蓮具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗炎等藥理作用，臨床上用于治療冠心病、出血性疾病等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明人對(duì)墨旱蓮的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了深入的研究，制備了墨旱蓮提取物并進(jìn)一步地從中提取分離出了17種化合物，并出人意料地發(fā)現(xiàn)了這些化合物絕大部分具有植物雌激素活性，可以用作補(bǔ)充雌激素的膳食補(bǔ)充劑，或用于制備治療和/或預(yù)防與雌激素分泌異常相關(guān)的疾病的藥物。本發(fā)明基于上述發(fā)現(xiàn)得以完成。

本發(fā)明第一方面提供了墨旱蓮提取物在制備用于治療和/或預(yù)防與雌激素分泌異常相關(guān)的疾病的藥物中的用途。

根據(jù)本發(fā)明第一方面任意一項(xiàng)的用途，其中所述的墨旱蓮提取物包含至少一種選自以下的化合物：旱蓮苷IV、3'-羥基鷹嘴豆素A、5-丁-1'-炔-3'-羥基-4'-氯-(2-戊-1"，3"-二炔)-噻酚、木樨草素7-O-β-D葡萄糖苷、旱蓮苷I、木樨草素、5-醛基-2,2',5',2"-三聯(lián)噻酚、刺囊酸-28-O-β-D-葡萄糖苷、原兒茶酸乙酯、豆甾醇、5-醛基-5'-(3-丁烯-1-炔基)-2,2'-二聯(lián)噻酚、蟛蜞菊內(nèi)酯及旱蓮苷A。

根據(jù)本發(fā)明第一方面任意一項(xiàng)的用途，其中每克墨旱蓮中含有10-4000微克的木樨草素7-O-β-D葡萄糖苷、7-450微克的木樨草素、300-1400微克的旱蓮苷IV、900-3000微克的旱蓮苷A及10-350微克的刺囊酸-28-O-β-D-葡萄糖苷。

根據(jù)本發(fā)明第一方面任意一項(xiàng)的用途，其中所述的墨旱蓮提取物由以下方法制備：

1)將墨旱蓮用乙醇水溶液提取；濃縮至無(wú)醇后獲得粗浸膏；其中，乙醇水溶液優(yōu)選采用體積百分?jǐn)?shù)為50-90％，更優(yōu)選采用60-80％，最優(yōu)選采用70％的乙醇水溶液；乙醇水溶液的用量?jī)?yōu)選為墨旱蓮的2-10倍量，更優(yōu)選為4-7倍量，最優(yōu)選為5倍量。提取時(shí)間優(yōu)選為1-4小時(shí)，更優(yōu)選為2-3小時(shí)；提取次數(shù)優(yōu)選為1-6次，更優(yōu)選為2-4次，最優(yōu)選為3次；

2)將所得粗浸膏溶散于水中(水量為粗浸膏的3-20倍量，更優(yōu)選為6-15倍量，最優(yōu)選為10倍量。)后用石油醚和乙酸乙酯萃取，去溶劑后分別得石油醚萃取部分浸膏、乙酸乙酯萃取部分浸膏及水層浸膏；其中，優(yōu)選用石油醚和乙酸乙酯分別萃取1-6次，更優(yōu)選為2-4次，最優(yōu)選為3次；去溶劑可以通過減壓蒸餾等本領(lǐng)域常用的方式實(shí)現(xiàn)，本發(fā)明在此不進(jìn)行限定。

3)將步驟2)中獲得的各部分浸膏合并、干燥后即得墨旱蓮提取物。干燥可以采用本領(lǐng)域常用的方式，本發(fā)明在此不進(jìn)行限定。

根據(jù)本發(fā)明第一方面任意一項(xiàng)的用途，其中所述與雌激素分泌異常相關(guān)的疾病為由雌激素水平高于正常水平而引起的疾病或由雌激素水平低于正常水平而引起的疾病，包括但不限于：更年期綜合征、前列腺癌、骨質(zhì)疏松癥、心血管疾病、乳腺增生、乳腺癌及子宮肌瘤。

本發(fā)明第二方面提供了一種治療和/或預(yù)防與雌激素分泌異常相關(guān)的疾病的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含前述任意的墨旱蓮提取物和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。

根據(jù)本發(fā)明第二方面任意一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述與雌激素分泌異常相關(guān)疾病為由雌激素水平高于正常水平而引起的疾病或由雌激素水平低于正常水平而引起的疾病，包括但不限于：更年期綜合征、前列腺癌、骨質(zhì)疏松癥、心血管疾病、乳腺增生、乳腺癌及子宮肌瘤。

本發(fā)明第三方面提供了一種治療和/或預(yù)防與雌激素分泌異常相關(guān)的疾病的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含至少一種選自下列的藥物活性成分和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑，所述藥物活性成分包括：旱蓮苷IV、3'-羥基鷹嘴豆素A、5-丁-1'-炔-3'-羥基-4'-氯-(2-戊-1"，3"-二炔)-噻酚、木樨草素7-O-β-D葡萄糖苷、旱蓮苷I、木樨草素、5-醛基-2,2',5',2"-三聯(lián)噻酚、刺囊酸-28-O-β-D-葡萄糖苷、原兒茶酸乙酯、豆甾醇、5-醛基-5'-(3-丁烯-1-炔基)-2,2'-二聯(lián)噻酚、蟛蜞菊內(nèi)酯及旱蓮苷A。

根據(jù)本發(fā)明第三方面任意一項(xiàng)的藥物組合物，其中該藥物組合物中所包含的藥物活性成分從墨旱蓮中提取得到。

從墨旱蓮中提取得藥物活性成分的方法如下：

根據(jù)前述墨旱蓮提取物制備方法中的步驟2)獲得石油醚萃取部分浸膏、乙酸乙酯萃取部分浸膏及水層浸膏；

將水層浸膏通過大孔樹指吸附分離，然后進(jìn)行梯度洗脫，將洗脫物用硅膠柱層析，最后通過制備液相色譜制備得到化合物6(木樨草素)和化合物7(芹菜素)；

將乙酸乙酯萃取部分浸膏用硅膠柱層析，用二氯甲烷-甲醇進(jìn)行梯度洗脫，獲得15個(gè)餾分，然后通過Sephadex LH-20凝膠柱色譜(甲醇洗脫)、Flash中壓色譜柱層析(ODS-C₁₈)和/或制備液相色譜分離得到化合物14(蟛蜞菊內(nèi)酯)、化合物10(刺囊酸-28-O-β-D-葡萄糖苷)、化合物17(旱蓮苷A)、化合物1(旱蓮苷IV)、化合物4(木樨草素7-O-β-D葡萄糖苷)、化合物5(旱蓮苷I)、化合物2(3'-羥基鷹嘴豆素A，英文名3'-hydroxybiochanin A)、化合物11(原兒茶酸乙酯)及化合物16(刺囊酸)；

