專利名稱：用于癌癥的診斷標記物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多種不同的蛋白質(zhì)作為癌癥的診斷標記物的用途，活性物質(zhì)用于治療癌癥的應(yīng)用，和相關(guān)的藥物學(xué)制品和試劑盒。
通常癌癥疾病以一個或多個腫瘤的發(fā)展為特征。腫瘤意味著組織的生長或組織體積的局部增加。廣義上來說，每個局部化的腫脹都屬于這個分類，例如水腫、急性或慢性的炎癥、由動脈瘤引起的擴張、器官的炎性生長(例如，所謂的脾腫瘤)。更狹義地說，腫瘤意味著通過機體組織的自發(fā)、不受控制、不受抑制至不同程度的、自主和不可逆的生長，連同細胞和組織特定功能喪失的新組織(贅疣、胚細胞瘤、成瘤)形成。
為了更好的分類，根據(jù)下列標準劃分腫瘤I.其生物學(xué)特性1.具有生長緩慢的分化細胞且替代正常組織的良性腫瘤2.顯示多態(tài)性的細胞核、非典型細胞、退行性變化、侵入性和破壞性生長及轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤3.顯示惡性腫瘤的組織學(xué)特征和局部浸潤生長但通常缺少轉(zhuǎn)移的半-惡性腫瘤。
II.組織發(fā)生標準就此而言，根據(jù)其發(fā)育起源的胚性組織來分類腫瘤。有1.起源于外胚層和內(nèi)胚層的上皮腫瘤a)良性腫瘤，類似于腺瘤、乳頭狀瘤或息肉b)惡性腫瘤，例如癌瘤2.起源于中胚層的間質(zhì)腫瘤a)良性腫瘤，類似于脂肪瘤、纖維瘤、骨瘤、肌瘤、平滑肌瘤、橫紋肌瘤、軟骨瘤b)惡性腫瘤，例如肉瘤3.發(fā)育自未分化組織的胚性腫瘤。腎胚細胞瘤、成神經(jīng)細胞瘤、成神經(jīng)管細胞瘤、成視網(wǎng)膜細胞瘤、胚性橫紋肌肉瘤、畸胎瘤屬于這個部分。
III.根據(jù)臨床和病理學(xué)結(jié)果的分類。在這些當中的是TNM-分類、分級、Laurén-分類、Dukes-分類、Kieler分類、Rappaport-分類等。
這個腫瘤分類的簡短縱覽正好顯示了不同類型的腫瘤是多么變化多端、相互交疊甚至對立。不僅在良性和惡性腫瘤之間存在差異；而且必須考慮到某些腫瘤的致死性以及良性腫瘤可成為惡性的可能性。
一些腫瘤，例如，乳腺癌瘤(乳腺癌)，婦女中最普遍的惡性腫瘤，尤其大量地發(fā)生在45和70歲之間。早期癥狀是癌癥預(yù)防體制中的檢查或乳房的定期自檢期間的可疑結(jié)果。根據(jù)腫瘤發(fā)育和分化的階段，預(yù)后可以是非常積極的至確實嚴重的范圍。由于乳腺癌的早期生淋巴和造血轉(zhuǎn)移，盡可能及早地快速診斷對于啟動治療措施是必要的。
前列腺癌(前列腺的癌瘤)是男性中最普遍的腫瘤，大多發(fā)生在50和70歲之間。主要的病例是腺癌。這種類型的惡性腫瘤首先通過在前列腺中的侵入性生長而擴散，稍后浸潤過渡區(qū)和腎盂結(jié)締組織中的細胞，以及很少浸潤腸、膀胱或尿道中的細胞。轉(zhuǎn)移通過生淋巴和/或造血途徑發(fā)生。治療措施取決于分化和臨床階段的組織學(xué)級別，并且通常意味著根治性手術(shù)，從而完全移除前列腺和淋巴結(jié)區(qū)；在發(fā)展性階段中撤除雄性激素是一種措施。預(yù)后也取決于腫瘤的階段。早期階段中根治性手術(shù)治愈大約90％的前列腺癌，而在發(fā)展性階段中預(yù)后經(jīng)常是很弱的。
