專利名稱：Lrp4/Corin多巴胺能神經(jīng)元祖細胞標(biāo)志物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測和選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的多核苷酸探針和抗體，以及使用上述多核苷酸探針和抗體的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的檢測和選擇方法，還有使用多巴胺能神經(jīng)元祖細胞等治療帕金森病等神經(jīng)變性疾病的試劑盒及治療方法。
背景技術(shù)：
多巴胺系統(tǒng)是與哺乳動物腦內(nèi)重要的運動調(diào)節(jié)、激素分泌調(diào)節(jié)、情緒調(diào)節(jié)等相關(guān)的非常重要的系統(tǒng)。因而，多巴胺能性神經(jīng)傳導(dǎo)的異?？梢l(fā)各種神經(jīng)系統(tǒng)障礙。例如，帕金森病是由中腦黑質(zhì)的多巴胺能神經(jīng)元特異性脫落原因引起的錐體外系統(tǒng)神經(jīng)變性疾病(HARRISON’S PRINCIPLESOF INTERNAL MEDICINE第2卷第23版，Isselbacher et al.等編，McGraw-Hill Inc.，NY(1994)pp.2275-7)。帕金森病的治療方法，主要采用口服給與L-DOPA(3，4-二羥基苯丙氨酸)的方法以補償多巴胺產(chǎn)量的減少，但已知該方法療效的持續(xù)性不好。
在帕金森病的治療方面，最近科研人員正在嘗試一種移植含有多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的6-9周齡流產(chǎn)胎兒的中腦腹側(cè)區(qū)以補償失去的多巴胺能神經(jīng)元的方法(專利文獻1；非專利文獻1-6)。但是，現(xiàn)階段，該方法不僅在細胞供應(yīng)方面和倫理方面存在問題(Rosenstain(1995)Exp.Neurol.33106；Turner et al.(1993)Neurosurg.331031-7)，而且還被指出在感染污染的危險性、移植物的免疫排斥(Lopez-Lozano et al.(1997)Transp.Proc.29977-80；Widner and Brudin(1988)Brain Res.Rev.13287-324)、由于與糖酵解相比胎兒組織更主要地依賴脂類代謝而造成的存活率低下(Rosenstain(1995)Exp.Neurol.33106)等各個方面存在問題。
為了解決倫理層面、供應(yīng)不足等問題，科研人員又提出了例如利用豬源的皮質(zhì)、紋及中腦細胞的方法等。(例如，參考專利文獻2-4)。在這些方法中，為了抑制排斥反應(yīng)，必須要進行改變細胞表面抗原(MHC-I類抗原)的繁雜操作。作為消除移植物排斥的方法，例如，有科研人員提出可通過同時移植Sertoli細胞而進行局部免疫抑制(專利文獻5-6及非專利文獻7)。雖然也可從MHC匹配的有血緣關(guān)系的人、其他人的骨髓、骨髓銀行及臍帶血銀行等獲取移植細胞，但如果能夠利用患者自身的細胞，就可以無需多余的操作和步驟而解決排斥反應(yīng)的問題。
因而，有望實現(xiàn)來自于胚胎干細胞(ES細胞)、骨髓間質(zhì)細胞等非神經(jīng)系統(tǒng)細胞的體外多巴胺能神經(jīng)元分化體系作為移植材料的應(yīng)用，而以此代替流產(chǎn)胎兒來源的細胞。實際上，有報道稱向大鼠帕金森病模型的病變紋移植ES細胞，可以形成功能性的多巴胺能神經(jīng)元(非專利文獻8)?？梢哉J(rèn)為將來，源自ES細胞或患者本人的神經(jīng)干細胞的再生治療會越來越重要。
在神經(jīng)組織損傷的治療方面，腦機能的再構(gòu)建是必須的，為了能夠與周圍的細胞形成合適的連接(形成網(wǎng)絡(luò))，必須移植不是成熟細胞的可以體內(nèi)分化為神經(jīng)元的細胞。在神經(jīng)元祖細胞移植方面，除上述供給方面之外，該祖細胞可能分化為不均一的細胞群，也是存在的問題之一。例如，在帕金森病的治療中，必須從含有兒茶酚胺的神經(jīng)元中選擇性地移植多巴胺能神經(jīng)元。目前為止，作為已經(jīng)提出的可用于帕金森病治療的移植細胞，例如包括紋狀體(非專利文獻3和9)、人胎兒神經(jīng)來源的無限增殖化細胞系(專利文獻7-9)、NT2Z細胞的有絲分裂后人神經(jīng)元(專利文獻10)、原始神經(jīng)元細胞(專利文獻11)、通過外源基因轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生多巴胺等兒茶酚胺類物質(zhì)的細胞、骨髓基質(zhì)細胞(專利文獻12-13)、基因修飾的ES細胞(非專利文獻8)等。此外，有人提出還可以利用通過使胎兒中腦組織來源的神經(jīng)祖細胞與FGF-8及Shh相接觸而形成的多巴胺能神經(jīng)元(專利文獻14)和通過以視黃酸處理NT2神經(jīng)細胞而形成的表達酪氨酸羥化酶的細胞(專利文獻15)。然而，上述材料均非僅含有多巴胺能神經(jīng)元或可分化為多巴胺能神經(jīng)元的細胞。
作為從未分化的細胞群中選擇性地濃縮、分離多巴胺能神經(jīng)元的方法，有人提出在多巴胺能神經(jīng)元表達的酪氨酸羥化酶(以下也稱為“TH”)等的基因的啟動子/增強子的控制下，將表達熒光蛋白的報告基因?qū)爰毎褐械母骷毎?，通過分離發(fā)出熒光的細胞，實現(xiàn)多巴胺能神經(jīng)元在存活狀態(tài)下的可視化，進而進行濃縮、分離或鑒定的方法(專利文獻16)。在該方法中，外源基因?qū)脒@樣繁瑣復(fù)雜的過程是必不可少的，而且在用于于基因治療的目的時，報告基因的存在也造成毒性、免疫原性方面的問題。
專利文獻專利文獻1美國專利第5690927號專利文獻2特表平10-508487號公報專利文獻3特表平10-508488號公報專利文獻4特表平10-509034號公報專利文獻5特表平11-509170號公報專利文獻6特表平11-501818號公報專利文獻7特表平8-509215號公報專利文獻8特表平11-506930號公報專利文獻9特表2002-522070號公報專利文獻10特表平9-5050554號公報專利文獻11特表平11-509729號公報專利文獻12特表2002-504503號公報專利文獻13特表2002-513545號公報專利文獻14美國專利第6277820號專利文獻15國際公開第00/06700號專利文獻16特開2002-51775號公報非專利文獻1Spencer et al.(1992)N.Engl.J.Med.3271541-8非專利文獻2Freed et al.(1992)N.Engl.J.Med.3271549-55非專利文獻3Widner et al.(1992)N.Engl.J.Med.3271556-63非專利文獻4Kordower et al.(1995)N.Engl.J.Med.3321118-24非專利文獻5Defer et al.(1996)Brain 11941-50非專利文獻6Lopez-Lozano et al.(1997)Transp.Proc.29977-80非專利文獻7Selawry and Cameron(1993)Cell Transplant 2123-9非專利文獻8Kim et al.(2002)Nature 41850-56非專利文獻9Lindvall et al.(1989)Arch.Neurol.46615-31發(fā)明的公開發(fā)明要解決的課題現(xiàn)階段，帕金森病移植治療方面的一個大問題是流產(chǎn)胎兒的中腦腹側(cè)區(qū)和體外分化誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元前體細胞均是多種細胞的混合物?？紤]到形成神經(jīng)回路方面的安全性，優(yōu)選分離出單一的目的類型的細胞并加以應(yīng)用。而且，考慮到形成腫瘤的危險性，以使用經(jīng)分離的分裂停止后的神經(jīng)細胞為佳。更進一步，考慮到移植時細胞在腦內(nèi)的存活以及正確形成網(wǎng)絡(luò)的能力，希望能夠分離出更早期的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞以增進治療效果。
解決該課題的方法因此，為了分離多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的特異性基因，將E1 2.5小鼠中腦腹側(cè)區(qū)沿背腹方向進一步切分為兩個區(qū)域，并采用改進的差減法(N-RDA，representational difference analysis，代表性差別分析法；RDA(Listsyn NA(1995)Trends Genet.11303-7))(“DNA片段的量均一化方法及差減法”(WO2002/103007小冊子))鑒定了在含有多巴胺能神經(jīng)元的最靠腹側(cè)的區(qū)域中特異性表達的基因。其結(jié)果，本發(fā)明人等成功分離了Lrp4/Corin。Lrp4編碼II型跨膜蛋白(

圖1)。
在中腦，Lrp4 mRNA在腹側(cè)中心部分特異性地表達，其表達區(qū)域與存在多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的區(qū)域一致。進而，比較Lrp4與多巴胺神經(jīng)元標(biāo)志物TH的表達，發(fā)現(xiàn)兩者的信號在背腹方向的位置一致但不重合(圖4和5)。這表明在停止細胞分裂并移動至神經(jīng)管外層的該祖細胞中不表達Lrp4mRNA。因此，通過將Lrp4 mRNA作為指標(biāo)，可以特異性地檢測和選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞。
因而，本發(fā)明提供可特異性地檢測Lrp4 mRNA的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞標(biāo)志多核苷酸探針，以及利用該探針選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞的方法。更進一步，本發(fā)明涉及利用這樣的核苷酸探針選擇出的分裂停止前的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞(以下也簡稱為“多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞”)、利用該增殖祖細胞分離多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞的特異性基因及從該祖細胞到多巴胺能神經(jīng)元的各成熟階段的特異性基因的方法、以及以成熟為指標(biāo)篩選誘導(dǎo)該祖細胞分化或增殖的化合物的方法。而且，對使用本發(fā)明的核酸探針選出的增殖祖細胞進行培養(yǎng)，可獲得含有分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元前體細胞的多巴胺能神經(jīng)元系細胞。這里，多巴胺能神經(jīng)元系細胞是指多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞、分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元前體細胞和/或多巴胺能神經(jīng)元。多巴胺能神經(jīng)元系細胞同樣可用于分離向多巴胺能神經(jīng)元成熟的各階段的特異性基因的方法，以及以成熟為指標(biāo)的篩選誘導(dǎo)該祖細胞分化或增殖的化合物的方法。因此，本發(fā)明涉及對利用本發(fā)明的核酸探針選出的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞進行培養(yǎng)而獲得多巴胺能神經(jīng)元系細胞的方法、通過該方法獲得的細胞、使用該細胞分離向多巴胺能神經(jīng)元成熟的各階段的特異性基因的方法、以及以成熟為指標(biāo)的篩選誘導(dǎo)該細胞分化或增殖的化合物的方法。
進一步，制備了抗Lrp4抗體，針對Lrp4蛋白的表達進行了研究。首先，在確認(rèn)組織內(nèi)的表達時(圖8)，發(fā)現(xiàn)其與Lrp4 mRNA同樣地發(fā)生了表達。在這個實驗中，雖然在TH表達區(qū)可檢出Lrp4蛋白的信號，但由于增殖祖細胞向神經(jīng)管最外層伸展出突起，所以無法區(qū)分該信號是突起上的蛋白質(zhì)的檢測結(jié)果還是TH表達細胞也同樣表達Lrp4蛋白。接下來，使用抗Lrp4抗體采用流式細胞術(shù)，分析了在細胞表面是否表達Lrp4蛋白。樣品使用已確認(rèn)表達Lrp4 mRNA的細胞即在體外將ES細胞分化誘導(dǎo)(源自基質(zhì)細胞的誘導(dǎo)活性(SDIA)法)為多巴胺能神經(jīng)元祖細胞而得的細胞。結(jié)果可以確認(rèn)該細胞中Lrp4蛋白確實在細胞表面表達(圖9)。如果利用這樣的在細胞表面表達的蛋白質(zhì)作為分離標(biāo)志物，就可以在存活狀態(tài)下對細胞進行選擇，因此是特別優(yōu)選的(參考圖15)。此外，采用5階段(5-stage)法在體外將ES細胞分化誘導(dǎo)為多巴胺能神經(jīng)元祖細胞，通過RT-PCR及使用抗Lrp4單克隆抗體的流式細胞術(shù)確認(rèn)了Lrp4的表達。結(jié)果表明，采用5階段法分化而得的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞中同樣表達Lrp4(圖17A、B)。
接下來，從經(jīng)誘導(dǎo)分化(SDIA法)的細胞及胎鼠中腦腹側(cè)細胞中，使用抗Lrp4抗體，通過細胞分選器對Lrp4陽性細胞進行分離。針對分離出的細胞通過RT-PCR方法進行基因表達分析時，雖可確認(rèn)神經(jīng)元增殖祖細胞標(biāo)志物即巢蛋白(Nestin)的表達，但進一步實驗還表明含有表達分裂停止后的神經(jīng)元標(biāo)志物即MAP2的細胞(圖10)。此外，與Lrp4陰性細胞群相比，Lrp4陽性細胞群中，分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞標(biāo)志物Nurrl和TH的表達水平更高。因而，與Lrp4 mRNA為指標(biāo)時的情況不同，以Lrp4蛋白為指標(biāo)使用抗體進行細胞選擇時，可以分離出含有分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元前體細胞的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞。以下，在本說明書中，“多巴胺能神經(jīng)元祖細胞”是指多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞及分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元前體細胞。此外，對于使用抗Lrp4抗體從采用SDIA法在體外誘導(dǎo)分化ES細胞而得的細胞中分離出的細胞，進行了ES細胞特異性表達的Eras和Nanog的表達分析。結(jié)果可以確認(rèn)兩者的基因在Lrp4陽性細胞中不表達，而在Lrp4陰性細胞中表達(圖18)。因而，通過使用抗Lrp4抗體對細胞進行選擇，在誘導(dǎo)分化后同樣可以選擇、除去未分化的ES細胞。進一步，從含有由采用5階段法在體外誘導(dǎo)分化ES細胞而得的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的細胞群中分離出Lrp4陽性細胞。接下來，對分離出的Lrp4陽性細胞進行體外培養(yǎng)的結(jié)果表明，誘導(dǎo)產(chǎn)生了TH蛋白陽性的多巴胺能神經(jīng)元(圖17C)。這表明采用5階段法誘導(dǎo)的Lrp4陽性細胞是多巴胺能神經(jīng)元祖細胞，并可在體外成熟。
因而，本發(fā)明提供可特異性地檢測出Lrp4蛋白的抗體、以及利用該抗體選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的方法。進一步，本發(fā)明涉及利用該抗體選擇的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞，以及利用該祖細胞分離多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的特異性基因及由該祖細胞向多巴胺能神經(jīng)元成熟的各階段的特異性基因的方法、以及以成熟為指標(biāo)的篩選誘導(dǎo)該祖細胞分化或增殖的化合物的方法。而且，對使用本發(fā)明的抗體選擇出的該祖細胞進行培養(yǎng)，可以獲得其它分化階段的多巴胺能神經(jīng)元系細胞。這些細胞同樣可用于篩選向多巴胺能神經(jīng)元成熟的各階段的特異性基因的方法、以及以成熟為指標(biāo)的篩選誘導(dǎo)該祖細胞分化或增殖的化合物的方法。因而，本發(fā)明還涉及對使用本發(fā)明的抗體選擇出的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞進行培養(yǎng)而獲得多巴胺能神經(jīng)元系細胞的方法、通過該方法獲得的細胞、使用該細胞分離向多巴胺能神經(jīng)元分化成熟的各階段中的特異性基因的方法、以及以成熟為指標(biāo)的篩選誘導(dǎo)該細胞分化或增殖的化合物的方法。
進一步，本發(fā)明人等將使用抗Lrp4單克隆抗體分離出的Lrp4表達細胞移植入帕金森病模型小鼠紋狀體。其結(jié)果，接受移植的小鼠紋狀體內(nèi)發(fā)現(xiàn)EGFP陽性細胞(表1)，由此可知所移植的Lrp4蛋白陽性細胞可在帕金森病模型小鼠的紋狀體內(nèi)植活。而且，幾乎所有的植活的細胞均為成熟神經(jīng)元標(biāo)志物MAP2陽性，還觀察到EGFP陽性的軸突伸長到紋狀體內(nèi)(表1及圖16)。與所移植的Lrp4蛋白陽性細胞為神經(jīng)祖細胞相對，幾乎所有植活的細胞均已分化為成熟的神經(jīng)細胞分化并已成熟，且這些植活的細胞中有約20％是TH陽性的，這強烈地暗示所移植的Lrp4蛋白陽性細胞中至少有一部分分化為多巴胺能神經(jīng)元。因此，可以認(rèn)為根據(jù)本發(fā)明分離的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞通過移植到腦內(nèi)可分化為多巴胺能神經(jīng)元，其對于帕金森病的治療是有效的。即本發(fā)明還涉及含有根據(jù)本發(fā)明分離的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的試劑盒，其用于治療神經(jīng)變性疾病優(yōu)選帕金森?。灰约爸委熒窠?jīng)變性疾病優(yōu)選帕金森病的方法，包括向患者腦內(nèi)移植該多巴胺能神經(jīng)元祖細胞。
發(fā)明的效果至今為止，未見有關(guān)編碼在多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞中特異性表達的膜蛋白的基因的報告。針對在細胞膜表面表達的Lrp4蛋白的抗體被認(rèn)為對于多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的分離是非常有效的。例如，使用抗Lrp4抗體從中腦腹側(cè)區(qū)或者含有體外誘導(dǎo)分化的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的培養(yǎng)細胞中分離Lrp4表達細胞，可以獲得純的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞(圖15)。而且，在采用兩種不同方法(SDIA法和5階段法)誘導(dǎo)的任何一種多巴胺能神經(jīng)元祖細胞中都可確認(rèn)Lrp4的表達，因此不論細胞的來源如何，Lrp4都可以用作多巴胺能神經(jīng)元祖細胞標(biāo)志物。進一步，在Lrp4陽性細胞中未確認(rèn)ES細胞中特異性表達的Eras和Nanog的表達，所以以Lrp4的表達為指標(biāo)，可挑選出未分化的ES細胞。
進一步，本發(fā)明中，分離而得的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞可直接或在體外增殖后進行移植。本發(fā)明的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞具有在腦內(nèi)的最適區(qū)域分化成熟的可能性及在體內(nèi)增殖的可能性，可以期待其具有長期性的治療效果。而且，如果使Lrp4表達細胞在體外分化、成熟后進行移植，對于那些由于某種原因在體內(nèi)不能分化為多巴胺能神經(jīng)元的情況，同樣可以期待其治療效果?？紤]到腫瘤化等危險性，如果在對體外增殖的Lrp4表達細胞進行誘導(dǎo)分化后，使用65B13(WO2004/038018小冊子)等分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞標(biāo)志物分離細胞，用這樣分離的細胞進行移植，可能具有更高的安全性。無論何種方法，通過分離出Lrp4表達細胞并用于移植治療，由于只分離出目的類型的細胞，所以具有高的安全性，而且因為可以使用最初期的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞，所以在存在活率、網(wǎng)絡(luò)形成能力等方面也可期待更好的治療效果。即使有些情況下使用剛分離出的初期的該祖細胞不能獲得最佳治療效果，由于可通過體外培養(yǎng)等手段使采用本發(fā)明的標(biāo)志物分離出的該祖細胞成熟，可以制備處于最適分化階段的材料(圖6)。
另一方面，純的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞在多巴胺能神經(jīng)元特異性基因的分離等帕金森病治療的靶標(biāo)探索方面也是有效的。特別是，多巴胺能神經(jīng)元祖細胞不僅對于多巴胺能神經(jīng)元成熟過程的研究及以成熟為指標(biāo)的篩選體系，而且對于可在體外或體內(nèi)使該祖細胞增殖的藥物的篩選、以及可在體內(nèi)誘導(dǎo)該祖細胞分化的藥物(體內(nèi)再生治療藥物)的篩選等均是有價值的。
附圖的簡要說明圖1Lrp4的結(jié)構(gòu)模式圖。TM跨膜域；FTIfrizzeled域；LDLaLDL受體域；SR清道夫受體域；Protease絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域。
圖2采用原位雜交法分析Lrp4及Shh的mRNA在E12.5小鼠后腦腹側(cè)和脊髓的表達情況，圖2為顯示其結(jié)果的照片。
圖3采用原位雜交法分析Lrp4、Shh、酪氨酸羥化酶(TH)及NCAM的mRNA在E12.5小鼠中腦腹側(cè)的表達情況，圖3為顯示其結(jié)果的照片。
圖4Lrp4在中腦表達模式的模式圖及顯示采用原位雜交法分析Lrp4、酪氨酸羥化酶(TH)、Sim-1和NCAM的mRNA在E12.5小鼠中腦腹側(cè)表達情況的結(jié)果的照片。VZ腦室區(qū)(ventricular zone)、ML套層(mantle layer)。
圖5采用原位雜交分析Lrp4的mRNA在E12.5小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達情況，圖5為顯示其結(jié)果的照片。A矢狀面；BA中方框內(nèi)部分的放大照片；CA中紅線位置的斷面；D顯示Lrp4、Shh及酪氨酸羥化酶(TH)的mRNA在E12.5小鼠中腦腹側(cè)的表達情況。
圖6多巴胺能神經(jīng)元產(chǎn)生至成熟期間，Lrp4、NCAM、TH和DAT的mRNA的表達時期的模式圖。
圖7上圖為采用SDIA法進行ES細胞向多巴胺能神經(jīng)元的誘導(dǎo)分化的模式圖及照片。下圖的照片顯示了采用SDIA法由ES細胞誘導(dǎo)分化多巴胺能神經(jīng)元、以RT-PCR方法研究Lrp4 mRNA的表達隨時間變化情況的結(jié)果。
圖8顯示Lrp4蛋白在E12.5小鼠中腦的表達情況的照片。
圖9使用抗Lrp4抗體對Lrp4蛋白在SDIA分化細胞的細胞表面的表達情況進行流式細胞術(shù)分析，圖9為顯示其結(jié)果的照片。
圖10對Lrp4陽性細胞中各種多巴胺能神經(jīng)元標(biāo)志物的表達情況進行RT-PCR分析，圖10為顯示其結(jié)果的照片。
圖11顯示多巴胺能神經(jīng)元產(chǎn)生至成熟期間，Lrp4 mRNA和蛋白以及THmRNA表達時期的模式圖。表明在Lrp4表達細胞中，可以增殖的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞與分裂已停止的多巴胺能神經(jīng)元前體細胞兩者共存。
圖12顯示對Lrp4陽性細胞的分化階段進行研究的結(jié)果的照片。
圖13顯示在體外增殖Lrp4陽性細胞的結(jié)果的照片。
圖14顯示Lrp4陽性細胞向多巴胺能神經(jīng)元分化的照片。
圖15顯示使用抗Lrp4抗體分離及應(yīng)用多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的方法的模式圖。
圖16顯示移植的Lrp4陽性細胞在體內(nèi)分化的照片。
圖17顯示5階段法分化細胞中，Lrp4的表達與Lrp4陽性細胞向多巴胺能神經(jīng)元分化的圖及照片。照片C中，箭頭所示為TH蛋白陽性的多巴胺能神經(jīng)元。
圖18Lrp4陽性細胞及Lrp4陰性細胞中，ES細胞特異性基因(ERas與Nanog)的表達情況的RT-PCR分析，圖18為顯示其結(jié)果的照片。
發(fā)明的最佳實施方式以下，針對本發(fā)明的實施方式進行說明。以下的實施方式是用于說明本發(fā)明的示例，并非意味著本發(fā)明僅限于這些實施方式。只要不脫離其要旨，本發(fā)明可以各種形態(tài)實施。而且本說明書引用的文獻和公開公報、專利公報及其它專利文獻均作為參考并入本說明書中。