將石油醚萃取部分浸膏用硅膠柱層析，用石油醚-乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫，共得17個(gè)餾分，然后通過Sephadex LH-20凝膠柱色譜(甲醇洗脫)、Flash中壓色譜柱層析(ODS-C₁₈)和/或制備液相色譜分離得到化合物9(5-醛基-2,2'；5',2"-三聯(lián)噻酚)、化合物13(5-醛基-5'-(3-丁烯-1-炔基)-2,2'-二聯(lián)噻酚)、化合物3(5-丁-1'-炔-3'-羥基-4'-氯-(2-戊-1"，3"-二炔)-噻酚)、化合物15(5-羥甲基-2,2'；5',2"-三聯(lián)噻酚)、化合物12(豆甾醇)及化合物8(2,2'；5',2"-三聯(lián)噻酚)。

根據(jù)本發(fā)明第三方面任意一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述與雌激素分泌異常相關(guān)的疾病為由雌激素水平高于正常水平而引起的疾病或由雌激素水平低于正常水平而引起的疾病，包括但不限于：更年期綜合征、前列腺癌、骨質(zhì)疏松癥、心血管疾病、乳腺增生、乳腺癌及子宮肌瘤。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“治療”具有其一般含義，并且在本文特別地是指對(duì)已經(jīng)罹患本發(fā)明所述與雌激素分泌異常相關(guān)的疾病的哺乳動(dòng)物個(gè)體(優(yōu)選為人)采用本發(fā)明的藥物進(jìn)行處理，以期對(duì)所述疾病產(chǎn)生治療、治愈、緩解、減輕等作用。類似地，如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“預(yù)防”具有其一般含義，并且在本文特別地是指對(duì)可能罹患本發(fā)明所述與雌激素分泌異常相關(guān)的疾病或者對(duì)本發(fā)明所述與雌激素分泌異常相關(guān)的疾病具有罹患風(fēng)險(xiǎn)的哺乳動(dòng)物個(gè)體采用本發(fā)明的藥物進(jìn)行處理，以期對(duì)所述疾病產(chǎn)生防止、預(yù)防、阻止、隔斷等作用。

如本文所用的，“藥學(xué)上可接受的”表示當(dāng)以通常用藥劑量使用時(shí)沒有實(shí)質(zhì)的毒性作用，從而可被政府或與其相當(dāng)?shù)膰?guó)際組織批準(zhǔn)或者已被批準(zhǔn)用于動(dòng)物，更特別地用于人，或者被登錄在藥典上。

本發(fā)明藥物組合物中可用的“藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑”可以是藥物制劑領(lǐng)域中任何常規(guī)的載體，特定載體的選擇將取決于用于治療特定患者的給藥方式或疾病類型和狀態(tài)。用于特定給藥模式的合適藥物組合物的制備方法完全在藥物領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。例如，可以作為藥學(xué)可接受的載體或賦形劑包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的溶劑、稀釋劑、分散劑、助懸劑、表面活性劑、等滲劑、增稠劑、乳化劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑、穩(wěn)定劑、水合劑、乳化加速劑、緩沖劑、吸收劑、著色劑、離子交換劑、脫模劑、涂布劑、矯味劑、和抗氧化劑等。必要時(shí)，還可以在藥物組合物中加入香味劑、防腐劑和甜味劑等。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“藥物組合物”具有其一般含義。此外，本發(fā)明的“藥物組合物”還可以以保健品、功能性食品、食品、食品添加劑等形式存在或提供。可采用制藥領(lǐng)域特別是制劑領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)，通過藥品生產(chǎn)中常用的提取分離純化手段得到本發(fā)明的藥物組合物的原料的有效成分，任選地與一種或更多種藥學(xué)可接受的載體或賦形劑混合，然后形成所需的劑型，來制備本發(fā)明的藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其為可以適用于口服給藥、胃腸外給藥或局部給藥、外用給藥的藥物制劑。本發(fā)明的藥物組合物可以制成片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊、口服液等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。具體地說，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，所述的藥物劑型包括但不限于：片劑、膠囊劑、顆粒劑、粉劑、注射液、注射用粉劑、透皮貼劑、軟膏劑、凝膠劑、栓劑、口服溶液、口服混懸液、注射用乳劑、口服乳劑等、緩釋片劑、控釋片劑。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。

用于口服施用的劑型可包括例如片劑、丸劑、硬或軟膠囊劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、糖漿劑、散劑、粉劑、細(xì)粒劑、顆粒劑、小丸劑、酏劑等，并不限于此。除了活性成分外，這些制劑還可包含稀釋劑(例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、纖維素和甘氨酸)、潤(rùn)滑劑(例如二氧化硅、滑石、硬脂酸或其鎂鹽、鈣鹽和聚乙二醇)。片劑還可包含粘合劑，例如硅酸鎂鋁、淀粉糊、明膠、黃芪膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和聚乙烯吡咯烷。必要時(shí)，其還可包含藥用添加劑，例如崩解劑(如淀粉、瓊脂、海藻酸或其鈉鹽)、吸收劑、著色劑、香味劑、甜味劑等。片劑可根據(jù)常用的混合、造?；虬碌姆椒ㄖ苽?。

用于腸道外施用的劑型可包括例如注射劑、藥用滴劑、軟膏劑、洗劑、凝膠劑、乳膏、噴霧劑、混懸劑、乳劑、栓劑、貼劑等，并不限于此。

根據(jù)本公開的藥物組合物可口服或非腸道例如經(jīng)直腸、經(jīng)局部、經(jīng)皮膚、經(jīng)靜脈內(nèi)、經(jīng)肌內(nèi)、經(jīng)腹膜內(nèi)或經(jīng)皮下施用。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“約”其通常是指本領(lǐng)域允許的誤差范圍，例如±10％，例如±5％，例如±2％。

經(jīng)研究表明，本發(fā)明從墨旱蓮中所得到的化合物具有不同程度的植物雌激素的作用，可以預(yù)期本發(fā)明所得到的化合物或含有它的墨旱蓮提取物、藥物組合物可以用于治療和/或預(yù)防與雌激素分泌異常相關(guān)的疾病，進(jìn)一步地，可以用于制備用于治療和/或預(yù)防與雌激素分泌異常相關(guān)的疾病的藥物。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行描述，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1墨旱蓮中活性成分的制備

取20kg墨旱蓮(購(gòu)自安國(guó)圣山藥業(yè)有限公司，批號(hào)：mhl0001，產(chǎn)地：河北)，用100L 70％乙醇熱回流提取，每次提取時(shí)間2小時(shí)，共提取3次。在45℃下減壓蒸餾，濃縮至無(wú)醇，估算浸膏質(zhì)量約1kg。