前列腺癌必須通過診斷方式與前列腺增生區(qū)別開來。前列腺增生是前列腺的良性腫瘤；該腺體通過基質(zhì)細胞和腺體的數(shù)目增加而變得增大。前列腺增生是上了年紀的男性中排尿困難的最普遍原因。臨床癥狀通常發(fā)生在40和50歲之間，并且該疾病緩慢和逐步地進展。癥狀經(jīng)常在逐步減弱尿的射出和延遲排尿若干年后出現(xiàn)。植物治療的應(yīng)用可能是治療性的使用，并緩和臨床癥狀。
一般，腫瘤的早期診斷對于快速啟動治療措施是必需的。如果腫瘤被早期檢測到；則預(yù)后得到提高；因此許多所謂的腫瘤標記物被用于臨床實踐。腫瘤標記物是可被鑒定或定量的分子或細胞改變物以獲得關(guān)于(惡性)病癥存在、進展和預(yù)后的信息。腫瘤標記物被劃分為1.細胞腫瘤標記物這個組尤其包含細胞膜的腫瘤抗原、受體(例如，激素受體、白血病中生長刺激物質(zhì)的受體)，和代表癌基因表達增加和單克隆細胞生長的細胞標記物，以及遺傳改造物，特別是染色體畸變。
2.體液腫瘤標記物在生理學(xué)條件下，可在生物樣品，特別是在血清、尿和其他體液中檢測到增加濃度的這些物質(zhì)(其大多屬于正常的生理學(xué)組成部分)。它們在腫瘤組織中合成和/或分泌，通過破壞腫瘤細胞或在組織對腫瘤的應(yīng)答中釋放。對腫瘤標記物的生理相關(guān)性只有很少的理解。在人體中，它通常不具有免疫原特性。它們的臨床(診斷)顯著性依賴于特異性和靈敏度。體液腫瘤標記物被分為兩類。一組包括由腫瘤產(chǎn)生的標記物，例如腫瘤締合的抗原、特定的激素(例如，促胃液素、皮質(zhì)醇等)、酶(例如，神經(jīng)元-特異的烯醇酶，NSE)或蛋白質(zhì)(例如，Bence-Jones-蛋白質(zhì))。通過腫瘤誘導(dǎo)而不是通過腫瘤細胞產(chǎn)生的腫瘤標記物屬于第二組。第二組的重要成員是堿性磷酸酶(AP)、LDH(乳酸脫氫酶)、新喋呤等。
最近的出版物公開了可在兒童中最常見的腦部腫瘤，成髓細胞瘤的兩個代表性細胞系中檢測到，并且可能被用作腫瘤標記物的蛋白質(zhì)的列表(A.Peyrl等，2003，Proteomics，3，1781-1800)。US6,645,465公開了屬于Ca2+結(jié)合蛋白的膜聯(lián)蛋白A1和A2可用作肺癌、乳腺癌和食管癌的腫瘤標記物，并且可通過檢測直接指向它們的自身-抗體而加以鑒定。在動物實驗中可能顯示使用針對膜聯(lián)蛋白A1的放射性標記的抗體導(dǎo)致腫瘤質(zhì)量損失，這可能促進腫瘤細胞的細胞壞死(P.Oh，Y.Li，J.Yu，E.Durr，K.M.Krasinska，L.A.Carver，J.E.Testa，J.E.Schnitzer，2004，Nature，429，629-35)。
最近已經(jīng)在膜聯(lián)蛋白A3指示作為鑒定蛋白這方面的惡性和非惡性(良性)的胰腺上皮細胞中進行差異豐度分析(A.R.Shekouh等，2003，Proteomics，3，1988-2001)。也已經(jīng)研究了惡性和非惡性前列腺組織中蛋白質(zhì)的豐度?？紤]就這方面所鑒定的蛋白質(zhì)，基本上沒有給出關(guān)于癌癥組織中列出的蛋白質(zhì)與健康組織中相比較可能過表達或表達不足的進一步細節(jié)(A.A.Alaiya等，2001，Cell.Mol.Life Sci.，58，307-311)。
迄今為止的報道證明了用于腫瘤檢測的選擇性和靈敏方法的重要性。此外，非常需要分別用于腫瘤和癌癥治療的新靶物。
因此本發(fā)明涉及開發(fā)用于癌癥診斷的新標記物以及用于癌癥治療的新靶物和藥物的問題。
這個問題將通過獨立權(quán)利要求的技術(shù)方案來解決。優(yōu)選的實施方案在從屬權(quán)利要求中給出。通過引用參考，全部權(quán)利要求的措辭成為說明書的完整部分。