標(biāo)志物多核苷酸探針本發(fā)明的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞標(biāo)志物多核苷酸探針可作為選擇和/或檢測多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞的標(biāo)志物和/或試劑使用。作為該探針使用的多核苷酸含有多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞中檢出的、與SEQ IDNO1或2的堿基序列互補的堿基序列。SEQ ID NO1為小鼠Lrp4 cDNA堿基序列；而SEQ ID NO2為人Lrp4 cDNA堿基序列。這些序列已分別在GenBank登錄(小鼠登錄號NM_016869；人登錄號XM_035037)。
這里，“標(biāo)志物多核苷酸探針”是指能夠檢測出Lrp4的表達特別是其轉(zhuǎn)錄的mRNA的、由數(shù)個脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)等的堿基或堿基對組成的聚合物。已知雙鏈cDNA可在組織原位雜交中作為探針使用，本發(fā)明的標(biāo)志物也包括這樣的雙鏈cDNA。用于檢測組織中RNA的特別優(yōu)選的探針標(biāo)志物多核苷酸包括例如RNA探針(核糖核酸探針)。而且，根據(jù)需要，本發(fā)明的標(biāo)志物多核苷酸探針可以含有非天然的堿基，例如4-乙酰胞苷、5-(羧基羥甲基)尿苷、2’-O-甲基胞苷、5-羧甲基氨甲基-3-硫代尿苷、5-羧甲基氨甲基尿苷、二氫尿苷、2’-O-甲基假尿苷、β-D-半乳糖基辮苷、2’-O-甲基鳥苷、肌苷、N6-異戊烯基腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿苷、1-甲基鳥苷、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥苷、2-甲基腺苷、2-甲基鳥苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鳥苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿苷、β-D-甘露糖基辮苷、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿苷、5-甲氧基羰基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺苷、N-((9-β-D-呋喃核糖基-2-甲硫基嘌呤-6-基)氨基甲酰)蘇氨酸、N-((9-β-D-呋喃核糖嘌呤-6-基)N-甲基氨基甲酰)蘇氨酸、尿苷-5-氧化乙酸-甲酯、尿苷-5-氧化乙酸、wybutoxosine、假尿苷、辮苷、2-硫代胞苷、5-甲基-2-硫代尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-甲基尿苷、N-((9-β-D-呋喃核糖嘌呤-6-基)氨基甲酰)蘇氨酸、2’-O-甲基-5-甲基尿苷、2’-O-甲基尿苷、wybutosine、3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷等。
而且，本發(fā)明的標(biāo)志物多核苷酸探針含有與編碼SEQ ID NO3或4的氨基酸序列的堿基序列互補的堿基序列。除SEQ ID NO1或2的堿基序列之外，編碼SEQ ID NO3或4的氨基酸序列的堿基序列還包括由于遺傳密碼子的簡并而與SEQ ID NO1或2的序列不同的堿基序列。此外，本發(fā)明的標(biāo)志物多核苷酸探針還包括含有與編碼在SEQ ID NO3或4的氨基酸序列中缺失跨膜區(qū)的序列的堿基序列互補的序列的那些。SEQ ID NO3或4的氨基酸序列不含信號序列，小鼠Lrp4(SEQ ID NO3)的113-135位氨基酸、人Lrp4(SEQ ID NO4)的46-68位氨基酸是形成跨膜區(qū)的部分。而且，SEQ ID NO3和4的序列也已分別在GenBank登錄(人XP_035037、小鼠NP_058565)。
這里，“與某堿基序列互補”并非僅指堿基序列與模板完全配對的情況，其中還包括至少70％、優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少90％、更優(yōu)選至少95％(例如97％或99％)配對的情況。所謂配對意為以T(RNA中為U)對應(yīng)于模板多核苷酸堿基序列中的A、以A對應(yīng)于其中的T或U、以C對應(yīng)于其中的G、以G對應(yīng)于其中的C而形成鏈。而特定的多核苷酸在堿基序列水平的同源性，可由BLAST算法(Altschul(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264-8；Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-7)確定。作為基于該算法的針對堿基序列的程序，研究人員已經(jīng)開發(fā)出BLASTN(Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215403-10)，此程序可用于確定標(biāo)志物多核苷酸探針序列的同源性。關(guān)于具體的分析方法，例如可以參考http://www.ncbi.nlm.nih.gov.等。
進一步，本發(fā)明的標(biāo)志物多核苷酸探針包括含有在嚴(yán)緊條件下與由SEQ ID NO1或2的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸雜交的堿基序列的多核苷酸。關(guān)于Lrp4，含有SEQ ID NO1或2所示的堿基序列的，均為公知，但也可能存在其它同種型(alternative isoform)及等位(allelic)突變體，含有與這樣的同種型、等位突變體互補的序列的，也可用作本發(fā)明的標(biāo)志物多核苷酸。以含有SEQ ID NO1或2的堿基序列的多核苷酸為探針，可采用集落雜交、蝕斑雜交、Southern印跡等公知的雜交方法從人、小鼠、大鼠、兔、倉鼠、雞、豬、牛、山羊、綿羊等動物的cDNA文庫及基因組文庫中獲得這樣的同種型和等位突變體。關(guān)于cDNA文庫的構(gòu)建方法，可以參考《Molecular Cloning，A Laboratory Manual 2nded.》(Cold Spring HarborPress(1989))。此外，也可利用商品化的cDNA文庫和基因組文庫。
更具體的，在cDNA文庫的制作中，首先采用胍超離心法(Chirwin et al.(1979)Biochemistry 185294-9)、AGPC法(Chomczynsk and Sacchi(1987)Anal.Biochem.162156-9)等公知的方法，從表達Lrp4的細胞、臟器、組織等制備總RNA，并使用mRNA純化試劑盒(Pharmacia)等純化mRNA。也可以使用QuickPrep mRNA純化試劑盒(Pharmacia)這樣的用于直接制備mRNA的試劑盒。接下來，由所得的mRNA使用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。市售的有諸如AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(生化學(xué)工業(yè))等用于cDNA合成的試劑盒。作為其它方法，可以采用5’-RACE法(Froham et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 858998-9002；Belyavskyet al.(1989)Nucleic Acids Res.172919-32)利用PCR合成及擴增cDNA。此外，為了制備高全長率的cDNA文庫，可以采用寡核苷酸帽法(Marugama andSugano(1994)Gene 138171-4；Suzuki(1997)Gene 200149-56)等公知的方法。通過上述操作獲得的cDNA可以整合至適當(dāng)?shù)妮d體中。
本發(fā)明中的嚴(yán)緊的雜交條件包括例如“2×SSC、0.1％SDS、50℃”、“2×SSC、0.1％SDS、42℃”、“1×SSC、0.1％SDS、37℃”等條件；更嚴(yán)緊的條件包括例如“2×SSC、0.1％SDS、65℃”、“0.5×SSC、0.1％SDS、42℃”、“0.2×SSC、0.1％SDS、65℃”等條件。更詳細地講，一種使用Rapid-hyb緩沖液(Amersham Life Science)的方法是在68℃進行30分鐘或更長的預(yù)雜交后，加入探針，于68℃保溫1小時或更長使雜交體形成，然后于室溫2×SSC、0.1％SDS中清洗3次、每次20分鐘，再于37℃、1×SSC、0.1％SDS中清洗3次、每次20分鐘，最后于50℃，1×SSC、0.1％SDS中清洗2次、每次20分鐘。另外，例如可于55℃在Expresshyb Hybridization Solution(CLONTECH)中進行30分鐘或更長的預(yù)雜交后，加入標(biāo)記探針，37℃～55℃溫育1小時或更長，然后于室溫、2×SSC、0.1％SDS中清洗3次、每次20分鐘，再于37℃下1×SSC、0.1％SDS中清洗1次、20分鐘。這里，例如通過提高預(yù)雜交、雜交或第二次清洗時的溫度，可以獲得更為嚴(yán)緊的條件。例如將預(yù)雜交和雜交的溫度設(shè)置為60℃，而作為更為嚴(yán)緊的條件則可設(shè)置為68℃。本領(lǐng)域技術(shù)人員可在這樣的緩沖液鹽濃度、溫度等條件的基礎(chǔ)上，添加其它探針濃度、探針長度、反應(yīng)時間等各種條件，對獲取Lrp4的同種型、等位突變體及對應(yīng)的其它生物物種來源的基因所需的條件進行設(shè)定。
關(guān)于雜交方法的詳細步驟可以參考《(Molecular Cloning，ALaboratoryManual 2nded.》(Cold Spring Harbor Press(1989)；特別是Section9.47-9.58)、《Current Protocols in Molecular Biology》(John Wiley&Sons(1987-1997)；特別是Section6.3-6.4)、《DNA Cloning1CoreTechniques，A Practical Approach 2nded.》(Oxford University(1995)；關(guān)于條件請?zhí)貏e參考Section 2.10)等。雜交多核苷酸包括例如含有與含有SEQ IDNO1或2的堿基的堿基序列具有至少50％、優(yōu)選至少70％、更優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少90％(例如至少95％，乃至99％)的同一性的堿基序列的多核苷酸。與上述同源性的確定相同，這種同一性也可通過BLAST算法(Altschul(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-8；Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-7)確定。除上述針對堿基序列的BLASTN程序外，作為基于此算法的針對氨基酸序列確定其同一性的程序、研究人員開發(fā)了BLASTX(Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215403-10)等，上述程序均可加以利用。正如前面提及的那樣，關(guān)于具體的分析方法可以參考http://www.ncbi.nlm.nih.gov.等。
此外可以使用以SEQ ID NO1或2的堿基序列為基礎(chǔ)設(shè)計的引物，利用基因擴增技術(shù)(PCR)(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons(1987)Section 6.1-6.4)，從人、小鼠、大鼠、兔、倉鼠、雞、豬、牛、山羊、綿羊等動物的cDNA文庫和基因組文庫中獲取Lrp4的同種型、等位突變體等具有與Lrp4類似的結(jié)構(gòu)和功能的基因。
可以采用常規(guī)方法進行測序以確認(rèn)多核苷酸的堿基序列。例如，可以采用雙脫氧核苷酸鏈末端終止法(Sanger et al.(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 745463-7)進行確認(rèn)。此外，還可以利用合適的DNA測序儀進行序列分析。
并且，本發(fā)明的標(biāo)志物多核苷酸包含(1)與SEQ ID NO1或2的堿基序列互補的序列；(2)與編碼SEQ ID NO3或4的氨基酸序列的堿基序列互補的序列；(3)與編碼在SEQ ID NO3或4的氨基酸序列中缺失跨膜區(qū)的序列的堿基序列互補的序列；及(4)由這樣的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸，所述堿基序列含有在嚴(yán)緊條件下與由SEQ ID NO1或2的堿基序列組成的多核苷酸雜交的各堿基序列中的至少15個連續(xù)的堿基。這樣的由含有至少15個連續(xù)的堿基的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸，可用作對Lrp4 mRNA的表達進行檢測的探針或進行擴增檢測的引物。通常，作為探針使用時，其應(yīng)由15-100個、優(yōu)選15-35個堿基構(gòu)成；而作為引物使用時，其應(yīng)至少由15個、優(yōu)選至少由30個堿基構(gòu)成。在作為引物使用時，其可設(shè)計為3’末端區(qū)域與目標(biāo)序列互補，而在5’末端添加限制性酶識別位點、標(biāo)簽等的形式。這樣的包括含有至少連續(xù)的15個堿基的堿基序列的多核苷酸，可與Lrp4多核苷酸雜交。
進一步，本發(fā)明的標(biāo)志物多核苷酸還包含可在嚴(yán)緊條件下與包含下列任意一項的堿基序列的第一鏈多核苷酸雜交的第二鏈多核苷酸(1)SEQ IDNO1或2的堿基序列；(2)包含編碼多肽的多核苷酸的堿基序列，所述多肽包含SEQ ID NO3或4的氨基酸序列；(3)包含編碼多肽的多核苷酸的堿基序列，所述多肽包含SEQ ID NO3或4的氨基酸序列中缺失跨膜區(qū)域的序列；及(4)包含可在嚴(yán)緊條件下與包含SEQ ID NO1或2的堿基序列的多核苷酸雜交的多核苷酸構(gòu)成的堿基序列。第二鏈多核苷酸優(yōu)選地包括含有優(yōu)選至少連續(xù)的15個堿基的堿基序列的多核苷酸。
采用上述的雜交法、PCR法等，可由表達Lrp4的細胞制備本發(fā)明的標(biāo)志物多核苷酸探針。而且，基于Lrp4的公知的序列信息，可以通過化學(xué)合成制備本發(fā)明的標(biāo)志物多核苷酸探針。特別是組織中的RNA檢測所優(yōu)選的核糖核酸探針，例如可以采用在質(zhì)粒載體pSP64中反方向插入克隆出的Lrp4基因或其部分、然后對插入序列部分進行失控(run-off)轉(zhuǎn)錄的方法獲取。pSP64含有SP6啟動子，此外，通過噬菌體T3、T7啟動子及RNA聚合酶的組合制備核糖核酸探針的方法也是公知的。本發(fā)明的標(biāo)志物多核苷酸探針可用作識別多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞的試劑，在上述的試劑中，除有效成分即多核苷酸之外，根據(jù)需要還可以混入例如滅菌水、生理鹽水、植物油、表面活性劑、脂質(zhì)、助溶劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、防腐劑等。
抗體本發(fā)明提供可用于從腦組織或培養(yǎng)細胞中選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞標(biāo)志物抗體(以下也稱為“本發(fā)明的抗體”)。與Lrp4mRNA不同，Lrp4多肽不僅在分裂停止前的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞中表達，而且還在分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞中表達，因此通過使用針對該多肽的本發(fā)明的抗體，可用于選擇及/或獲取分裂停止前后的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞。本發(fā)明的抗體包括多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體(scFV)(Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-83；The Pharmacology Monoclonal Antibody，Vol.113，Rosenburg andMoore ed.，Springer Verlag(1994)pp.269-315)、人源化抗體、多特異性抗體(LeDoussal et al.(1992)Int.J.Cancer Suppl.758-62；Paulus(1985)Behring Inst.Mitt.78118-32；Millstein and Cuello(1983)Nature 305537-9；Zimmermann(1986)Rev.Physiol.Biochem.Pharmacol.105176-260；Van Dijk et al.(1989)Int.J.Cancer 43944-9)，以及Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv等抗體片段。而且，根據(jù)需要還可采用PEG等對本發(fā)明的抗體進行修飾。另外，本發(fā)明的抗體還可與β-半乳糖苷酶、麥芽糖結(jié)合蛋白、GST、綠色熒光蛋白(GFP)等一起作為融合蛋白進行生產(chǎn)，這樣無需第二抗體即可進行檢測。而且，本發(fā)明的抗體可通過采用生物素標(biāo)記修飾，從而有利于使用抗生物素蛋白、鏈球菌抗生物素蛋白等進行抗體的回收。
本發(fā)明的抗體是針對(1)-(6)任意一項的特異性抗體(1)由SEQ ID NO1或2的堿基序列所編碼的多肽；(2)由SEQ ID NO3或4的氨基酸序列構(gòu)成的多肽；(3)由在SEQ ID NO3或4的氨基酸序列中缺失跨膜區(qū)的氨基酸序列構(gòu)成的多肽；(4)由在SEQ ID NO3或4的氨基酸序列中發(fā)生一個或數(shù)個氨基酸缺失、插入、替換或添加的氨基酸序列構(gòu)成的多肽；(5)由可在嚴(yán)緊條件下與由SEQ ID NO1或2的堿基序列的互補序列雜交的堿基序列編碼的多肽；(6)至少具有8個氨基酸殘基的上述(1)-(5)的多肽的片段多肽。
此外，本發(fā)明的抗體可以是與包含下列(1)-(4)任意一項的氨基酸序列或其部分序列的多肽相結(jié)合的抗體(1)SEQ ID NO3或4的氨基酸序列；(2)在SEQ ID NO3或4的氨基酸序列中缺失跨膜區(qū)的氨基酸序列；(3)在SEQ ID NO3或4的氨基酸序列中發(fā)生一個或數(shù)個氨基酸缺失、替換或添加，或者其組合而導(dǎo)致的變異的氨基酸序列；(4)包含多肽的氨基酸序列，所述多肽由可在嚴(yán)緊條件下與由SEQ ID NO1或2的堿基序列的互補序列構(gòu)成的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼；上述的由部分序列構(gòu)成的多肽，例如包含具有優(yōu)選至少連續(xù)6個氨基酸殘基(例如8個、10個、12個或15個或更多的氨基酸殘基)的多肽。
在SEQ ID NO3所示的氨基酸序列中發(fā)生一個或數(shù)個氨基酸的缺失、替換或添加，或者其組合而成的變異的氨基酸序列，包括例如(i)在SEQ IDNO3所示的氨基酸序列中缺失1-9個(例如，1-5個、優(yōu)選1-3個、更優(yōu)選1-2個、更優(yōu)選1個)氨基酸的氨基酸序列；(ii)在SEQ ID NO3所示的氨基酸序列中添加1-9個(例如，1-5個、優(yōu)選1-3個，更優(yōu)選1-2個更優(yōu)選1個)氨基酸的氨基酸序列；(iii)SEQ ID NO3所示的氨基酸序列中的1-9個(例如，1-5個、優(yōu)選1-3個、更優(yōu)選1-2個、更優(yōu)選1個)氨基酸替換為其它氨基酸的氨基酸序列；(iv)發(fā)生上述(i)-(iii)的組合所導(dǎo)致的變異的氨基酸序列。
在SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中發(fā)生一個或數(shù)個氨基酸的缺失、替換或添加，或者由其組合所引起的變異的氨基酸序列，包括例如(i)在SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中缺失1-9個(例如，1-5個、優(yōu)選1-3個、更優(yōu)選1-2個、更優(yōu)選1個)氨基酸的氨基酸序列；(ii)在SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中增加1-9個(例如，1-5個、優(yōu)選1-3個，更優(yōu)選1-2個更優(yōu)選1個)氨基酸的氨基酸序列；(iii)SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中的1-9個(例如，1-5個、優(yōu)選1-3個、更優(yōu)選1-2個、更優(yōu)選1個)氨基酸替換為其它氨基酸的氨基酸序列；(iv)發(fā)生上述(i)-(iii)的組合所導(dǎo)致的變異的氨基酸序列。
這里，氨基酸的缺失意為在序列中缺失一個以上的氨基酸殘基的變異，缺失包括在氨基酸序列的末端缺失氨基酸殘基和在氨基酸序列的中間缺失氨基酸殘基。
這里，氨基酸的添加意為在序列中增加一個以上的氨基酸殘基的變異，添加包括在氨基酸序列的末端增加氨基酸殘基和在氨基酸序列的中間增加氨基酸殘基。
這里，氨基酸的替換意為序列中的一個以上的氨基酸殘基被改變?yōu)椴煌N類的氨基酸殘基的變異。通過這樣的替換改變氨基酸序列時，優(yōu)選進行保守替換。保守替換是指改變序列而使其編碼與替換前的氨基酸性質(zhì)相似的氨基酸。氨基酸按性質(zhì)例如可以分為非極性氨基酸(Ala、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Val)、不帶電的氨基酸(Asn、Cys、Gln、Gly、Ser、Thr、Tyr)、酸性氨基酸(Asp、Glu)、堿性氨基酸(Arg、His、Lys)、中性氨基酸(Ala、Asn、Cys、Gln、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val)、脂肪族氨基酸(Ala、Gly)、支鏈氨基酸(Ile、Leu、Val)、羥基氨基酸(Ser、Thr)、酰胺型氨基酸(Gln、Asn)、含硫氨基酸(Cys、Met)、芳香族氨基酸(His、Phe、Trp、Tyr)、雜環(huán)氨基酸(His、Trp)、亞氨基酸(Pro、4Hyp)等。
因而，優(yōu)選在非極性氨基酸之間、或在不帶電的氨基酸之間進行替換。其中，作為保持蛋白質(zhì)性質(zhì)的替換，優(yōu)選Ala、Val、Leu和Ile之間、Ser和Thr之間、Asp和Glu之間、Asn和Gln之間、Lys和Arg之間、Phe和Tyr之間的替換。而發(fā)生變異的氨基酸的個數(shù)和位點沒有特別限制。
特別優(yōu)選的本發(fā)明的抗體包括例如實施例4中使用的兩種抗Lrp4抗體及包含其片段的變體。這兩種抗體已經(jīng)以下述保藏號進行了國際保藏。
(1)保藏機構(gòu)的名稱和地址名稱獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心地址日本國茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6(郵政編碼305-8566)(2)保藏日期2004年7月14日(4)保藏號FERM BP-10315和FERM BP-10316(由在日本國內(nèi)保藏的FERM P-20120和FERM P-20121移送保藏)本發(fā)明的抗體可以通過利用Lrp4多肽或其片段、或者表達該多肽或片斷的細胞作為致敏抗原而進行生產(chǎn)。此外Lrp4多肽的短片段，可以與牛血清白蛋白、鑰孔血藍蛋白、卵清白蛋白等載體(carrier)結(jié)合的形式作為免疫原使用。此外，可將鋁佐劑，弗氏完全(或不完全)佐劑、百日咳菌佐劑等公知的佐劑與Lrp4多肽或其片段聯(lián)合使用，以強化針對抗原的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明中的“Lrp4多肽”是肽聚合物，優(yōu)選的實例包括例如具有SEQ IDNO3或4的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。構(gòu)成Lrp4多肽的氨基酸殘基可以是天然存在的，也可以是經(jīng)過修飾的。而且，Lrp4多肽包括缺失跨膜區(qū)的蛋白以及經(jīng)其它多肽序列修飾的融合蛋白。
在本發(fā)明中，Lrp4多肽只要具有Lrp4多肽的抗原性，還包括含有在SEQID NO3或4的氨基酸序列中發(fā)生一個或數(shù)個氨基酸的缺失、插入、替換或添加的氨基酸序列的多肽。包含發(fā)生一個或數(shù)個氨基酸的缺失、插入、替換或添加的氨基酸序列的多肽維持與原多肽相同的生物學(xué)活性是公知的事實(Mark等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 815662-6；Zoller and Smith(1982)Nucleic Acids Res.106487-500；Wang等(1984)Science 2241431-3；Dalbadie-McFarland等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 796409-13)。而且，采用公知的《Molecular Cloning，A Laboratory Manual 2nded.》(Cold SpringHarbor Press(1989))、《Current Protocols in Molecular Biology》(John Wiley&Sons(1987-1997)；特別是Section 8.1-8.5)、Hashimoto-Goto等(1995)Gene152271-5、Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82488-92、Kramer andFritz(1987)Method.Enzymol.154350-67、Kunkel(1988)Method.Enzymol.852763-6等所述的定點誘變方法制備編碼所需多肽的多核苷酸，并使其適當(dāng)表達，可以獲得這樣的含有在SEQ ID NO3或4的氨基酸序列中發(fā)生一個或數(shù)個氨基酸的缺失、插入、替換或添加的氨基酸序列的、保持了Lrp4的抗原性的多肽。此外，除上述的定點誘變之外，還可以采用以突變源處理基因的方法，或者選擇性地切開基因，然后去除、添加或替換所選的核苷酸，最后進行連接的方法。
