專利名稱：親和顆粒和親和分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及親和顆粒和親和分離方法。更具體的說，涉及利用了有機顆粒的親和顆粒和可高精度且容易分離目標(biāo)物質(zhì)的親和分離方法。本發(fā)明的親和顆粒對于可高精度且容易地檢測目標(biāo)物質(zhì)的免疫沉淀法、膠乳凝集法等為代表的各種分離、純化、檢測方法也極為有用。
背景技術(shù)：
以往，生物體物質(zhì)的分離純化是采用柱層析。但是，柱分離中由以下(1)-(3)所示的致命的問題。
(1)為了獲得目標(biāo)物質(zhì)，必須使用多種柱，純化效率差。
(2)必須進行確認(rèn)實驗，以確認(rèn)分離成分中是否含有目標(biāo)物質(zhì)，因此純化需要較多時間。
(3)純化時的損失大，需要大量的樣品。
為此，在目標(biāo)物質(zhì)的分離純化中采用了擔(dān)載有配體的親和柱或親和顆粒(專利文獻1、專利文獻2)。
但是，通過親和柱進行分離純化有以下的問題。
(1)所需目標(biāo)物質(zhì)無法選擇性分離。即，除被配體捕捉的目標(biāo)物質(zhì)之外，不希望的目標(biāo)物質(zhì)也吸附在柱上。
(2)捕捉效率低，需要大量的液體試樣。
另外，在使親和顆粒分散在液體試樣中進行分離的親和分離方法中，要使用瓊脂糖等(非專利文獻1)，這有無法選擇性分離所需目標(biāo)物質(zhì)的問題。即，除被配體捕捉的目標(biāo)物質(zhì)之外，不希望的物質(zhì)也吸附于親和顆粒上。
含有有機顆粒的親和顆粒除上述致命問題之外，在高鹽濃度的試樣中還存在有機顆粒容易發(fā)生凝聚的問題。因此，需要將試樣稀釋進行測定。
專利文獻1日本特公平8-26076號公報專利文獻2日本特表平2002-511141號公報非專利文獻1Bioconjugate Chem.；2002；13(2)；163-166發(fā)明內(nèi)容發(fā)明所要解決的課題本發(fā)明為解決上述課題而設(shè)，提供在各種分離、純化、檢查方法等中使用的、含有有機顆粒的親和顆粒。
解決課題的方法即，本發(fā)明提供親和顆粒，其特征在于有機顆粒的表面以共價鍵的形式具有下述式(1)所示的磷酰膽堿基。
本發(fā)明還提供親和顆粒，其特征在于有機顆粒的表面以共價鍵的形式具有下述式(1)所示的磷酰膽堿基，有機顆粒的表面以共價鍵或吸附的形式具有可與對某種目標(biāo)物質(zhì)具有特異親和性的配體結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團。
本發(fā)明又提供親和顆粒，其特征在于有機顆粒的表面以共價鍵的形式具有下述式(1)所示的磷酰膽堿基，有機顆粒的表面以共價鍵或吸附的形式具有與某種目標(biāo)物質(zhì)具有特異親和性的配體。
本發(fā)明還提供上述親和顆粒，其特征在于上述有機顆粒為合成顆?；蚨嗵穷?，其中所述合成顆粒是聚合物中含有選自苯乙烯、甲基丙烯酸縮水甘油酯、(甲基)丙烯酸、N-烷基丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸烷基酯中的1種或多種單體單元而得到的，多糖類含有瓊脂糖或瓊脂糖凝膠(Sepharose)，其平均粒徑為20nm-500μm。
本發(fā)明又提供上述親和顆粒，其特征在于上述配體為選自各種抗體、抗原、酶、底物、受體、肽、DNA、RNA、核酸配體、蛋白A、蛋白G、抗生物素蛋白、生物素、螯形化合物、各種金屬離子的一種或多種配體。
本發(fā)明還提供通過有機顆粒進行的目標(biāo)物質(zhì)的親和分離方法，其特征在于包含以下步驟(1)使權(quán)利要求1或2的親和顆粒與任意的配體結(jié)合的第1步驟，(2)使第1步驟中制造的親和顆粒分散于液體試樣中的第2步驟，其中液體試樣含有通過任意的配體選擇性捕捉的目標(biāo)物質(zhì)，(3)回收由親和顆粒捕捉的目標(biāo)物質(zhì)的第3步驟。
本發(fā)明又提供通過有機顆粒進行的目標(biāo)物質(zhì)的親和分離方法，其特征在于包含以下步驟(1)使權(quán)利要求3的親和顆粒分散于液體試樣中的第1步驟，其中所述液體試樣含有通過任意的配體選擇性捕捉的目標(biāo)物質(zhì)，(2)回收由親和顆粒捕捉的目標(biāo)物質(zhì)的第2步驟。
將本發(fā)明的親和顆粒應(yīng)用于免疫沉淀法或膠乳凝集法等抗體或蛋白的檢測時，不需要(2)的回收步驟，可通過目視，通過其分散狀態(tài)的變化容易地進行確認(rèn)。
發(fā)明效果本發(fā)明的親和顆粒通過配體只捕捉某種目標(biāo)物質(zhì)(希望分離的目標(biāo)物質(zhì))，并抑制其他物質(zhì)吸附于顆粒上，因此分離選擇性極高。由于其優(yōu)異的分散性，以及在血清中等各種鹽存在的試樣中也不會發(fā)生凝聚，因此可簡便且高精度地分離目標(biāo)物質(zhì)。
也就是說，本發(fā)明的目標(biāo)物質(zhì)的分離方法可以在短時間有效、且簡便地分離以分離為目的的目標(biāo)物質(zhì)。通常，物質(zhì)具有吸附異物的性質(zhì)，以往的親和顆粒難以有效地只分離目標(biāo)物質(zhì)，但通過用磷酰膽堿基修飾顆粒表面，可極有效地防止目標(biāo)物質(zhì)與親和顆粒的非特異性吸附，可提高純化效率。
另外，磷酰膽堿基具有極高的親水性，在含有水的液體試樣中，也具有使親和顆粒的分散性提高的功能。
并且，通常的顆粒有遇鹽凝聚的傾向，例如要從血清中分離目標(biāo)物時，顆粒由于血清中的各種鹽而凝聚，純化效率低，但本發(fā)明的親和顆粒即使在鹽的存在下也較少凝聚，可高效回收目標(biāo)物。
附圖簡述

圖1是表示本發(fā)明的親和顆粒與以往的親和顆粒在捕捉蛋白質(zhì)時的選擇性的差異的模式圖。
圖2是合成例1制造的化合物的結(jié)構(gòu)式和NMR波譜。
圖3是合成例2制備的化合物的結(jié)構(gòu)式和NMR波譜。
圖4是表示以往的親和顆粒在水中和食鹽水中的粒度分布的圖表。