通過惡性退化組織(癌組織)和正常組織之間的集中比較分析，可鑒定出在不同類型的組織中顯示明顯不同豐度和濃度的獨特的蛋白質(zhì)組。與對照相比較的某些蛋白質(zhì)的特征性豐度代表了退化細胞生長，即癌組織的重要指標。根據(jù)本發(fā)明，這些特定的蛋白質(zhì)被用作癌癥的診斷標記物。
為了鑒定這些蛋白質(zhì)，制備來自腫瘤組織(前列腺癌)和健康組織的樣品，兩個樣品用兩種不同的放射性同位素標記。匯集樣品，混合物通過在雙向聚丙烯酰胺凝膠上電泳來分離。單獨檢測每個同位素的信號，進一步分析相應(yīng)的蛋白質(zhì)點。這個方法鑒定和定量在癌癥或健康組織中明顯具有不同豐度的幾個獨特蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)中的一些在癌組織中明顯是更豐富的，其被上調(diào)，而另一些以明顯較低的豐度存在，它們被下調(diào)。
本發(fā)明涵蓋蛋白質(zhì)膜聯(lián)蛋白，特別是膜聯(lián)蛋白A3作為癌癥的診斷標記物的應(yīng)用。本發(fā)明人能夠證明這個蛋白質(zhì)在來自明確集合的患者的腫瘤組織中平均被上調(diào)2.4倍，而在某些情況下上調(diào)超過5倍。在特別優(yōu)選的實施方案中，膜聯(lián)蛋白A3可因此被用作前列腺癌的特定亞型(患者群)的診斷標記。因此這個蛋白質(zhì)相對于對照的上調(diào)被優(yōu)選研究作為癌組織的特征性指標。膜聯(lián)蛋白是在存在鈣時結(jié)合磷脂并形成鈣孔的結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白質(zhì)家族的成員。迄今為止膜聯(lián)蛋白的精確功能尚不完全清楚。
有跡象表明膜聯(lián)蛋白參與胞內(nèi)和胞外過程。但是仍然未知膜聯(lián)蛋白如何被分泌，例如膜交通、細胞運動性Ca2+流入和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。例如，它們沒有用于轉(zhuǎn)移進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的經(jīng)典前導(dǎo)序列。但是可在小分泌泡，所謂的核外體中發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白，因此推測膜聯(lián)蛋白借助于核外體的裂解到達細胞的外側(cè)。所述囊泡的裂解可導(dǎo)致腫瘤中修飾抗原的呈遞。一般，核外體涉及免疫系統(tǒng)中抗原的呈遞，其涉及MHC類I/T-細胞系統(tǒng)。
有趣的是，膜聯(lián)蛋白參與骨礦化(Wang W.Xu J.，Kirsch T 2003 J.Biol.Chem.2003，2783762-9)。膜聯(lián)蛋白-介導(dǎo)的Ca2+流入調(diào)節(jié)生長面軟骨細胞成熟和細胞凋亡。這是特別顯著的，因為前列腺癌的轉(zhuǎn)移與其他癌癥類型相比通常產(chǎn)生高頻率的成骨細胞骨病變。大多數(shù)癌癥轉(zhuǎn)移以其溶骨活性為特征，這意味著骨的退化。相比之下，前列腺癌轉(zhuǎn)移顯示破壞骨(破壞性)以及成骨(增殖)活性。在這種情況下，正常的骨結(jié)晶體解構(gòu)，然后再建立為不規(guī)則的骨沉積物。即使對這個機制只有很少的了解，礦質(zhì)化的生理學(xué)過程扮演重要的角色。礦質(zhì)化由礦質(zhì)化成骨細胞的質(zhì)膜分泌的小泡，所謂的基質(zhì)小泡引起。