Lrp4多肽片段是與上述Lrp4多肽的一部分同一的、由優(yōu)選連續(xù)的至少6個的氨基酸殘基(例如，至少8個、10個、12個或15個的氨基酸殘基)構(gòu)成的多肽片段。特別優(yōu)選的片段可以是缺失了氨基末端、羧基末端、跨膜區(qū)的多肽片段。Lrp4的多肽片段包括含有α螺旋和α螺旋形成區(qū)、α兩親性區(qū)、β片層和β片層形成區(qū)、β兩親性區(qū)、底物結(jié)合區(qū)、高抗原指數(shù)區(qū)、卷曲和卷曲形成區(qū)、親水區(qū)、疏水區(qū)、轉(zhuǎn)角和轉(zhuǎn)角形成區(qū)以及表面形成區(qū)的片段。本發(fā)明中的Lrp4多肽片段，只要具有Lrp4多肽的抗原性，可以是任何片段。多肽的抗原決定部位，可采用分析蛋白質(zhì)氨基酸序列的疏水性/親水性的方法(Kyte-Doolittle(1982)J.Mol.Bio.157105-22)、二級結(jié)構(gòu)分析方法(Chou-Fasman(1978)Ann.Rev.Biochem.47251-76)進行預(yù)測，也可進一步通過計算機程序(Anal.Biochem.151540-6(1985))或采用合成短肽并檢驗其抗原性的PEPSCAN法(特表昭60-500684號公報)等進行確認(rèn)。
Lrp4多肽及多肽片段，可以用表達Lrp4的細胞、組織等為原材料，基于其物理性質(zhì)等進行分離。此外，也可采用公知的基因重組技術(shù)或化學(xué)合成方法制備。例如，在體外制備Lrp4多肽時，可依照體外翻譯(Dasso和Jackson(1989)Nucleic Acids Res-173129-44)等方法，在無細胞試管體系中制備多肽。與此相對，在使用細胞制備多肽時，首先要將編碼所需多肽的多核苷酸整合入合適的載體，然后選擇合適的宿主細胞，以該載體進行轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細胞，可以獲得所需的多肽。
合適的載體包括質(zhì)粒、粘粒、病毒、噬菌體、克隆載體、表達載體等各種載體(Molecular Cloning，A Laboratory Manual 2nded.，Cold Spring HarborPress(1989)、Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons(1987))。載體上具有可控制目標(biāo)多核苷酸在所導(dǎo)入的宿主細胞內(nèi)的表達的調(diào)控序列，多核苷酸連接在該調(diào)控序列下游。這里的“調(diào)控序列”，如宿主細胞是原核生物包括啟動子、核糖體結(jié)合位點及終止子；如宿主細胞是真核生物則為啟動子和終止子，根據(jù)情況還包括反式激活因子、轉(zhuǎn)錄因子、穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的polyA信號、剪接及多腺苷化信號等。這種調(diào)控序列包含與之相連的多核苷酸的表達所必需的全部構(gòu)成要素。載體可以攜帶選擇標(biāo)記。此外，通過與目的基因連接的方式將編碼必要的信號肽的序列整合至載體中，可以將細胞內(nèi)表達的多肽移送至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，或者當(dāng)宿主細胞是革蘭氏陰性菌時將其分泌至周質(zhì)或胞外區(qū)?？梢岳卯愒吹鞍讈碓吹男盘栯淖鳛檫@樣的信號肽。而且，必要時可加入接頭，或插入起始密碼子(ATG)、終止密碼子(TAA、TAG或TGA)。
pBEST(Promega)是示例性的可在體外進行多肽表達的載體。而且，各種適合于在原核細胞宿主內(nèi)進行表達的載體均是公知的(參考《微生物學(xué)基礎(chǔ)講座8基因工程》(共立出版)等)，在選擇原核細胞作為宿主時，本領(lǐng)域技術(shù)人員可適當(dāng)?shù)剡x出適合于所選宿主的載體和將載體導(dǎo)入宿主的方法。此外，適合用作Lrp4多肽及其抗原性片段表達宿主的還有酵母等真菌類、高等植物、昆蟲、魚類、兩棲類、爬行類、鳥類、哺乳類及各種培養(yǎng)細胞系(COS、Hela、C123、3T3、BHK、HEK293、Bowes黑素瘤細胞、骨髓瘤、Vero、Namalwa、Namalwa KJM-1、HBT5637(特開昭63-299號公報)等)，適合于每種細胞的載體系統(tǒng)和將載體導(dǎo)入宿主細胞的方法均是公知的。而且，在動物活體內(nèi)(參考Susumu(1985)Nature 315592-4；Ludon(1998)Biotechnol.Annu.Rev.41-54等)和植物體內(nèi)表達外源蛋白質(zhì)的方法也是已知的，這些方法可應(yīng)用于Lrp4多核苷酸的表達。
可以通過利用限制性酶位點的連接酶反應(yīng)將DNA插入載體中(CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons(1987)Section 11.4-11.11；Molecular Cloning，A Laboratory Manual 2nded.，Cold Spring Harbor Press(1989)Section 5.61-5.63)。此外，必要時，考慮到所用宿主的密碼子使用頻率，可以選擇表達效率高的堿基序列，從而設(shè)計編碼Lrp4多肽的表達載體(Grantham等.(1981)Nucleic Acids Res.9r43-74)。產(chǎn)生Lrp4多肽的宿主細胞內(nèi)含有編碼Lrp4多肽的多核苷酸，只要該多核苷酸不位于其在宿主細胞基因組中天然存在的位置上，其可以處于其自身的啟動子的支配之下，也可整合至基因組中，還可作為染色體外的結(jié)構(gòu)而保持。將載體轉(zhuǎn)導(dǎo)(轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)染))入宿主細胞可以采用公知的傳統(tǒng)方法進行。
例如，當(dāng)宿主為細菌(大腸桿菌(E.coli)，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis))時，可以采用例如Cohen等的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69，2110(1972))、原生質(zhì)體法(Mol.Gen.Genet.，168，111(1979)、感受態(tài)法(J.Mol.Biol.56，209(1971))；當(dāng)宿主為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)時，可采用例如Hinnen等的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1927(1978))、鋰離子法(J.Bacteriol.，153，163(1983))；當(dāng)宿主為植物細胞時，可采用例如葉盤(leaf disk)法(Science，227，129(1985))、電穿孔法(Nature，319，791(1986))、農(nóng)桿菌法(Horsch等，Science，227，129(1985)、Hiei等，Plant J.，6，271-282(1994))；當(dāng)宿主為動物細胞時，可采用例如Graham的方法(Virology，52，456(1973))；當(dāng)宿主為昆蟲細胞時，可采用例如Summers等的方法(Mol.Cell.Biol.，3，2156-2165(1983))。
宿主細胞的培養(yǎng)可采用適于所選細胞的公知的方法進行。例如當(dāng)選擇動物細胞時，可以使用DMEM(Virology 8396(1959))、MEM(Science 122501(1952))、RPMI1640(J.Am.Med.Assoc.199519(1967))、199(Proc.Soc.Biol.Med.731(1950))或IMDM等培養(yǎng)基，根據(jù)需要加入胎牛血清(FCS)等血清，于pH約6-8、30-40℃培養(yǎng)15-200小時左右。另外，必要時可在培養(yǎng)過程中更換培養(yǎng)基或進行通氣和攪拌。
通常，采用基因重組技術(shù)生產(chǎn)的Lrp4多肽，如果該多肽分泌至細胞外，可首先回收培養(yǎng)基；特別是當(dāng)使用轉(zhuǎn)基因生物時，可回收體液等。而如果多肽在細胞內(nèi)表達，則可溶解細胞并回收溶解成分。然后通過適當(dāng)?shù)亟M合公知的蛋白質(zhì)純化方法，例如鹽析、蒸餾、各種層析、凝膠電泳、凝膠過濾、超濾、重結(jié)晶、酸抽提、透析、免疫沉淀、溶劑沉淀、溶劑抽提、硫酸銨或乙醇沉淀等，可以純化所需的多肽。公知的層析方法包括陰離子或陽離子交換等離子交換層析、親和層析、反相層析、吸附層析、凝膠過濾層析、疏水層析、羥基磷灰石層析、磷酸纖維素層析以及凝集素層析等(Strategies for Protein Purification and CharacterizationA Laboratory CourseManual，Marshak等.ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996))。層析可采用HPLC、FPLC等液相層析的方式進行。此外，當(dāng)產(chǎn)物為GST融合蛋白時，可使用谷胱甘肽柱進行純化；而當(dāng)產(chǎn)物為組氨酸標(biāo)簽融合蛋白時，則可使用鎳柱進行純化。當(dāng)以融合蛋白的形式生產(chǎn)Lrp4多肽時，可在純化后根據(jù)需要使用凝血酶或因子Xa等切去不必要的部分。
此外，還可純化獲取天然來源的多肽。例如，可利用針對Lrp4多肽的抗體，通過親和層析進行純化(Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley&Sons(1987)Section 16.1-16.19)。而且，根據(jù)需要可使用胰凝乳蛋白酶、葡糖苷酶、胰蛋白酶、蛋白激酶及賴氨酰內(nèi)肽酶等酶類，對純化后的多肽進行修飾。另一方面，除上述與Lrp4多肽制備相同的合成和基因工程方法外，還可使用肽酶等適當(dāng)?shù)拿?，通過酶切Lrp4多肽制備Lrp4的多肽片段。
根據(jù)需要，用于選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的多克隆抗體，可以例如通過上述工藝純化的Lrp4多肽或其片段與所需的佐劑共免疫哺乳動物，由該免疫動物獲取血清而獲得。這里，對所使用的動物沒有特別限定，一般為嚙齒目、兔形目和靈長目動物。所述嚙齒目動物包括例如小鼠、大鼠、倉鼠等；兔形目動物包括例如兔等；靈長目動物包括例如猴(例如食蟹猴、獼猴、阿拉伯狒狒和黑猩猩等)等。動物免疫按如下方式進行以磷酸鹽緩沖鹽水(Phosphate-Buffered Saline，PBS)或生理鹽水適當(dāng)稀釋并懸濁致敏抗原，根據(jù)需要與佐劑混合并乳化后，注射至動物腹腔內(nèi)或皮下。然后，優(yōu)選每4-21天給與數(shù)次與弗氏不完全佐劑混合的致敏抗原。可采用常用的方法對血清中所需抗體的水平進行測定，以此驗證是否產(chǎn)生抗體。最后，血清本身可作為多克隆抗體使用，也可進一步純化后再加以利用。具體方法例如可以參考《Current Protocols in Molecular Biology》(John Wiley&Sons(1987)Section 11.12-11.13)。
此外，為生產(chǎn)多克隆抗體，可首先從按上述方法免疫的動物體內(nèi)取出脾臟，從脾臟中分離出免疫細胞，用聚乙二醇(PEG)等使該免疫細胞與合適的骨髓瘤細胞融合從而建立雜交瘤。細胞融合可按Milstein的方法(Galfreand Milstein(1981)Methods Enzymol.733-46)進行。這里，合適的骨髓瘤細胞特別包括例如可通過藥物對融合細胞進行選擇的細胞。使用這種骨髓瘤細胞時，可通過在含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)來選擇融合的雜交瘤，因為該培養(yǎng)液對除融合細胞以外的其它細胞均是致死的。接下來，從建立的雜交瘤中選擇產(chǎn)生可與本發(fā)明的多肽及其片段結(jié)合的抗體的克隆。然后，將選出的克隆移植入小鼠等的腹腔，回收腹水可以獲得單克隆抗體。此外，具體的方法可參考《Current Protocols in MolecularBiology)》(John Wiley&Sons(1987)Section 11.4-11.11)。本發(fā)明的雜交瘤優(yōu)選FERM BP-10315和FERM BP-10316。
另外，雜交瘤還可通過以下方法獲得在體外用免疫原致敏已感染EB病毒的淋巴細胞，使致敏淋巴細胞與人源的骨髓瘤細胞(U266等)融合，從而獲取產(chǎn)生人抗體的雜交瘤(特開昭63-17688號公報)。此外，使用通過致敏具有人抗體基因譜(repertoire)的轉(zhuǎn)基因動物而制備的抗體生成細胞，也可獲得人抗體(WO92/03918；WO93-02227；WO94/02602；WO94/25585；WO96/33735；WO96/34096；Mendez等.(1997)Nat.Genet.15146-56等)。不使用雜交瘤的實例有在產(chǎn)生抗體的淋巴細胞等免疫細胞中導(dǎo)入癌基因而永生化的方法。
本發(fā)明的抗體還可采用基因重組技術(shù)制備(參考Borrebaeck和Larrick(1990)Therapeutic Monoclonal Antibodies，MacMillan Publishers Ltd.，UK)。首先，從雜交瘤或抗體生成細胞(例如致敏淋巴細胞等)克隆出編碼抗體的基因。將獲得的基因整合入適當(dāng)載體，再將該載體導(dǎo)入宿主，然后培養(yǎng)宿主即可產(chǎn)生抗體。這樣的重組抗體也包括在本發(fā)明的抗體中。代表性的重組抗體包括，例如，包含非人源抗體可變區(qū)和人源抗體恒定區(qū)的嵌合抗體，以及包含非人源抗體互補決定區(qū)(CDR)和人源抗體構(gòu)架區(qū)(FR)及恒定區(qū)的人源化抗體(Jones等(1986)Nature 321522-5；Reichmann等(1988)Nature 322323-9；Presta(1992)Curr.Op.Struct.Bio.2593-6；MethodsEnzymol.20399-121(1991))。
本發(fā)明抗體片段可通過用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶等酶處理前述的多克隆或單克隆抗體進行生產(chǎn)。此外，也可使用編碼抗體片段的基因采用基因工程方法生產(chǎn)(參見Co等，(1994)J.Immunol.1522968-76；Better和Horwitz(1989)Methods Enzymol.178476-96；Pluckthun和Skerra(1989)Methods Enzymol.178497-515；Lamoyi(1986)Methods Enzymol.121652-63；Rousseaux等(1986)121663-9；Bird和Walker(1991)Trends Biotechnol.9132-7)。
多特異性抗體包括雙特異性抗體(BsAb)、雙抗體(diabody)(Db)等。多特異性抗體可以采用(1)使用不同種的雙功能接頭將不同特異性的抗體化學(xué)偶聯(lián)(Paulus1985))Behring Inst.Mill.78118-32)方法、(2)使分泌不同單克隆抗體的雜交瘤相融合的方法(Millstein和Cuello(1983)Nature305537-9)、(3)用不同多克隆抗體的輕鏈基因和重鏈基因(4種DNA)轉(zhuǎn)染小鼠骨髓瘤細胞等真核生物細胞表達系統(tǒng)后，分離雙特異性的單價部分的方法(Zimmermann(1986)Rev.Physio.Biochem.Pharmacol.105176-260；Van Dijk等(1989)Int.J.Cancer 43944-9)等方法制備。另一方面，雙體抗體是包含可通過基因融合構(gòu)建的二價的兩條多肽鏈的二聚體抗體片段，可采用公知的方法制備。(參考Holliger等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-8；EP404097；WO93/11161)。
抗體和抗體片段的回收與純化，可使用蛋白A和蛋白G進行，此外也可與制備抗體以外的多肽時相同，采用前述的蛋白純化技術(shù)進行(AntibodiesA Laboratory Manual，Ed Harlow和David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory(1988))。例如，當(dāng)利用蛋白A純化本發(fā)明抗體時，可使用Hyper D、POROS或Sepharose F.F.(Pharmacia)等蛋白A柱。所獲抗體的濃度可通過測定其吸光度或通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)確定。
抗體的抗原結(jié)合活性可采用測定吸光度、熒光抗體法、酶免疫測定法(EIA)、放射免疫測定法(RIA)或ELISA等方法確定。例如，當(dāng)采用ELISA法進行測定時，首先是將本發(fā)明抗體固定在平板等載體上，然后加入Lrp4多肽，再加入含有目標(biāo)抗體的樣品。這里，含有目標(biāo)抗體的樣品可包括抗體生成細胞的培養(yǎng)上清、純化的抗體等。接下來，加入識別本發(fā)明抗體的第二抗體，溫育平板。然后，清洗平板，檢測結(jié)合在第二抗體上的標(biāo)記。即，如果第二抗體用堿性磷酸酶標(biāo)記，可通過加入對硝基苯磷酸等酶的底物并測吸光度的方法來測定其抗原結(jié)合活性。此外，抗體的活性評價，也可使用BIAcore(Pharmacia)等商品化的系統(tǒng)完成。
本發(fā)明涉及以抗Lrp4抗體為有效成分的、識別多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的試劑。除有效成分即本發(fā)明的抗體之外，根據(jù)需要上述試劑中可以加入例如滅菌水、生理鹽水、植物油、表面活性劑、脂質(zhì)、助溶劑、緩沖劑、蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑(BSA、明膠等)、防腐劑等。
多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的選擇方法等本發(fā)明提供獲取作為選擇性的均一群體的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞的方法。使用本發(fā)明的標(biāo)志物多核苷酸探針，可以選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞。而且，本發(fā)明還提供獲取作為選擇性的均一群體的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的方法。使用本發(fā)明的抗體，可以合適地選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細胞。這樣，使用本發(fā)明的多核苷酸探針或抗體，最終可特異性地選擇向多巴胺能神經(jīng)元分化的多巴胺能神經(jīng)元系細胞。
這里，術(shù)語“選擇”包括檢測出某樣品中表達標(biāo)志物的細胞的存在、以及在檢測出其存在后進一步分離或離析兩方面含義。本發(fā)明提供選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞的方法，該方法包括使含多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞的細胞樣品與本發(fā)明的多核苷酸探針相接觸的步驟。該方法中，優(yōu)選用放射性同位素或非放射性化合物對標(biāo)志物多核苷酸探針進行標(biāo)記。例如，用于標(biāo)記的放射性同位素包括35S、3H等。使用放射性同位素標(biāo)記的標(biāo)志物多核苷酸探針時，通過乳膠放射自顯影檢測銀顆粒，可以檢測出與標(biāo)志物結(jié)合的RNA。此外，用于標(biāo)志物多核苷酸探針標(biāo)記的非放射性同位素包括生物素、地高辛等。生物素標(biāo)記的標(biāo)志物可使用標(biāo)記有例如熒光或堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶等酶的抗生物素蛋白來檢測。而地高辛標(biāo)記的標(biāo)志物則可使用標(biāo)記有例如熒光或堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶等酶的抗地高辛抗體來檢測。采用酶分子標(biāo)記時是通過與酶的底物共保溫，使穩(wěn)定的色素在標(biāo)志物的位置沉著，從而可以進行檢測。特別是利用了熒光的原位雜交法(FISH)操作簡便，所以是尤其優(yōu)選的。
此外，本發(fā)明提供選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的方法，其包括使用于選擇本發(fā)明的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的抗體與含有多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的細胞樣品相接觸的步驟。即，通過使預(yù)期含有多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的細胞樣品與本發(fā)明的抗體相接觸、并選擇與抗體結(jié)合的細胞，可以獲取多巴胺能神經(jīng)元祖細胞(圖13)。在與細胞樣品接觸前，本發(fā)明的抗體可固定化于適當(dāng)?shù)妮d體上備用。而且，在使本發(fā)明的抗體與細胞樣品相接觸并結(jié)合后，依據(jù)抗體的親和性進行純化，可以選擇性地回收與該抗體結(jié)合的細胞。例如，當(dāng)本發(fā)明的抗體結(jié)合有生物素時，可以將其添加至結(jié)合有抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白的平板上或?qū)游鲋羞M行純化。另外，例如可以將磁性微粒結(jié)合在抗體上，利用磁鐵回收該抗體以及在細胞表面表達與該抗體結(jié)合的Lrp4的細胞。此外，利用細胞分選機和熒光等標(biāo)記的抗Lrp4抗體，可以通過流式細胞術(shù)選擇表達Lrp4的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞。
這樣獲得的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞群中，例如含有至少40％、優(yōu)選至少50％、更優(yōu)選至少60％、特別優(yōu)選至少70％的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞。
本發(fā)明提供通過培養(yǎng)使用本發(fā)明的多核苷酸探針或抗體選出的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞，選擇和/或生產(chǎn)分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的方法。而且，本發(fā)明還提供使本發(fā)明的標(biāo)志物多核苷酸探針或抗體與含有多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的細胞樣品相接觸并選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細胞，通過培養(yǎng)上述選出的祖細胞，選擇及/或生產(chǎn)分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的方法。
進一步，根據(jù)本發(fā)明，通過培養(yǎng)使用本發(fā)明的標(biāo)志物多核苷酸探針或抗體選出的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞，并進而使用分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞標(biāo)志物進行選擇及/或篩選(screening)，可以獲得腫瘤化危險性低的、特別適合于移植治療的分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞。分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞標(biāo)志物包括例如65B13、Nurrl、TH等(WO2004/038018；Kawasaki等(2000)Neuron 2831-40；Wallen等(1999)Exp.Cell.Res.253737-46)。例如，使本發(fā)明的標(biāo)志物多核苷酸探針或抗體與含有多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的細胞樣品相接觸，并選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細胞，進一步根據(jù)需要進行培養(yǎng)，將這樣的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞與針對65B13多肽的抗體相接觸并選擇表達65B13多肽的細胞，由此可以選擇和/或生產(chǎn)分裂停止的多巴胺能神經(jīng)元前體細胞。