圖5是表示本發(fā)明的親和顆粒在水中和食鹽水中的粒度分布的圖表。
圖6是比較參考例1制備的苯乙烯-甲基丙烯酸縮水甘油酯顆粒與PC顆粒(A)的蛋白質(zhì)吸附量的圖表。
圖7是比較參考例2制備的苯乙烯-甲基丙烯酸縮水甘油酯顆粒與PC顆粒(B)、(C)的蛋白質(zhì)吸附量的圖表。
圖8是比較參考例3制備的瓊脂糖珠與PC顆粒(D)的蛋白質(zhì)吸附量的圖表。
圖9是比較實施例1的親和顆粒的抗體選擇性的圖表。
圖10是比較比較例1的親和顆粒的抗體選擇性的圖表。
實施發(fā)明的最佳方式以下詳細說明本發(fā)明。
“有機顆?！北景l(fā)明中，對于構(gòu)成親和顆粒的有機顆粒沒有特別限定。有機顆粒通常是指平均粒徑為20nm-500μm左右的有機物體。具體的顆粒有聚合物中含有苯乙烯、(甲基)丙烯酸縮水甘油酯、(甲基)丙烯酸、N-烷基丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸烷基酯、(甲基)丙烯酸氨基烷基酯、(甲基)丙烯酸羥基烷基酯中的一種或多種單體單元而得到的合成顆粒，或者瓊脂糖、瓊脂糖凝膠等有機顆粒。也包含外層含有有機的物體、內(nèi)側(cè)含有無機顆粒的芯-殼結(jié)構(gòu)的混雜顆粒。
特別優(yōu)選的顆粒是苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、苯乙烯-甲基丙烯酸縮水甘油基酯-二乙烯基苯共聚物、丙烯酸-N-異丙基丙烯酰胺-亞甲基雙丙烯酰胺共聚物、甲基丙烯酸2-羥基酯-苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、甲基丙烯酸2-氨基乙酯-N-異丙基丙烯酰胺-亞甲基雙丙烯酰胺共聚物等可通過乳液聚合、懸浮聚合等容易地合成的顆粒。
上述(1)式的磷酰膽堿基和配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團通過共價鍵導(dǎo)入顆粒表面，因此優(yōu)選其表面具有氨基、羧基、羥基、硫醇基等反應(yīng)基團的顆粒。
還優(yōu)選有機顆粒的平均粒徑為20nm-500μm的親和顆粒。
例如苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、苯乙烯-甲基丙烯酸縮水甘油酯-二乙烯基苯共聚物、丙烯酸-N-異丙基丙烯酰胺-亞甲基雙丙烯酰胺共聚物、甲基丙烯酸2-羥基酯-苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、甲基丙烯酸2-氨基乙酯-N-異丙基丙烯酰胺-亞甲基雙丙烯酰胺共聚物等。
“配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團”只要配體可結(jié)合即可，沒有特別限定。例如共價鍵形態(tài)中，優(yōu)選酰胺、酯、氨基甲酸乙酯、醚、仲胺、脲鍵、二硫鍵等。因此，優(yōu)選配體可以形成這些共價鍵形態(tài)的反應(yīng)基團，優(yōu)選氨基、羥基、羧基、硫醇基等。吸附形態(tài)，優(yōu)選抗生物素蛋白-生物素、金屬-螯形化合物等。因此，優(yōu)選配體可形成這些吸附形態(tài)的吸附基團，優(yōu)選抗生物素蛋白、生物素、螯形化合物等。
“配體”本發(fā)明中，配體是與某種目標(biāo)物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)，是各種抗體、抗原、酶、底物、受體、肽、核酸配體、蛋白A、蛋白G、抗生物素蛋白、生物素、螯形化合物、各種金屬離子等。例如，各種抗體有IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、IgY、多糖類、酶有谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，底物有谷胱甘肽，受體有激素受體、細胞因子受體，配體有凝集素，螯形化合物有氮川三乙酸，各種金屬離子有Ni2+、Co2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+。
“本發(fā)明的親和顆粒的制造方法”有機顆粒的表面以共價鍵的形式具有式(1)所示的磷酰膽堿基，有機顆粒的表面以共價鍵或吸附的形式直接存在可以與對某種目標(biāo)物質(zhì)具有特異親和性的配體結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團，這是本發(fā)明的本質(zhì)，因此其制備方法沒有限定，可以通過任何方法結(jié)合。
不過，如上所述，使用預(yù)先具有磷酰膽堿基和配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團的聚合物、沒有化學(xué)鍵、只是被覆在顆粒表面的方案不包含在本發(fā)明中。這是由于被覆的聚合物可能發(fā)生剝離，出現(xiàn)由于被覆聚合物產(chǎn)生的影響。
本發(fā)明的親和顆?？赏ㄟ^下述方法等制備。
步驟1向顆粒導(dǎo)入下述式(1)所示的磷酰膽堿基和配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團。對反應(yīng)基團或吸附基團沒有限定，可以是氨基或羥基、羧基、硫醇基等。
步驟2使式(1)所示的磷酰膽堿基和配體與導(dǎo)入顆粒的反應(yīng)基團或吸附基團結(jié)合。在磷酰膽堿基或配體與反應(yīng)基團或吸附基團之間存在的化學(xué)結(jié)構(gòu)(間隔基團)是任意的。例如任意的間隔基團除亞甲基鏈、氧乙烯基鏈等之外，還可以是含有一個或多個氨基的亞烷基鏈。
“存在于顆粒表面的反應(yīng)基團或吸附基團為氨基時”步驟1可通過公知的方法或今后開發(fā)的方法將氨基導(dǎo)入任意的顆粒中。氨基可直接導(dǎo)入顆粒表面。氨基為伯胺或仲胺。
步驟2由甘油磷酰膽堿的氧化性開裂反應(yīng)得到醛體或水合物，將其與具有氨基的顆粒進行還原性氨基化反應(yīng)，使磷酰膽堿基直接附加于顆粒表面。
