專利名稱：一個(gè)新的多巴胺能神經(jīng)元保護(hù)因子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體的本發(fā)明涉及一個(gè)新的多巴胺能神經(jīng)元保護(hù)因子——賽斯達(dá)廷C(cystatin C)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是當(dāng)今社會(huì)一種較為常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，該病好發(fā)于中老年，在美國(guó)，所有人群平均發(fā)病率約為1‰，而60歲以上的發(fā)病率則為1％。在我國(guó)，該病的發(fā)病率因人口老化等因素發(fā)病率與西方國(guó)家相似，并有逐漸上升的趨勢(shì)。帕金森病病人自主運(yùn)動(dòng)的能力逐漸喪失，出現(xiàn)包括震顫、強(qiáng)直、動(dòng)作遲緩等多種臨床癥狀，病理特征為黑質(zhì)致密帶多巴胺能(Dopaminergic，DA)神經(jīng)元退行性病變，在殘余的黑質(zhì)神經(jīng)元出現(xiàn)嗜酸特性的Lewy小體。DA神經(jīng)元的死亡導(dǎo)致紋狀體多巴胺的嚴(yán)重枯竭(OlanowCW，Tatton，WG，Etiology and pathogenesis of Parkinson disease.1999，Annu.Rev.Neurosci.22123-44；Blandini F，Nappi G，Tassorelli C，et al.Functional changesof the basal ganglia circuitry in Parkinson’s disease.2000，Prog.Neurobiol.，6263-88)。
迄今為止，國(guó)內(nèi)外神經(jīng)科學(xué)界對(duì)它的發(fā)生機(jī)理的研究雖然已取得顯著進(jìn)展，但仍然缺乏完整的了解，在治療方面，除緩解病人癥狀的一些方法外，更是缺乏根本而有效的手段。目前，人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到帕金森病的神經(jīng)退行性變化的進(jìn)程是可以延緩的。有資料顯示，在約60-70％黑質(zhì)DA神經(jīng)元死亡后，帕金森病的臨床癥狀才會(huì)出現(xiàn)，表明黑質(zhì)——紋狀體系統(tǒng)的巨大的可塑性和功能上的代償能力，因此，如能有效減緩帕金森病退行性變化的進(jìn)程和/或增強(qiáng)剩余多巴胺能神經(jīng)元的功能，就有可能顯著改善臨床癥狀，從而提高患者的生活質(zhì)量。從這一點(diǎn)出發(fā)，找到能有效保護(hù)中腦多巴胺能神經(jīng)元的因子不失為一種有較大應(yīng)用前景的治療方法。
目前，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種與保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元相關(guān)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，如膠質(zhì)細(xì)胞源性的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)及其家族的其它因子等等，它們均在各種實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證中顯示出促進(jìn)和保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元的特性(Airaksinen MS，Saarma M，The GDNF familysignaling，biological functions and therapeutic value，2002 Nature Review Neuroscience 3；383-394)。但是，它們的這種作用只是部分有效。一般認(rèn)為，要達(dá)到更高水平的細(xì)胞保護(hù)，需要多個(gè)因子的聯(lián)合使用才能實(shí)現(xiàn)。另一方面，隨著對(duì)帕金森病發(fā)病機(jī)理認(rèn)識(shí)的提高，包括線粒體損傷、氧化應(yīng)激(ROS)、谷氨酸毒性、遺傳因子和細(xì)胞凋亡等被認(rèn)為與帕金森病的發(fā)生有非常密切的關(guān)系(Olanow CW，Tatton WG，Etiology and pathogenesis of Parkinson’sdisease.1999，Annu.Rev.Neurosci.22123-44)，表明帕金森病致病機(jī)制的多樣性和復(fù)雜性。由于帕金森病的發(fā)生可能同時(shí)涉及到上述多個(gè)各自獨(dú)立的因素，因此，同時(shí)阻斷疾病發(fā)生的各個(gè)環(huán)節(jié)才能有效控制其發(fā)展，從而達(dá)到最佳的治療效果。因此，目前迫切需要研究新的能有效保護(hù)多巴胺神經(jīng)元的分子，并且品種應(yīng)是越多越好，以盡可能適應(yīng)臨床實(shí)踐的需要。