將粗浸膏溶散于10L水中，用等量石油醚和乙酸乙酯萃取3次，分別得石油醚萃取部分浸膏255g(命名為EPA-P)，乙酸乙酯萃取部分浸膏150g(命名為EPA-E)，水層浸膏600g(命名為EPA-W)。

水層部分(EPA-W)600g，通過大孔樹脂D101吸附分離，采用純水，30％乙醇，70％乙醇，純乙醇洗脫，30％乙醇洗脫物為EPA-W-D3。

EPA-W-D3組分共25g，用50g硅膠拌樣，250g硅膠裝柱，進(jìn)行硅膠柱層析，柱體積600ml。用二氯甲烷-甲醇進(jìn)行梯度洗脫，得到共16個(gè)餾分；TLC(薄層色譜)檢測(cè)后合并，合并餾分1-4記為：EPA-W-D3-1；合并餾分5-6記為：EPA-W-D3-5；合并餾分7-8記為：EPA-W-D3-7；合并餾分9-10記為：EPA-W-D3-9；合并餾分11-13記為：EPA-W-D3-11；餾分14記為：EPA-W-D3-14。其中組分EPA-W-D3-11通過制備液相色譜制備得到化合物6(348mg)、7(83mg)。

乙酸乙酯部分(EPA-E)150g，以200g硅膠拌樣，1.6Kg硅膠裝柱，進(jìn)行硅膠柱層析，柱體積4L。用二氯甲烷-甲醇進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度(二氯甲烷-甲醇體積比)分別為1:0，100:1，50:1，25:1，12.5:1，7:1，4:1，1:1，0:1，每個(gè)梯度收集兩個(gè)柱體積。所得各餾分通過TLC分析檢測(cè)，共15個(gè)餾分。

其中第8，9餾分合并，命名為EPA-E8，通過Sephadex LH-20凝膠柱色譜(甲醇洗脫)、制備液相色譜分離得到化合物14(32mg)。第11餾分命名為EPA-E11，通過Sephadex LH-20凝膠，甲醇洗脫、Flash中壓色譜柱層析(ODS-C₁₈)，40％甲醇→100％甲醇梯度洗脫、制備液相色譜分離，系列比例甲醇水洗脫，TLC及HPLC檢測(cè)各洗脫餾分，合并相同餾分，得到化合物10(130mg)、化合物17(1290mg)。第13，14，15餾分合并，命名為EPA-E13，通過Sephadex LH-20凝膠、制備液相色譜分離得到化合物1(95mg)、化合物4(25mg)、化合物5(210mg)。第5，6餾分合并，命名為EPA-E5，經(jīng)硅膠柱層析、Sephadex LH-20凝膠、Flash中壓色譜柱層析(ODS-C₁₈)、制備液相色譜分離得到化合物2(49mg)、化合物11(114mg)、化合物16(43mg)。

石油醚部分(EPA-P)255g，以500g硅膠拌樣，通過硅膠柱層析，用石油醚-乙酸乙酯(體積比1：0→0：1)進(jìn)行梯度洗脫，共得17個(gè)餾分。各組分通過TLC分析檢測(cè)，合并得8個(gè)組分，餾分1命名為EPA-P-1；餾分2-4為EPA-P-2；餾分5-7為EPA-P-5；餾分8-10為EPA-P-8；餾分11-14為EPA-P-11；餾分15為EPA-P-15；餾分16為EPA-P-16；餾分17為EPA-P-17。

組分EPA-P-1通過制備液相色譜制備得到化合物8(88mg)。組分EPA-P-5通過Flash中壓色譜(ODS-C₁₈)分離得到EPA-P-5-F6,再通過制備液相色譜制備得到化合物9(98mg)、13(45mg)。組分EPA-P-8通過Flash中壓色譜(ODS-C₁₈)分離得到EPA-P-8-F3，EPA-P-8-F7，再通過制備液相色譜制備得到化合物3(43mg)。組分EPA-P-11通過反復(fù)Sephadex LH-20凝膠分離，再通過制備液相色譜制備、重結(jié)晶方法得到化合物15(61mg)、12(149mg)。本實(shí)施例中的百分?jǐn)?shù)均為體積百分?jǐn)?shù)；餾分命名均按洗脫順序命名。

實(shí)施例2：化合物1-17結(jié)構(gòu)的確定

通過¹H、¹³C-NMR，確定化合物1-17結(jié)構(gòu)；所確定的化合物1-17結(jié)構(gòu)如表1所示。

NMR儀器的型號(hào)為：BRUKER AVANCE Ⅲ 500超導(dǎo)核磁共振波譜儀(TMS為內(nèi)標(biāo)，瑞士Bruker公司)；

具體的：

化合物1的表征如下：

¹H-NMR(500MHz,pyridine-d₅)譜低場(chǎng)區(qū)有2個(gè)氫：δ5.65(1H，br s，H-12)和5.25(1H，br s，H-16)。中低場(chǎng)區(qū)可以觀測(cè)到：δ3.31(1H，m)為H-3位氫信號(hào)；δ4.92(1H,d,J＝7.0Hz,H-1')和δ5.37(1H,d,J＝7.5Hz,H-1")提示有兩個(gè)葡萄糖基存在。在高場(chǎng)區(qū)還可觀測(cè)到7個(gè)特征的甲基峰信號(hào)：δ1.85(3H,s,H-27),1.28(3H,s,H-23),1.19(3H,s,H-30),1.10(3H,s,H-24),1.07(3H,s,H-29),1.03(3H,s,H-26),和0.87(3H,s,H-25)。¹³C-NMR(125MHz，pyridine-d₅)譜數(shù)據(jù)歸屬如下：38.8(C-1)，26.7(C-2)，89.0(C-3)，39.6(C-4)，56.0(C-5)，18.6(C-6)，33.4(C-7)，39.9(C-8)，47.2(C-9)，37.0(C-10)，23.9(C-11)，122.4(C-12)，145.2(C-13)，42.2(C-14)，36.2(C-15)，74.7(C-16)，48.9(C-17)，41.5(C-18)，47.4(C-19)，31.1(C-20)，36.3(C-21)，32.9(C-22)，28.3(C-23)，16.9(C-24)，15.6(C-25)，17.5(C-26)，27.3(C-27)，180.0(C-28)，33.6(C-29)，24.8(C-30)，105.1(C-1')，83.4(C-2')，78.3(C-3')，71.6(C-4')，77.9(C-5')，62.7(C-6')，106.1(C-1")，77.1(C-2")，78.0(C-3")，71.6(C-4")，77.9(C-5")，62.8(C-6")。