不使磷酰膽堿基與全部氨基結(jié)合(調(diào)節(jié)反應(yīng)量)，殘留的氨基成為配體可結(jié)合的取代基。
或者，由甘油磷酰膽堿的氧化開裂反應(yīng)得到羧基體，將其與具有氨基的顆粒進行酰胺化反應(yīng)，將磷酰膽堿基直接附加于顆粒表面。不使磷酰膽堿基與全部氨基結(jié)合(調(diào)節(jié)反應(yīng)量)，殘留的氨基成為配體可結(jié)合的取代基。
“顆粒表面導(dǎo)入氨基的方法”將氨基導(dǎo)入顆粒的公知的方法(步驟1)如下所述。
1.通過等離子體處理的表面反應(yīng)導(dǎo)入氨基在氮氣氣氛下，通過低溫等離子體向顆粒表面導(dǎo)入氨基。具體來說，將顆粒裝入等離子體反應(yīng)容器內(nèi)，用真空泵將反應(yīng)容器內(nèi)抽真空，然后導(dǎo)入氮氣和氫氣。接著可通過輝光放電向顆粒表面導(dǎo)入氨基。也可以將經(jīng)等離子體處理的有機材料進行機械制粒。關(guān)于等離子體處理的文獻如下所示。
1.M.Muller，C.oehrPlasma aminofunctionalisation of PVDF microfiltration membranescomparison of the in plasma modifications with a grafting method usingESCA and an amino-selective fluorescent probeSurface and Coatings Technology 116-119(1999)802-8072.Lidija Tusek，Mirko Nitschke，Carsten Werner，Karin Stana-Kleinschek，Volker RibitschSurface characterization of NH3 plasma treated polyamide 6 foilsColloids and Surfaces APhysicochem.Eng.Aspects 195(2001)81-953.Fabienne Poncin-Epaillard，Jean-Claude Brosse，Thierry FalherReactivity of surface groups formed onto a plasma treated poly(propylene)filmMacromol.Chem.Phys.200.989-996(1999)2.通過表面改性劑導(dǎo)入氨基使用具有氨基的烷氧基硅烷、氯硅烷、硅氨烷等表面改性劑，對含烷氧基甲硅烷基的顆粒等有機顆粒表面進行處理。
例如，通過具有伯氨基的3-氨基丙基三甲氧基硅烷，對含烷氧基甲硅烷基的顆粒進行處理，導(dǎo)入氨基。具體來說，將1-甲基丙烯酸3-三甲氧基甲硅烷基丙基酯-甲基丙烯酸甲酯-二乙烯基苯共聚顆粒浸入水-2-丙醇混合液中，添加3-氨基丙基三甲氧基硅烷，然后加熱至50℃，反應(yīng)6小時。冷卻至室溫后，用甲醇洗滌上述聚合物，干燥，可得到氨基直接導(dǎo)入到上述共聚顆粒表面的顆粒。
3.通過有機硅氣相處理導(dǎo)入氨基(參照日本特公平1-54379號公報、日本特公平1-54380號公報、日本特公平1-54381號公報)首先通過1，3，5，7-四甲基環(huán)四硅氧烷對顆粒表面進行處理，使導(dǎo)入到表面的Si-H基與具有氨基的單體反應(yīng)，得到氨基化的表面。例如，將苯乙烯-二乙烯基苯共聚顆粒和1，3，5，7-四甲基環(huán)四硅氧烷裝入干燥器中，用吸氣機進行脫氣。在80℃下反應(yīng)16小時，然后取出上述顆粒，在50℃下干燥。將所得顆粒分散于乙醇中，添加烯丙基胺，接著添加氯鉑酸的乙醇溶液，在60℃下攪拌2小時，反應(yīng)終止后過濾，用乙醇洗滌，減壓干燥，得到氨基化有機顆粒。
本方法中使用的單體可以使用胺系單體。胺系單體不限于烯丙基胺，只要具有氨基和可聚合的乙烯基、丙烯基等反應(yīng)性部位即可。氨基可被丁氧基羰基、芐氧基羰基等保護。
另外，即使不是胺系單體，如環(huán)氧基那樣，也可以是具有例如通過與二胺的反應(yīng)可簡單地導(dǎo)入氨基的官能團的單體。
“向具有氨基的顆粒導(dǎo)入磷酰膽堿基的方法”下面，如下表示向氨基化顆粒表面導(dǎo)入磷酰膽堿基的方法(步驟2)。
將顆粒浸泡于甲醇中，添加磷脂酰甘油醛，在室溫下放置6小時。然后在0℃下添加氰基硼酸鈉，加熱攪拌過夜，使磷酰膽堿基附加到氨基上。將顆粒用甲醇洗凈后，干燥，可得到表面直接具有磷酰膽堿基的顆粒。反應(yīng)溶劑除甲醇外，只要是水、乙醇、2-丙醇等質(zhì)子性溶劑均可使用，使用甲醇時的導(dǎo)入率較高。
或者將顆粒分散于二甲基亞砜-水混合溶液中，添加溶解了N-羥基琥珀酰亞胺、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和羧甲基磷酰膽堿的二甲基亞砜-水混合溶液。在室溫下攪拌6小時，將顆粒用水充分洗滌，然后干燥，可得到表面直接具有磷酰膽堿基的顆粒。反應(yīng)溶劑除上述之外，還可優(yōu)選使用N，N’-二甲基甲酰胺、四氫呋喃、乙腈等非質(zhì)子性溶劑。或者使羧甲基磷酰膽堿與亞硫酰氯反應(yīng)，制成酰氯化物，在以N，N’-二甲基甲酰胺、乙腈等為溶劑的無水條件下與顆粒反應(yīng)，將顆粒用水充分洗滌，然后干燥，可得到表面直接具有磷酰膽堿基的顆粒。該方法也可以與表面的羥基有效反應(yīng)，對于顆粒為瓊脂糖、瓊脂糖凝膠等多糖類的情況或為(甲基)丙烯酸2-羥基乙酯的情況也是有效的。
使用3-氨基丙基三甲氧基硅烷作為表面改性劑，將氨基導(dǎo)入具有烷氧基甲硅烷基的有機顆粒、接著導(dǎo)入磷酰膽堿基(簡稱PC)的方法的方案如下所示。
如上所述，制備具有氨基的顆粒，由甘油磷酰膽堿的氧化性開裂反應(yīng)得到醛體或水合物，通過其與具有氨基的顆粒的還原性氨基化反應(yīng)，可以制備磷酰膽堿基直接附加在顆粒表面的顆粒。
該方法具有磷酰膽堿基的導(dǎo)入率高，可以修飾各種有機顆粒的表面的優(yōu)點。