已有的研究表明，6-羥基多巴胺(6-OHDA)所導(dǎo)致的帕金森病大鼠模型及帕金森病病人的紋狀體的抽提物均有促進(jìn)體外培養(yǎng)的腹側(cè)中腦多巴胺能神經(jīng)元存活的作用(Zhou J，Shen Y，Tang Z，Xu L.et al.Striatal extracts promote the survival and phenotypic expressionof rat fetal dopaminergic neurons in vitro.2000，Neurosci.Lett.2925-8)。在該大鼠模型的紋狀體內(nèi)，膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)家族中的多個(gè)分子，如GDNF，neurturin，persephin，artemin的mRNA表達(dá)水平顯著上升，提示黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的死亡可導(dǎo)致去神經(jīng)支配的紋狀體內(nèi)一些因子的mRNA水平的顯著提高(Zhou J，Yu，Y，Tang，Z，Shen Y and Xu L.Differential expression of mRNAs of GDNF family in the striatumfollowing 6-OHDA-induced lesion.2000，Neuroreport，113289-3293)，并且這些因子中的一部分已被他人證實(shí)與神經(jīng)保護(hù)有關(guān)，由于它們可能只是一群有神經(jīng)保護(hù)作用分子中的一部分，因此，詳細(xì)研究這群因子有助于建立和開發(fā)與帕金森病相關(guān)的創(chuàng)新性治療方法。
有鑒于此，我們通過抑制消減雜交的方法獲得一系列在大鼠帕金森病模型紋狀體中差異表達(dá)基因的克隆。賽斯達(dá)廷C(cystatin C，簡(jiǎn)稱CYSC)是其中的一個(gè)。該基因在GenBank的登錄號(hào)是X05607。
CYSC是賽斯達(dá)廷超家族II類家族中的一個(gè)成員，具有抑制半胱氨酸蛋白酶(cysteineprotease)的作用。人源的II型賽斯達(dá)廷超家族包括賽斯達(dá)廷C，D，S，SN，以及近來發(fā)現(xiàn)的E/M和F，它們都位于20號(hào)染色體的賽斯達(dá)廷多基因位點(diǎn)。人源CYSC成熟蛋白含120個(gè)氨基酸，起初合成的前體蛋白含26個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。它是半胱氨酸蛋白酶papain，cathepsin B，H，L和S等的抑制劑(Mason RW，Johnson DA，Barrett AJ，Chapman HA.Elastinolytic activity of human cathepsin L，1986，Biochem J.233925-7；BaricosWH，Zhou YW，F(xiàn)uerst RS，Barrett AJ，Shah SV.The role of aspartic and cysteineproteinases in albumin degradation by rat kidney cortical lysosomes.1987，ArchBiochem Biophys.256687-91；Turk D，Podobnik M，Kuhelj R，Dolinar M，Turk V.Crystalstructures of human procathepsin B at 3.2 and 3.3 Angstroms resolution reveal aninteraction motif between a papain-like cysteine protease and its propeptide.1996，F(xiàn)EBS Lett.384211-4)。
最近的結(jié)果還顯示，CYSC是堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖時(shí)的輔助因子(Taupin P，Ray J，F(xiàn)ischer WH，Suhr ST，Hakansson K，Grubb A，Gage FH.FGF-2-responsiveneural stem cell proliferation requires CCg，a novel autocrine/paracrine cofactor.2000，Neuron.28385-97)，并且CYSC的這一作用需要CYSC的糖基化才能實(shí)現(xiàn)。
CYSC廣泛分布于各種組織，包括體液中，如尿液、血液和腦脊液(Barrett AJ，Davies ME，Grubb A，The place of human gamma-trace(cystatin C)amongst the cysteine proteinaseinhibitors.1984，Biochem Biophys Res Commun.120631-6；Moller CA，Lofberg H，GrubbAO，Olsson SO，Davies ME，Barrett AJ.Distribution of cystatin C(gamma-trace)，aninhibitor of lysosomal cysteine proteinases，in the anterior lobe of simian and humanpituitary glands.1985，Neuroendocrinology 41400-4)。有報(bào)道表明，CYSC可能參與腦損傷和大腦疾病的某些過程。如在短暫的腦缺血模型中，海馬中的錐體細(xì)胞和活躍的星型膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)有特定的上調(diào)表達(dá)模式(Palm DE，Knuckey NW，Primiano MJ，Spangenberger AG，Johanson CE.Cystatin C，a protease inhibitor，in degenerating rat hippocampalneurons following transient forebrain ischemia.1995，Brain Res.6911-8)，而且氧化應(yīng)激反應(yīng)也能使體外培養(yǎng)的神經(jīng)元表達(dá)CYSC的水平升高(Nishio C，Yoshida K，Nishiyama K，Hatanaka H，Yamada M.Involvement of cystatin C in oxidativestress-induced apoptosis of cultured rat CNS neurons.2000，Brain Res.873252-62)，提示CYSC參與了由氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。