本發(fā)明提供通過培養(yǎng)使用本發(fā)明的標(biāo)志物多核苷酸探針或抗體選出的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞，來選擇和/或生多巴胺能多巴胺能神經(jīng)元的方法。而且，本發(fā)明還提供使本發(fā)明的標(biāo)志物多核苷酸探針或抗體與含有多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的細胞樣品相接觸并選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細胞，通過培養(yǎng)上述選出的細胞，選擇和/或生多巴胺能多巴胺能神經(jīng)元的方法。
而且，根據(jù)本發(fā)明，通過培養(yǎng)使用本發(fā)明的標(biāo)志物多核苷酸探針或抗體選出的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞、并進而使用多巴胺能神經(jīng)元標(biāo)志物進行選擇和/或篩選，可以獲取腫瘤化危險性低的、特別適合于移植治療的多巴胺能神經(jīng)元。多巴胺能神經(jīng)元標(biāo)志物包括例如DAT等(Development.2004.131(5)1145-55.)。例如，使本發(fā)明的標(biāo)志物多核苷酸探針或抗體與含有多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的細胞樣品相接觸，并選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細胞，進而通過使培養(yǎng)的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞與針對DAT的抗體相接觸，并選擇表達DAT的細胞，可以選擇及/或生多巴胺能多巴胺能神經(jīng)元。
本發(fā)明提供對于經(jīng)培養(yǎng)或未經(jīng)培養(yǎng)的使用本發(fā)明的抗體選出的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞，進一步除去分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元前體細胞，從而選擇及/或生產(chǎn)可培養(yǎng)增殖的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的方法。此外，本發(fā)明提供使本發(fā)明的抗體與含有多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的細胞樣品相接觸，并選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細胞，培養(yǎng)或不培養(yǎng)上述選出的細胞，并進一步除去分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元前體細胞，從而選擇及/或生產(chǎn)可培養(yǎng)增殖的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的方法。
在除去分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元前體細胞時，可以使用分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元前體細胞標(biāo)志物選擇和/或除去分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元前體細胞，以獲得具有培養(yǎng)增殖潛力的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞。分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元前體細胞標(biāo)志物包括例如65B13、Nurrl、TH等(WO2004/038018；Kawasaki等(2000)Neuron 2831-40；Wallen等(1999)Exp.Cell.Res.253737-46)。例如，使本發(fā)明的抗體與含有多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的細胞樣品相接觸，并選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細胞，進一步使根據(jù)需要進行培養(yǎng)的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞與針對65B13多肽的抗體相接觸，并選擇不表達65B13多肽的細胞，可以選擇及/或生多巴胺能多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞。
表達Lrp4的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的選擇及/或篩選，也可利用針對Lrp4的啟動子進行(例如，參考特開2002-51775號公報)。例如，可以將通過后述的Lrp4表達調(diào)控區(qū)分析所獲得的啟動子與編碼GFP等可檢測標(biāo)志物的基因連接而形成構(gòu)建體，用攜帶該構(gòu)建體的載體轉(zhuǎn)染細胞。另外，可以將編碼標(biāo)志物的基因敲入(knock in)Lrp4基因座。不論采用何種方法，均可特異性地在多巴胺能神經(jīng)元祖細胞中檢測出標(biāo)志物基因的表達，使得特異性細胞的選擇成為可能。
這里使用的細胞樣品，優(yōu)選中腦腹側(cè)區(qū)細胞或含有在體外誘導(dǎo)分化的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的培養(yǎng)細胞。多巴胺能神經(jīng)元細胞的體外誘導(dǎo)分化，可以用公知的ES細胞、骨髓間質(zhì)細胞、神經(jīng)來源的無限增殖細胞系(特表平8-509215號公報；特表平11-506930號公報；特表2002-522070號公報)、原始神經(jīng)元細胞(特表平11-509729號公報)等細胞為起始材料，采用公知的方法進行。通常，將從腦的多巴胺能區(qū)獲得的組織與神經(jīng)組織來源的支持細胞層共培養(yǎng)，即可使之分化為多巴胺能神經(jīng)元。另一方面，一些已知的方法可由紋狀體、皮質(zhì)等通常的非多巴胺能神經(jīng)組織誘導(dǎo)形成多巴胺能神經(jīng)元(特表平10-509319號公報)。此外，有報告稱在低氧條件下進行培養(yǎng)，可以獲得更多含有多巴胺能神經(jīng)元的細胞(特表2002-530068號公報)。此外，也可采用5階段法(Lee等(2000)Nat.Biotech.18675-679、mousedopaminergic neuron differentiation kit(R&D Systems))由ES細胞(CCE)誘導(dǎo)分化多巴胺能神經(jīng)元。用于本發(fā)明的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞選擇的細胞樣品，可以是采用包括上述方法在內(nèi)的任何方法分離或培養(yǎng)的細胞群。
此外，用于固定本發(fā)明的抗體的載體，優(yōu)選對細胞是無害的。載體包括例如合成的或天然產(chǎn)生的有機高分子化合物，玻璃珠、硅膠、氧化鋁、活性炭等無機材料，以及在它們表面包被有多糖或合成高分子等的材料。載體的形狀沒有特別限制，可以是例如薄膜狀、纖維狀、顆粒狀、中空纖維狀、無紡布狀、多孔形狀或蜂窩形狀，并且可對其厚度、表面積、寬度、長度、形狀和大小進行各種改變，從而控制接觸面積。
用于治療神經(jīng)變性疾病的含有多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的試劑盒以及利用多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的神經(jīng)變性疾病治療方法以Lrp4 mRNA的表達為指標(biāo)，使用多核苷酸探針獲得的細胞是多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞，以Lrp4多肽的表達為指標(biāo)，使用抗體獲得的細胞是多巴胺能神經(jīng)元祖細胞，因此無論以mRNA或是多肽為指標(biāo)均可獲得多巴胺能神經(jīng)元系的細胞群。與傳統(tǒng)的混合細胞群或?qū)胪庠椿虻亩喟桶纺苌窠?jīng)元相比，采用本發(fā)明的方法獲得的祖細胞，在安全性、存活率、網(wǎng)絡(luò)形成能力等方面均更適于與姿勢反射、運動及獎賞相關(guān)行為(reward-associated behaviors)相關(guān)的疾病，特別是帕金森病等神經(jīng)變性疾病、精神分裂癥及藥物成癮(Hynes等(1995)Cell 8095-101)的移植治療。以Lrp4的表達為指標(biāo)獲得的細胞，可以直接或在體外增殖后用于移植(圖13)。這種細胞由于具有在腦內(nèi)的最適位置分化成熟的潛力，可望具有治療效果。即，本發(fā)明還提供含有用于治療神經(jīng)變性疾病的試劑盒(以下也稱為“本發(fā)明的試劑盒”)，其包含使用本發(fā)明的標(biāo)志物多核苷酸探針或抗體選擇和/或生產(chǎn)的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞、分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元前體細胞和/或多巴胺能神經(jīng)元；還提供以及以向患者腦內(nèi)移植該細胞為特征的神經(jīng)變性疾病的治療方法。進一步，本發(fā)明還提供使用本發(fā)明的標(biāo)志物多核苷酸探針或抗體選擇和/或生產(chǎn)的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞、分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元前體細胞和/或多巴胺能神經(jīng)元用于生產(chǎn)治療神經(jīng)變性疾病的試劑盒的用途。在本發(fā)明中，神經(jīng)變性疾病優(yōu)選帕金森病。除細胞之外，本發(fā)明的試劑盒還可以含有藥學(xué)上允許的載體。這些載體包括例如生理鹽水、磷酸緩沖液、培養(yǎng)液、血清、生物體液、羧甲基纖維素溶液、可充當(dāng)細胞支架的固體(例如，cytodex3(Amersham Bioscience，17-0485-01)等)、細胞外基質(zhì)成分(例如，膠原、纖連蛋白、玻連蛋白、昆布氨酸、硫酸乙酰肝素、蛋白聚糖、糖胺聚糖、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、彈性蛋白或兩種或兩種以上的上述物質(zhì)的組合等)或者凝膠狀支持物等。此外，本發(fā)明的試劑盒中可以加入pH調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、防腐劑等。本發(fā)明的試劑盒可用于一次接種，也可用于數(shù)次接種。此外，可根據(jù)接種的人或動物的體重、年齡及給藥方式等選擇適合的給藥量。
以Lrp4 mRNA的表達為指標(biāo)選擇的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞具備在體內(nèi)進一步增殖的潛力，可以期待其具有更長期的治療效果。而且，在體外，通過選擇培養(yǎng)基等條件，可以使以Lrp4 mRNA的表達為指標(biāo)選擇的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞分化至適當(dāng)?shù)碾A段，因此，其作為各種神經(jīng)移植的材料是優(yōu)選的。例如，對于上述以Lrp4 mRNA的表達為指標(biāo)選擇的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞，進一步以分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元前體細胞標(biāo)志物(例如65B13、Nurrl、TH等)為指標(biāo)進行選擇，可以獲得在移植方面具有更高安全性的細胞。本發(fā)明涉及在體外培養(yǎng)上述祖細胞并使之分化增殖的方法。進行培養(yǎng)的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞也可以是分裂停止后的前體細胞。
采用本發(fā)明方法獲得的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞時，可以例如移植1×102～1×108個細胞、優(yōu)選1×103～1×106個細胞、更優(yōu)選5～6×104個細胞。首選方法是將細胞懸液移植到腦中的立體定位腦手術(shù)(stereotaxic surgery)。此外，細胞移植也可通過顯微外科手術(shù)進行。關(guān)于神經(jīng)元組織移植的方法，可以參考Backlund等(Backlund等(1985)J.Neurosurg.62169-73)，Lindvall等(Lindvall等(1987)Ann.Neurol.22457-68)或Madrazo等(Madrazo等(1987)New Engl.J.Med.316831-4)的方法。
此外，本發(fā)明細胞還可用于分離多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的特異性基因及祖細胞成熟為多巴胺能神經(jīng)元的各個階段的特異性基因，探尋帕金森病治療的靶標(biāo)，闡明多巴胺能神經(jīng)元的成熟過程，以及以成熟作為指標(biāo)進行篩選。
基因表達水平的比較使用本發(fā)明的多核苷酸探針或抗體獲得的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞可用做分離在該細胞中特異性表達的基因的材料。進一步，還可以研究和分離由分化、誘導(dǎo)或增殖本發(fā)明的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞而得的細胞中特異性表達的基因。此外，通過研究在分化/誘導(dǎo)/增殖的細胞中和原祖細胞中表達水平存在差異的基因，也可以調(diào)查被認(rèn)為多巴胺能神經(jīng)元體內(nèi)分化必需的基因。這些基因可作為治療由多巴胺能神經(jīng)元缺陷引起的疾病的候選對象，因此確定與分離它們是極具價值的。
本發(fā)明的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞與由該祖細胞分化/誘導(dǎo)/增殖的細胞或其它細胞之間、或者分化/誘導(dǎo)/增殖的細胞與其它細胞之間的基因表達水平的比較，可采用常用的細胞原位雜交、Northern印跡雜交、RNA斑點印跡雜交、反轉(zhuǎn)錄PCR、RNA酶保護試驗、DNA微陣列雜交、基因表達系列分析(SAGE；serial analysis of gene expression)(Velculescu等(1995)Science270484-487)，差減雜交(subtractive hybridization)和代表性差別分析(RDA)(Lisitsyn(1995)Trends Genet.11303-307)等方法。
在細胞原位雜交中，使用特定RNA序列的特異性標(biāo)記探針與由細胞制備的總RNA或polyA+RNA雜交，可研究各種細胞中發(fā)生RNA加工、轉(zhuǎn)運和細胞質(zhì)定位的位置等。此外，RNA的大小可使用凝膠電泳等進行大小分級來測定。此外，使用定量熒光原位雜交(FISH)和數(shù)字成像顯微鏡可原位可視化RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(Femino等(1998)Science 280585-90)，這些技術(shù)適用于本發(fā)明。
采用反轉(zhuǎn)錄PCR分析基因表達時，可粗略定量特定基因的表達情況。采用本方法，也可檢測和分析同一RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的各種同種型。反轉(zhuǎn)錄PCR方法中，首先使用外顯子特異性引物進行反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)，如果檢出預(yù)期產(chǎn)物之外的擴增產(chǎn)物，則對這些產(chǎn)物進行分析，就能夠鑒定選擇性剪接產(chǎn)生的mRNA同種型。例如，可以參考Pykett等(1994)Hum.Mol.Genet.3559-64中記載的方法。當(dāng)需要快速地進行粗略表達情況分析時，本發(fā)明的利用PCR的方法因迅速、靈敏、簡便是特別優(yōu)選的。
使用DNA芯片可以提高基因表達篩選的效率。這里，DNA芯片是指在玻璃等載體表面高密度固定了寡核苷酸、DNA克隆等的小型陣列。例如，為了進行多重表達篩選，可以將針對各目標(biāo)基因的cDNA克隆或基因特異性的寡核苷酸固定在芯片上以制備微陣列。接下來，從本發(fā)明多巴胺能神經(jīng)元祖細胞或由該祖細胞分化/誘導(dǎo)/增殖獲得的細胞制備RNA，再經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶處理得到cDNA。然后，將所得cDNA樣品用熒光標(biāo)記物或其它標(biāo)記物標(biāo)記，并與微陣列雜交。結(jié)果，在總標(biāo)記cDNA中，細胞中表達活躍的基因所占比例變高，而未顯著表達的基因所占比例變低。即，表示標(biāo)記cDNA與芯片上cDNA克隆或寡核苷酸之間雜交的熒光信號強度，反映了標(biāo)記cDNA中各序列的表達程度，這使得基因表達的定量成為可能。
此外，mRNA差異展示技術(shù)使用簡并PCR引物進行反轉(zhuǎn)錄PCR，可以同時分析本發(fā)明的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞和由該祖細胞分化/誘導(dǎo)/增殖而獲得的細胞中的多個基因的表達情況。首先，準(zhǔn)備改變了指定mRNA的polyA尾3’端的一個或兩個堿基的修飾oligo-dT引物，并對從本發(fā)明的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞或由該祖細胞分化/誘導(dǎo)/增殖而獲得的細胞，及用于比較表達的對照細胞分離的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)(Liang等(1993)NucleicAcids Res.213269-3275)。如果改變的堿基是“G”，那么可選擇性擴增在polyA尾緊鄰前方為“C”的mRNA；而如果改變的堿基是“CA”，則可選擇性擴增在polyA尾緊鄰前方為“TG”的mRNA。接下來，準(zhǔn)備長約10個堿基的任意序列作為第二引物，使用上述修飾的oligo-dT引物和該第二引物進行PCR擴增反應(yīng)。使用泳動距離長的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，從而將擴增產(chǎn)物按大小分級分離。采用這種方法，可檢測出來源于分別在本發(fā)明的細胞和對照細胞中特異性表達的mRNA的cDNA，因其條帶僅出現(xiàn)在一方的樣品的電泳結(jié)果中。該方法還可用于分析未經(jīng)鑒定的基因的表達。
SAGE可以同時檢測多個轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達，且不需要特殊檢測裝置，是優(yōu)選的分析方法之一。首先，采用標(biāo)準(zhǔn)方法從本發(fā)明的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞或由該祖細胞分化/誘導(dǎo)/增殖而獲得的細胞中提取polyA+RNA。接下來，使用生物素化的oligo-dT引物將上述RNA轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA，然后用識別4堿基序列的限制性酶(錨定酶(anchoring enzyme)，AE)處理。這樣，AE處理片段在其3’端帶有生物素基團。接下來，使AE處理片段與鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合，將結(jié)合的cDNA分成兩部分，分別使各部分與不同的雙鏈寡核苷酸銜接子(接頭)A或B連接。這些接頭的構(gòu)成如下(1)突出的單鏈部分，它具有與經(jīng)錨定酶作用形成的突出部分序列互補的序列；(2)作為標(biāo)簽酶(tagging enzyme，TE)的IIS-型限制性酶(在距離識別位點不超過20bp的固定位點酶切)的5’堿基識別序列；(3)充分滿足構(gòu)建PCR特異性引物需要的附加序列。這里，用標(biāo)簽酶酶切與接頭連接的cDNA，這樣僅有與接頭結(jié)合的cDNA序列部分變成短序列的標(biāo)簽。然后，使具有不同接頭的兩種混合物相互連接，并用接頭A和B特異的引物進行PCR擴增。結(jié)果，可獲得擴增產(chǎn)物，其是含有可與接頭A和B連接的兩種連接序列標(biāo)簽(雙標(biāo)簽，ditag)的多種序列的混合物。用錨定酶處理擴增產(chǎn)物，游離的雙用通常的連接反應(yīng)將標(biāo)簽部分相連成鏈狀，然后進行克隆。測定克隆的堿基序列，可讀出一定長度的連續(xù)雙標(biāo)簽。這樣測定了克隆的核苷酸序列，又獲得了序列標(biāo)簽的信息，就可鑒定對應(yīng)于每一種標(biāo)簽的mRNA的存在。
差減雜交常常用于克隆那些在多種組織或細胞中具有表達差異的基因，該方法同樣可用于克隆在本發(fā)明的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞或由該祖細胞分化/誘導(dǎo)/增殖而獲得的細胞中特異性表達的基因。首先，制備本發(fā)明的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞中的測試細胞DNA樣品(以下稱待試DNA)。然后，制備比照細胞的DNA(以下稱驅(qū)動DNA)。待試DNA和驅(qū)動DNA可互換使用。任一種情況均是檢測存在于待試DNA但不存在于驅(qū)動DNA中的基因。然后，將制備的待試DNA與過量的驅(qū)動DNA混合、變性使之成為單鏈DNA，隨后退火。通過調(diào)節(jié)退火條件，可將不存在于驅(qū)動DNA中的特異性序列作為僅由待試DNA來源的DNA構(gòu)成的雙鏈DNA而分離出來。關(guān)于更詳細方法，可以參考Swaroop等(1991)Nucleic Acids Res.191954和Yasunaga等(1999)Nature Genet.21363-9。
RDA方法是使用PCR選擇性擴增不存在于驅(qū)動DNA中的待試DNA序列的方法，和上述其它方法一樣，該方法也可應(yīng)用于本發(fā)明。關(guān)于更為詳細的步驟，可以參考Lisitsyn(1995)Trends Genet.11303-7和Schutte等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 925950-4。
采用以上方法檢測和分離出的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞或由該祖細胞分化/誘導(dǎo)/增殖而獲得的細胞中的特異性基因，可采用上述的各種公知方法插入載體等，進行序列測定和表達分析。
以多巴胺能神經(jīng)元祖細胞成熟為指標(biāo)的篩選本發(fā)明提供篩選方法，該方法包括使被檢物質(zhì)與本發(fā)明的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞接觸的步驟，以及檢測由接觸引起的該祖細胞的分化和增殖的步驟。采用這種篩選方法獲得的化合物顯示了在多巴胺能神經(jīng)元的分化、增殖等方面的調(diào)節(jié)功能，其作為治療由多巴胺能神經(jīng)元缺陷引起的疾病的候選治療對象，是非常有價值的。本發(fā)明的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞包括例如使用本發(fā)明的多核苷酸探針或抗體選擇出的細胞、以及由這些細胞分化/誘導(dǎo)/增殖而獲得的細胞。
這里，“被檢物質(zhì)”可以是任何類型的化合物、包括基因文庫的表達產(chǎn)物、合成低分子化合物文庫、合成肽文庫、抗體、細菌釋放物、細胞(微生物、植物細胞、動物細胞)提取液、細胞(微生物、植物細胞、動物細胞)培養(yǎng)上清、純化或部分純化的多肽、來源于海洋生物、植物或動物的提取物、土壤、隨機噬菌體肽展示文庫等。
通過與不與被檢物質(zhì)接觸時的細胞狀態(tài)相比較，可以檢測細胞的分化和增殖。細胞分化和增殖的檢測，可在顯微鏡下通過形態(tài)學(xué)觀察完成，也可通過檢測、定量細胞中產(chǎn)生的多巴胺等物質(zhì)進行。
Lrp4的表達調(diào)控區(qū)分析Lrp4的表達調(diào)控區(qū)可利用Lrp4的基因序列采用公知的方法從基因組DNA克隆。例如，S1作圖法這樣的確定轉(zhuǎn)錄起始位點的方法(細胞工程，增刊8，新細胞工程實驗方案，東京大學(xué)醫(yī)科學(xué)研究所制癌研究部編，秀潤社(1993)pp.362-374)是已知的，并可應(yīng)用于本發(fā)明。通常，將基因5’端的15-100bp、優(yōu)選30-50bp作為探針DNA，對基因組DNA文庫進行篩選，可以克隆基因的表達調(diào)控區(qū)(在本發(fā)明中是SEQ ID NO1或2的全部或部分堿基)。以這種方式獲得的克隆包含10kbp以上的5’非編碼區(qū)，接下來可通過核酸外切酶處理將其截短或片段化。最后，對于截短的含有可能的表達調(diào)控區(qū)的部分序列，可以用報告基因評價其是否表達、表達的強度及調(diào)控等，從而確定維持Lrp4表達調(diào)控區(qū)活性的最小必要單元。