上述方法中，含有由甘油磷酰膽堿的氧化性開裂反應(yīng)得到醛體的化合物是通過公知的方法，將公知的甘油磷酰膽堿基進行氧化性開裂得到的，是極簡單的步驟。該反應(yīng)是使用高碘酸或高碘酸鹽，對1，2-二醇進行氧化，使鍵開裂，得到兩個醛體，本方法生成磷酰膽堿醛體和甲醛。反應(yīng)通常在水中或含有水的有機溶劑中進行。反應(yīng)溫度為0℃至室溫。醛體在水中經(jīng)過平衡反應(yīng)可成為水合物，這對于接下來的與胺的反應(yīng)沒有影響。以下表示制備含有磷酰膽堿基的單官能醛體的方案的一個例子。
使由甘油磷酰膽堿的氧化性開裂反應(yīng)得到的醛體(或水合物)與顆粒的氨基結(jié)合的還原性氨基化反應(yīng)可通過將兩者在溶劑中攪拌而容易地進行。該反應(yīng)是將兩者溶解或分散于水或醇中(可以混合第三成分的有機溶劑)，形成亞胺，然后通過還原劑將其還原，得到仲胺。還原劑優(yōu)選氰基硼酸鈉等溫和的還原劑，只要磷酰膽堿穩(wěn)定，也可以使用其它還原劑。反應(yīng)通常在0℃至室溫下進行，也可以根據(jù)情況加熱。
可以使式(2)所示的化合物以任意的量、按照常規(guī)方法與上述氨基反應(yīng)，也可以將殘留的氨基作為配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團。
n＝1-12的整數(shù)
“關(guān)于配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團”上述反應(yīng)中，不使磷酰膽堿基與全部氨基結(jié)合(調(diào)節(jié)反應(yīng)量)，殘留的氨基成為配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團。該顆粒為權(quán)利要求2的親和顆粒，是式(1)所示的磷酰膽堿基和配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團直接存在于有機顆粒的表面的顆粒。配體與該殘留的氨基結(jié)合的顆粒是權(quán)利要求3的親和顆粒，是式(1)所示的磷酰膽堿基和配體直接存在于有機顆粒的表面的顆粒。
權(quán)利要求2的親和顆粒是使用者根據(jù)要捕捉的物質(zhì)(目標(biāo)物質(zhì))，可使其與任意的配體結(jié)合的制品形式。權(quán)利要求3的親和顆粒是預(yù)先與使其與配體結(jié)合了的制品形式。權(quán)利要求1的親和顆粒是至少式(1)的磷酰膽堿基存在于顆粒表面的親和顆粒，不管有否配體或可與其結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團，使用者根據(jù)要捕捉的物質(zhì)(目標(biāo)物質(zhì))，可以使其與任意的配體結(jié)合的制品形式。只要至少式(1)所示的磷酰膽堿基存在于顆粒表面即可，包含任何形式的親和顆粒，例如也包含權(quán)利要求2和權(quán)利要求3的形式。
上述反應(yīng)中，使氨基殘留以作為配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團，這可通過使3-氨基丙基三甲氧基硅烷和導(dǎo)入了磷酰膽堿基的3-氨基丙基三甲氧基硅烷進行競爭反應(yīng)的方法或調(diào)節(jié)反應(yīng)量等來進行。
也可以使任意的具有官能團的化合物與該氨基反應(yīng)，使該官能團成為配體可結(jié)合的反應(yīng)基或吸附基團。例如可以是戊二醛、二亞氨酸烷基酯、?；B氮基類、異氰酸酯類等。
在使用3-氨基丙基三甲氧基硅烷作為上述表面改性劑時的方案中，調(diào)節(jié)表面改性劑的反應(yīng)量，使存在于顆粒表面的羥基(OH)殘留，可以利用殘留的OH基作為配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團。
“配體與具有氨基的顆粒的結(jié)合方法”配體為蛋白質(zhì)時，可以使戊二醛的一個醛基與有機顆粒上的氨基反應(yīng)，使蛋白質(zhì)中的氨基與另一個醛基反應(yīng)，從而結(jié)合蛋白質(zhì)。
“存在于顆粒表面的反應(yīng)基團或吸附基團為羥基的情況”有機顆粒存在羥基時，無需新導(dǎo)入象上述氨基那樣的配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團，可直接利用存在于顆粒表面的羥基(OH)，導(dǎo)入磷酰膽堿基以及配體或配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團。本發(fā)明的親和顆粒優(yōu)選通過該方法制備。
“向具有羥基的顆粒導(dǎo)入磷酰膽堿基的方法”從下述式(3)或(4)的化合物的Si-OMe脫水，與顆粒表面的羥基形成化學(xué)鍵。通過在幾乎所有的有機溶劑中進行加熱·回流，該化學(xué)反應(yīng)可極容易地定量進行。通過該脫水反應(yīng)，可以導(dǎo)入化學(xué)性、物理性極其穩(wěn)定的磷酰膽堿基，因而優(yōu)選。下述式(3)或式(4)所示的含有磷酰膽堿基的化合物為新型化合物。
[化11] 式中，m為2-6，n為1-4。OMe可以是OEt、Cl。另外與Si結(jié)合的OMe或OEt或Cl中最多兩個可以是甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基。
“式(3)的含磷酰膽堿基化合物的制備方法”使下述式(5)所示的磷酰膽堿衍生物溶解于蒸餾水。下述式(5)的磷酰膽堿衍生物為公知的化合物，可購自市場。
將式(5)的化合物的水溶液在冰水浴中冷卻，加入高碘酸鈉，攪拌5小時。減壓濃縮反應(yīng)液，減壓干燥，通過甲醇萃取下述式(6)所示的具有醛基的磷酰膽堿衍生物。
接著，向式(6)的甲醇溶液中添加0.5當(dāng)量的3-氨基丙基三甲氧基硅烷。將該混合溶液在室溫下攪拌規(guī)定時間，然后冰冷卻，適量添加氰基硼氫化鈉，回復(fù)至室溫，攪拌16小時。其間繼續(xù)向反應(yīng)容器中通入干燥氮。過濾沉淀后，得到式(3)的甲醇溶液。