CYSC在去內(nèi)嗅皮層支配海馬的過程中可能參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后神經(jīng)可塑性的過程(Ying GX，Huang C，Jiang ZH，Liu X，JingNH，Zhou CF.Up-regulation of cystatin C expression in the murine hippocampusfollowing perforant path transections.2002 Neuroscience 112289-98)。最近還有資料顯示，在老年性癡呆病人的腦脊液中，CYSC的水平較對(duì)照組高(Levy E，Sastre M，KumarA，Gallo G，Piccardo P，Ghetti B，Tagliavini F，Codeposition of cystatin C withamyloid-beta protein in the brain of Alzheimer’s disease patients.2001，JNeuropathol Exp Neurol.6094-104)。上述資料提示CYSC與中樞神經(jīng)系統(tǒng)有密切的關(guān)系，它可能參與了大腦神經(jīng)元的退行性病變過程。但CYSC在這些病理?xiàng)l件下的確切功能和意義還不清楚，也沒有資料提示它與帕金森病或多巴胺能神經(jīng)元有任何關(guān)聯(lián)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的就是提供一種新的利用CYSC治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病尤其是帕金森病的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供CYSC的一種新用途。
本發(fā)明的再一目的是提供一種治療神經(jīng)退變以及促進(jìn)中樞神經(jīng)再生尤其是帕金森病的藥物組合物。
本發(fā)明的第一方面，提供了一種治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的方法，所述方法包括步驟給需要所述治療的病人施用安全有效量的多巴胺能神經(jīng)元保護(hù)因子——賽斯達(dá)廷C(cystatin C)。在一優(yōu)選例中，所述的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病為帕金森病。較佳的，所述賽斯達(dá)廷C被局部施用于病灶處。
本發(fā)明的第二方面，提供了一種賽斯達(dá)廷C的用途，所述賽斯達(dá)廷C用于制備治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的藥物組合物。優(yōu)選的，所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病為帕金森病。
在一優(yōu)選例中，所述藥物組合物是針劑。
本發(fā)明的第三方面，提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物含有安全有效量的賽斯達(dá)廷C以及藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體。
較佳的，所述藥物組合物的劑量為0.01微克/千克體重-約100微克/千克體重。
本發(fā)明的第四方面，提供了一種賽斯達(dá)廷C(cystatin C)的用途，所述賽斯達(dá)廷C用于篩選治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的化合物。
本發(fā)明的第五方面，提供了一種保健品，所述保健品含有賽斯達(dá)廷C。
如本文所用，術(shù)語“賽斯達(dá)廷C蛋白”“cystatin C”和“CYSC”可互換使用。
具體而言，本發(fā)明的賽斯達(dá)廷C蛋白可通過將相應(yīng)的編碼序列引入宿主細(xì)胞(直接引入或通過引入含賽斯達(dá)廷C編碼序列的載體)，并在合適的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞以表達(dá)賽斯達(dá)廷C蛋白，然后分離和純化出賽斯達(dá)廷C蛋白。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)賽斯達(dá)廷C蛋白。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
在上面的方法中的重組蛋白可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
具體而言，本發(fā)明的賽斯達(dá)廷C蛋白有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)治療神經(jīng)退變以及促進(jìn)中樞神經(jīng)再生，和用于篩選促進(jìn)賽斯達(dá)廷C蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達(dá)的重組賽斯達(dá)廷C蛋白篩選多肽庫(kù)可用于尋找有治療價(jià)值的能抑制或刺激人賽斯達(dá)廷C蛋白功能的多肽分子。