可以用Neural Network(http://www.fruitfly.org./seq_tools/promoter.html；Reese等，BiocomputingProceedings of the 1996 Pacific Symposium，Hunterand Klein ed.，World Science Publishing Co.，Singapore，(1996))等程序預(yù)測基因表達調(diào)控區(qū)。此外，預(yù)測表達調(diào)控區(qū)的最小活性單元的程序也是已知的(http://biosci.cbs.umn.edu./software/proscan/promoterscan.htm；Prestridge(1995)J.Mol.Biol.249923-32)，并可應(yīng)用于本發(fā)明。
以這種方式分離的Lrp4基因表達調(diào)控區(qū)，可用于體內(nèi)在多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞中特異性地產(chǎn)生所需的蛋白。
Lrp4的配體Lrp4多肽具有跨膜域，因此被認(rèn)為在天然狀態(tài)中是以包埋在細胞膜內(nèi)的狀態(tài)存在。Lrp4在多巴胺能神經(jīng)元祖細胞中表達，因此被認(rèn)為與多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的增殖調(diào)控及神經(jīng)元的分化、成熟相關(guān)。因此，可能對Lrp4顯示激動功能或拮抗功能的配體，可能可以用于體內(nèi)、離體和體外調(diào)控多巴胺能神經(jīng)元的分化。在鑒定Lrp4多肽的配體時，首先是使本發(fā)明多肽與候選化合物接觸，檢測其是否結(jié)合。此時，可使用固定在載體上的，或以包埋于細胞膜中的形式表達的Lrp4多肽。對于候選化合物沒有具體限制，包括基因文庫的表達產(chǎn)物、海洋生物來源的天然成分、各種細胞的提取物、已知化合物和肽、植物來源的天然成分、生物體組織提取物、微生物培養(yǎng)上清和通過噬菌體展示方法隨機制備的肽群體(J.Mol.Biol.222301-10(1991))等。此外，候選化合物可以是帶有標(biāo)記的，以便于檢測結(jié)合。
Lrp4的表達抑制通過本發(fā)明，已經(jīng)明確Lrp4 mRNA在多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞中瞬時表達，因此Lrp4被認(rèn)為與祖細胞的增殖調(diào)控及神經(jīng)元的分化、成熟相關(guān)。因此，阻礙Lrp4基因表達的物質(zhì)有望用于體內(nèi)、離體和體外調(diào)控多巴胺能神經(jīng)元的分化。阻礙基因表達的物質(zhì)，包括例如反義核酸、核酶及雙鏈RNA(small interfering RNA，siRNA)。因此，本發(fā)明提供這樣的反義核酸、核酶及雙鏈RNA。
抑制靶基因表達的反義機制包括(1)通過形成三股螺旋抑制轉(zhuǎn)錄起始，(2)通過在由RNA聚合酶形成的局部開環(huán)結(jié)構(gòu)位點形成雜交體抑制轉(zhuǎn)錄，(3)合成過程中通過與RNA形成雜交抑制轉(zhuǎn)錄，(4)通過在內(nèi)含子-外顯子連接區(qū)形成雜交體抑制剪接、(5)通過在剪接體形成位點形成雜交抑制剪接，(6)通過與mRNA形成雜交體抑制mRNA遷移到細胞質(zhì)，(7)通過與加帽部位或polyA添加部位形成雜交體抑制剪接、(8)通過與起始因子結(jié)合部位形成雜交體抑制翻譯起始，(9)通過與核糖體結(jié)合部位形成雜交體抑制翻譯，(10)通過與mRNA編碼區(qū)或多核糖體結(jié)合部位形成雜交體抑制肽鏈延長、和(11)通過與核酸/蛋白質(zhì)作用位點形成雜交體抑制基因表達(平島和井上《新生物化學(xué)實驗講座2核酸IV基因的復(fù)制與表達》日本生化學(xué)會編，東京化學(xué)同人，pp.319-347(1993))。
本發(fā)明的Lrp4反義核酸可以是通過上述(1)-(11)的任何機制抑制基因表達的核酸，即該反義核酸不僅可包含針對要阻礙其表達基因的編碼區(qū)序列的反義序列，還可包含針對非編碼區(qū)序列的反義序列?？蓪⒕幋a反義核酸的DNA連接在允許其表達的合適的調(diào)控序列之下來使用。反義核酸只要能有效抑制靶基因表達，并非必須與該基因的編碼區(qū)或非編碼區(qū)完全互補。這種反義核酸的鏈長應(yīng)至少在15bp，優(yōu)選至少100bp，更優(yōu)選至少500bp；且通常不超過3000bp，優(yōu)選不超過2000bp，更優(yōu)選不超過1000bp。這種反義核酸與目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的互補鏈優(yōu)選具有至少90％、更優(yōu)選至少95％的同一性。這種反義核酸可基于Lrp4多核苷酸，采用硫代磷酸酯法(Stein(1988)Nucleic Acid Res.163209-3221)制備。
“核酶”是帶有RNA組分的催化劑的總稱，大致可分為大核酶(largeribozyme)和小核酶(small ribozyme)。大核酶切斷核酸的磷酸酯鍵，且反應(yīng)后反應(yīng)位點上保留5’-磷酸基和3’-羥基。大核酶又進一步分為(1)在5’-剪接位點進行鳥苷引發(fā)的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的第I組內(nèi)含子RNA；(2)以經(jīng)由套索結(jié)構(gòu)的兩步反應(yīng)形式自剪接的第II組內(nèi)含子RNA；及(3)通過水解反應(yīng)在5’端酶切前體tRNA的RNA酶P的RNA成分。與此相對，小核酶是相對較小的結(jié)構(gòu)單元(40bp左右)，切斷RNA產(chǎn)生5’-羥基和2’-3’環(huán)磷酸。小核酶包括例如錘頭型核酶(Koizumi等(1988)FEBS Lett.228225)和發(fā)卡型核酶(Buzayan(1986)Nature 323349；Kikuchi和Sassaki(1992)NucleicAcids Res.196571；菊地洋(1992)化學(xué)與生物30112)。核酶容易改變和合成，并且許多修飾方法均是公知的，例如通過將核酶底物結(jié)合部分設(shè)計成與靶位點附近的RNA序列互補，可獲得識別和切割靶RNA中的堿基序列UC、UU或UA的錘頭型核酶(Koizumi等(1988)FEBS Lett.228225；小泉誠和大冢榮子(1990)蛋白質(zhì)核酸酶352191；Koizumi等(1989)NucleicAcid Res.177059)。發(fā)卡型核酶也可采用公知的方法設(shè)計和制備(Kikuchi和Sasaki(1992)Nucleic Acid Res.196571；菊地洋(1992)化學(xué)與生物30112)。
本發(fā)明的反義核酸和核酶可作為反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒等的病毒載體、利用脂質(zhì)體等的非病毒載體、或裸DNA用于離體或體內(nèi)基因治療，從而調(diào)控細胞內(nèi)的基因表達。
RNA干擾是指由向細胞內(nèi)導(dǎo)入雙鏈人工RNA引起的具有相同堿基序列的RNA的降解現(xiàn)象(Fire et al.(1998)Nature 391806-11)。本發(fā)明的siRNA只要阻礙Lrp4 mRNA的轉(zhuǎn)錄，沒有特別限制。一般的，siRNA是針對目標(biāo)mRNA的有義鏈和反義鏈的組合，其為最少10個堿基至與目標(biāo)mRNA相同。優(yōu)選15-75個、更優(yōu)選18-50個、更優(yōu)選20-25個核苷酸長。
為抑制Lrp4的表達，可采用公知的方法將siRNA導(dǎo)入細胞。例如，設(shè)計在一條鏈上編碼構(gòu)成siRNA的兩條RNA鏈的DNA，將該DNA整合到表達載體中，用該表達載體轉(zhuǎn)化細胞，即可以具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA的形式在細胞內(nèi)表達siRNA。還設(shè)計了通過轉(zhuǎn)染持續(xù)產(chǎn)生siRNA的質(zhì)粒表達載體(例如RNAi-Ready pSIREN-RetroQ Vector(BD Biosciences Clontech))。
siRNA的堿基序列，可使用例如Ambionwebsite(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.heml)的計算機程序設(shè)計。用于篩選功能性siRNA的試劑盒(例如，BD Knockout RNAiSystem(BD Biosciences Clontech))也已實現(xiàn)商品化，可以加以利用。
實施例以下通過實施例更詳細地說明本發(fā)明，但是這些實施例并不在任何意義上限制本明。
實施例1 多巴胺能神經(jīng)元祖細胞特異性基因的分離及序列分析為了分離多巴胺能神經(jīng)元祖細胞特異性的基因，將E12.5鼠中腦腹側(cè)部分沿著背腹方向進一步切分成兩個部分，采用差減(N-RDA)法鑒定含有多巴胺能神經(jīng)元的最腹側(cè)區(qū)域中特異性表達的基因。分離的片段之一就是編碼Lrp4/Corin的cDNA片段。Lrp4編碼II型跨膜蛋白(圖1)。
(1)N-RDA法(1-1)銜接子(adapter)的制備將下述的寡核苷酸退火，配制成100μM。
(ad2ad2S+ad2A、ad3ad3S+ad3A、ad4ad4S+ad4A、ad5ad5S+ad5A、ad13ad13S+ad13A)ad2Scagctccacaacctacatcattccgt(SEQ ID NO5)ad2Aacggaatgatgt (SEQ ID NO6)ad3Sgtccatcttctctctgagactctggt(SEQ ID NO7)ad3Aaccagagtctca(SEQ ID NO8)ad4Sctgatgggtgtcttctgtgagtgtgt(SEQ ID NO9)ad4Aacacactcacag(SEQ ID NO10)ad5Sccagcatcgagaatcagtgtgacagt(SEQ ID11)ad5Aactgtcacactg(SEQ ID NO12)ad13Sgtcgatgaacttcgactgtcgatcgt(SEQ ID13)ad13Aacgatcgacagt(SEQ ID NO14)(1-2)cDNA合成從由日本SLC獲得的小鼠的12.5天胚胎中切出中腦腹側(cè)，進一步沿腹背方向切分成兩個部分。使用RNeasy微量試劑盒(Qiagen)制備總RNA，使用cDNA合成試劑盒(TAKARA)合成雙鏈cDNA。用限制性內(nèi)切酶RsaI消化后，加入ad2，以ad2S為引物，用15個循環(huán)的PCR擴增cDNA。擴增條件是在72℃溫育5分鐘后，將94℃30秒、65℃30秒、72℃2分鐘的反應(yīng)進行15循環(huán)，最后在72℃溫育2分鐘。N-RDA的PCR反應(yīng)全部以如下組成的反應(yīng)液進行10×ExTaq 5μl2.5mM dNTP4μlExTaq 0.25μl100μM引物0.5μlcDNA 2μl蒸餾水38.25μl(1-3)驅(qū)動方(Driver)的制作將用ad2S擴增的cDNA進一步用5個循環(huán)的PCR擴增。擴增條件是在94℃溫育2分鐘后，將94℃30秒、65℃30秒、72℃2分鐘的反應(yīng)進行5個循環(huán)，最后在72℃溫育2分鐘。使用Qiaquick PCR純化試劑盒(Qiagen)純化cDNA，RsaI消化。每次差減各使用3μg。
(1-4)待試方(Tester)的制作將用ad2S擴增的cDNA進一步用5個循環(huán)的PCR擴增。擴增條件是在94℃溫育2分鐘后，將94℃30秒、65℃30秒、72℃2分鐘的反應(yīng)進行5個循環(huán)，最后在72℃溫育2分鐘。使用Qiaquick PCR純化試劑盒(Qiagen)純化cDNA，RsaI消化。向60ng的經(jīng)RsaI消化的cDNA中加入ad3。
(1-5)第一次差減將在上述3以及4中制作的待試方以及驅(qū)動方混合，乙醇沉淀后，溶解到1μl的1xPCR緩沖液中。98℃5分鐘后，加入1xPCR緩沖液+1M NaCl1μl。進一步98℃5分鐘后，使之在68℃雜交16小時。
將雜交的cDNA以ad3S為引物，用10個循環(huán)的PCR擴增后(在72℃溫育5分鐘后，將94℃30秒、65℃30秒、72℃2分鐘的反應(yīng)進行10個循環(huán))、用綠豆核酸酶(TAKARA)消化，用Qiaquick PCR純化試劑盒純化。進一步用13個循環(huán)的PCR擴增。擴增條件是在94℃溫育2分鐘后，將94℃30秒、65℃30秒、72℃2分鐘的反應(yīng)進行13個循環(huán)，最后在72℃溫育2分鐘。
(1-6)歸一化向第一次差減中擴增的cDNA 8ng中加入1μl 2xPCR緩沖液。98℃5分鐘后，加入1xPCR緩沖液+1M NaCl 2μl。進一步98℃5分鐘后，使之在68℃雜交16小時。
將雜交的cDNA用RsaI消化，用Qiaquick PCR純化試劑盒純化。以ad3S為引物，用11個循環(huán)的PCR擴增之后(94℃溫育2分鐘后，將94℃30秒、65℃30秒、72℃2分鐘的反應(yīng)進行11個循環(huán)，最后在72℃溫育2分鐘)用RasI消化，加入ad4。
(1-7)第二次差減以上述6中加入了ad4的cDNA 20ng為待試方，與上述3的驅(qū)動方混合，進一步用與上述5同樣的方法進行差減。最后向RsaI消化的cDNA中加入ad5。
(1-8)第三次差減以上述7中加入了ad5的cDNA 2ng為待試方，與上述3的驅(qū)動方混合，進一步用與上述5同樣的方法進行差減。最后向RsaI消化的cDNA中加入ad13。
(1-9)第四次差減以上述8中加入了ad13的cDNA 2ng為待試方，與上述3的驅(qū)動方混合，然后用與上述5同樣的方法進行差減。將擴增的cDNA克隆到pCRII(Invitrogen)，使用ABI3100測序儀分析堿基序列。
實施例2 Lrp4基因的表達分析接下來，用Lrp4基因，按照下面的方案進行原位雜交表達分析。
首先將小鼠12.5日胚胎用OCT包埋，制作厚度為16μm的新鮮冷凍切片。使之在載玻片上干燥后，用4％PFA在室溫固定30分鐘。用PBS清洗后，在65度雜交(1μg/ml DIG化的RNA探針、50％甲酰胺、5xSSC，1％SDS，50μg/ml酵母RNA，50μg/ml肝素)40小時。然后在65度清洗(50％甲酰胺、5xSSC，1％SDS)、在室溫用RNA酶(5μg/ml RNA酶)處理5分鐘。65度用0.2xSSC清洗，室溫用1xTBST清洗之后，進行封閉(封閉試劑Roche)。使之與堿性磷酸酶標(biāo)記的抗DIG抗體(DAKO)反應(yīng)，清洗(1xTBST、2mM Levamisole)后，以NBT/BCIP(DAKO)為底物使之顯色。
通過原位雜交的表達分析結(jié)果顯示，在作為多巴胺能神經(jīng)元產(chǎn)生時期的E12.5中，Lrp4 mRNA在從中腦，到后腦、脊髓的腹側(cè)中心部分特異性地表達。其從后腦到脊髓顯示與Shh mRNA同樣的表達模式，表明對于組織導(dǎo)體區(qū)即底板(floor plate)是特異的(圖2及圖5)。在中腦中，表達僅在Shh mRNA表達區(qū)域中更為中心的區(qū)域可見(圖3以及5)。
根據(jù)與多巴胺的成熟標(biāo)志物NCAM mRNA比較的結(jié)果，Lrp4 mRNA表達細胞是NCAM mRNA陰性的腦室區(qū)域(Ventricular Zone(VZ))內(nèi)的增殖祖細胞。進一步與多巴胺能神經(jīng)元的標(biāo)志物TH mRNA比較，盡管由于TH mRNA僅在套層(mantle layer)中表達，不能在同一細胞中發(fā)現(xiàn)兩者的表達，但兩者在背-腹軸方向的表達范圍完全一致(圖3及圖5)。我們知道，一般神經(jīng)管(neural tube)內(nèi)的神經(jīng)細胞首先在VZ內(nèi)增殖，在分化開始的同時停止分裂，然后移動到相鄰?fù)鈧?cè)的ML后成熟。所以，可以認(rèn)為多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞在TH表達區(qū)域的相鄰內(nèi)側(cè)的VZ內(nèi)增殖，分裂停止后移動到外側(cè)，然后表達TH mRNA。也就是說，可以認(rèn)為Lrp4 mRNA在中腦的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞中特異性地表達(圖4及圖6)。
實施例3 從ES細胞誘導(dǎo)分化的多巴胺能神經(jīng)元中Lrp4的表達下面研究在體外ES細胞誘導(dǎo)分化成多巴胺能神經(jīng)元時是否表達Lrp4。
首先，通過SDIA法(Kawasaki et.al.(2000)Neuron 28(1)31-40)從ES細胞誘導(dǎo)分化多巴胺能神經(jīng)元(參照圖7上部)。分別在誘導(dǎo)后4、6、8、10、12天回收細胞，使用RNeasy微量試劑盒(Qiagen)回收總RNA，進行RT-PCR。RT-PCR中，最初對于1μg的總RNA，使用RNA PCR試劑盒(TaKaRa)進行cDNA合成。其中，將相當(dāng)于10ng、1ng、0.1ng的cDNA用作模板，使用以下的反應(yīng)體系進行PCR。
10×ExTaq 2μl2.5mM dNTP 1.6μlExTaq 0.1μl100μM引物 各0.2μlcDNA 1μl蒸餾水 14.9μl94℃溫育2分鐘后，將94℃30秒、65℃30秒、72℃2分鐘的反應(yīng)進行35個循環(huán)，最后在72℃溫育2分鐘。
使用以下序列的引物。
Lrp4TAGTCTACCACTGCTCGACTGTAACG(SEQ ID NO15)/CAGAGTGAACCCAGTGGACATATCTG(SEQ ID NO16)THGTTCCCAAGGAAAGTGTCAGAGTTGG(SEQ ID NO17)/GAAGCTGGAAAGCCTCCAGGTGTTCC(SEQ ID NO18)DATCTCCGAGCAGACACCATGACCTTAGC(SEQ ID NO19)/AGGAGTAGGGCTTGTCTCCCAACCTG(SEQ ID NO20)根據(jù)RT-PCR的表達分析的結(jié)果，Lrp4在ES細胞(CCE)以及基質(zhì)細胞(PA6)中不表達，但誘導(dǎo)分化后，Lrp4與TH一樣在第四天被誘導(dǎo)表達(圖8)。所以，本發(fā)明的標(biāo)志物多寡核苷酸探針作為標(biāo)志物，不僅可用于分離胎兒中腦來源的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞，還可用于分離在體外從ES細胞誘導(dǎo)分化的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞。
實施例4 Lrp4蛋白質(zhì)的表達分析以下使用Lrp4基因中編碼胞外區(qū)域的基因序列，通過以下方案制備抗Lrp4抗體，通過免疫組織染色進行表達分析。
首先，將Lrp4基因中編碼胞外區(qū)域(161-502氨基酸)的基因序列基因?qū)?93E細胞，表達并回收Lrp4蛋白質(zhì)的胞外部分。將回收的蛋白質(zhì)免疫倉鼠后，取出淋巴細胞使之與骨髓瘤細胞融合。培養(yǎng)融和細胞，得到其培養(yǎng)上清液。接著將小鼠12.5日胚胎在4℃用4％PFA/PBS(-)固定2小時后，在4℃用20％蔗糖/PBS(-)置換過夜，再用OCT包埋。制作厚度為12μm的切片，貼到載玻片上，在室溫干燥30分鐘，再次用PBS(-)潤濕。然后在室溫進行封閉(10％正常猴血清、10％正常山羊血清/Block Ace)20分鐘后，使之與制作的抗Lrp4單克隆抗體(混合FERM BP-10315、FERM BP-10316使用(每份1/4稀釋的培養(yǎng)上清，10％正常猴血清，10％正常猴血清，2.5％Block Ace/PBS))以及抗TH抗體(Chemicon，0.7μg/ml，10％正常猴血清；10％正常山羊血清；2.5％Block Ace/PBS)在室溫反應(yīng)1小時后，進一步在4℃反應(yīng)過夜。在0.1％Triton X-100/PBS(-)中，室溫進行4次10分鐘的清洗。使之與Cy3標(biāo)記抗倉鼠IgG抗體、FITC標(biāo)記抗小鼠IgG抗體(Jackson、10μg/ml、10％正常猴血清；10％正常山羊血清；2.5％Block Ace/PBS)在室溫反應(yīng)1小時，同樣進行清洗后，用PBS(-)室溫清洗10分鐘，封裝。
根據(jù)使用制備的抗Lrp4單克隆抗體的免疫組織染色的表達分析結(jié)果，如原位雜交的表達分析結(jié)果那樣，在處于多巴胺能神經(jīng)元產(chǎn)生時期的E12.5中，發(fā)現(xiàn)了Lrp4在中腦腹側(cè)的表達(圖8)。與多巴胺能神經(jīng)元的標(biāo)志物TH蛋白質(zhì)的表達相比較，Lrp4蛋白質(zhì)在表達TH蛋白質(zhì)的中腦最腹側(cè)的VZ側(cè)表達，所以可以認(rèn)為Lrp4蛋白質(zhì)是在多巴胺能神經(jīng)元祖細胞中表達。
接著，使用抗Lrp4單克隆抗體，通過流式細胞術(shù)進行Lrp4表達細胞的檢測。
首先，用SDIA法在體外從ES細胞誘導(dǎo)分化多巴胺能神經(jīng)元祖細胞。將含有該組細胞的細胞群用細胞分散緩沖液(Invitrogen)分散后，不經(jīng)過固定、滲透處理，直接用抗Lrp4單克隆抗體(混合FERM BP-10315、FERMBP-10316使用(每份1/4稀釋的培養(yǎng)上清、1％胎牛血清、1mM EDTA/SDIA分化培養(yǎng)基))在4℃染色20分鐘。然后用1％胎牛血清、1mM EDTA/SDIA分化培養(yǎng)基在4℃進行3次3分鐘的清洗，用生物素標(biāo)記的抗倉鼠IgG抗體(Jackson，10μg/ml，1％胎牛血清，1mM EDTA/SDIA分化培養(yǎng)基)在4℃染色20分鐘，同樣清洗后，用PE標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白(Pharmingen、20μg/ml、1％胎牛血清、1mM EDTA/SDIA分化培養(yǎng)基)在4℃染色20分鐘，同樣清洗。染色后，在流式細胞儀上檢測Lrp4表達細胞。
根據(jù)使用制備的抗Lrp單克隆抗體通過流式細胞術(shù)檢測表達細胞的結(jié)果，檢測出了表達Lrp4蛋白質(zhì)的群體(圖9)。因為未經(jīng)固定、滲透處理即能檢測出Lrp4蛋白質(zhì)表達細胞，所以可以認(rèn)為通過使用帶有細胞分選儀的流式細胞儀分離活細胞狀態(tài)的Lrp4蛋白質(zhì)表達細胞。Lrp4蛋白質(zhì)被認(rèn)為在多巴胺能神經(jīng)元祖細胞中表達，所以可以認(rèn)為抗Lrp4抗體對于多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的分離是有用的。
實施例5 用抗體分離Lrp4表達細胞下面，分析用抗Lrp4抗體分離的Lrp4蛋白質(zhì)陽性細胞的性質(zhì)。
首先，采取與實施例4同樣的方法用抗Lrp4抗體將E12.5小鼠胎兒中腦腹側(cè)區(qū)域以及含有用SDIA法在體外從ES細胞誘導(dǎo)分化的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的細胞群染色，通過細胞分選儀分離Lrp4陽性細胞和陰性細胞。分離后立即從分離的細胞用RNeasy微量試劑盒(Qiagen)回收總RNA，合成cDNA，用與實施例1同樣的方法擴增cDNA用作RT-PCR的模板。將相當(dāng)于4ng、0.4ng、0.04ng擴增cDNA的cDNA作為模板，用以下反應(yīng)體系進行PCR。
10×ExTaq 1μl2.5mM dNTP 0.8μlExTaq 0.05μl100μM引物 各0.1μlcDNA 1μl蒸餾水 6.95μl94℃溫育2分鐘后，將94℃30秒、65℃30秒、72℃2分鐘的反應(yīng)進行26個循環(huán)，最后在72℃溫育2分鐘。
Lrp4TAGTCTACCACTGCTCGACTGTAACG(SEQ ID NO15)/CAGAGTGAACCCAGTGGACATATCTG(SEQ ID NO16)THGTTCCCAAGGAAAGTGTCAGAGTTGG(SEQ ID NO17)/GAAGCTGGAAAGCCTCCAGGTGTTCC(SEQ ID NO18)NurrlCACTCCTGTGTCTAGCTGCCAGATGC(SEQ ID NO21)/AGTGCGAACACCGTAGTGCTGACAGG(SEQ ID NO22)
巢蛋白GATGAAGAAGAAGGAGCAGAGTCAGG(SEQ ID NO23)/ATTCACTTGCTCTGACTCCAGGTTGG(SEQ ID NO24)MAP2CCATGATCTTTCCCCTCTGGCTTCTG(SEQ ID NO25)/TTTGGCTGGAAAGGGTGACTCTGAGG(SEQ ID NO26)RT-PCR的表達分析結(jié)果正如預(yù)想的那樣，發(fā)現(xiàn)了增殖祖細胞標(biāo)志物巢蛋白的表達，還發(fā)現(xiàn)Lrp4蛋白質(zhì)陽性細胞集團中含有表達分裂停止后的標(biāo)志物MAP2的細胞(圖10)。所以，這表明Lrp4蛋白質(zhì)的表達在mRNA的表達停止后仍可持續(xù)，Lrp4蛋白質(zhì)作為標(biāo)記物不僅可用于分離多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞，而且可用于分離分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元前體細胞(圖11)。此外，與Lrp4陰性集團相比，作為分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元前體細胞標(biāo)志物的Nurrl和TH高水平表達，這證明了Lrp4陽性細胞確實是多巴胺能神經(jīng)元系的祖細胞(圖10)。
下面研究用Lrp4抗體分離的Lrp4蛋白質(zhì)陽性細胞集團中含有的增殖祖細胞和分裂停止后前體細胞的比例。