即使式(3)所示化合物中的m、n改變，也可按照上述順序完全同樣地進行。這里所示的順序是m＝3、n＝2的情況。對反應(yīng)溶劑沒有特別限定，除上述甲醇之外，可以使用水或乙醇、丙醇、丁醇等醇，DMF或DMSO等非質(zhì)子性溶劑。不過，為防止反應(yīng)中的聚合，優(yōu)選脫水溶劑，其中優(yōu)選脫水甲醇。
(3)中的甲氧基(OMe)換為乙氧基(OEt)時，可以將甲醇改為乙醇進行反應(yīng)，為Cl時，可只變更為二甲基甲酰胺或二甲基亞砜。
并且，與Si結(jié)合的OMe或OEt或Cl中，2個或1個被甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基的其中之一取代時，也可以與上述方法完全同樣地制備。
“式(4)的含磷酰膽堿基化合物的制備方法”將式(5)的化合物的水溶液在冰水浴中冷卻，添加高碘酸鈉和催化劑量的三氯化釕，攪拌3小時。減壓濃縮反應(yīng)液并減壓干燥，通過甲醇萃取下述式所示的具有羧基的磷酰膽堿衍生物(7)。
接著，向式(7)的乙腈或N，N’-二甲基甲酰胺分散液中添加1.2當(dāng)量亞硫酰氯，攪拌30分鐘，向所得溶液中添加0.9當(dāng)量3-氨基丙基三甲氧基硅烷。將該混合溶液在室溫下攪拌4小時，得到式(8)的化合物。
上述縮合反應(yīng)中使用的試劑除亞硫酰氯之外，只要是通常生成羧基酰鹵化物的試劑均可無問題地使用，有五氯化磷、氯氧化磷、三溴化磷、草酰氯等。
除使用式(8)的硅烷偶聯(lián)劑之外，還可以使式(7)的化合物與羥基直接反應(yīng)。例如將瓊脂糖凝膠珠分散于無水乙腈中，將式(7)的化合物與1.2當(dāng)量的亞硫酰氯混合，添加攪拌過夜的乙腈溶液，攪拌3小時，得到表面導(dǎo)入了磷酰膽堿化合物的顆粒。
“關(guān)于配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團”上述反應(yīng)中，不使磷酰膽堿基與全部羥基反應(yīng)(調(diào)節(jié)反應(yīng)量)，則殘留的羥基成為配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團。該顆粒為權(quán)利要求2的親和顆粒，是式(1)所示的磷酰膽堿基和配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團直接存在于有機顆粒表面的顆粒。該殘留的羥基與配體結(jié)合得到的顆粒則是權(quán)利要求3的親和顆粒，是式(1)所示的磷酰膽堿基和配體直接存在于有機顆粒的表面的顆粒。
權(quán)利要求2的親和顆粒是使用者根據(jù)要捕捉的物質(zhì)(目標(biāo)物質(zhì))，可使其與任意的配體結(jié)合的制品形式。權(quán)利要求3的親和顆粒是預(yù)先與配體結(jié)合了的制品形式。權(quán)利要求1的親和顆粒是至少式(1)的磷酰膽堿基存在于顆粒表面的親和顆粒，是不管有否配體或配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團，使用者根據(jù)要捕捉的蛋白質(zhì)(某種目標(biāo)物質(zhì))，可使其與任意的配體結(jié)合的制品形式。另外，只要是至少式(1)的磷酰膽堿基存在于顆粒表面，則本發(fā)明包含任何形式的親和顆粒，例如也包含權(quán)利要求2和權(quán)利要求3的形式。
“配體與具有羥基的顆粒的結(jié)合方法”配體為蛋白質(zhì)時，使用溴化氰活化顆粒上的羥基。使蛋白質(zhì)中的氨基與其反應(yīng)，以此結(jié)合蛋白質(zhì)。
使任何具有官能團的化合物與該羥基反應(yīng)，可以使該官能團成為蛋白質(zhì)可以結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團。
“導(dǎo)入到顆粒中的反應(yīng)基團或吸附基團為羧基的情況”步驟1通過公知的方法或今后開發(fā)的方法將羧基導(dǎo)入任意顆粒中。羧基可直接導(dǎo)入顆粒表面。
步驟2通過常規(guī)方法使下述式(9)所示的含有磷酰膽堿的化合物與具有羧基的顆粒反應(yīng)，使磷酰膽堿基形成酰胺鍵，使殘留的羧基作為配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團。
不使磷酰膽堿基與全部羧基結(jié)合(調(diào)節(jié)反應(yīng)量)，則殘留的羧基成為配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團。
“向顆粒表面導(dǎo)入羧基的方法”向顆粒中導(dǎo)入羧基的公知的方法(步驟1)如下所述。
1.通過表面改性劑導(dǎo)入羧基使用具有羧基的烷氧基硅烷、氯硅烷、硅氨烷等表面改性劑，對含有烷氧基甲硅烷基的顆粒等有機顆粒表面進行處理。
例如通過三乙氧基甲硅烷基丙基琥珀酸酐對具有烷氧基甲硅烷基的有機顆粒進行處理，導(dǎo)入羧基。具體來說，使三乙氧基甲硅烷基丙基琥珀酸酐溶解于N，N-二甲基甲酰胺，添加蒸餾水和4-二甲基氨基吡啶，在室溫下攪拌16小時，得到具有羧酸的硅烷偶聯(lián)劑。本反應(yīng)是通過4-二甲基氨基吡啶進行的琥珀酸酐的水解反應(yīng)。
通過具有羧酸的硅烷偶聯(lián)劑，將具有烷氧基甲硅烷基的有機顆粒浸泡在水-2-丙醇混合液中，添加具有羧酸的硅烷偶聯(lián)劑，然后加熱至50℃，反應(yīng)6小時。冷卻至室溫，然后用甲醇洗滌有機顆粒，干燥，可得到羧基直接導(dǎo)入到有機顆粒表面的顆粒。
2.通過有機硅氣相處理導(dǎo)入羧基(參照日本特公平1-54379號公報、日本特公平1-54380號公報、日本特公平1-54381號公報)。
首先通過1，3，5，7-四甲基環(huán)四硅氧烷對顆粒表面進行處理，使導(dǎo)入到表面的Si-H基與具有羧基的單體反應(yīng)，得到羧基化表面。
本方法中使用的單體可以使用羧基系單體。羧基系單體只要具有羧基和可聚合的乙烯基、丙烯基等反應(yīng)性部位即可。