化合物2的表征如下：

¹H-NMR(500MHz,DMSO-d₆)譜低場(chǎng)區(qū)，可以看到δ12.98(1H,s)為5位羥基與羰基締合信號(hào)；6.23(1H,d,J＝1.5Hz,H-6),6.39(1H,d,J＝1.5Hz,H-8)。氫譜低場(chǎng)區(qū)信號(hào)δ:8.36(1H,s,H-2)提示該化合物為異黃酮。低場(chǎng)區(qū)還可看到B環(huán)的一組ABX信號(hào)：7.14(1H,d,J＝1.5Hz,H-2'),6.82(1H,d,J＝8.5Hz,H-5'),6.99(1H,dd,J＝1.5,8.5Hz,H-6')，提示B環(huán)3'，4'二取代；氫譜中還可觀測(cè)到一個(gè)甲氧基信號(hào)：δ3.80(3H,s,4'-OCH₃)。在¹³C-NMR(125MHz,DMSO-d₆)譜上出現(xiàn)相應(yīng)的異黃酮碳信號(hào)：δ:93.6(C-8),98.9(C-6),104.3(C-10),113.2(C-2'),115.2(C-5'),121.5(C-3),121.6(C-6'),122.2(C-1'),146.6(C-4'),147.2(C-3'),154.1(C-2),157.4(C-9),161.9(C-5),164.2(C-7),180.1(C-4)，以及甲氧基信號(hào)δ56.0(4'-OCH₃)。

化合物3的表征如下：

¹H-NMR(500MHz,CDCl₃)譜低場(chǎng)區(qū)有2個(gè)氫：δ7.10(1H，d，J＝4.0Hz)和7.06(1H，d，J＝4.0Hz)分別為噻酚環(huán)上H-3和4位氫信號(hào)；中低場(chǎng)區(qū)可以觀測(cè)到：δ4.82(2H，dd，J＝4.5，6.5Hz)為H-3'位氫信號(hào)；δ3.79(1H，dd，J＝4.5，11.5Hz)和3.73(1H，dd，J＝6.5，11.5Hz)分別為H-4'位的氫信號(hào)；在高場(chǎng)區(qū)有一個(gè)明顯的甲基峰信號(hào)：δ2.04(3H，s，H-5")。¹³C-NMR(125MHz，CDCl₃)譜數(shù)據(jù)歸屬如下：δ4.8(C-5")、48.7(C-4')、63.1(C-3')、64.1(C-3")、66.3(C-2")、79.1(C-1')、79.7(C-1")、83.6(C-4")、90.7(C-2')、123.4(C-5)、124.5(C-2)、132.7(C-4)、133.6(C-3)。

化合物4的表征如下：

¹H-NMR(500MHz,DMSO-d₆)譜低場(chǎng)區(qū)，可以看到δ12.99(1H,s)為5位羥基與羰基締合信號(hào)；δ6.45(1H,d,J＝2.0Hz)和δ6.79(1H,d,J＝2.0Hz)分別為6位和8位氫信號(hào)；6.75(1H,s)為3位氫質(zhì)子信號(hào)，低場(chǎng)區(qū)還可看到B環(huán)的一組ABX信號(hào)：δ6.91(1H,d,J＝8.5Hz,H-5')，7.42(1H,d,J＝2.0Hz,H-2')和7.45(1H,dd,J＝2.0,8.5Hz,H-6')，提示B環(huán)3'，4'二取代；此外，還可觀測(cè)到一組β-D葡萄糖信號(hào)：δ5.08(1H,d,J＝7.5Hz,H-1"),3.28(1H,m,H-2"),3.30(1H,m,H-3"),3.19(1H,m,H-4"),3.45(1H,m,H-5"),3.71(1H,dd,J＝4.0,11.5Hz,H-6"b),3.49(1H,m,H-6"a)。在¹³C-NMR(125MHz,DMSO-d₆)譜上出現(xiàn)黃酮苷元相應(yīng)的15個(gè)碳信號(hào)：δ94.6(C-8),99.4(C-6),103.1(C-3),105.2(C-10),113.5(C-2'),115.9(C-5'),119.1(C-6'),121.3(C-1'),145.7(C-3'),149.8(C-4'),156.8(C-9),161.0(C-5),162.8(C-7),164.4(C-2)和181.8(C-4)；碳譜中還觀測(cè)到一組對(duì)應(yīng)的β-D葡萄糖信號(hào)：δ99.8(C-1"),73.0(C-2"),76.3(C-3"),69.4(C-4"),77.2(C-5"),60.5(C-6")。

化合物5的表征如下：

¹H-NMR(500MHz,pyridine-d₅)譜低場(chǎng)區(qū)有2個(gè)氫：δ5.63(1H，br s，H-12)和5.32(1H，br s，H-16)。中低場(chǎng)區(qū)可以觀測(cè)到：δ3.43(1H，m)為H-3位氫信號(hào)；δ4.96(1H,d,J＝7.5Hz,H-1')和δ6.34(1H,d,J＝8.0Hz,H-1")提示有兩個(gè)葡萄糖基存在。在高場(chǎng)區(qū)還可觀測(cè)到7個(gè)特征的甲基峰信號(hào)：δ1.86(3H,s,H-27),1.30(3H,s,H-23),1.15(3H,s,H-26),1.05(3H,s,H-30),1.01(3H,s,H-29),1.01(3H,s,H-24)和0.90(3H,s,H-25)。¹³C-NMR(125MHz，pyridine-d₅)譜數(shù)據(jù)歸屬如下：38.9(C-1)，26.6(C-2)，88.9(C-3)，39.5(C-4)，55.9(C-5)，18.6(C-6)，33.5(C-7)，40.1(C-8)，47.2(C-9)，37.1(C-10)，23.9(C-11)，122.7(C-12)，144.5(C-13)，42.1(C-14)，36.2(C-15)，74.2(C-16)，49.1(C-17)，41.3(C-18)，47.2(C-19)，30.9(C-20)，36.0(C-21)，32.2(C-22)，28.3(C-23)，17.1(C-24)，15.6(C-25)，17.6(C-26)，27.3(C-27)，176.0(C-28)，33.2(C-29)，24.6(C-30)，106.9(C-1')，75.8(C-2')，79.4(C-3')，71.9(C-4')，78.3(C-5')，63.1(C-6')，96.0(C-1")，74.2(C-2")，79.4(C-3")，71.1(C-4")，78.8(C-5")，62.2(C-6")。