將分離的細胞接種在包被了聚-L-鳥氨酸(Sigma，PBS中，0.002％)、層粘連蛋白(Invitrogen，PBS中，5μg/ml)和纖連蛋白(Sigma，PBS中，5μg/ml)的載玻片上，在37℃、N2(Invitrogen、1x)、B27(Invitrogen、1x)、抗壞血酸(Sigma，200μM)BDNF(Invitrogen，20ng/ml)/SDIA分化培養(yǎng)基中溫育40分鐘使之貼壁。貼壁的細胞用4％PFA/PBS在4℃固定20分鐘，用PBS在4℃進行2次10分鐘的洗滌。然后，用0.3％TritonX-100/PBS在室溫進行15分鐘的滲透處理，用10％正常猴血清/Block Ace在室溫進行20分鐘的封閉。接著，用抗巢蛋白抗體(Chemicon，2μg/ml，10％正常猴血清，2.5％Block Ace，0.1％Triton X-100/PBS)、抗βIII-微管蛋白抗體(BABCO、1/2000、0.5μg/ml、10％正常猴血清、2.5％Block Ace、0.1％Triton X-100/PBS)在室溫反應(yīng)1小時、接著4℃反應(yīng)過夜。第二天用0.1％Triton X-100/PBS在室溫進行3次5分鐘的清洗后，與FITC標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體、Cy5標(biāo)記的抗兔IgG抗體(均為Jackson；10μg/ml、10％正常猴血清、2.5％Block Ace、0.1％Triton X-100/PBS)在室溫反應(yīng)30分鐘。然后同樣進行清洗，用PBS在室溫洗滌5分鐘，封固觀察。
將分離的細胞同樣接種在載玻片上，在向上述培養(yǎng)基中添加了BrdU(Roche；5-溴-2’-脫氧-尿苷標(biāo)記和檢測試劑盒II，1x)的培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18小時后，同樣進行上述步驟直到封閉，使之與2N HCl在37℃反應(yīng)20分鐘，然后用PBS清洗3次，與抗BrdU抗體、DNA酶(Roche；5-溴-2’-脫氧-尿苷標(biāo)記和檢測試劑盒II，1x，1x濃度，于溫育緩沖液中)在37℃反應(yīng)30分鐘。進一步與抗BrdU抗體(Sigma、44μg/ml、10％正常猴血清、2.5％Block Ace、0.1％Triton X-100/PBS)在室溫反應(yīng)1小時，接著在4℃反應(yīng)過夜。第二天用0.1％Triton X-100/PBS在室溫進行3次5分鐘的清洗后，與FITC標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體(Jackson；10μg/ml、10％正常猴血清、2.5％BlockAce、0.1％Triton X-100/PBS)在室溫反應(yīng)30分鐘。然后同樣進行清洗、封固、觀察。
并且，標(biāo)志物染色的結(jié)果證明，大多數(shù)Lrp4陽性細胞是巢蛋白陽性的增殖祖細胞，其中一部分細胞為分裂停止后標(biāo)志物βIII-微管蛋白陽性(圖12)。而且確認(rèn)了分離的細胞高頻率地攝入BrdU，并實際地在體外增殖(圖13)。
接著確認(rèn)分離的Lrp4陽性細胞分化成多巴胺能神經(jīng)元。
將分離的細胞接種在包被了聚-L-鳥氨酸(Sigma，PBS中，0.002％)、層粘連蛋白(Invitrogen，PBS中，5μg/ml)和纖連蛋白(Sigma，PBS中，5μg/ml)的載玻片上，在37℃、N2(Invitrogen、1x)、B27(Invitrogen、1x)、抗壞血酸(Sigma、200μM)BDNF(Invitrogen、20ng/ml)、bFGF(R&D、10ng/ml)/SDIA分化培養(yǎng)基中溫育24小時。然后用不含bFGF的上述培養(yǎng)基再培養(yǎng)6天。將培養(yǎng)的細胞用4％PFA/PBS在4℃固定20分鐘，用PBS在4℃進行2次10分鐘的洗滌。然后，用0.3％Triton X-100/PBS在室溫進行15分鐘的滲透處理，用10％正常猴血清/Block Ace在室溫進行20分鐘的封閉。接著，用抗TH抗體(Chemicon；0.3μg/ml、10％正常猴血清、2.5％Block Ace、0.1％Triton X-100/PBS)、抗βIII-微管蛋白抗體(BABCO、1/2000、0.5μg/ml、10％正常猴血清、2.5％Block Ace、0.1％Triton X-100/PBS)在室溫反應(yīng)1小時、接著4℃反應(yīng)過夜。第二天用0.1％Triton X-100/PBS在室溫進行3次5分鐘的清洗后，與FITC標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體、Cy5標(biāo)記的抗兔IgG抗體(二者都為Jackson；10μg/ml、10％正常猴血清、2.5％BlockAce、0.1％Triton X-100/PBS)在室溫反應(yīng)30分鐘。然后同樣進行清洗，用PBS在室溫洗滌5分鐘，封固觀察。
與對照即未分離的細胞相比，分離的細胞在體外培養(yǎng)的結(jié)果是明顯誘導(dǎo)了更多TH蛋白質(zhì)陽性的多巴胺能神經(jīng)元。所以，這證明了Lrp4細胞確實是多巴胺能神經(jīng)元系的祖細胞，且可以體外成熟(圖14)。
實施例6 向帕金森病模型小鼠紋狀體移植分離的Lrp4蛋白質(zhì)陽性細胞。
使用抗Lrp4單克隆抗體，用流式細胞術(shù)分離Lrp4表達細胞，將該細胞移植到帕金森病模型小鼠紋狀體中。
首先，用SDIA法在體外從ES細胞誘導(dǎo)分化多巴胺能神經(jīng)元祖細胞，將含有該祖細胞的細胞群用細胞分散緩沖液(Invitrogen)分散后，不經(jīng)過固定、滲透處理，在4℃用在實施例4中制備的抗Lrp4單克隆抗體(混合使用FERM BP-10315、FERM BP-10316(每份1/4稀釋的培養(yǎng)上清、1％胎牛血清、1mM EDTA/SDIA分化培養(yǎng)基))在4℃染色20分鐘。然后用1％胎牛血清、1mM EDTA/SDIA分化培養(yǎng)基在4℃進行3次3分鐘的清洗，用生物素標(biāo)記的抗倉鼠IgG抗體(Jackson；10μg/ml、1％胎牛血清、1mMEDTA/SDIA分化培養(yǎng)基)在4℃染色20分鐘，同樣清洗后，用PE標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白(Pharmingen、20μg/ml、1％胎牛血清、1mM EDTA/SDIA分化培養(yǎng)基)在4℃染色20分鐘，同樣清洗。染色后，在流式細胞儀上分離出Lrp4表達細胞。
接著，將分離的Lrp4蛋白質(zhì)陽性細胞移植到帕金森病模型小鼠紋狀體，分析腦內(nèi)的Lrp4蛋白質(zhì)陽性細胞的性質(zhì)。
首先，通過向12周齡的小鼠(slc)的單側(cè)的前腦內(nèi)側(cè)束(medial forebrainbundle)中注入1.25μl的6-OHDA(Sigma；2μg/μl)，殺滅從中腦投射到紋狀體的多巴胺能神經(jīng)元來制備帕金森病模型小鼠。模型小鼠制作后第二周，向每只鼠的注入了6-OHDA一側(cè)的紋狀體中移植3×104個Lrp4蛋白質(zhì)陽性細胞。移植的Lrp4蛋白質(zhì)陽性細胞是這樣制備的將基因?qū)隕S細胞使得EGFP基因在CAG啟動子(Niwa等.(1991)Gene.108193-200)控制下表達；用SDIA法在體外將該ES細胞誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元祖細胞；用實施例4相同的方法用抗Lrp4抗體對含有該祖細胞的細胞群體進行染色，并通過細胞分選儀分選而得。
移植后第三周，腹腔內(nèi)給與500μl 10％溶于鹽水的鳥拉坦進行麻醉，麻醉起效后開胸，從左心室注入生理鹽水(大冢)30ml灌注后，用4％PFA/PBS(-)30ml灌注固定(perfusion-fix)。固定后取出腦，進一步在4％PFA/PBS(-)中浸漬固定8小時。然后切成2mm厚的片，在20-40％蔗糖/PBS(-)中置換過夜，包埋到OCT中。制備厚度為10-12μm的切片，貼到載玻片上后，在室溫干燥30分鐘，再次用PBS(-)濕潤。然后在室溫封閉(10％正常猴血清/BlockAce)20分鐘，與抗GFP抗體(Molecular probes、20μg/ml、10％正常猴血清、10％Block Ace/PBS)、抗MAP2抗體(Sigma、小鼠腹水、100倍稀釋、10％正常猴血清、10％Block Ace/PBS)或者抗TH抗體(Chemicon、1μg/ml、10％正常猴血清、10％Block Ace/PBS)在室溫反應(yīng)1小時后，進一步4℃反應(yīng)過夜。然后用0.1％Triton X-100/PBS(-)在室溫進行四次清洗，每次10分鐘。接著，與Alexa Fluor488標(biāo)記的抗兔IgG抗體(Molecular Probes；4μg/ml、10％正常猴血清、10％Block Ace/PBS)、Cy3標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體(Jackson；10μg/ml、10％正常猴血清、10％Block Ace/PBS)或者Cy5標(biāo)記的抗綿羊IgG抗體(Jackson；10μg/ml、10％正常猴血清、10％Block Ace/PBS)在室溫反應(yīng)1小時后，同樣進行清洗，用PBS(-)在室溫清洗十分鐘，封固。
并且，通過免疫組織染色進行各種標(biāo)志物的表達分析。
其結(jié)果首先在移植的小鼠的紋狀體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了EGFP陽性細胞(表1)。由此，可以認(rèn)為移植的Lrp4蛋白質(zhì)陽性細胞在帕金森病模型小鼠的紋狀體中植活。
而且也確認(rèn)了植活的絕大多數(shù)細胞都是成熟神經(jīng)元標(biāo)志物MAP2陽性的，EGFP陽性的軸突在紋狀體內(nèi)伸展較長(表1以及圖16)。
表1

(表1表示移植的Lrp4陽性細胞在體內(nèi)向TH陽性細胞分化的情況。在以6-OHDA破壞#6小鼠及#7小鼠的多巴胺能神經(jīng)元2周后移植Lrp4蛋白質(zhì)陽性細胞，在移植后三周灌注。)由此可見，移植的Lrp4蛋白質(zhì)陽性細胞是神經(jīng)祖細胞，相對于此，大多數(shù)植活的細胞都分化以及成熟為成熟的神經(jīng)細胞。而且這些植活的細胞中約有20％是TH陽性，這強烈地暗示移植的Lrp4蛋白質(zhì)陽性細胞的至少一部分分化成了多巴胺能神經(jīng)元。
所以，根據(jù)本發(fā)明分離的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞通過移植到腦內(nèi)可能分化成多巴胺能神經(jīng)元，可以認(rèn)為根據(jù)本發(fā)明分離的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞對于治療是有效的。
實施例7 采用5階段法從ES細胞誘導(dǎo)分化的多巴胺能神經(jīng)元中Lrp4的表達研究使用5階段法在體外將ES細胞誘導(dǎo)分化成多巴胺能神經(jīng)元時Lrp4是否表達。
首先，通過5階段法(Lee et.al.(2000)Nat.Biotech.18675-679)，小鼠多巴胺能神經(jīng)元分化試劑盒(R&D systems))從ES細胞(CCE)誘導(dǎo)分化多巴胺能神經(jīng)元。分別在階段1的第2天、階段2的第4天、階段3的第6天、階段4的第4、6天、階段5的第4、7天回收細胞，用RNeasy微量試劑盒(Qiagen)回收總RNA，進行RT-PCR。在RT-PCR中，最初相對于1μg的總RNA，使用RNA PCR kit(TaKaRa)進行cDNA合成。將其中相當(dāng)于10ng、1ng、0.1ng的cDNA用作模板，用以下反應(yīng)體系進行PCR。
10×ExTaq 2μl2.5mM dNTP1.6μlExTaq 0.1μl100μM引物各0.2μlcDNA 1μl蒸餾水14.9μl94℃溫育2分鐘后，將94℃30秒、65℃30秒、72℃2分鐘的反應(yīng)進行32個循環(huán)，最后在72℃溫育2分鐘。
使用以下序列的引物。
Lrp4TAGTCTACCACTGCTCGACTGTAACG(SEQ ID NO15)/CAGAGTGAACCCAGTGGACATATCTG(SEQ ID NO16)THGTTCCCAAGGAAAGTGTCAGAGTTGG(SEQ ID NO17)/GAAGCTGGAAAGCCTCCAGGTGTTCC(SEQ ID NO18)RT-PCR的表達分析結(jié)果證明，Lrp4在未分化的ES細胞狀態(tài)的階段1中不表達，但是在產(chǎn)生多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的階段4中被誘導(dǎo)表達(圖17A)。
接著，在采用5階段法在體外使ES細胞誘導(dǎo)分化成多巴胺能神經(jīng)元的情況下，使用抗Lrp4單克隆抗體通過流式細胞儀檢測了Lrp4表達細胞。
首先，用細胞分散溶液Accumax(Innovative Cell Technologies，Inc.)分散含有采用5階段法在體外從ES細胞誘導(dǎo)分化的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的細胞群(階段4、第7天)后，不經(jīng)過固定、滲透處理，用抗Lrp4單克隆抗體(混合FERM BP-10315、FERM BP-10316使用(每份1/2稀釋的培養(yǎng)上清)在4℃染色20分鐘。然后用1％胎牛血清、1mM EGTA、4.5mg/ml葡萄糖、40ng/ml DNA酶I/不含Ca·Mg的Hanks’平衡鹽溶液(HBSS-)在4℃進行3次3分鐘的清洗，用PE標(biāo)記的抗倉鼠IgG抗體(8μg/ml(BDBioscience)、1％胎牛血清、1mM EGTA、4.5mg/ml葡萄糖、40ng/ml DNA酶I/不含Ca·Mg的Hanks’平衡鹽溶液(HBSS-))在4℃染色30分鐘，同樣清洗。染色后，在流式細胞儀上檢測Lrp4表達細胞。
根據(jù)使用抗Lrp4單克隆抗體的流式細胞術(shù)檢測Lrp4表達細胞的結(jié)果，在含有采用5階段法在體外從ES細胞誘導(dǎo)分化的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的細胞群中，檢出了表達Lrp4蛋白質(zhì)的集團(圖17B)。所以不僅是SDIA法，采用5階段法從ES細胞誘導(dǎo)分化的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞同樣表達Lrp4，可以認(rèn)為其作為細胞分離的標(biāo)志物是有價值的。
實施例8 使用抗體分離的Lrp4表達細胞在體外分化成熟研究使用抗Lrp4抗體分離的Lrp4蛋白質(zhì)陽性細胞在體外是否分化成多巴胺能神經(jīng)元。
對含有用5階段法在體外從ES細胞誘導(dǎo)分化的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的細胞群，采取與實施例4相同的方法用抗Lrp4抗體進行染色，并通過細胞分選儀分離Lrp4陽性細胞。將分離的細胞接種在包被了聚-L-鳥氨酸(Sigma，PBS中，0.002％)和纖連蛋白(Sigma，PBS中，5μg/ml)的載玻片上，在N2(Invitrogen、1x)、抗壞血酸(Sigma、200μM)BDNF(R&DSystems，20ng/ml)/DMEM/F12中37℃溫育七天。然后，將培養(yǎng)的細胞用2％PFA、0.15％苦味酸/PBS在4℃固定20分鐘，用PBS在4℃進行2次10分鐘的洗滌。然后，用0.3％Triton X-100/PBS在室溫進行30分鐘的滲透處理，用10％正常猴血清、10％正常山羊血清/Block Ace在室溫進行20分鐘的封閉。接著，用抗TH抗體(Chemicon；0.4μg/ml、10％正常猴血清、10％正常山羊血清、2.5％Block Ace、0.1％Triton X-100/PBS)、抗MAP2抗體(Sigma；腹水1/200；10％正常猴血清、10％正常山羊血清、2.5％Block Ace、0.1％Triton X-100/PBS)在室溫反應(yīng)1小時、接著4℃反應(yīng)過夜。第二天用0.1％Triton X-100/PBS在室溫進行4次10分鐘的清洗后，與FITC標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體、Cy3標(biāo)記的抗兔IgG抗體(二者均為Jackson；10μg/ml、10％正常猴血清、10％正常山羊血清、2.5％Block Ace、0.1％TritonX-100/PBS)在室溫反應(yīng)30分鐘。然后同樣進行清洗，用PBS在室溫洗滌5分鐘，封固觀察。
在體外培養(yǎng)Lrp4陽性細胞的結(jié)果是TH蛋白質(zhì)陽性的大多數(shù)多巴胺能神經(jīng)元被誘導(dǎo)(圖17C)，所以，表明采用5階段法誘導(dǎo)的Lrp4陽性細胞是多巴胺能神經(jīng)元祖細胞，并可在體外成熟。Lrp4在通過兩種不同的分化方法(SDIA法、5階段法)誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞之中均表達，使用抗Lrp4抗體可以分離任何一種多巴胺能神經(jīng)元祖細胞。由于這些原因，Lrp4被認(rèn)為可以有效地用作多巴胺能神經(jīng)元祖細胞標(biāo)志物，而與其細胞來源無關(guān)。而且，5階段法不需與動物來源的細胞以及成分接觸即能夠分化誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元祖細胞，其臨床應(yīng)用值得期待。Lrp4在該方法中用作細胞分離標(biāo)志物，可以認(rèn)為將其應(yīng)用于包括帕金森病在內(nèi)的神經(jīng)變性疾病的移植治療的可能性很高。
實施例9 通過使用抗Lrp4抗體對多巴胺能神經(jīng)元祖細胞進行分離而除去未分化的ES細胞制備來源于ES細胞的移植細胞時，在安全性方面最重要的就是除去會造成畸胎瘤的未分化ES細胞。因為Lrp4在未分化的ES細胞中不表達(實施例3)，所以有望使用Lrp4作標(biāo)志物進行分離除去未分化的ES細胞。為了確認(rèn)這一點，利用RT-PCR，通過檢測ES細胞特異性基因Eras(Nature.2003 423(6939)541-5)以及Nanog(Cell.2003 113(5)631-42.)的表達，來研究采用SDIA法在體外從ES細胞誘導(dǎo)分化的細胞用Lrp4抗體分離后，所得的細胞中是否含有未分化的ES細胞。
首先，用與實施例5同樣的方法，在含有通過SDIA法在體外從ES細胞誘導(dǎo)分化的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的細胞群中，通過細胞分選儀分離Lrp4陽性細胞以及陰性細胞。分離后立即從分離的細胞回收總RNA，制備擴增cDNA，將相當(dāng)于4ng、0.4ng、0.04ng的cDNA用作模板，用以下反應(yīng)體系進行PCR。
10×ExTaq 1μl2.5mM dNTP 0.8μlExTaq 0.05μl100μM引物 各0.1μlcDNA 1μl蒸餾水 6.95μl94℃溫育2分鐘后，將94℃30秒、65℃30秒、72℃2分鐘的反應(yīng)進行26個循環(huán)(Lrp4，巢蛋白)或者30個循環(huán)(Eras，Nanog)，最后在72℃溫育2分鐘。
使用以下序列的引物(Lrp4和巢蛋白在實施例5中記載)ERasTGCTCTCACCATCCAGATGACTCACC(SEQ ID NO27)/TGGACCATATCTGCTGCAACTGGTCC(SEQ ID NO28)NanogTCCAGCAGATGCAAGAACTCTCCTCC(SEQ ID NO29)/TTATGGAGCGGAGCAGCATTCCAAGG(SEQ ID NO30)其結(jié)果是在Lrp4陽性細胞集團中，沒有發(fā)現(xiàn)ES細胞特異表達的ERas以及Nanog的表達，而另一方面在Lrp4陰性集團中檢測到了ERas以及Nanog的表達(圖18)。由此表明，通過使用Lrp4的細胞分離，能夠除去采用SDIA法分化誘導(dǎo)的細胞中含有的未分化ES細胞。
產(chǎn)業(yè)上應(yīng)用的潛能本發(fā)明確定了Lrp4是在多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞中特異的、且瞬時表達的基因。更加詳細的關(guān)于其表達的研究結(jié)果確認(rèn)，Lrp4 mRNA在多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞、Lrp4蛋白在包含分裂停止前后的細胞的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞中分別特異地表達。因而，以細胞中該Lrp4 mRNA或者Lrp4多肽的表達為指標(biāo)，能夠選擇出在安全性、存活率以及網(wǎng)絡(luò)形成能力方面均適于包括帕金森病在內(nèi)的神經(jīng)變性疾病的移植治療的多巴胺能神經(jīng)元系細胞。像本發(fā)明這樣，以Lrp4作為標(biāo)志物獲取細胞時，即使是用于需要成熟細胞的治療等情形，仍然能夠容易地在體外使之分化至適宜狀態(tài)。而且，使用本發(fā)明的方法獲得的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞，可以分離該細胞中特異性表達的基因。進一步，可以認(rèn)為該細胞在開發(fā)針對帕金森病等神經(jīng)變性疾病的藥物方面也是有價值的。尤其是，以Lrp4mRNA為指標(biāo)獲得的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞是處于神經(jīng)元形成初期的祖細胞，它們可用來闡明神經(jīng)元的成熟過程，即與成熟過程相關(guān)的各種因子的作用。這些因子的闡明有望對神經(jīng)變性疾病的治療作出巨大貢獻。更進一步，以該細胞的成熟為指標(biāo)，還能夠篩選調(diào)節(jié)(抑制或者促進)該過程的物質(zhì)。
序列表<110>衛(wèi)材株式會社(EISAI CO.，LTD.)<120>Lrp4/Corin多巴胺能神經(jīng)元祖細胞標(biāo)志物<140>PCT/JP05/013453<141>2005-07-22<150>JP2004-213743<151>2004-07-22<150>JP2004-315060<151>2004-10-29<160>30<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>4864<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<400>1ctagtcccca ggcagacggt ccctcactcc tgtggcttgg cgtcggagac gctggcagtc 60atgggcaggg tttccttcag cgttcgggtc agctccgtgc ggagagcccg ctgctcttgt 120cctgggcgat gctacctctc ctgcagagtc cctccaacca ccgccctccg tgcactgaac 180ggtcttggct gcgcgggggt tccgggggag actgcaggtg gagccgtcgg acccggcccc 240ttggggaccc gtggcttcct ctccgggtcc aagttccagg ctcccggcag ctggaaggat 300tgctttggag ccccgcctgc tccagacgtc ttgagagcag acaggagcgt gggcgagggc 360tgtcctcaga agctggtgac tgctaacttg ctgcgcttcc tcctgctggt gctcatcccc 420tgcatctgcg ccctcatcgt gctgctggcc atcctgctgt cctttgtggg aacattaaaa 480agggtttatt tcaaatcaaa tgacagtgaa cctttggtca ctgatgggga agctcgagtg 540cctggtgtta ttcctgtaaa tacagtttat tatgagaaca caggggcgcc ctctctgccc 600cccagccagt ccactccagc ctggacaccg agagctcctt ctccagagga ccagagtcac 660aggaacacaa gcacctgcat gaacatcact cacagccagt gtcaaattct gccctaccac 720agcacgttgg cacctctctt gccaattgtc aaaaacatgg acatggagaa gttcctcaag 780ttcttcacgt acctccatcg cctcagttgc tatcaacata tcctgctctt cggctgtagc 840ctcgccttcc ctgagtgcgt tgttgatggc gatgacaggc atggtcttct accctgtaga 900tctttctgtg aggctgcaaa agaaggatgc gaatctgtcc tgggaatggt gaactcctcc 960tggccggatt ccctcagatg ctctcagttt agggaccaca ctgagactaa cagcagtgtc 1020