“向具有羧基的顆粒中導(dǎo)入磷酰膽堿基的方法”接著，以下表示向羧基化顆粒表面導(dǎo)入磷酰膽堿基的方法(步驟2)。
將表面具有羧基的顆粒浸泡在N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺的溶液中，顆粒的表面被活性酯基覆蓋。向其中加入式(9)所示的具有氨基的磷酰膽堿衍生物溶液，導(dǎo)入磷酰膽堿基。
“關(guān)于配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團”上述反應(yīng)中，不使磷酰膽堿基與全部的羧基結(jié)合(調(diào)節(jié)反應(yīng)量)，則殘留的羧基成為配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團。該顆粒為權(quán)利要求2的親和顆粒，是式(1)所示的磷酰膽堿基和配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團直接存在于有機顆粒表面的顆粒。配體與該配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團結(jié)合，則成為權(quán)利要求3的親和顆粒，是式(1)所示的磷酰膽堿基和配體直接存在于有機顆粒的表面的顆粒。
權(quán)利要求2的親和顆粒是使用者根據(jù)要捕捉的物質(zhì)(目標(biāo)物質(zhì))，可使其與任意的配體結(jié)合的制品形式。權(quán)利要求3的親和顆粒是預(yù)先與配體結(jié)合的制品形式。權(quán)利要求1的親和顆粒是顆粒表面至少存在式(1)的磷酰膽堿基的親和顆粒，是不管有否配體或配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團，使用者根據(jù)要捕捉的物質(zhì)(目標(biāo)物質(zhì))，可以使其與任何配體結(jié)合的制品形式。只要是顆粒表面至少存在式(1)的磷酰膽堿基，則本發(fā)明包含任何形式的親和顆粒，例如也包含權(quán)利要求2和權(quán)利要求3的形式。
上述反應(yīng)中，使羧基作為配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團殘留，這可通過調(diào)節(jié)導(dǎo)入磷酰膽堿基的具有羧酸的硅烷偶聯(lián)劑的反應(yīng)量來進行。
使任意具有官能團的化合物與該羧基反應(yīng)，該官能團可以作為配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團。
“配體與具有羧基的顆粒的結(jié)合方法”配體為蛋白質(zhì)時，有機顆粒上的羧基浸泡在N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺的溶液中，使顆粒表面形成活性酯。使蛋白質(zhì)中的氨基與其反應(yīng)，以此結(jié)合蛋白質(zhì)。使任意的具有官能團的化合物與該羥基反應(yīng)，則該官能團可以作為蛋白質(zhì)可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團。
“目標(biāo)物質(zhì)的親和分離方法”
使用上述所得本發(fā)明的親和顆粒，可以進行本發(fā)明的目標(biāo)物質(zhì)的親和分離方法。
本發(fā)明方法利用有機顆粒，可簡便的進行高精度的分離，從這點來講，是具有劃時代意義的目標(biāo)物質(zhì)的分離方法。
本發(fā)明的方法包含以下三個步驟。當(dāng)為配體預(yù)先結(jié)合的親和顆粒時(權(quán)利要求2)，第1步驟已經(jīng)進行，因此省略。
1.使任意的配體與親和顆粒化學(xué)結(jié)合的第1步驟，其中，親和顆粒的特征在于有機顆粒的表面以共價鍵的形式具有式(1)所示的磷酰膽堿基，或者有機顆粒的表面以共價鍵的形式具有式(1)所示的磷酰膽堿基且有機顆粒的表面以共價鍵或吸附的形式具有配體，該配體與某種目標(biāo)物質(zhì)具有特異親和性。
例如，有機顆粒的表面具有式(1)所示的磷酰膽堿基和配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團，其中前者以共價鍵結(jié)合，后者以共價鍵或吸附形式結(jié)合，將這樣的親和顆粒和1ml任意的配體PBS溶液裝入2ml微量離心管中，在4℃下緩慢振蕩30分鐘。以15000rpm離心30分鐘，傾去上清。為了清洗，加入1ml PBS溶液，緩慢振蕩，以15000rpm離心30分鐘，傾去上清。將該漂洗操作重復(fù)三次。
2.使第1步驟中制備的親和顆粒分散于液體試樣中的第2步驟，其中所述液體試樣含有可被任意的配體選擇性捕捉的目標(biāo)物質(zhì)。
例如，使第1步驟中制備的親和顆粒分散于液體試樣中，其中液體試樣含有可被任意的配體選擇性地捕捉的目標(biāo)物質(zhì)，在4℃下緩慢振蕩30分鐘。以15000rpm離心5分鐘，傾去上清。為了漂洗，加入1ml PBS溶液，緩慢振蕩，以15000rpm離心30分鐘，傾去上清。將該漂洗操作重復(fù)3次。
3.從分離出的親和顆粒中回收捕捉的目標(biāo)物質(zhì)的第3步驟。
例如為了從親和顆粒中回收捕捉的目標(biāo)物質(zhì)，加入1ml洗脫緩沖液，在4℃下緩慢振蕩30分鐘，從顆粒中洗脫目標(biāo)物質(zhì)，回收上清。加入1ml洗脫緩沖液，緩慢振蕩，以15000rpm離心30分鐘，回收上清。將該操作重復(fù)2次。
圖1是表示通過本發(fā)明的親和顆粒與以往的親和顆粒捕捉目標(biāo)物質(zhì)的選擇性的差異的模式圖。
實施例下面根據(jù)實施例進一步詳細說明本發(fā)明。本發(fā)明不受這些實施例的限定。導(dǎo)入到顆粒表面的磷酰膽堿基可通過以下方法進行確認(rèn)、定量。
<定量方法>
將所得顆粒浸泡在高氯酸中，加熱至180℃使其分解。將所得溶液用水稀釋，向其中加入七鉬酸六銨四水合物和L抗壞血酸，在95℃下顯色5分鐘，然后進行710nm的吸光度測定，求出導(dǎo)入量。校正曲線使用磷酸二氫鈉水溶液。