利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與賽斯達(dá)廷C蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如抑制劑、激動(dòng)劑或拮抗劑等。在篩選時(shí)，可以將賽斯達(dá)廷C蛋白加入生物分析測(cè)定中，通過測(cè)定化合物影響賽斯達(dá)廷C蛋白和其底物之間的相互作用來確定該化合物的影響。此外，還可將測(cè)試化合物與賽斯達(dá)廷C蛋白一起施用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，與對(duì)照相比中樞神經(jīng)細(xì)胞存活數(shù)的變化可以表明，該化合物具有促進(jìn)或抑制賽斯達(dá)廷C蛋白的作用。
此外，還可將賽斯達(dá)廷C基因的cDNA裝入表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞株，制備高表達(dá)賽斯達(dá)廷C蛋白的細(xì)胞株并以此細(xì)胞株中的賽斯達(dá)廷C蛋白為靶位點(diǎn)，篩選對(duì)賽斯達(dá)廷C蛋白有激活或抑制作用的藥物。并向所述的表達(dá)賽斯達(dá)廷C蛋白的細(xì)胞株培養(yǎng)液中加入測(cè)試化合物，檢測(cè)賽斯達(dá)廷C蛋白表達(dá)量的變化。促進(jìn)賽斯達(dá)廷C蛋白表達(dá)的化合物就是促進(jìn)中樞神經(jīng)再生的化合物。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、激動(dòng)劑、拮抗劑等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、口服、或局部給藥。正常的賽斯達(dá)廷C蛋白可直接用于疾病治療，例如，治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的賽斯達(dá)廷C蛋白、其編碼核酸、和/或反義核酸，以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約0.01微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的蛋白還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的賽斯達(dá)廷C蛋白或其拮抗劑、激動(dòng)劑施用于哺乳動(dòng)物，其中該安全有效量通常至少約0.01微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約0.01微克/千克體重-約100微克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
另外重組人賽斯達(dá)廷C基因可包裝到脂質(zhì)體中，然后再轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。多聚核苷酸導(dǎo)入組織或細(xì)胞內(nèi)的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內(nèi)組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多聚核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中，再將細(xì)胞移植到體內(nèi)等。
本發(fā)明的賽斯達(dá)廷C蛋白及其拮抗劑不僅可用于治療，也可用于促進(jìn)神經(jīng)再生。因此，本發(fā)明還提供了一種保健品，它含有哺乳動(dòng)物的賽斯達(dá)廷C蛋白或其編碼序列，或其拮抗劑(如反義核酸)。本發(fā)明保健品，可通過保健品領(lǐng)域常規(guī)的方法，通過將哺乳動(dòng)物的賽斯達(dá)廷C蛋白或其編碼序列，或其拮抗劑(如反義核酸)與合適的稀釋劑、食品等混合在一起而制備。優(yōu)選的保健品是片劑、顆粒劑、口服劑形式。
發(fā)明人通過多種實(shí)驗(yàn)手段，證實(shí)了CYSC與多巴胺能神經(jīng)元的相關(guān)性及其在帕金森病大鼠模型中的特定上調(diào)模式。借助體外細(xì)胞培養(yǎng)和在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了CYSC對(duì)多巴胺能神經(jīng)元具有明顯的促進(jìn)存活和降低神經(jīng)毒素對(duì)其毒害的作用，提示該分子在帕金森病的治療方面具有潛在的應(yīng)用前景。
如前所述，CYSC具有半胱氨酸蛋白酶抑制劑的特性，但CYSC在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病狀態(tài)下的確切功能和意義還不清楚，迄今也沒有文獻(xiàn)資料提示它與帕金森病或多巴胺能神經(jīng)元有任何關(guān)聯(lián)。發(fā)明人的研究結(jié)果顯示，CYSC的mRNA在不同時(shí)期帕金森病大鼠模型大腦中紋狀體內(nèi)的表達(dá)水平顯著升高(圖1，圖2)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，CYSC的高表達(dá)分布于紋狀體的尾殼核和蒼白球(圖3，表1)，并來源于多種細(xì)胞成分，即神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞(圖4)。在黑質(zhì)，它的表達(dá)上調(diào)同樣也很明顯。CYSC對(duì)體外培養(yǎng)的胚胎腹側(cè)中腦多巴胺能神經(jīng)元有顯著的促進(jìn)其存活的作用，與對(duì)照組細(xì)胞存活相比，達(dá)2倍以上。