agaaagagct gcttctcact gcagcaggaa catggaaagc aatcactctg tggagggggc1080gagagcttcc tgtgtaccag cgggctctgc gtccccaaga agctgcagtg taacggctat1140aatgactgtg atgactggag cgacgaggcg cattgcaact gcagcaagga tctgtttcac1200tgtggcacag gcaagtgcct ccactacagc ctcttgtgtg atgggtacga tgactgtggg1260gacccgagtg acgagcaaaa ctgtgattgt aatctcacaa aagagcatcg ctgtggagat1320gggcgctgca ttgcggctga gtgggtgtgc gatggggacc atgactgtgt ggacaagtct1380gatgaggtca actgctcttg tcacagccag ggcctggtgg aatgcacaag tggacagtgc1440atccctagca ccttccagtg tgatggggac gaagactgta aggatgggag tgacgaggag1500aactgcagtg acagtcagac gccatgtcca gaaggagaac agggatgctt tggcagttcc1560tgcgtcgaat cctgtgctgg tagctctctg tgtgactcag acagcagcct gagtaactgc1620agtcaatgtg agcccatcac tttggaactc tgcatgaatt tgctctacaa ccatacacat1680tatccaaatt accttggcca cagaactcaa aaggaagcgt ccatcagctg ggagtcatcc1740cttttccctg cccttgtaca aaccaactgt tacaaatacc tcatgttttt cgcttgcacc1800attttggttc caaagtgtga tgtgaataca ggacaacgca tcccgccttg cagactcctg1860tgtgagcact ccaaagagcg ctgtgagtct gttctgggaa tcgttggcct gcagtggcct1920gaagacaccg actgcaatca atttccagag gaaagttcag acaatcaaac ttgcctcctg1980cccaatgaag atgtggaaga atgctctccg agtcacttca aatgccgctc gggacgatgc2040gttctgggct ccaggagatg tgacggccag gctgactgtg acgacgacag tgacgaggag2100aactgtggtt gtaaagagag agctctttgg gaatgtccat ttaataagca atgtctgaag2160catacattaa tctgcgatgg gtttccagat tgtccagaca gtatggatga aaaaaactgc2220tcattttgcc aagacaatga gctggaatgt gccaaccatg agtgtgtgcc gcgtgacctt2280tggtgcgacg gatgggtcga ctgctcagac agttctgatg aatggggctg tgtgaccctc2340tctaaaaatg ggaactcctc ctcattgctg actgttcaca aatctgcaaa ggaacaccac2400gtgtgtgctg acggctggcg ggagacgttg agtcagctgg cctgcaagca gatgggttta2460ggagaaccgt ctgtgaccaa gctgatccca ggacaggaag gccagcagtg gctgaggttg2520taccccaact gggagaatct caatgggagc accttgcagg agctgctggt atacaggcac2580tcctgcccaa gcagaagtga gatttccctt ctgtgctcca agcaagactg tggccgccgc2640cctgctgccc gaatgaacaa gaggatcctt gggggtcgga ctagtcgtcc tgggaggtgg2700ccgtggcagt gctctctgca gagtgaaccc agtggacata tctgtggctg tgtcctcatt2760gccaagaagt gggtcctgac agttgcccat tgctttgaag ggagagaaga cgctgatgtt2820
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530 535 540Leu Gly His Arg Thr Gln Lys Glu Ala Ser Ile Ser Trp Glu Ser Ser545 550 555 560Leu Phe Pro Ala Leu Val Gln Thr Asn Cys Tyr Lys Tyr Leu Met Phe565 570 575Phe Ala Cys Thr Ile Leu Val Pro Lys Cys Asp Val Asn Thr Gly Gln580 585 590Arg Ile Pro Pro Cys Arg Leu Leu Cys Glu His Ser Lys Glu Arg Cys595 600 605Glu Ser Val Leu Gly Ile Val Gly Leu Gln Trp Pro Glu Asp Thr Asp610 615 620Cys Asn Gln Phe Pro Glu Glu Ser Ser Asp Asn Gln Thr Cys Leu Leu625 630 635 640Pro Asn Glu Asp Val Glu Glu Cys Ser Pro Ser His Phe Lys Cys Arg645 650 655Ser Gly Arg Cys Val Leu Gly Ser Arg Arg Cys Asp Gly Gln Ala Asp660 665 670Cys Asp Asp Asp Ser Asp Glu Glu Asn Cys Gly Cys Lys Glu Arg Ala675 680 685Leu Trp Glu Cys Pro Phe Asn Lys Gln Cys Leu Lys His Thr Leu Ile690 695 700Cys Asp Gly Phe Pro Asp Cys Pro Asp Ser Met Asp Glu Lys Asn Cys705 710 715 720Ser Phe Cys Gln Asp Asn Glu Leu Glu Cys Ala Asn His Glu Cys Val725 730 735Pro Arg Asp Leu Trp Cys Asp Gly Trp Val Asp Cys Ser Asp Ser Ser740 745 750Asp Glu Trp Gly Cys Val Thr Leu Ser Lys Asn Gly Asn Ser Ser Ser755 760 765
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Leu Gln Glu Gly Glu Val Arg Ile Ile Pro Leu Glu Gln Cys Gln101010151020Ser Tyr Phe Asp Met Lys Thr Ile Thr Asn Arg Met Ile Cys Ala102510301035Gly Tyr Glu Ser Gly Thr Val Asp Ser Cys Met Gly Asp Ser Gly104010451050Gly Pro Leu Val Cys Glu Arg Pro Gly Gly Gln Trp Thr Leu Phe105510601065Gly Leu Thr Ser Trp Gly Ser Val Cys Phe Ser Lys Val Leu Gly107010751080Pro Gly Val Tyr Ser Asn Val Ser Tyr Phe Val Gly Trp Ile Glu108510901095Arg Gln Ile Tyr Ile Gln Thr Phe Leu Gln Lys Lys Ser Gln Gly110011051110<210>4<211>1848<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>4Met Arg Arg Gln Trp Gly Ala Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Cys Ala1 5 10 15His Val Leu Pro Thr Cys Ser Pro Leu Asp Phe His Cys Asp Asn Gly20 25 30Lys Cys Ile Arg Arg Ser Trp Val Cys Asp Gly Asp Asn Asp Cys Glu35 40 45Asp Asp Ser Asp Glu Gln Asp Cys Pro Pro Arg Glu Cys Glu Glu Asp50 55 60Glu Phe Pro Cys Gln Asn Gly Tyr Cys Ile Arg Ser Leu Trp His Cys65 70 75 80Asp Gly Asp Asn Asp Cys Gly Asp Asn Ser Asp Glu Gln Cys Asp Met85 90 95
Arg Lys Cys Ser Asp Lys Glu Phe Arg Cys Ser Asp Gly Ser Cys Ile100 105 110Ala Glu His Trp Tyr Cys Asp Gly Asp Thr Asp Cys Lys Asp Gly Ser115 120 125Asp Glu Glu Asn Cys Pro Ser Ala Val Pro Ala Pro Pro Cys Asn Leu130 135 140Glu Glu Phe Gln Cys Ala Tyr Gly Arg Cys Ile Leu Asp Ile Tyr His145 150 155 160Cys Asp Gly Asp Asp Asp Cys Gly Asp Trp Ser Asp Glu Ser Asp Cys165 170 175Cys Glu Tyr Ser Gly Gln Leu Gly Ala Ser His Gln Pro Cys Arg Ser180 185 190Gly Glu Phe Met Cys Asp Ser Gly Leu Cys Ile Asn Ala Gly Trp Arg195 200 205Cys Asp Gly Asp Ala Asp Cys Asp Asp Gln Ser Asp Glu Arg Asn Cys210 215 220Lys Gln Phe Arg Cys His Ser Gly Arg Cys Val Arg Leu Ser Trp Arg225 230 235 240Cys Asp Gly Glu Asp Asp Cys Ala Asp Asn Ser Asp Glu Glu Asn Cys245 250 255Glu Asn Thr Gly Ser Pro Gln Cys Ala Leu Asp Gln Phe Leu Cys Trp260 265 270Asn Gly Arg Cys Ile Gly Gln Arg Lys Leu Cys Asn Gly Val Asn Asp275 280 285Cys Gly Asp Asn Ser Asp Glu Ser Pro Gln Gln Asn Cys Arg Pro Arg290 295 300Thr Gly Glu Glu Asn Cys Asn Val Asn Asn Gly Gly Cys Ala Gln Lys305 310 315 320Cys Gln Met Val Arg Gly Ala Val Gln Cys Thr Cys His Thr Gly Tyr325 330335
Arg Leu Thr Glu Asp Gly His Thr Cys Gln Asp Val Asn Glu Cys Ala340 345 350Glu Glu Gly Tyr Cys Ser Gln Gly Cys Thr Asn Ser Glu Gly Ala Phe355 360 365Gln Cys Trp Cys Glu Thr Gly Tyr Glu Leu Arg Pro Asp Arg Arg Ser370 375 380Cys Lys Ala Leu Gly Pro Glu Pro Val Leu Leu Phe Ala Asn Arg Ile385 390 395 400Asp Ile Arg Gln Val Leu Pro His Arg Ser Glu Tyr Thr Leu Leu Leu405 410 415Asn Asn Leu Glu Asn Ala Ile Ala Leu Asp Phe His His Arg Arg Glu420 425 430Leu Val Phe Trp Ser Asp Val Thr Leu Asp Arg Ile Leu Arg Ala Asn435 440 445Leu Asn Gly Ser Ash Val Glu Glu Val Val Ser Thr Gly Leu Glu Ser450 455 460Pro Gly Gly Leu Ala Val Asp Trp Val His Asp Lys Leu Tyr Trp Thr465 470 475 480Asp Ser Gly Thr Ser Arg Ile Glu Val Ala Asn Leu Asp Gly Ala His485 490 495Arg Lys Val Leu Leu Trp Gln Asn Leu Glu Lys Pro Arg Ala Ile Ala500 505 510Leu His Pro Met Glu Gly Thr Ile Tyr Trp Thr Asp Trp Gly Asn Thr515 520 525Pro Arg Ile Glu Ala Ser Ser Met Asp Gly Ser Gly Arg Arg Ile Ile530 535 540Ala Asp Thr His Leu Phe Trp Pro Asn Gly Leu Thr Ile Asp Tyr Ala545 550 555 560Gly Arg Arg Met Tyr Trp Val Asp Ala Lys His His Val Ile Glu Arg
565 570 575Ala Asn Leu Asp Gly Ser His Arg Lys Ala Val Ile Ser Gln Val Phe580 585 590Glu Asp Ser Leu Tyr Trp Thr Asp Trp His Thr Lys Ser Ile Asn Ser595 600 605Ala Asn Lys Phe Thr Gly Lys Asn Gln Glu Ile Ile Arg Asn Lys Leu610 615 620His Phe Pro Met Asp Ile His Thr Leu His Pro Gln Arg Gln Pro Ala625 630 635 640Gly Lys Asn Arg Cys Gly Asp Asn Asn Gly Gly Cys Thr His Leu Cys645 650 655Leu Pro Ser Gly Gln Asn Tyr Thr Cys Ala Cys Pro Thr Gly Phe Arg660 665 670Lys Ile Ser Ser His Ala Cys Ala Gln Ser Leu Asp Lys Phe Leu Leu675 680 685Phe Ala Arg Arg Met Asp Ile Arg Arg Ile Ser Phe Asp Thr Glu Asp690 695 700Leu Ser Asp Asp Val Ile Pro Leu Ala Asp Val Arg Ser Ala Val Ala705 710 715 720Leu Asp Trp Asp Ser Arg Asp Asp His Val Tyr Trp Thr Asp Val Ser725 730 735Thr Asp Thr Ile Ser Arg Ala Lys Trp Asp Gly Thr Gly Gln Glu Val740 745 750Val Val Asp Thr Ser Leu Glu Ser Pro Ala Gly Leu Ala Ile Asp Trp755 760 765Val Thr Asn Lys Leu Tyr Trp Thr Asp Ala Gly Thr Asp Arg Ile Glu770 775 780Val Ala Asn Thr Asp Gly Ser Met Arg Thr Val Leu Ile Trp Glu Asn785 790 795 800
Leu Asp Arg Pro Arg Asp Ile Val Val Glu Pro Met Gly Gly Tyr Met805 810 815Tyr Trp Thr Asp Trp Gly Ala Ser Pro Lys Ile Glu Arg Ala Gly Met820 825 830Asp Ala Ser Gly Arg Gln Val Ile Ile Ser Ser Asn Leu Thr Trp Pro835 840 845Asn Gly Leu Ala Ile Asp Tyr Gly Ser Gln Arg Leu Tyr Trp Ala Asp850 855 860Ala Gly Met Lys Thr Ile Glu Phe Ala Gly Leu Asp Gly Ser Lys Arg865 870 875 880Lys Val Leu Ile Gly Ser Gln Leu Pro His Pro Phe Gly Leu Thr Leu885 890 895Tyr Gly Glu Arg Ile Tyr Trp Thr Asp Trp Gln Thr Lys Ser Ile Gln900 905 910Ser Ala Asp Arg Leu Thr Gly Leu Asp Arg Glu Thr Leu Gln Glu Asn915 920 925Leu Glu Asn Leu Met Asp Ile His Val Phe His Arg Arg Arg Pro Pro930 935 940Val Ser Thr Pro Cys Ala Met Glu Asn Gly Gly Cys Ser His Leu Cys945 950 955 960Leu Arg Ser Pro Asn Pro Ser Gly Phe Ser Cys Thr Cys Pro Thr Gly965 970 975Ile Asn Leu Leu Ser Asp Gly Lys Thr Cys Ser Pro Gly Met Asn Ser980 985 990Phe Leu Ile Phe Ala Arg Arg Ile Asp Ile Arg Met Val Ser Leu Asp995 10001005Ile Pro Tyr Phe Ala Asp Val Val Val Pro Ile Asn Ile Thr Met101010151020Lys Asn Thr Ile Ala Ile Gly Val Asp Pro Gln Glu Gly Lys Val102510301035
Tyr Trp Ser Asp Ser Thr Leu His Arg Ile Ser Arg Ala Asn Leu104010451050Asp Gly Ser Gln His Glu Asp Ile Ile Thr Thr Gly Leu Gln Thr105510601065Thr Asp Gly Leu Ala Val Asp Ala Ile Gly Arg Lys Val Tyr Trp107010751080Thr Asp Thr Gly Thr Asn Arg Ile Glu Val Gly Asn Leu Asp Gly108510901095Ser Met Arg Lys Val Leu Val Trp Gln Asn Leu Asp Ser Pro Arg110011051110Ala Ile Val Leu Tyr His Glu Met Gly Phe Met Tyr Trp Thr Asp111511201125Trp Gly Glu Asn Ala Lys Leu Glu Arg Ser Gly Met Asp Gly Ser113011351140Asp Arg Ala Val Leu Ile Asn Asn Asn Leu Gly Trp Pro Asn Gly114511501155Leu Thr Val Asp Lys Ala Ser Ser Gln Leu Leu Trp Ala Asp Ala116011651170His Thr Glu Arg Ile Glu Ala Ala Asp Leu Asn Gly Ala Asn Arg117511801185His Thr Leu Val Ser Pro Val Gln His Pro Tyr Gly Leu Thr Leu119011951200Leu Asp Ser Tyr Ile Tyr Trp Thr Asp Trp Gln Thr Arg Ser Ile120512101215His Arg Ala Asp Lys Gly Thr Gly Ser Asn Val Ile Leu Val Arg122012251230Ser Asn Leu Pro Gly Leu Met Asp Met Gln Ala Val Asp Arg Ala123512401245Gln Pro Leu Gly Phe Asn Lys Cys Gly Ser Arg Asn Gly Gly Cys125012551260
Ser His Leu Cys Leu Pro Arg Pro Ser Gly Phe Ser Cys Ala Cys126512701275Pro Thr Gly Ile Gln Leu Lys Gly Asp Gly Lys Thr Cys Asp Pro128012851290Ser Pro Glu Thr Tyr Leu Leu Phe Ser Ser Arg Gly Ser Ile Arg129513001305Arg Ile Ser Leu Asp Thr Ser Asp His Thr Asp Val His Val Pro131013151320Val Pro Glu Leu Asn Asn Val Ile Ser Leu Asp Tyr Asp Ser Val132513301335Asp Gly Lys Val Tyr Tyr Thr Asp Val Phe Leu Asp Val Ile Arg134013451350Arg Ala Asp Leu Asn Gly Ser Asn Met Glu Thr Val Ile Gly Arg135513601365Gly Leu Lys Thr Thr Asp Gly Leu Ala Val Asp Trp Val Ala Arg137013751380Asn Leu Tyr Trp Thr Asp Thr Gly Arg Asn Thr Ile Glu Ala Ser138513901395Arg Leu Asp Gly Ser Cys Arg Lys Val Leu Ile Asn Asn Ser Leu140014051410Asp Glu Pro Arg Ala Ile Ala Val Phe Pro Arg Lys Gly Tyr Leu141514201425Phe Trp Thr Asp Trp Gly His Ile Ala Lys Ile Glu Arg Ala Asn143014351440Leu Asp Gly Ser Glu Arg Lys Val Leu Ile Asn Thr Asp Leu Gly144514501455Trp Pro Asn Gly Leu Thr Leu Asp Tyr Asp Thr Arg Arg Ile Tyr146014651470Trp Val Asp Ala His Leu Asp Arg Ile Glu Ser Ala Asp Leu Asn
147514801485Gly Lys Leu Arg Gln Val Leu Val Ser His Val Ser His Pro Phe149014951500Ala Leu Thr Gln Gln Asp Arg Trp Ile Tyr Trp Thr Asp Trp Gln150515101515Thr Lys Ser Ile Gln Arg Val Asp Lys Tyr Ser Gly Arg Asn Lys152015251530Glu Thr Val Leu Ala Asn Val Glu Gly Leu Met Asp Ile Ile Val153515401545Val Ser Pro Gln Arg Gln Thr Gly Thr Asn Ala Cys Gly Val Asn155015551560Asn Gly Gly Cys Thr His Leu Cys Phe Ala Arg Ala Ser Asp Phe156515701575Val Cys Ala Cys Pro Asp Glu Pro Asp Ser Arg Pro Cys Ser Leu158015851590Val Pro Gly Leu Val Pro Pro Ala Pro Arg Ala Thr Gly Met Ser159516001605Glu Lys Ser Pro Val Leu Pro Asn Thr Pro Pro Thr Thr Leu Tyr161016151620Ser Ser Thr Thr Arg Thr Arg Thr Ser Leu Glu Glu Val Glu Gly1625 16301635Arg Cys Ser Glu Arg Asp Ala Arg Leu Gly Leu Cys Ala Arg Ser164016451650Asn Asp Ala Val Pro Ala Ala Pro Gly Glu Gly Leu His Ile Ser165516601665Tyr Ala Ile Gly Gly Leu Leu Ser Ile Leu Leu Ile Leu Val Val167016751680Ile Ala Ala Leu Met Leu Tyr Arg His Lys Lys Ser Lys Phe Thr168516901695