“合成例1”“含有磷酰膽堿基的醛化合物”將6.29g 1-α-甘油磷酰膽堿溶解于210ml蒸餾水，在冰水浴中冷卻。添加10.23g高碘酸鈉，攪拌5小時。減壓濃縮反應(yīng)液，減壓干燥，通過甲醇萃取目標(biāo)物。下述化合物(6)表示其結(jié)構(gòu)。
式(6)的化合物在重水中的1H NMR波譜如圖2所示。式(6)的化合物在水中與式(10)呈平衡狀態(tài)，因此實際的波譜反應(yīng)了式(6)和式(10)雙方。
[化18] “合成例2”“含有磷酰膽堿基的羧酸化合物”將5g 1-α-甘油磷酰膽堿溶解于70ml水-30ml乙腈。在冰冷卻下添加17g高碘酸鈉和80mg三氯化釕，攪拌過夜。過濾沉淀物，減壓濃縮，用甲醇萃取，得到化學(xué)式(7)所示的目標(biāo)羧甲基磷酰膽堿。
式(7)的化合物在重水中的1H NMR波譜如圖3所示。
“參考例1”“苯乙烯-甲基丙烯酸縮水甘油酯顆?！睂?.6g甲基丙烯酸縮水甘油酯、2.4g苯乙烯、0.08g二乙烯基苯添加到220ml用氮取代進行了充分脫氣的純凈水中。添加0.12gV-60聚合引發(fā)劑，在70℃下攪拌1小時。再添加0.6g甲基丙烯酸縮水甘油酯，在70℃下攪拌過夜。冷卻至室溫，通過離心(15000rpm×30分鐘，3次)進行純化，得到目標(biāo)顆粒。
“導(dǎo)入氨基的苯乙烯-甲基丙烯酸縮水甘油酯顆?！睂?g苯乙烯-甲基丙烯酸縮水甘油酯顆粒分散于80ml純凈水中，添加20ml 25％氨水溶液，在70℃下加熱攪拌過夜。冷卻至室溫，通過離心(17000rpm×60分鐘，3次)進行純化。
“磷酰膽堿修飾顆粒(PC顆粒(A))”將0.5g導(dǎo)入了氨基的苯乙烯-甲基丙烯酸縮水甘油酯顆粒分散于10ml甲醇中，添加0.5g合成例1的醛體，攪拌過夜。在冰水浴中添加140mg氰基硼酸鈉，攪拌6小時，然后通過離心(17000rpm×60分鐘，3次)進行純化，得到PC顆粒(A)。
“鹽發(fā)生的凝聚”圖4、5中給出了參考例1中制備的苯乙烯-甲基丙烯酸縮水甘油酯顆粒和PC顆粒(A)在水中和食鹽水(0.1M水溶液)中的粒度分布。
圖4中，對于使用親和顆粒的膠乳凝聚法中通常使用的苯乙烯-甲基丙烯酸縮水甘油酯顆粒在水中的粒度分布的大小比較，在NaCl水溶液中的粒度分布的大小大幅增大，表示發(fā)生了凝聚。而圖5與圖4相比較，PC顆粒(A)在食鹽水溶液中的粒度分布變化小，表示難以發(fā)生鹽引起的凝聚。以上表明PC顆粒(A)通過式(1)的磷酰膽堿的修飾，可降低鹽等妨礙物質(zhì)的影響，提高測定精度。
“對抑制蛋白質(zhì)非特異吸附的評價”分別取25mg參考例1中制備的苯乙烯-甲基丙烯酸縮水甘油酯顆粒和PC顆粒(A)，加入1ml蒸餾水，進行1分鐘超聲波處理。離心除去蒸餾水，加入1ml 100μg/ml白蛋白或100μg/ml溶菌酶，在室溫下反應(yīng)1小時，通過MICRO BCA法對離心(5000g)后的上清進行定量。結(jié)果如圖6所示。由此可知與苯乙烯-甲基丙烯酸縮水甘油酯顆粒相比，用磷酰膽堿基處理的PC顆粒(A)強烈抑制白蛋白、溶菌酶的吸附。通過式(1)的磷酰膽堿的修飾，蛋白質(zhì)的吸附量大幅減少。除顆粒之間的凝聚外，各種蛋白質(zhì)對顆粒的非特異性吸附也是測定精度降低的主要原因，因此，本發(fā)明的親和顆粒被配體只選擇性地捕捉目標(biāo)蛋白質(zhì)的精度優(yōu)異。
“參考例2”“甲基丙烯酸2-氨基乙酯-N-異丙基丙烯酰胺-亞甲基雙丙烯酰胺顆粒”將1.35g N-異丙基丙烯酰胺和58mg亞甲基丙烯酰胺添加到200ml用氮取代進行了充分脫氣的純凈水中。添加7mg V-50聚合引發(fā)劑，在70℃下攪拌30分鐘。添加100mg甲基丙烯酸2-氨基乙酯，再在70℃下攪拌4小時，冷卻至室溫，然后在水中透析，通過冷凍干燥得到目標(biāo)顆粒。
“磷酰膽堿修飾顆粒(PC顆粒(B))”將0.1g所得甲基丙烯酸2-氨基乙酯-N-異丙基丙烯酰胺-亞甲基雙丙烯酰胺顆粒分散于20ml甲醇中，添加25mg合成例1的醛體，攪拌過夜。在冰水浴中添加6mg氰基硼酸鈉，攪拌6小時，然后通過在水中透析進行純化，得到PC顆粒(B)。
“磷酰膽堿修飾顆粒(PC顆粒(C))”將0.1g所得甲基丙烯酸2-氨基乙酯-N-異丙基丙烯酰胺-亞甲基雙丙烯酰胺顆粒分散于8ml二甲基亞砜-2ml水中，添加溶解有25mg合成例2的羧基體、20mg N-羥基琥珀酰亞胺、23mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽的1ml水，攪拌過夜。通過在水中透析進行純化，得到PC顆粒(C)。
“對抑制蛋白質(zhì)非特異吸附的評價”分別取25mg參考例1中制備的苯乙烯-甲基丙烯酸縮水甘油酯顆粒和參考例2中制備的PC顆粒(B)、(C)，加入1ml蒸餾水，進行1分鐘超聲波處理。離心除去蒸餾水，加入1ml 100μg/ml白蛋白或100μg/ml溶菌酶，在室溫下反應(yīng)1小時，通過MICRO BCA法對離心(5000g)后的上清進行定量。結(jié)果如圖7所示。與苯乙烯-甲基丙烯酸縮水甘油酯顆粒相比，用磷酰膽堿基處理的PC顆粒(B)、(C)強烈抑制白蛋白、溶菌酶的吸附。由此可知通過式(1)的磷酰膽堿的修飾，蛋白質(zhì)的吸附量大幅減少。除顆粒之間的凝聚外，各種蛋白質(zhì)對顆粒的非特異性吸附也是測定精度降低的主要原因，因此，本發(fā)明的親和顆粒被配體只選擇性地捕捉目標(biāo)蛋白質(zhì)的精度優(yōu)異。
“參考例3”“磷酰膽堿修飾顆粒(PC顆粒(D))”將100mg瓊脂糖珠(交聯(lián)率6％)分散于10ml無水N，N’-二甲基甲酰胺中，將50mg合成例2的羧基體和25mg亞硫酰氯溶解于1ml無水N，N’-二甲基甲酰胺中，添加反應(yīng)的溶液，在室溫下攪拌3小時。通過用N，N’-二甲基甲酰胺、乙腈依次離心，進行純化，得到PC顆粒(D)。