已知神經(jīng)毒素N-甲基-4-苯吡啶(N-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+)對(duì)多巴胺神經(jīng)元具有高度特異的毒性作用，體外培養(yǎng)的多巴胺能神經(jīng)元MPP+處理后，細(xì)胞存活數(shù)為對(duì)照組的50％左右，但CYSC(20ng/ml)與MPP+(如20μM)同時(shí)加入培養(yǎng)的多巴胺神經(jīng)元中則能顯著對(duì)抗MPP+的這一毒性作用，說明CYSC具有對(duì)多巴胺神經(jīng)元的保護(hù)作用(圖5)。為進(jìn)一步驗(yàn)證CYSC能否對(duì)抗另一種針對(duì)多巴胺神經(jīng)元的神經(jīng)毒素6-羥基多巴胺，我們預(yù)先將CYSC(每只動(dòng)物5微克或15微克)注射進(jìn)黑質(zhì)，然后再在同一部位給予6-羥基多巴胺，動(dòng)物存活4周后，對(duì)照組黑質(zhì)殘留的多巴胺能神經(jīng)元約為正常對(duì)照的6.9％(與文獻(xiàn)中報(bào)告的相符)，而在分別給予5微克或15微克CYSC的兩組動(dòng)物中黑質(zhì)殘留的多巴胺能神經(jīng)元分別至27％和28％，約為對(duì)照組的4倍(圖6，表2)。上述結(jié)果提示，由于受損傷大腦自身增加合成CYSC的反應(yīng)滯后同時(shí)產(chǎn)量不足，因而，不足以對(duì)抗神經(jīng)毒素所致對(duì)多巴胺神經(jīng)元的毒性作用，外源性給予的CYSC則有助于保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元，表明該分子用作臨床治療的潛在價(jià)值。它的這一作用為研究治療神經(jīng)退變以及促進(jìn)中樞神經(jīng)再生的新方法提供了嶄新的資料。


圖1.用Northern blot印跡法顯示帕金森病大鼠紋狀體中賽斯達(dá)廷C mRNA水平的變化。損傷2周和5周后，損傷側(cè)的賽斯達(dá)廷C mRNA水平(箭頭所指)與對(duì)側(cè)相比有明顯增高。圖的下半部分顯示各樣品的總RNA水平，以示各泳道上樣量基本一致。
圖2.原位雜交法顯示在帕金森病大鼠模型的尾殼核(A，B)和蒼白球(C，D)CYSC mRNA的變化。
損傷側(cè)(B，D)表達(dá)CYSC mRNA的細(xì)胞(藍(lán)色點(diǎn)狀物，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞)比損傷對(duì)側(cè)(A，C)增多，表明CYSC可能與腦損傷相關(guān)。
圖3.用免疫組織化學(xué)方法顯示CYSC在帕金森病大鼠紋狀體中表達(dá)水平有升高。損傷側(cè)(B，D，F(xiàn))表達(dá)CYSC的細(xì)胞數(shù)(棕色點(diǎn)狀物)比損傷對(duì)側(cè)(A，C，E)增多。
圖4.免疫熒光雙標(biāo)記顯示CYSC的來源。
A-CCYSC與膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(glial fibrilary acid protein，GFAP，星型膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物)在部分細(xì)胞(箭頭所指)中共存，表明星型膠質(zhì)細(xì)胞是CYSC的來源之一。
D-FCYSC與RIP蛋白(少突膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物)沒有在任何細(xì)胞中共存，表明少突膠質(zhì)細(xì)胞不是CYSC的來源。
G-ICYSC與Integrin αM(小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物)在部分細(xì)胞(箭頭所指)中共存，表明小膠質(zhì)細(xì)胞也是CYSC的來源之一。
圖5.賽斯達(dá)廷C對(duì)體外培養(yǎng)的多巴胺能神經(jīng)元的存活有促進(jìn)作用。
將取自胚胎14天的腹側(cè)中腦(含多巴胺能神經(jīng)元)在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)3天，屆時(shí)將這些培養(yǎng)的細(xì)胞用多聚甲醛固定，然后用酪氨酸羥化酶(TH)抗體進(jìn)行免疫組化染色，隨后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
A空白對(duì)照。
BCYSC處理后的細(xì)胞培養(yǎng)，與A相比，可見存活的多巴胺能神經(jīng)元(顏色較深者)數(shù)增加。
CLeupeptin(作為陽性對(duì)照)處理后的細(xì)胞培養(yǎng)，與A相比，同樣可見存活的多巴胺能神經(jīng)元(顏色較深者)數(shù)增加。
DCYSC的劑量效應(yīng)圖。
ELeupeptin的劑量效應(yīng)圖。
F在0-20μM MPP+存在下，CYSC能部分阻斷其毒性作用，挽救多巴胺能神經(jīng)元。
圖6. 在體情況下，賽斯達(dá)廷C腦內(nèi)注射對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用。
A、C、E、G首先在大鼠紋狀體內(nèi)通過注射熒光金逆向標(biāo)記黑質(zhì)的多巴胺能神經(jīng)元，已被標(biāo)記的細(xì)胞可在330nm波長(zhǎng)處被激發(fā)而呈現(xiàn)綠色，因而它被用來標(biāo)記黑質(zhì)存活的多巴胺能神經(jīng)元。