化合物6的表征如下：

¹H-NMR(500MHz,DMSO-d₆)譜低場(chǎng)區(qū)，可以看到δ12.98(1H,s)為5位羥基與羰基締合信號(hào)；δ6.19(1H,d,J＝2.0Hz)和δ6.45(1H,d,J＝2.0Hz)分別為6位和8位氫信號(hào)；6.67(1H,s)為3位氫質(zhì)子信號(hào)。此外，低場(chǎng)區(qū)還可看到B環(huán)的一組ABX信號(hào)：δ6.89(1H,d,J＝8.0Hz,H-5')，7.40(1H,d,J＝2.0Hz,H-2')和7.41(1H,dd,J＝2.0,8.0Hz,H-6')，提示B環(huán)3'，4'二取代。在¹³C-NMR(125MHz,DMSO-d₆)譜上出現(xiàn)15個(gè)相應(yīng)的碳信號(hào)：δ93.7(C-8),98.7(C-6),102.8(C-3),103.6(C-10),113.3(C-2'),115.9(C-5'),118.9(C-6'),121.4(C-1'),145.6(C-3'),149.6(C-4'),157.2(C-9),161.4(C-5),163.8(C-2),164.0(C-7)和181.6(C-4)。

化合物7的表征如下：

¹H-NMR(500MHz,DMSO-d₆)譜低場(chǎng)區(qū)，可以看到δ12.96(1H,s)為5位羥基與羰基締合信號(hào)；δ6.19(1H,d,J＝2.0Hz)和δ6.48(1H,d,J＝2.0Hz)分別為6位和8位氫信號(hào)；6.78(1H,s)為3位氫質(zhì)子信號(hào)。此外，低場(chǎng)區(qū)還可看到B環(huán)的一組AA'BB'信號(hào)：δ6.93(2H,dd,J＝2.0,8.5Hz,H-3',5')和7.93(2H,dd,J＝2.0,8.5Hz,H-2',6')，提示B環(huán)對(duì)位取代。在¹³C-NMR(125MHz,DMSO-d₆)譜上出現(xiàn)13個(gè)相應(yīng)的碳信號(hào)(包括兩個(gè)對(duì)稱碳信號(hào))：δ93.9(C-8),98.7(C-6),102.8(C-3),103.6(C-10),115.9(C-3',5'),121.1(C-1'),128.4(C-2',6'),157.2(C-9),161.1(C-4'),161.4(C-5),163.7(C-2),164.0(C-7)和181.7(C-4)。

化合物8的表征如下：

¹H-NMR(500MHz,CDCl₃)譜低場(chǎng)區(qū)，可以看到δ7.08(br s,2H)為3'和4'位質(zhì)子信號(hào)；7.02(2H，dd，J＝3.5,5.0Hz，H-4，4")，7.17(2H，dd，J＝1.0,3.5Hz，H-3，3")和7.22(2H，dd，J＝1.0,5.0Hz，H-5，5")，提示結(jié)構(gòu)中存在對(duì)稱結(jié)構(gòu)。在¹³C-NMR(125MHz,CDCl₃)譜上出現(xiàn)6個(gè)芳香碳，123.7(C-3、3")、124.3(C-3'、4')、124.5(C-5、5")、127.9(C-4、4")、136.2(C-2'、5')、137.1(C-2、2")。

化合物9的表征如下：

¹H-NMR(500MHz,CDCl₃)譜低場(chǎng)區(qū)，δ9.86為5位醛基質(zhì)子信號(hào)；δ7.67(1H，d，J＝4.0Hz)和7.24(1H，overlapped)為A環(huán)上4和3位氫信號(hào)；7.28(1H，overlapped)和7.27(1H，overlapped)分別為B環(huán)上H-4'和3'的信號(hào)；7.23(1H，overlapped)，7.13(1H，d，J＝4.0Hz)和7.05(1H,dd,J＝4.0,5.0Hz)分別為C環(huán)上H-3",5"和4"的信號(hào)。具體碳譜數(shù)據(jù)(125MHz,CDCl₃)如下：δ124.0(C-3)、124.5(C-3")、124.7(C-5")、125.4(C-4')、126.9(C-3')、128.1(C-4")、134.5(C-2')、136.4(C-5')、137.3(C-4)、139.2(C-2")、141.6(C-5)、146.8(C-2)、182.4(5-CHO)。

化合物10的表征如下：

¹H-NMR(500MHz,pyridine-d₅)譜低場(chǎng)區(qū)有2個(gè)氫：δ5.63(1H，br s，H-12)和5.29(1H，br s，H-16)。中低場(chǎng)區(qū)可以觀測(cè)到：δ3.44(1H，dd,J＝5.0,11.0Hz)為H-3位氫信號(hào)；δ6.31(1H,d,J＝8.5Hz,H-1')提示有一個(gè)葡萄糖基存在。在高場(chǎng)區(qū)還可觀測(cè)到7個(gè)特征的甲基峰信號(hào)：δ1.82(3H,s,H-27),1.21(3H,s,H-23),1.16(3H,s,H-26),1.05(3H,s,H-30),1.03(3H,s,H-24),1.00(3H,s,H-29)和0.97(3H,s,H-25)。¹³C-NMR(125MHz，pyridine-d₅)譜數(shù)據(jù)歸屬如下：39.1(C-1)，28.1(C-2)，78.1(C-3)，39.4(C-4)，56.0(C-5)，18.9(C-6)，33.2(C-7)，40.2(C-8)，47.3(C-9)，37.5(C-10)，23.9(C-11)，122.7(C-12)，144.5(C-13)，42.1(C-14)，36.0(C-15)，74.1(C-16)，48.9(C-17)，41.4(C-18)，47.3(C-19)，30.9(C-20)，36.1(C-21)，32.3(C-22)，28.8(C-23)，16.6(C-24)，15.8(C-25)，17.6(C-26)，27.3(C-27)，176.0(C-28)，33.6(C-29)，24.6(C-30)，95.9(C-1')，74.1(C-2')，79.4(C-3')，71.0(C-4')，78.8(C-5')，62.2(C-6')。

化合物11的表征如下：

¹H-NMR(500MHz,CD₃OD)譜低場(chǎng)區(qū)，可以看到一組ABX芳香氫質(zhì)子信號(hào)：δ7.43(1H,d,J＝2.0Hz,H-2),7.42(1H,dd,J＝2.0,8.0Hz,H-6),6.80(1H,d,J＝8.0Hz,H-5),一組乙基氫質(zhì)子信號(hào)：δ4.29(2H,q,J＝7.0Hz,H-8)；δ1.35(3H,t,J＝7.0Hz,H-9)。在¹³C-NMR(125MHz,CD₃OD)譜上出現(xiàn)六個(gè)相應(yīng)的芳香碳信號(hào)：δ122.9(C-1),117.4(C-2),146.2(C-3),145.7(C-4),115.9(C-5)和123.6(C-6)，一個(gè)羧基碳信號(hào)：δ168.5(C-7)，一組乙基碳信號(hào)δ61.7(C-8),14.7(C-9)。