在早期階段，磷酸鈣的晶體在基質(zhì)小泡內(nèi)側(cè)出現(xiàn)。這些小泡被膜覆蓋；因此通道蛋白是為轉(zhuǎn)運礦物質(zhì)進入小泡所必需的。小泡的重要成分是蛋白質(zhì)膜聯(lián)蛋白A2、A5和A6以及小泡外表面上結(jié)合膜聯(lián)蛋白A5以粘附至小泡外表面的膠原II和X型。膜聯(lián)蛋白通過基質(zhì)小泡的膜形成通道，其容許Ca2+進入小泡內(nèi)部。結(jié)合膜聯(lián)蛋白A5的膠原擴增通道活性，并與其他膜聯(lián)蛋白一起介導(dǎo)Ca2+的快速流入以及小泡內(nèi)最初結(jié)晶相的形成。這導(dǎo)致礦質(zhì)化的起始。當胞內(nèi)晶體已經(jīng)達到臨界大小，其破壞膜并裂解小泡。晶體進一步生長(礦質(zhì)化的生長階段)并促進骨的建立。根據(jù)本發(fā)明人的結(jié)果，由前列腺癌轉(zhuǎn)移造成的骨的不規(guī)則礦質(zhì)化中膜聯(lián)蛋白的這個功能推測與癌組織中膜聯(lián)蛋白A3的上調(diào)相關(guān)。在本文中，必須考慮無機焦磷酸酶，根據(jù)本發(fā)明人的結(jié)果，這個酶釋放磷酸，并且在癌癥，特別是前列腺癌中被上調(diào)。從癌細胞中膜聯(lián)蛋白A3的上調(diào)可得出結(jié)論，膜聯(lián)蛋白A3在前列腺癌細胞的核外體中具有生物功能。這可能是由于離子通道的關(guān)系。蛋白質(zhì)膜聯(lián)蛋白A3的優(yōu)選應(yīng)用涉及核外體中蛋白質(zhì)的活性。優(yōu)選地，這導(dǎo)致腫瘤細胞免疫學(xué)控制的變化。由于膜聯(lián)蛋白A3的細胞外濃度在腫瘤細胞附近是更高的，親合試劑-特別是對膜聯(lián)蛋白A3具有高親合力的抗體-適于指向類似于鄰近腫瘤的毒素或放射性化合物的活性物質(zhì)。這種藥品不會通過細胞膜，以使得只表達胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3的健康細胞不受到影響。有趣的是，也已經(jīng)觀察到基質(zhì)小泡與骨關(guān)節(jié)炎軟骨和動脈粥樣硬化損傷相關(guān)。
核外體裂解后發(fā)生的細胞質(zhì)蛋白釋放進入胞外介質(zhì)可誘導(dǎo)與細胞壞死相似的炎癥反應(yīng)。已知炎癥可減少已知表征許多癌細胞的適應(yīng)性T-細胞-導(dǎo)致的免疫應(yīng)答。此外，胞外空間中膜聯(lián)蛋白的存在也可影響這個模式(A.Bonanza等，2004 J.Exp.Med.200 1157-65)。因此可通過了解和影響這個系統(tǒng)確定針對癌癥的疫苗接種。
應(yīng)用膜聯(lián)蛋白A3的特別優(yōu)選的實施方案涉及該蛋白質(zhì)的上調(diào)和膜聯(lián)蛋白A1、膜聯(lián)蛋白A2和/或膜聯(lián)蛋白A5的同時下調(diào)。優(yōu)選地這與對照比較進行。最近已經(jīng)證實在癌組織，特別是前列腺癌中膜聯(lián)蛋白A1、膜聯(lián)蛋白A2和膜聯(lián)蛋白A5被下調(diào)。因此結(jié)合分析一種或多種其他的膜聯(lián)蛋白的下調(diào)和膜聯(lián)蛋白A3的上調(diào)是特別有益的。根據(jù)這些結(jié)果，在前列腺癌發(fā)生期間膜聯(lián)蛋白A3可替代其他的膜聯(lián)蛋白，因此是用于前列腺癌治療的替代標記物或靶物。