B、D、F、H通過酪氨酸羥化酶(TH)的免疫組織化學(xué)的染色，觀察了多巴胺能神經(jīng)元的存活情況。在530nm光波的激發(fā)下，被酪氨酸羥化酶抗體標(biāo)記的多巴胺能神經(jīng)元呈紅色(B，D，F(xiàn)，H)，有完整細(xì)胞形態(tài)的神經(jīng)元均記數(shù)在內(nèi)。損傷對(duì)側(cè)的細(xì)胞數(shù)記數(shù)為100％，而對(duì)照組損傷側(cè)殘留的神經(jīng)元為6.9％，這和文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相符，說明我們模型的制備是成功的。在5微克加藥組和15微克加藥組的動(dòng)物，損毀側(cè)存活的細(xì)胞分別為27％和28％(F，H)，從另一個(gè)角度顯示了CYSC對(duì)受損的多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)驗(yàn)材料TOTALLY RNA分離試劑盒(Ambion，Austin，TX，USA)，in vitro transcription試劑盒(Roche，USA)，羊血清(Invitrogen公司，USA)，抗RIP抗體(美國(guó)路易斯維爾大學(xué)徐曉明博士惠贈(zèng))，抗IntegrinαM抗體(Chemicon，CA，USA)，人源賽斯達(dá)廷C(Calbiochem，USA)，熒光金(Flurogold，F(xiàn)lurochrome，CA，USA)，DMEM/F12(GIBCO，Invitrogen，USA)以下試劑均來自美國(guó)Sigma公司(St.Louis，MO)生物素化的羊抗兔IgG，生物素化的羊抗鼠IgG，熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗鼠IgG，得克薩斯紅標(biāo)記的羊抗兔IgG，Cy3標(biāo)記的親和素，DTAT標(biāo)記的親和素(Jackson Immuno Research，USA)，抗酪氨酸羥化酶(TH)單克隆抗體，抗膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(GFAP)抗體。所用大鼠來自于中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(松江九亭)。
實(shí)施例1帕金森病大鼠模型的制備將體重為180-220克的雌性Sprague-Dawley大鼠經(jīng)麻醉后固定在小動(dòng)物立體定位儀上。利用微型注射器將4微升6-羥基多巴胺(Sigma，USA)(2.5微克/微升溶于0.2毫克/毫升抗壞血酸(Sigma，USA))注射入大鼠右側(cè)內(nèi)側(cè)前腦束(相對(duì)于前囟的定位坐標(biāo)AP，-4.4mm，ML，+1.2mm，DV，+7.8mm)，注射速度為0.4微升/分鐘，完成注射后留針10分鐘再將注射器緩慢退出。手術(shù)后一周腹腔注射阿樸嗎啡(Sigma，USA)(0.05毫克/公斤體重)，測(cè)試大鼠旋轉(zhuǎn)，旋轉(zhuǎn)每分鐘6圈以上者為合格的帕金森病大鼠模型。
實(shí)施例2 Northern blot印跡利用TOTALLY RNA分離試劑盒(Ambion，Austin，TX，USA)從成年大鼠腦內(nèi)抽取出總RNA，經(jīng)電泳后利用毛細(xì)管現(xiàn)象將總RNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜，然后與32磷標(biāo)記的CYSC探針在42℃下雜交16小時(shí)，經(jīng)漂洗后，在-80℃下與X光片共同曝光3天，顯影后即得到圖1。在該圖中可以清楚地看到帕金森病大鼠紋狀體中賽斯達(dá)廷C mRNA水平的變化。損傷2周和5周后，損傷側(cè)的賽斯達(dá)廷C mRNA水平(箭頭所指)與對(duì)側(cè)相比有明顯增高。圖的下半部分顯示各樣品的總RNA水平，以示各泳道上樣量基本一致。
實(shí)施例3原位雜交分析首先根據(jù)歐洲分子生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(EMBL)中登錄的CYSC的基因(登錄號(hào)X16957.1)序列設(shè)計(jì)引物并利用PCR獲取一690堿基長(zhǎng)的cDNA片斷，利用in vitro transcription試劑盒(Roche，USA)合成相應(yīng)的地高辛標(biāo)記的cRNA探針。將帕金森病大鼠模型的大腦用4％多聚甲醛固定后，切片，然后與CYSC的cRNA探針在50℃下雜交過夜，雜交液含50％甲酰胺，10％右旋糖苷，10mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.5)，600毫摩爾氯化納，1×Denhardt’s溶液and 400微克/毫升魚精DNA。雜交結(jié)束后，經(jīng)漂洗，與抗地高辛抗體孵育，加入適當(dāng)?shù)孜锖蠹纯娠@現(xiàn)被標(biāo)記的陽性細(xì)胞(圖2)。用該方法可以靈敏地顯示在帕金森病大鼠模型的尾殼核(A，B)和蒼白球(C，D)CYSC mRNA的變化。在圖2中可見，損傷側(cè)(B，D)表達(dá)CYSC mRNA的細(xì)胞(藍(lán)色點(diǎn)狀物，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞)比損傷對(duì)側(cè)(A，C)增多，表明CYSC可能與腦損傷相關(guān)。