化合物12的表征如下：

¹H-NMR(500MHz,CDCl₃)譜低場(chǎng)區(qū)有3個(gè)氫：δ5.34(1H，d，J＝5.0Hz，H-6)，5.15(1H，dd，J＝9.0，15.0Hz，H-22)和δ5.02(1H，dd，J＝9.0，15.0Hz，H-23)。中低場(chǎng)區(qū)δ3.52(1H，m，H-3)為3位的連氧氫信號(hào)。高場(chǎng)區(qū)出現(xiàn)6個(gè)甲基信號(hào)：δ1.02(3H，d，J＝7.0Hz，H-21)，1.01(3H，s，H-19)，0.85(3H，d，J＝7.0Hz，H-26)，0.81(3H，t，J＝7.0Hz，H-29)，0.80(3H，d，J＝7.0Hz，H-27)和0.70(3H，s，H-18)。¹³C-NMR(125MHz，CDCl₃)譜具體數(shù)據(jù)歸屬如下δ：12.1(C-18)、12.3(C-29)、19.0(C-27)、19.4(C-19)、21.1(C-11,16)、21.2(C-21)、24.4(C-15)、25.4(C-28)、28.9(C-16)、31.7(C-25)、31.9(C-2,7,8)、36.5(C-10)、37.3(C-1)、39.7(C-12)、40.5(C-20)、42.2(C-13)、42.3(C-4)、50.2(C-9)、51.3(C-24)、56.0(C-17)、56.9(C-14)、71.8(C-3)、121.7(C-6)、129.3(C-23)、138.3(C-22)、140.8(C-5)。

化合物13的表征如下：

¹H-NMR(500MHz,CDCl₃)譜中δ9.86為5位醛基質(zhì)子信號(hào)；δ7.67(1H，d，J＝4.0Hz)和7.24(1H，d，J＝4.0Hz)為A環(huán)上4和3位氫信號(hào)；7.22(1H，d，J＝4.0Hz)和7.14(1H，d，J＝4.0Hz)分別為B環(huán)上H-3'和4'的信號(hào)；6.02(1H，dd，J＝11.5,17.5Hz,H-4")；5.76(1H，dd，J＝1.0,17.5Hz)和5.60(1H，dd,J＝1.0,11.5Hz)為5"位的烯氫信號(hào)。¹³C-NMR(125MHz，CDCl₃)譜數(shù)據(jù)歸屬如下：δ82.7(C-2")、94.3(C-3")、116.6(C-4")、124.6(C-3)、124.8(C-5')、126.0(C-3')、127.8(C-5")、133.1(C-4')、137.2(C-2')、137.2(C-4)、142.1(C-5)、146.1(C-2)、182.5(5-CHO)。

化合物14的表征如下：

在¹H-NMR(500MHz,DMSO-d₆)譜低場(chǎng)區(qū)，可以看到4個(gè)芳香氫質(zhì)子信號(hào)：δ6.47(1H,d,J＝2.0Hz,H-8),6.63(1H,d,J＝2.0Hz,H-6),7.18(1H,s,H-13),7.25(1H,s,H-10)。在¹³C-NMR(125MHz,DMSO-d₆)譜上出現(xiàn)12個(gè)芳香碳，2個(gè)烯碳，一個(gè)羰基碳和一個(gè)甲氧基碳信號(hào)：δ158.8(C-1),101.6(C-2),155.2(C-3),96.6(C-4),154.7(C-5),93.1(C-6),162.1(C-7),98.1(C-8),157.7(C-9),104.5(C-10),145.3(C-11),144.2(C-12),98.8(C-13),113.6(C-14),148.8(C-15),55.6(C-16)。

化合物15的表征如下：

¹H-NMR(500MHz,CDCl₃)譜的低場(chǎng)區(qū)有7個(gè)氫，δ7.22(1H，d，J＝5.0Hz)，7.17(1H，d，J＝3.0Hz)和7.02(1H，overlapped)分別為C環(huán)上H-5"，3"和4"位氫信號(hào)；7.06(1H，d，J＝3.5Hz)和7.05(1H，d，J＝3.5Hz)分別為B環(huán)上H-4'和3'的信號(hào)；7.03(1H，overlapped)和6.92(1H，d，J＝3.0Hz)分別為A環(huán)上H-3和4的信號(hào)。在中低場(chǎng)區(qū)有一個(gè)明顯的寬單峰：δ4.81(2H，br s，5-CH₂OH)。碳譜具體數(shù)據(jù)(125MHz,CDCl₃)如下：δ60.2(5-CH₂OH)、123.3(C-3)、123.8(C-3")、124.3(C-3'、4')、124.5(C-5")、126.3(C-4)、127.9(C-4")、136.1(C-5')、136.4(C-2')、137.1(C-2")、137.4(C-2)、143.1(C-5)。

化合物16的表征如下：

¹³C-NMR(125MHz，pyridine-d₅)譜數(shù)據(jù)歸屬如下：39.1(C-1)，28.2(C-2)，78.1(C-3)，39.4(C-4)，55.9(C-5)，18.9(C-6)，33.4(C-7)，40.0(C-8)，47.3(C-9)，37.5(C-10)，23.9(C-11)，122.5(C-12)，145.2(C-13)，42.2(C-14)，36.2(C-15)，74.7(C-16)，48.9(C-17)，41.5(C-18)，47.3(C-19)，31.1(C-20)，36.2(C-21)，32.9(C-22)，28.8(C-23)，16.6(C-24)，15.7(C-25)，17.6(C-26)，27.3(C-27)，180.0(C-28)，33.6(C-29)，24.8(C-30)。

化合物17的表征如下：

¹H-NMR(500MHz,CD₃OD)譜低場(chǎng)區(qū)有2個(gè)氫：δ5.29(1H，br s，H-12)和4.46(1H，br s，H-16)。中低場(chǎng)區(qū)可以觀測(cè)到：δ3.18(1H，m)為H-3位氫信號(hào)；δ4.32(1H,d,J＝7.5Hz,H-1')提示有一個(gè)葡萄糖基存在。在高場(chǎng)區(qū)還可觀測(cè)到7個(gè)特征的甲基峰信號(hào)：δ1.37(3H,s,H-27),1.05(3H,s,H-23),0.97(3H,s,H-30),0.96(3H,s,H-25),0.88(3H,s,H-29),0.85(3H,s,H-24)和0.79(3H,s,H-26)。¹³C-NMR(125MHz，CD₃OD)譜數(shù)據(jù)歸屬如下：38.0(C-1)，27.1(C-2)，90.9(C-3)，36.3(C-4)，57.2(C-5)，19.4(C-6)，34.4(C-7)，40.2(C-8)，47.8(C-9)，36.6(C-10)，24.5(C-11)，123.5(C-12)，145.1(C-13)，40.7(C-14)，39.9(C-15)，75.3(C-16)，47.8(C-17)，42.1(C-18)，42.7(C-19)，31.5(C-20)，36.3(C-21)，32.8(C-22)，28.6(C-23)，17.1(C-24)，16.1(C-25)，17.8(C-26)，27.3(C-27)，181.2(C-28)，33.5(C-29)，25.0(C-30)，106.8(C-1')，75.8(C-2')，78.4(C-3')，71.7(C-4')，77.7(C-5')，62.9(C-6')。