本發(fā)明也涵蓋蛋白質(zhì)泛素異肽酶T和/或蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)作為癌癥的診斷標記物的應(yīng)用。有利的是，與對照相比較泛素異肽酶T的下調(diào)和/或蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)的上調(diào)應(yīng)被用作癌癥組織的特征性標記物。本發(fā)明人證明與健康組織相比較癌癥組織中泛素異肽酶T的豐度平均低了5-6倍，而PDI的豐度高大約2倍。這證明PDI和泛素異肽酶T之間的逆相關(guān)。
泛素異肽酶是連同其他酶一起涉及蛋白質(zhì)的泛素依賴的蛋白水解切割的酶。在向靶蛋白質(zhì)加入聚泛素鏈后，該泛素化的蛋白質(zhì)被由多個亞基組成的蛋白質(zhì)復(fù)合物，26S蛋白酶體降解。隨后通過鋅-結(jié)合泛素酶異肽酶T介導(dǎo)聚泛素鏈的去除。因此泛素異肽酶T的下調(diào)可影響前列腺癌中泛素導(dǎo)致的蛋白水解的速度，或特異蛋白質(zhì)的降解速率。而且如泛素異肽酶T PDI涉及蛋白質(zhì)的控制水解，即細胞凋亡過程。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)部，PDI在某些條件下與具有泛素樣結(jié)構(gòu)域和泛素締合結(jié)構(gòu)域的泛素相互作用。這種相互作用與獲得對缺血性應(yīng)力和細胞凋亡的耐受力功能性相關(guān)(Ko H.S.，等，2002，J.Biol.Chem.27735386-92)。
兩個酶與細胞凋亡的關(guān)系使得對其上調(diào)或下調(diào)的觀察適合作為癌組織的特征性標記物。另一方面，只分析一個蛋白質(zhì)，特別是作為診斷標記物的泛素異肽酶T的豐度可能是有利的。很大的優(yōu)點是，癌組織中泛素異肽酶被顯著下調(diào)，并顯示只有健康對照中豐度的大約1/5至大約1/6。所觀察到的癌組織中泛素-異肽酶T的豐度減少比起被識別為抗-致癌物的哺乳動物脂肪酸-結(jié)合蛋白(M-FABP)來說是更顯著的。
膜聯(lián)蛋白通過MHC(主要組織相容性復(fù)合物)抗原呈遞借助于泛素-異肽酶T和由于前列腺組織中缺少含有免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的SAP，通過全身免疫系統(tǒng)的變化活性來影響T-細胞活性之間的可能聯(lián)系對于免疫系統(tǒng)存在時腫瘤細胞的存活可能是極為重要的。
本發(fā)明也涵蓋線粒體烯?；?輔酶A-水合酶作為癌癥的診斷標記物和/或作為治療靶分子的用途。這個蛋白也可與脂肪酸-結(jié)合蛋白3(FABP-3)和/或表皮脂肪酸-結(jié)合蛋白(E-FABP)和/或膜聯(lián)蛋白A3組合使用。給出的特別優(yōu)選是與對照相比較進行線粒體烯?；?輔酶A-水合酶和/或表皮脂肪酸-結(jié)合蛋白(E-FABP)的上調(diào)和/或脂肪酸-結(jié)合蛋白3(FABP-3)和/或膜聯(lián)蛋白A3的下調(diào)，因為根據(jù)本發(fā)明這些蛋白質(zhì)的這種上調(diào)/下調(diào)揭示為癌組織的特征性特點。