Asp Pro Gly Met Gly Asn Leu Thr Tyr Ser Asn Pro Ser Tyr Arg170017051710Thr Ser Thr Gln Glu Val Lys Ile Glu Ala Ile Pro Lys Pro Ala171517201725Met Tyr Asn Gln Leu Cys Tyr Lys Lys Glu Gly Gly Pro Asp His173017351740Asn Tyr Thr Lys Glu Lys Ile Lys Ile Val Glu Gly Ile Cys Leu174517501755Leu Ser Gly Asp Asp Ala Glu Trp Asp Asp Leu Lys Gln Leu Arg176017651770Ser Ser Arg Gly Gly Leu Leu Arg Asp His Val Cys Met Lys Thr177517801785Asp Thr Val Ser Ile Gln Ala Ser Ser Gly Ser Leu Asp Asp Thr179017951800Glu Thr Glu Gln Leu Leu Gln Glu Glu Gln Ser Glu Cys Ser Ser180518101815Val His Thr Ala Ala Thr Pro Glu Arg Arg Gly Ser Leu Pro Asp182018251830Thr Gly Trp Lys His Glu Arg Lys Leu Ser Ser Glu Ser Gln Val183518401845<210>5<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的銜接子序列<400>5cagctccaca acctacatca ttccgt 26<210>6<211>12<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的銜接子序列<400>6acggaatgat gt 12<210>7<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的銜接子序列<400>7gtccatcttc tctctgagac tctggt 26<210>8<211>12<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的銜接子序列<400>8accagagtct ca 12<210>9<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的銜接子序列<400>9ctgatgggtg tcttctgtga gtgtgt 26<210>10<211>12<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的銜接子序列<400>10acacactcac ag 12<210>11<211>26<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>人工合成的銜接子序列<400>11ccagcatcga gaatcagtgt gacagt 26<210>12<211>12<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的銜接子序列<400>12actgtcacac tg 12<210>13<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的銜接子序列<400>13gtcgatgaac ttcgactgtc gatcgt 26<210>14<211>12<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的銜接子序列<400>14acgatcgaca gt 12<210>15<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>15tagtctacca ctgctcgact gtaacg 26<210>16<211>26<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列<400>16cagagtgaac ccagtggaca tatctg 26<210>17<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>17gttcccaagg aaagtgtcag agttgg 26<210>18<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>18gaagctggaa agcctccagg tgttcc 26<210>19<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>19ctccgagcag acaccatgac cttagc 26<210>20<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>20aggagtaggg cttgtctccc aacctg 26<210>21<211>26<212>DNA
<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>21cactcctgtg tctagctgcc agatgc 26<210>22<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>22agtgcgaaca ccgtagtgct gacagg 26<210>23<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>23gatgaagaag aaggagcaga gtcagg 26<210>24<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>24attcacttgc tctgactcca ggttgg 26<210>25<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>25ccatgatctt tcccctctgg cttctg 26<210>26<211>26
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>26tttggctgga aagggtgact ctgagg 26<210>27<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>27tgctctcacc atccagatga ctcacc 26<210>28<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>28tggaccatat ctgctgcaac tggtcc 26<210>29<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>29tccagcagat gcaagaactc tcctcc 26<210>30<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>30ttatggagcg gagcagcatt ccaagg 2權(quán)利要求
1.多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞標(biāo)志物多核苷酸探針，其包含選自以下(1)到(5)的堿基序列中的序列(1)與SEQ ID NO1或2的堿基序列互補的堿基序列；(2)與編碼SEQ ID NO3或4的氨基酸序列的堿基序列互補的堿基序列；(3)與編碼在SEQ ID NO3或4的氨基酸序列中缺失跨膜區(qū)的序列的堿基序列互補的堿基序列；(4)在嚴(yán)緊條件下與由SEQ ID NO1或2的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸雜交的堿基序列；(5)包含上述(1)-(4)的序列中至少15個連續(xù)的堿基的堿基序列。
2.選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞的方法，該方法包括使被認(rèn)為含有多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞的細胞樣品與權(quán)利要求1的多核苷酸探針相接觸的步驟。
3.選擇多巴胺能神經(jīng)元系細胞的方法，包括以下步驟采用權(quán)利要求2的選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞的方法選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞；培養(yǎng)在上述(1)中選出的增殖祖細胞；利用分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元的標(biāo)志物對上述(2)中培養(yǎng)的細胞進行篩選。
4.采用權(quán)利要求2的方法選擇出的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞。
5.分離多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞特異性基因及從增殖祖細胞到多巴胺能神經(jīng)元的各成熟階段的特異性基因的方法，該方法包括使用權(quán)利要求4的增殖祖細胞或者由該增殖祖細胞經(jīng)分化、誘導(dǎo)或增殖所得的細胞，檢測、分離在該細胞中特異性表達的基因的步驟。
6.以成熟為指標(biāo)篩選調(diào)節(jié)多巴胺能神經(jīng)元系細胞的增殖及/或分化的化合物的方法，該方法包括使被檢驗物質(zhì)與權(quán)利要求4的增殖祖細胞或者由該增殖祖細胞經(jīng)分化、誘導(dǎo)或增殖而得的細胞相接觸的步驟，以及檢測由接觸所引起的增殖祖細胞或祖細胞的變化的步驟。
7.針對選自以下(1)-(6)的多肽的抗體(1)由SEQ ID NO1或2的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸所編碼的多肽；(2)包含SEQ ID NO3或4的氨基酸序列的多肽；(3)包含在SEQ ID NO3或4的氨基酸序列中缺失跨膜區(qū)的氨基酸序列的多肽；(4)包含在SEQ ID NO3或4的氨基酸序列中發(fā)生一個或數(shù)個氨基酸缺失、插入、替換或添加的氨基酸序列的多肽；(5)由可在嚴(yán)緊條件下與由SEQ ID NO1或2的堿基序列的互補序列構(gòu)成的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼的多肽；(6)作為上述(1)-(5)的多肽的片段，且至少具有8個氨基酸殘基的多肽。
8.權(quán)利要求7的抗體，其由雜交瘤FERM BP-10315或FERM BP-10316產(chǎn)生。
9.多巴胺能神經(jīng)元祖細胞標(biāo)志物抗體，其包含權(quán)利要求7或8的抗體。
10.選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的方法，該方法包括使被認(rèn)為含有多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的細胞樣品與權(quán)利要求7-9任一項的抗體接觸的步驟。
11.選擇多巴胺能神經(jīng)元系細胞的方法，包括下列步驟采用權(quán)利要求10的方法選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細胞；培養(yǎng)在上述(1)中選出的祖細胞；使用分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元的標(biāo)志物對上述(2)中培養(yǎng)的祖細胞進行篩選。
12.采用權(quán)利要求10的方法選擇出的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞。
13.分離多巴胺能神經(jīng)元祖細胞特異性基因及從祖細胞到多巴胺能神經(jīng)元的各成熟階段的特異性基因的方法，該方法包括使用權(quán)利要求12的祖細胞或者由該祖細胞經(jīng)分化、誘導(dǎo)或增殖所得的細胞檢測、分離在該細胞中特異性表達的基因的步驟。
14.以成熟為指標(biāo)篩選調(diào)節(jié)多巴胺能神經(jīng)元系細胞的增殖及/或分化的化合物的方法，該方法包括使被檢驗物質(zhì)與權(quán)利要求12的祖細胞或者由該祖細胞經(jīng)分化、誘導(dǎo)或增殖而得的細胞相接觸的步驟、以及檢測由接觸所引起的祖細胞的分化或增殖的步驟。
15.用于治療帕金森病的試劑盒，其含有權(quán)利要求4的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞或權(quán)利要求12的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞。
16.帕金森病的治療方法，其中向患者腦內(nèi)移植權(quán)利要求4的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞或權(quán)利要求12的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞。
17.權(quán)利要求4的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞或權(quán)利要求12的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞在制造用于治療帕金森病的試劑盒中的用途。
18.檢測或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞的方法，該方法包括使第二多核苷酸與含有多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞的細胞樣品相接觸的步驟，其中所述第二多核苷酸可在嚴(yán)緊條件下與由以下(1)-(4)任意一項的堿基序列構(gòu)成的第一多核苷酸雜交(1)SEQ ID NO1或2的堿基序列；(2)由編碼由SEQ ID NO3或4的氨基酸序列所構(gòu)成的多肽的多核苷酸構(gòu)成的堿基序列；(3)由編碼由在SEQ ID NO3或4的氨基酸序列中缺失跨膜區(qū)的序列構(gòu)成的多肽的多核苷酸構(gòu)成的堿基序列；(4)由可在嚴(yán)緊條件下與由SEQ ID NO1或2的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸雜交的多核苷酸構(gòu)成的堿基序列。
19.權(quán)利要求18的方法，其中第二多核苷酸至少長15個堿基。
20.采用權(quán)利要求18或19的方法選擇出的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞群體。
21.用于識別多巴胺能增殖祖細胞的試劑，其含有第二多核苷酸作為有效成分，所述第二多核苷酸可在嚴(yán)緊條件下與由以下(1)-(4)任意一項的堿基序列構(gòu)成的第一多核苷酸雜交(1)SEQ ID NO1或2的堿基序列；(2)由編碼由SEQ ID NO3或4的氨基酸序列所構(gòu)成的多肽的多核苷酸構(gòu)成的堿基序列；(3)由編碼包含在SEQ ID NO3或4的氨基酸序列中缺失跨膜區(qū)的序列的多肽的多核苷酸構(gòu)成的堿基序列；(4)由可在嚴(yán)緊條件下與由序列編號1或2的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸雜交的多核苷酸構(gòu)成的堿基序列。
22.權(quán)利要求21的試劑，其第二多核苷酸的長度至少為15個堿基。
23.生產(chǎn)分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元前體細胞的方法，該方法包括以下(1)-(3)的步驟(1)采用權(quán)利要求18或19的方法選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞；(2)培養(yǎng)步驟(1)中選擇出的細胞；(3)從步驟(2)培養(yǎng)的細胞中選擇分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元前體細胞。
24.產(chǎn)生多巴胺能神經(jīng)元的方法，該方法包括以下(1)-(2)的步驟(1)采用權(quán)利要求18或19的方法選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞；(2)培養(yǎng)步驟(1)中選擇出的細胞。
25.權(quán)利要求24的方法，其還包括從步驟(2)培養(yǎng)的細胞中進一步選擇多巴胺能神經(jīng)元的步驟(3)。
26.檢測或選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的方法，該方法包括使與由以下(1)-(4)任意一項的氨基酸序列或其部分序列構(gòu)成的多肽結(jié)合的抗體與含有多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的細胞樣品相接觸的步驟(1)SEQ ID NO3或4的氨基酸序列；(2)在SEQ ID NO3或4的氨基酸序列中缺失跨膜區(qū)的氨基酸序列；(3)在SEQ ID NO3或4的氨基酸序列中發(fā)生一個或數(shù)個氨基酸缺失、替換或添加，或者其組合而變異的氨基酸序列；(4)由可在嚴(yán)緊條件下與由SEQ ID NO1或2的堿基序列的互補序列構(gòu)成的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼的多肽構(gòu)成的氨基酸序列。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述由部分序列構(gòu)成的多肽具有至少6個連續(xù)的氨基酸殘基。
28.采用權(quán)利要求26或27的方法選擇出的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞群體。
29.權(quán)利要求28的細胞群體，其中在全體細胞中含有不少于40％的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞。
30.用于識別多巴胺能神經(jīng)元祖細胞的試劑，含有可與由以下(1)-(4)任意一項的氨基酸序列或其部分序列構(gòu)成的多肽結(jié)合的抗體作為有效成分(1)SEQ ID NO3或4的氨基酸序列；(2)在SEQ ID NO3或4的氨基酸序列中缺失跨膜區(qū)的氨基酸序列；(3)在SEQ ID NO3或4的氨基酸序列中發(fā)生一個或數(shù)個氨基酸缺失、替換或添加，或者其組合而變異的氨基酸序列；(4)由多核苷酸編碼的多肽構(gòu)成的氨基酸序列，所述多核苷酸可在嚴(yán)緊條件下與由SEQ ID NO1或2的堿基序列的互補序列構(gòu)成的多核苷酸雜交。
3 1.權(quán)利要求30的試劑，其中由部分序列構(gòu)成的多肽至少具有連續(xù)的6個氨基酸殘基。
32.權(quán)利要求30的試劑，其中抗體是由雜交瘤FERM BP-10315或FERM BP-10316產(chǎn)生的抗體。
33.由雜交瘤FERM BP-10315或FERM BP-10316產(chǎn)生的抗體。
34.生產(chǎn)多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞的方法，該方法包括以下(1)-(2)的步驟(1)采用權(quán)利要求26或27的方法選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細胞；(2)除去分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元前體細胞，選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞。
35.生產(chǎn)分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元前體細胞的方法，該方法包括以下(1)-(2)的步驟(1)采用權(quán)利要求26或27的方法選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細胞；(2)培養(yǎng)步驟(1)中選擇出的細胞。
36.權(quán)利要求35的方法，進一步包括從步驟(2)培養(yǎng)的細胞中選擇分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元前體細胞的步驟(3)。
37.生產(chǎn)多巴胺能神經(jīng)元的方法，該方法包括以下(1)-(2)的步驟(1)采用權(quán)利要求26或27的方法選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細胞；(2)培養(yǎng)步驟(1)中選擇出的細胞。
38.權(quán)利要求37的方法，進一步包括從步驟(2)培養(yǎng)的細胞中選擇多巴胺能神經(jīng)元的步驟(3)。
39.用于治療神經(jīng)變性疾病的試劑盒，其至少含有一種選自下列的細胞(1)權(quán)利要求20的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞群體；(2)采用權(quán)利要求23的方法生產(chǎn)的分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元前體細胞；(3)采用權(quán)利要求24的方法生產(chǎn)的多巴胺能神經(jīng)元；(4)采用權(quán)利要求25的方法生產(chǎn)的多巴胺能神經(jīng)元；(5)權(quán)利要求28的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞群體；(6)權(quán)利要求29的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞群體；(7)采用權(quán)利要求34的方法生產(chǎn)的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞；(8)采用權(quán)利要求35的方法生產(chǎn)的分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元前體細胞；(9)采用權(quán)利要求36的方法生產(chǎn)的分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元前體細胞；(10)采用權(quán)利要求37的方法生產(chǎn)的多巴胺能神經(jīng)元；(11)采用權(quán)利要求38的方法生產(chǎn)的多巴胺能神經(jīng)元。
40.權(quán)利要求39的試劑盒，其中神經(jīng)變性疾病為帕金森病。
41.神經(jīng)變性疾病的治療方法，其中在患者腦內(nèi)移植至少一種選自下列的細胞(1)權(quán)利要求20的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞群體；(2)采用權(quán)利要求23的方法生產(chǎn)的分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元前體細胞；(3)采用權(quán)利要求24的方法生產(chǎn)的多巴胺能神經(jīng)元；(4)采用權(quán)利要求25的方法生產(chǎn)的多巴胺能神經(jīng)元；(5)權(quán)利要求28的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞群體；(6)權(quán)利要求29的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞群體；(7)采用權(quán)利要求34的方法生產(chǎn)的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞；(8)采用權(quán)利要求35的方法生產(chǎn)的分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元前體細胞；(9)采用權(quán)利要求36的方法生產(chǎn)的分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元前體細胞；(10)采用權(quán)利要求37的方法生產(chǎn)的多巴胺能神經(jīng)元；(11)采用權(quán)利要求38的方法生產(chǎn)的多巴胺能神經(jīng)元。
42.權(quán)利要求41的方法，其中神經(jīng)變性疾病為帕金森病。
43.選自下列的至少一種細胞在生產(chǎn)用于治療神經(jīng)變性疾病的試劑盒中的用途(1)權(quán)利要求20的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞群體；(2)采用權(quán)利要求23的方法生產(chǎn)的分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元前體細胞；(3)采用權(quán)利要求24的方法生產(chǎn)的多巴胺能神經(jīng)元；(4)采用權(quán)利要求25的方法生產(chǎn)的多巴胺能神經(jīng)元；(5)權(quán)利要求28的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞群體；(6)權(quán)利要求29的多巴胺能神經(jīng)元祖細胞群體；(7)采用權(quán)利要求34的方法生產(chǎn)的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細胞；(8)采用權(quán)利要求35的方法生產(chǎn)的分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元前體細胞；(9)采用權(quán)利要求36的方法生產(chǎn)的分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元前體細胞；(10)采用權(quán)利要求37的方法生產(chǎn)的多巴胺能神經(jīng)元；(11)采用權(quán)利要求38的方法生產(chǎn)的多巴胺能神經(jīng)元。
44.權(quán)利要求43的用途，其中神經(jīng)變性疾病為帕金森病。
全文摘要
本發(fā)明提供用于檢測Lrp4/Corin多巴胺能祖細胞標(biāo)志物的多核苷酸探針和抗體，使用該探針和抗體可高效地分離多巴胺能祖細胞；還涉及使用它們分離祖細胞的方法。使用該Lrp4在細胞中的表達作為指標(biāo)，可以選擇在安全性、生存率和網(wǎng)絡(luò)形成能力上適用于神經(jīng)變性疾病包括帕金森病的移植治療的細胞。
文檔編號G01N33/53GK101027390SQ20058003191
公開日2007年8月29日 申請日期2005年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月22日
發(fā)明者坂本佳正, 尾野雄一, 今井俊夫, 中川康子 申請人:衛(wèi)材株式會社