表1化合物列表

實(shí)施例3墨旱蓮提取物中化合物含量的測(cè)定

(a)對(duì)照品及供試品溶液的制備

分別稱取各對(duì)照品適量，精密稱定，置10mL容量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為50％的甲醇-水溶液至刻度，得對(duì)照品系列溶液①，木樨草素7-O-β-D葡萄糖苷(簡(jiǎn)稱A,18.15mg),木樨草素(簡(jiǎn)稱B,4.64mg),旱蓮苷IV(簡(jiǎn)稱C,11.85mg),芹菜素(簡(jiǎn)稱D,1.56mg),旱蓮苷A(簡(jiǎn)稱E,21.50mg),刺囊酸-28-O-β-D-葡萄糖苷(簡(jiǎn)稱F,2.60mg),刺囊酸(簡(jiǎn)稱G,8.45mg)。取對(duì)照品系列溶液①各1mL分別置10mL容量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為50％的甲醇-水溶液至刻度，得對(duì)照品系列溶液②。取各對(duì)照品溶液②等體積混合，加體積分?jǐn)?shù)為50％的甲醇-水溶液稀釋，得到對(duì)照品混標(biāo)溶液；最終得各化合物的線性范圍為：0.028－20.17μg/mL(A),0.012－8.59μg/mL(B),0.060－43.89μg/mL(C),0.008－5.78μg/mL(D),0.033－23.89μg/mL(E),0.013－9.63μg/mL(F),0.013－9.39μg/mL(G)。

取墨旱蓮粗粉樣品約1.00g，精密稱定，置50mL量瓶中，精密加入25mL體積分?jǐn)?shù)為50％的甲醇-水溶液，稱定重量，室溫下超聲30分鐘，放置30分鐘，加甲醇補(bǔ)足重量.過濾，取續(xù)濾液1mL置10mL容量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為50％的甲醇-水溶液定溶，取1mL定溶液只離心管中，以13171g離心10分鐘，取上清即得供試品溶液。

(b)墨旱蓮的HPLC-QQQ(高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜)分析

HPLC流動(dòng)相：乙腈(A)-水(含0.1％甲酸；B)；采用梯度洗脫方式：0–5分鐘,30–100％A；5–10分鐘,100％A；10–11分鐘,100–30％A；11–20分鐘,30％A；流速0.5mL/分鐘；柱溫35℃；進(jìn)樣體積1μL。

QQQ：電噴霧離子源(ESI)；采用負(fù)離子模式；液氮為霧化氣和干燥氣，高純氮為碰撞氣；干燥氣流速8.0L/分鐘，溫度350℃；霧化氣壓力45psig；毛細(xì)管電壓4000V；采用MRM(多反應(yīng)監(jiān)測(cè))模式同時(shí)監(jiān)測(cè)7個(gè)化合物(見表2)；

表2MRM定量參數(shù)

(c)線性關(guān)系考察

吸取對(duì)照品混標(biāo)溶液適量，加50％甲醇稀釋，共制備7份不同濃度混標(biāo)溶液，按上述(b)中的HPLC-QQQ條件測(cè)定，每個(gè)樣品測(cè)定3次，以峰面積為縱坐標(biāo)Y，樣品濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)X，進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果線性關(guān)系良好，R²均在0.9990以上，詳見表3。

表3定量標(biāo)準(zhǔn)曲線,定量限及檢測(cè)限

(d)檢測(cè)限與定量限

以50％甲醇(體積百分?jǐn)?shù))稀釋對(duì)照品混標(biāo)溶液，按上述(b)中HPLC-QQQ條件測(cè)定，分別以信噪比(S/N)為3和10計(jì)算最低檢測(cè)限(LOD)和最低定量限(LOQ)，結(jié)果見表3。

(e)精密度與重復(fù)性

日內(nèi)精密度(Intra-day Precision)：取標(biāo)準(zhǔn)曲線中間點(diǎn)的同一對(duì)照品混標(biāo)溶液，按上述HPLC-QQQ條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄LC-MS譜圖，積分、計(jì)算峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，考察儀器的精密度，結(jié)果各化合物的RSD均小于2.37％，表明日內(nèi)精密度良好，結(jié)果如表4所示。

日間精密度(Inter-day Precision)：取標(biāo)準(zhǔn)曲線中間點(diǎn)的同一對(duì)照品混標(biāo)溶液，連續(xù)3天，每隔12小時(shí)，按上述HPLC-QQQ條件測(cè)定一次，記錄LC-MS譜圖，積分、計(jì)算峰面積，計(jì)算RSD，結(jié)果各化合物的RSD均小于2.49％，表明日間精密度良好，結(jié)果如表4所示。

重復(fù)性試驗(yàn)：平行取6份同一樣品(S9)，按3.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照上述HPLC-QQQ條件，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD，結(jié)果各化合物的RSD均小于2.99％，表明供試品制備方法重復(fù)性良好。結(jié)果如表4所示。

表4.精密度，重復(fù)性及加樣回收率

(f)樣品測(cè)定及結(jié)果

采用上述(b)中HPLC-QQQ對(duì)13批(S1-S13)不同產(chǎn)地的墨旱蓮進(jìn)行含量測(cè)定，每份樣品測(cè)定3次。結(jié)果見表5。

各批墨旱蓮的產(chǎn)地如下：

S1：湖南；S2：河北；S3：河南；S4：河南；S5：河北；S6：未知；S7：江蘇；S8：未知；S9：河北；S10：未知；S11：未知；S12：河北；S13：安徽。

表5.含量測(cè)定結(jié)果(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,μg/g,n＝3)

ND:表示未檢測(cè)出；

實(shí)施例4化合物1-17雌激素活性篩選實(shí)驗(yàn)

試劑：DMEM/F-12,HEPES,no phenol red為公司生產(chǎn)，；貨號(hào)為11039-021規(guī)格為500ml/瓶；

活性碳吸附胎牛血清FBS為BioInd公司生產(chǎn)，貨號(hào)為04-201-1A，規(guī)格為500ml/瓶；

penicillin streptomycin solution為hyclone公司生產(chǎn)，貨號(hào)為SV30010規(guī)格為100ml/瓶；