本發(fā)明人已經(jīng)能夠顯示癌組織中線粒體烯酰基-輔酶A-水合酶具有平均增加大約2.8至4倍的豐度。已經(jīng)描述這個酶與脂肪酸的β-氧化協(xié)同，并且這主要發(fā)生在線粒體中。烯?；?輔酶A-水合酶參與非氧化的代謝作用。長久以來已知即使存在氧過量時，癌細胞仍具有增加的、非氧化代謝，并且癌癥患者中脂肪酸的氧化和重新合成都增加。在本文中列出的癌癥伴隨脂肪酸代謝的許多變化。最近負責脂肪酸重新合成的脂肪酸合酶已經(jīng)被建議作為治療性的藥物學(xué)靶物。提供的結(jié)果顯示烯酰基-輔酶A-水合酶是相似的適合靶物。以脂肪酸代謝的這個聯(lián)系代表了烯酰基-輔酶A-水合酶和FABP-3及E-FABP之間的功能性聯(lián)系。癌組織中這些脂肪酸-結(jié)合蛋白的豐度也被特征性地改變。FABP-3大致下調(diào)2.5倍，而E-FABP大致上調(diào)2.3倍。除與脂肪酸的聯(lián)系之外，已經(jīng)描述了FABP-3在與細胞循環(huán)控制的關(guān)系中的作用(Seidita G.等2000，Carcinogenesis 212203-10)。已經(jīng)描述了E-FABP與不同類型癌癥的關(guān)系，并且已經(jīng)在癌癥患者的尿中被檢測到(Brouard M.C.等2002，Melanoma-Research 12627-31)。由本發(fā)明人所觀察到的這個蛋白質(zhì)豐度的增加使得當與其他的標記物線粒體烯?；?輔酶A-水合酶和/或FABP-3和/或膜聯(lián)蛋白A3組合時，其特別適合作為癌癥的診斷標記物，因為在這些不同的蛋白質(zhì)之間存在功能性聯(lián)系。因此，與對照相比較，可觀察一個或特別有利地是觀察兩個或三個這些蛋白質(zhì)的豐度，以使得通過這些蛋白質(zhì)特征性的上/下調(diào)，可得到關(guān)于癌組織存在的結(jié)論。如此后將指明的，與脂肪酸代謝的聯(lián)系也被應(yīng)用于在此描述的更多蛋白質(zhì)。
本發(fā)明也涵蓋蛋白質(zhì)血清-淀粉狀蛋白P-成分(SAP)作為癌癥的診斷標記物或治療劑的用途。本發(fā)明人能夠顯示癌組織中這個蛋白平均揭示其發(fā)生率減少大約2.7至5.1倍。SAP主要存在于良性前列腺組織的間質(zhì)細胞中，使得其在癌組織中相對較低的發(fā)生率可解釋為癌組織中相對較少數(shù)量的間質(zhì)細胞。因此與對照相比較SAP下調(diào)的研究特別適合作為癌組織的特征性特點。SAP是正五聚蛋白家族的凝集素類似的急性期蛋白質(zhì)(來自小鼠的結(jié)果)，并且與幾個淀粉狀蛋白的臨床現(xiàn)象有關(guān)聯(lián)。有時在男性泌尿系統(tǒng)中觀察到淀粉狀蛋白的沉積，但很少對其有生物學(xué)的了解。超越淀粉狀蛋白小纖維而正確折疊的天然SAP也借助于酸碳水化合物決定簇、磷酸乙醇胺和磷酸膽堿結(jié)合多糖，包括細菌多糖和基質(zhì)成分。SAP是簡單膜的構(gòu)成成分，并且可能引起其與層粘連蛋白和磷脂的相互作用。它參與經(jīng)進化的或全身性免疫系統(tǒng)的吞噬細胞，例如多形核白細胞的靶識別，結(jié)合凋亡細胞上的磷脂，導(dǎo)致經(jīng)巨噬細胞的其吞噬作用。長久以來已知惡性人血清中的SAP水平增加，并且至少在一些癌癥患者的血清中，IL-6似乎對此負責。總而言之，可推測SAP參與非癌細胞與其環(huán)境相互作用的調(diào)節(jié)和可能的免疫監(jiān)測，這一功能可能在許多癌細胞中受到干擾。正五聚蛋白可通過細胞因子被誘導(dǎo)，其在血液中的濃度在感染和創(chuàng)傷期間顯著升高，因此它們在免疫防御中發(fā)揮作用。提供的觀察結(jié)果暗示了膜聯(lián)蛋白A3、泛素異肽酶T和血清-淀粉狀蛋白P-成分之間在前列腺免疫監(jiān)測中導(dǎo)致通過核外體而改變免疫監(jiān)測調(diào)節(jié)的聯(lián)系。