實(shí)施例4免疫組織化學(xué)染色腦片經(jīng)常規(guī)方法固定，用含0.01％曲拉通X-100的磷酸鹽緩沖液漂洗后用4％羊血清(Invitrogen公司，USA)孵育30分鐘，在4℃下與含1％羊血清的第一抗體孵育48小時(shí)，漂洗，然后在生物素化的第二抗體中孵育1.5小時(shí)，再與結(jié)合有卵白素的辣根過氧化酶孵育1小時(shí)，最后加入底物DAB顯色反應(yīng)。用光學(xué)顯微鏡下經(jīng)放大200倍進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果可見(圖3)，損傷側(cè)(B，D，F(xiàn))表達(dá)CYSC的細(xì)胞數(shù)(棕色點(diǎn)狀物)比損傷對(duì)側(cè)(A，C，E)增多，在損傷側(cè)黑質(zhì)和紋狀體的CYSC免疫反應(yīng)陽性的細(xì)胞較對(duì)側(cè)數(shù)目多，且著色深，說明黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的受損導(dǎo)致CYSC的表達(dá)水平上升，進(jìn)一步表明CYSC可能與腦損傷相關(guān)。詳細(xì)的細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果列于表1中。
實(shí)施例5免疫熒光雙色標(biāo)記染色腦片經(jīng)常規(guī)方法固定，用含0.01％曲拉通X-100的磷酸鹽緩沖液漂洗后用4％羊血清孵育30分鐘，在4℃下與含1％羊血清的第一抗體孵育48小時(shí)，漂洗，將腦片與生物素結(jié)合的第二抗體(Sigma，USA)孵育1.5小時(shí)，漂洗，再與結(jié)合有卵白素的熒光素孵育1小時(shí)，漂洗。然后4％多聚甲醛固定20分鐘，漂洗，用4％羊血清孵育30分鐘，然后與各類細(xì)胞標(biāo)記分子的抗體孵育，漂洗，然后與對(duì)應(yīng)的熒光素標(biāo)記的第二抗體(如熒光素標(biāo)記的羊抗鼠IgG、得克薩斯紅標(biāo)記的羊抗兔IgG，Cy3標(biāo)記的親和素或DTAT標(biāo)記的親和素)孵育，漂洗。用熒光封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察，照相。結(jié)果顯示，在紋狀體CYSC免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞從形態(tài)上看除有神經(jīng)元之外，星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞也表達(dá)CYSC。在黑質(zhì)CYSC出現(xiàn)在多巴胺能神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞中(圖4)。


實(shí)施例6胚胎大鼠腹側(cè)中腦細(xì)胞的原代培養(yǎng)及CYSC作用的觀察取懷孕14天Sprague-Dawley孕鼠(發(fā)現(xiàn)陰栓之日為懷孕第0天)的胚胎置于預(yù)先冷卻的無鈣、鎂離子的D-Hanks緩沖液中，在解剖顯微鏡下分離腹側(cè)中腦。先以D-Hanks緩沖液洗滌組織2次，再加入胰蛋白酶(25微克/毫升)室溫下孵育5-10分鐘，以10％胎牛血清終止反應(yīng)，DMEM/F12(1∶1)(GIBCO，Invitrogen，USA)洗滌組織2次，輕柔吹散組織塊，靜置5分鐘取上清細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色后計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。以每平方厘米1×105個(gè)細(xì)胞的密度種入預(yù)先鋪多聚賴氨酸的96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)基為含10％胎牛血清的DMEM/F12。4小時(shí)后更換為含1％N2的DMEM/F12，同時(shí)加入CYSC。細(xì)胞培養(yǎng)液體積為100微升，換液后24小時(shí)固定細(xì)胞。由圖5可見，與對(duì)照組相比，CYSC對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的促進(jìn)存活的作用可達(dá)2.2倍。
為觀察CYSC對(duì)N-甲基-4-苯吡啶(MPP+)(Sigma，USA)處理的體外培養(yǎng)的腹側(cè)中腦細(xì)胞是否有促進(jìn)存活作用，將胚胎14天大鼠腹側(cè)中腦細(xì)胞的原代培養(yǎng)如上，4小時(shí)后更換為含1％N2的DMEM/F12，隨即加入MPP+或CYSC加MPP+，36小時(shí)后多聚甲醛固定，用TH單克隆抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果顯示，在不同濃度MPP+存在的情況下，20納克/毫升CYSC對(duì)培養(yǎng)的中腦多巴胺能神經(jīng)元有明顯的對(duì)抗MPP+毒性的作用(圖5F)。
實(shí)施例7 CYSC的腦內(nèi)注射對(duì)在體動(dòng)物黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元保護(hù)作用的觀察Sprague-Dawley雌性大鼠，體重180-220克，麻醉后固定于定位儀上，如前，鼻高設(shè)為0。按以下坐標(biāo)于紋狀體兩側(cè)注射0.2微升用2％生理鹽水配制的熒光金相對(duì)于前囟的定位坐標(biāo)為AP，+0.5mm；ML，±3.4mm；DV，-5.0mm。一周后，注射CYSC，分為5微克組，15微克組及對(duì)照組。對(duì)照組注射0.1％牛血清白蛋白(溶于0.1摩爾磷酸鹽緩沖液)。各組注射液體積均為3.4微升.坐標(biāo)為AP，-5.4mm；ML，-2.2mm；DV，-8.5mm。鼻高為-3.3mm.注射速度為0.4微升/分鐘，留針5分鐘后緩慢退針。6小時(shí)后，每只大鼠在同一坐標(biāo)點(diǎn)注射用含0.02％抗壞血酸的生理鹽水配置的6-羥基多巴胺2微克/3.4微升，手術(shù)同前PD模型。4周后將動(dòng)物處死、灌注并制備大腦組織切片。