FBS為Hyclone公司生產(chǎn)貨號(hào)：SH30084.03E規(guī)格500ml；

ERαAntibody(F-10)為Santa Cruz公司生產(chǎn)貨號(hào)：sc-8002規(guī)格200μg/ml；

Donkey Anti-Mouse IgG H&L(Alexa488)為abcam公司生產(chǎn)貨號(hào)：ab150105 500ug；

Hochest33342為SIGMA公司生產(chǎn)貨號(hào)：14533；

他莫昔芬為Sigma-Aldrich公司生產(chǎn)貨號(hào)：T5648-1G

PBS由KH2PO4，Na2HPO4，NaCl，KCl粉末用超純水配制，粉末均為Sigma公司生產(chǎn)；

DMSO為索來寶公司生產(chǎn),細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)別，貨號(hào)：D8371規(guī)格50ml/瓶；

4％多聚甲醛為索萊寶公司生產(chǎn)，貨號(hào)：P1110規(guī)格500ml/瓶；

TritonX-100為索萊寶公司生產(chǎn)貨號(hào)T8200規(guī)格100ml/瓶；

Tween-20為索萊寶公司生產(chǎn)貨號(hào)：T8220規(guī)格100ml；

儀器:High Screening Assay(Operetta)在Perkin Elmer公司購(gòu)買；

CO2培養(yǎng)箱IL-161HI為STIK公司生產(chǎn)；

可調(diào)速可定時(shí)漩渦混合器(SI-T256)

電熱式恒溫水浴鍋為天津歐諾儀器公司生產(chǎn)；

移液槍為Eppendorf公司生產(chǎn)；

尼康ECLIPSE Ti-U倒置生物顯微鏡

1.6R臺(tái)式多用離心機(jī)為Thermo公司生產(chǎn)；

制水機(jī)為美國(guó)密理博Milli-Q Century超純水系統(tǒng)，型號(hào)為Milli-QAcademic,Milli-Q Grandient,Milli-Q Biocel,Milli-Q Synthesis

4℃海爾冰箱

-20℃海爾冰箱

化合物1-17樣品配制：用稱取的樣品質(zhì)量m除以該樣品的相對(duì)分子質(zhì)量M，得到該樣品的物質(zhì)的量n,然后加入10*n體積的DMSO,得到10^-1mol/L的初始濃度。取10ul體積的10^-1mol/L的藥物，用DMSO稀釋至100ul，得到濃度為10^-2mol/L濃度的藥物，以此類推，稀釋至10^-4mol/L，分裝為10ul每管，-20℃保存。

采用間接免疫熒光的方法篩選能夠選擇性激活雌激素受體入核的化合物。實(shí)際上，雌激素受體由細(xì)胞漿進(jìn)入細(xì)胞核是其發(fā)揮基因組途徑調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的起始步驟。

1、細(xì)胞及其培養(yǎng)

MCF-7細(xì)胞(Number:HTB-22^TM)購(gòu)自ATCC并由本室傳代培養(yǎng)；MCF-7細(xì)胞在37℃，5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，用10％FBS/DMEM(4500mg/L D-葡萄糖、L-谷氨酰和110mg/L丙酮酸鈉，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素)培養(yǎng)。

2、核遷移實(shí)驗(yàn)步驟

在37℃，5％CO₂的條件下，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中使用含有10％活性炭吸附的胎牛血清和1％雙抗的無(wú)酚紅DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞。72h后，細(xì)胞密度為80％左右，將細(xì)胞按7000/孔的密度鋪于96孔黑板中，中間60孔為實(shí)驗(yàn)孔，每孔中加入含1％活性炭吸附的血清及1％雙抗的無(wú)酚紅DMEM/F12培養(yǎng)液100ul，周圍孔用100mlPBS填充，培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞完全貼壁。用無(wú)酚紅DMEM/F12培基稀釋藥品(藥品是用DMSO稀釋至10^-4M,分裝保存于-20℃冰箱)至10^-7M。96孔板中實(shí)驗(yàn)孔每孔100ul濃度10^-7M的藥物溶液，陽(yáng)性藥為他莫昔芬，空白對(duì)照加入含有1‰DMSO的無(wú)酚紅DMEM/F12培養(yǎng)基，每種藥物設(shè)三個(gè)復(fù)孔。給藥完成后，在37℃，5％CO₂的條件下孵育半小時(shí)，用4％的多聚甲醛固定細(xì)胞半小時(shí)(室溫)。用PBS洗細(xì)胞三遍，每孔200ul,每遍一分鐘。加入0.2％的TritonX-100打孔半小時(shí)(室溫)，用PBS洗細(xì)胞三遍，每孔200ul,每遍一分鐘。加入5％的胎牛血清(Hyclone小牛血清，用PBS稀釋)封閉2小時(shí)(室溫)，加入一抗(0.01％Tween-20+0.5％Hyclone胎牛血清+1％一抗+PBS，一抗為ERα),4℃孵育過夜，PBST(PBS+0.05％Tween-20)洗細(xì)胞三遍，每孔200ul,每遍5分鐘，然后再用PBS洗三遍，每孔200ul,每遍一分鐘。避光加入二抗(0.01％Tween-20+0.5％Hyclone胎牛血清+萬(wàn)分之一的Hochest+二百分之一的二抗+PBS，二抗為Alex488,),室溫孵育兩小時(shí)。PBST(PBS+0.05％Tween-20)洗細(xì)胞三遍，每孔200ul,每遍5分鐘，然后再用PBS洗三遍，每孔200ul,每遍一分鐘，最后孔內(nèi)加入100ulPBS上高內(nèi)涵。高內(nèi)涵拍照完成后，用高內(nèi)涵自動(dòng)處理數(shù)據(jù)，即核內(nèi)的熒光值比細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的熒光值，取三個(gè)空的平均值。用Graphpad作圖，SPSS處理數(shù)據(jù)，藥物組與空白組對(duì)比是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表6所示：

表6化合物1-17對(duì)雌激素受體α的激活作用結(jié)果

*p<0.05，**p<0.01,***p<0.001，ns代表無(wú)效

從上述的活性實(shí)驗(yàn)可以看出，從墨旱蓮中分離出的化合物1-17，除化合物7、化合物8、化合物15、化合物16外，其它化合物均能夠與雌激素受體ERα結(jié)合，提高其轉(zhuǎn)錄活性，證實(shí)了這些化合物具有雌激素樣作用。因此，可用于防治更年期綜合征、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、乳腺癌、子宮癌、前列腺癌和結(jié)腸癌，且其藥理作用在心血管系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)和免疫調(diào)節(jié)等領(lǐng)域得到擴(kuò)展。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。