本發(fā)明也涵蓋蛋白質(zhì)14-3-3蛋白τ(tau)作為癌癥的診斷標記物的用途。已知這個蛋白質(zhì)參與凋亡過程。已經(jīng)描述這個過程與癌癥相關(guān)，但建立了抗-致癌物的狀態(tài)(He H.1997，Gan-To-Kagaku-Ryoho 241448-53)。然而，本發(fā)明人已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)癌組織中增加水平的14-3-3蛋白質(zhì)τ(1.8倍)。免疫組化學(xué)染色反應(yīng)已經(jīng)揭示14-3-3蛋白質(zhì)τ主要存在于健康的上皮細胞和前列腺組織的癌細胞中。然而在間質(zhì)中，蛋白質(zhì)14-3-3τ只存在于淋巴細胞(只有淋巴細胞被染色)中。因此根據(jù)本發(fā)明，與對照相比較研究該蛋白質(zhì)的上調(diào)作為癌組織的表征性特點。
本發(fā)明也涵蓋蛋白質(zhì)核氯離子通道蛋白(CLIC-1)作為癌癥，特別是前列腺癌的診斷標記物的用途。本發(fā)明人證實與對照相比較在癌組織中，這個蛋白質(zhì)的豐度增加大約1.5倍。因此優(yōu)選與對照相比較研究這個蛋白質(zhì)的上調(diào)作為癌組織的表征性特點。已經(jīng)描述這個細胞內(nèi)陰離子通道與細胞分裂和凋亡相關(guān)(Ashley R.H.，2003，Mol.Membr.Biol.201-11)。
此外，本發(fā)明涵蓋蛋白質(zhì)HES1作為癌癥的診斷標記物的應(yīng)用。本發(fā)明人可證明與對照相比癌組織中這個蛋白質(zhì)的豐度是大約4倍高。T-檢驗中相應(yīng)上調(diào)的概率的p-值＜0.0001。優(yōu)選與對照相比較的這個蛋白質(zhì)的上調(diào)被考慮是癌癥疾病的特征性標記物。這個蛋白質(zhì)是具有未知功能的特定拼接變體(HES1/Kpn-la)。它包含DJ1-Pfdl-結(jié)構(gòu)域；推測其位于線粒體，這可表明與烯?；?輔酶A-水合酶功能的可能聯(lián)系。這個蛋白質(zhì)在許多人組織中表達。其與癌癥的關(guān)系已經(jīng)被發(fā)明人首次證明。
此外，本發(fā)明涵蓋蛋白酶體α2-亞基作為癌癥的診斷標記物的應(yīng)用。對于這個蛋白質(zhì)與癌癥疾病的關(guān)系已經(jīng)被發(fā)明人首次證明。在癌組織中與對照相比較豐度加倍。這個蛋白質(zhì)的癌癥-相關(guān)變化的t-檢驗是顯著的，p＜0.009。優(yōu)選與對照相比較檢驗這個蛋白質(zhì)的上調(diào)。已知蛋白酶體在加工用于MHC 1類系統(tǒng)抗原呈遞的肽中發(fā)揮功能，這促進了殺傷t細胞的活性。
此外，本發(fā)明涵蓋蛋白質(zhì)腺嘌呤-磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶作為癌癥，特別是前列腺癌的診斷標記物的應(yīng)用。最近已經(jīng)論述了這個蛋白質(zhì)與癌癥的關(guān)系。例如已經(jīng)描述了乳腺癌患者的淋巴細胞中這個蛋白的下調(diào)。此外，已經(jīng)觀察到這個蛋白質(zhì)在結(jié)腸直腸癌中的過表達。本發(fā)明人可證明與對照相比較，前列腺癌組織中這個蛋白質(zhì)的豐度是大約2倍高。這些結(jié)果在t-檢驗中對于差異表達是顯著的，p＜0.007。根據(jù)本發(fā)明，與對照比較這個蛋白質(zhì)的上調(diào)被考慮為癌組織的特征性標記物。