在腦片上識(shí)別多巴胺神經(jīng)元的兩種方法一是通過在紋狀體注射熒光金，一周后逆行運(yùn)輸?shù)胶谫|(zhì)的多巴胺神經(jīng)元，通過紫外光的激發(fā)(330nm波長(zhǎng))可在熒光顯微鏡下看到被熒光金標(biāo)記的細(xì)胞(圖6A，C，E)。二是，多巴胺神經(jīng)元本身有豐富的酪氨酸羥化酶，通過免疫組織化學(xué)染色可以顯示(圖6B，D，F(xiàn))。這兩種方法相互獨(dú)立，可以更客觀地衡量CYSC腦內(nèi)注射后的效果。
由熒光金標(biāo)記結(jié)果可見，損傷對(duì)側(cè)被熒光金標(biāo)記的細(xì)胞在黑質(zhì)的分布完整，且細(xì)胞形態(tài)完整，數(shù)量為100％。對(duì)照組中被熒光金標(biāo)記的細(xì)胞多數(shù)為凋亡狀態(tài)(圖6C)，形態(tài)完整的細(xì)胞約為對(duì)側(cè)的6.9％，這和文獻(xiàn)報(bào)道6.1％的結(jié)果相符。5微克給藥組和15微克給藥組損毀側(cè)細(xì)胞數(shù)接近，約為對(duì)照組的28％和27.1％，說明CYSC對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。另一方面，通過酪氨酸羥化酶(TH)的免疫組織化學(xué)染色，我們考察了TH免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元的存活情況。在530nm光波的激發(fā)下，被TH標(biāo)記的多巴胺能神經(jīng)元呈紅色，只有細(xì)胞形態(tài)完整的神經(jīng)元才列入記數(shù)。損傷對(duì)側(cè)的TH陽性細(xì)胞數(shù)設(shè)為100％，而對(duì)照組損傷側(cè)殘留的TH免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元為對(duì)照的6.9％(圖6D)，在5微克給藥組和15微克給藥組損毀側(cè)存活的細(xì)胞分別為27％和28％(圖6F，6H，表2)，顯示了CYSC對(duì)受損的多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用。詳細(xì)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果列于表2中。
實(shí)施例8 藥物組合物的制備將CYSC蛋白制成針劑，使用時(shí)對(duì)患處進(jìn)行皮下注射，直接保護(hù)病灶處的中樞神經(jīng)細(xì)胞，使病人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病特別是帕金森病得到改善，從而達(dá)到治療的目的。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的方法，其特征在于，包括步驟給需要所述治療的病人施用安全有效量的多巴胺能神經(jīng)元保護(hù)因子——賽斯達(dá)廷C(cystatin C)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病為帕金森病。
3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的賽斯達(dá)廷C被局部施用于病灶處。
4.一種賽斯達(dá)廷C的用途，其特征在于，用于制備治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的藥物組合物。
5.權(quán)利要求4所述的賽斯達(dá)廷C的用途，其特征在于，所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病為帕金森病。
6.權(quán)利要求4或5所述的賽斯達(dá)廷C的用途，其特征在于，所述藥物組合物是針劑。
7.一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的賽斯達(dá)廷C以及藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體。
8.權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征在于，其劑量為0.01微克/千克體重-約100微克/千克體重。
9.一種賽斯達(dá)廷C(cystatin C)的用途，其特征在于，用于篩選治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的化合物。
10.一種保健品，其特征在于，它含有賽斯達(dá)廷C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的利用CYSC治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病尤其是帕金森病的方法以及利用CYSC篩選、制備治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的化合物或藥物組合物的新用途。同時(shí)本發(fā)明公開了一種治療神經(jīng)退變以及促進(jìn)中樞神經(jīng)再塵尤其是帕金森病的藥物組合物。
文檔編號(hào)A61K38/14GK1618458SQ20031010871
公開日2005年5月25日 申請(qǐng)日期2003年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月19日
發(fā)明者周嘉偉, 許蕾, 盛建松, 唐仲書 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院