“對抑制蛋白質(zhì)非特異吸附的評價”分別取25mg參考例1中制備的苯乙烯-甲基丙烯酸縮水甘油酯顆粒和參考例3中制備的PC顆粒(D)，加入1ml蒸餾水，進行1分鐘超聲波處理。離心除去蒸餾水，加入1ml 100μg/ml白蛋白或100μg/ml溶菌酶，在室溫下反應(yīng)1小時，通過MICRO BCA法對離心(5000g)后的上清進行定量。結(jié)果如圖8所示。與瓊脂糖珠相比，用磷酰膽堿基處理的PC顆粒(D)強烈抑制白蛋白、溶菌酶的吸附。由此可知通過式(1)的磷酰膽堿的修飾，蛋白質(zhì)的吸附量大幅減少。除顆粒之間的凝聚外，各種蛋白質(zhì)對顆粒的非特異性吸附也是測定精度降低的主要原因，因此，本發(fā)明的親和顆粒被配體只選擇性地捕捉目標(biāo)蛋白質(zhì)的精度優(yōu)異。
“實施例1”“親和顆粒”以下給出權(quán)利要求6所示的親和分離法。向0.1g參考例2中得到的甲基丙烯酸2-氨基乙酯-N-異丙基丙烯酰胺-亞甲基雙丙烯酰胺顆粒中添加10mg合成例1的醛體，攪拌過夜，然后在冰水浴中添加3mg氰基硼酸鈉，攪拌6小時，然后通過在水中透析進行純化、制備。向25mg該親和顆粒中加入1mL 8％戊二醛溶液和10mg用于穩(wěn)定席夫堿的氰基硼氫化鈉(シアノトリヒドロホウ酸ナトリウム)，在室溫下反應(yīng)5小時，用PBS離心·純化(5000g)5次。得到戊二醛為配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團的權(quán)利要求2的親和顆粒。接著加入1ml 1mg/ml牛白蛋白或1mg/ml人血紅蛋白和10mg硼氫化鈉，在室溫下反應(yīng)1天，用PBS進行4次離心·純化(5000g)。該牛白蛋白或人血紅蛋白為配體。以下是權(quán)利要求7所示的親和分離方法。為了使殘留的戊二醛基失活，加入1ml乙醇胺鹽酸鹽(0.5M、pH 7.1)和10mg硼氫化鈉(トリヒドロホウ酸ナトリウム)，在室溫下反應(yīng)1小時，用PBS進行4次離心·純化(5000g)，得到權(quán)利要求3的親和顆粒。接著加入1ml HRP標(biāo)記抗牛白蛋白抗體(10μg/ml)或HRP標(biāo)記抗人血紅蛋白抗體(10μg/ml)，在室溫下反應(yīng)1小時，用PBS離心純化(5000g)5次。再加入1ml PBS，攪拌，將10μl轉(zhuǎn)移至96孔板，用底物TMBZ進行顯色實驗，用450nm進行測定。其結(jié)果如圖9所示?？芍褂萌魏蔚呐潴w，都可以高選擇性捕捉目標(biāo)抗體。
“比較例1”
對0.1g參考例2中得到的甲基丙烯酸2-氨基乙酯-N-異丙基丙烯酰胺-亞甲基雙丙烯酰胺顆粒不經(jīng)磷酰膽堿修飾，進行與實施例相同的操作，結(jié)果如圖10所示?？芍c實施例1比較，使用任何配體，選擇性都低。
產(chǎn)業(yè)實用性本發(fā)明的親和顆粒只捕捉要分離的目標(biāo)蛋白質(zhì)，因此選擇性極高。另外分散性優(yōu)異，極容易從液體試樣中分離。鹽產(chǎn)生的凝聚少，因此可簡便且高精度地分離目標(biāo)物質(zhì)。作為免疫沉淀法、膠乳凝聚法等的試劑，可以不受鹽的影響，靈敏度良好地檢測，因此可用作要求高精度分離、檢測目標(biāo)物質(zhì)的生物體相關(guān)產(chǎn)業(yè)。
權(quán)利要求
1.一種親和顆粒，其特征在于有機顆粒的表面以共價鍵的形式具有下述式(1)所示的磷酰膽堿基[化1]
2.一種親和顆粒，其特征在于有機顆粒的表面以共價鍵的形式具有下述式(1)所示的磷酰膽堿基，有機顆粒的表面以共價鍵或吸附的形式具有可與對某種目標(biāo)物質(zhì)具有特異親和性的配體結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團[化2]
3.一種親和顆粒，其特征在于有機顆粒的表面以共價鍵的形式具有下述式(1)所示的磷酰膽堿基，有機顆粒的表面以共價鍵或吸附的形式具有與某種目標(biāo)物質(zhì)具有特異親和性的配體[化3]
4.權(quán)利要求1-3中任一項的親和顆粒，其特征在于上述有機顆粒為合成顆?；蚨嗵穷悾渲兴龊铣深w粒是聚合物中含有選自苯乙烯、甲基丙烯酸縮水甘油酯、(甲基)丙烯酸、N-烷基丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸烷基酯中的1種或多種單體單元而得到的，多糖類含有瓊脂糖或瓊脂糖凝膠(Sepharose)，其平均粒徑為20nm-500μm。
5.權(quán)利要求1-4中任一項的親和顆粒，其特征在于上述配體為選自各種抗體、抗原、酶、底物、受體、肽、DNA、RNA、核酸配體、蛋白A、蛋白G、抗生物素蛋白、生物素、螯形化合物、各種金屬離子的一種或多種配體。
6.一種通過有機顆粒進行的目標(biāo)物質(zhì)的親和分離方法，其特征在于包含以下步驟(1)使權(quán)利要求1或2的親和顆粒與任意的配體結(jié)合的第1步驟，(2)使第1步驟中制造的親和顆粒分散于液體試樣中的第2步驟，其中液體試樣含有被任意的配體選擇性捕捉的目標(biāo)物質(zhì)，(3)回收由親和顆粒捕捉的目標(biāo)物質(zhì)的第3步驟。
7.一種通過有機顆粒進行的目標(biāo)物質(zhì)的親和分離方法，其特征在于包含以下步驟(1)使權(quán)利要求3的親和顆粒分散于液體試樣中的第1步驟，其中所述液體試樣含有被任意的配體選擇性捕捉的目標(biāo)物質(zhì)，(2)回收由親和顆粒捕捉的目標(biāo)物質(zhì)的第2步驟。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供親和顆粒，其特征在于有機顆粒的表面以共價鍵具有下述式(1)所示的磷酰膽堿基，有機顆粒的表面以共價鍵或吸附的形式具有與某種目標(biāo)物質(zhì)具有特異性親和性的配體。本發(fā)明的目的還在于提供親和分離方法，該方法通過利用有機顆粒的親和顆粒，可簡便且高精度地分離目標(biāo)物質(zhì)。
文檔編號G01N33/566GK1956780SQ20058001658
公開日2007年5月2日 申請日期2005年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月24日
發(fā)明者宮澤和之, 前野克行 申請人:株式會社資生堂