此外，本發(fā)明涵蓋蛋白質(zhì)無機焦磷酸酶作為癌癥，特別是前列腺癌的診斷標記物的應(yīng)用。最近已經(jīng)顯示這個蛋白質(zhì)在肺癌和結(jié)腸直腸癌中的上調(diào)。本發(fā)明人可證明與正常組織相比較，前列腺癌組織中這個蛋白質(zhì)的豐度是1.6倍高。這些結(jié)果在t-檢驗中對于差異表達是顯著的，p＜0.005。無機焦磷酸酶1催化釋放無機磷酸的反應(yīng)。這涉及其中膜聯(lián)蛋白，特別是膜聯(lián)蛋白A3參與Ca2+流動的鈣化過程。因此特別地在膜聯(lián)蛋白A3的上調(diào)和無機焦磷酸酶的上調(diào)之間存在功能性的聯(lián)系。
在此參考的多種蛋白質(zhì)以及下文中進一步提及的蛋白質(zhì)可被單獨用于診斷目的或與其他蛋白質(zhì)組合。
此外，本發(fā)明涵蓋下列蛋白質(zhì)中的至少一種作為癌癥的診斷標記物的應(yīng)用泛素-異肽酶T、血清淀粉狀蛋白P成分(SAP)、脂肪酸-結(jié)合蛋白3(FABP-3)、半乳凝素-1、熱休克蛋白27(HSP27)、14-3-3蛋白質(zhì)β、14-3-3蛋白質(zhì)ζ(zeta)、核氯離子通道蛋白1(CLIC-1)、14-3-3蛋白質(zhì)τ、熱休克蛋白90(HSP 90)、蛋白質(zhì)-二硫鍵-異構(gòu)酶(PDI)、表皮脂肪酸-結(jié)合蛋白(E-FABP)、線粒體烯?；?輔酶A-水合酶、核磷蛋白、膜聯(lián)蛋白、特別是膜聯(lián)蛋白A3、轉(zhuǎn)凝蛋白、磷酸丙糖異構(gòu)酶、醛縮酶A HES1、蛋白酶體的α2-亞基、腺嘌呤-磷酸核糖基-轉(zhuǎn)移酶。優(yōu)選與對照相比較，蛋白質(zhì)異肽酶T、血清淀粉狀蛋白P成分(SAP)、脂肪酸-結(jié)合蛋白3(FABP-3)、半乳凝素-1、微精液蛋白(microseminoprotein)β、熱休克蛋白27(HSP27)或轉(zhuǎn)凝蛋白中至少一種的下調(diào)被考慮是癌癥疾病的特征性標記物。此外優(yōu)選與對照相比較，蛋白質(zhì)14-3-3蛋白質(zhì)β、14-3-3蛋白質(zhì)ζ、核氯離子通道蛋白1(CLIC-1)、14-3-3蛋白質(zhì)τ、熱休克蛋白90(HSP 90)、蛋白質(zhì)-二硫鍵-異構(gòu)酶(PDI)、表皮脂肪酸-結(jié)合蛋白(E-FABP)、線粒體烯?；?輔酶A-水合酶、核磷蛋白、膜聯(lián)蛋白、特別是膜聯(lián)蛋白3、磷酸丙糖異構(gòu)酶、醛縮酶A、HES1、蛋白酶體的α2-亞基、腺嘌呤-磷酸核糖基-轉(zhuǎn)移酶和無機焦磷酸酶1中至少一種附加或選擇的上調(diào)被考慮是癌癥疾病的特征性標記物。特別優(yōu)選的方式是，除這些蛋白質(zhì)中的一種或多種外，研究其他膜聯(lián)蛋白下調(diào)。特別優(yōu)選地是研究至少兩種蛋白質(zhì)。
通過應(yīng)用下列蛋白質(zhì)中的兩種作為診斷標記物來提供特別的益處泛素-異肽酶T、熱休克蛋白27(HSP27)、熱休克蛋白90(HSP90)、蛋白質(zhì)-二硫鍵-異構(gòu)酶(PDI)、線粒體烯酰基-輔酶A-水合酶和/或核磷蛋白。
根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)證實，一組獨特蛋白質(zhì)的表達分別被特征性地下-或上調(diào)。詳細內(nèi)容顯示在概括鑒定和定量在良性和惡性組織之間差異表達的蛋白質(zhì)結(jié)果的下列表1中。蛋白質(zhì)的選擇基于良性(良性部分)或惡性組織(癌部分)中蛋白質(zhì)的統(tǒng)計顯著差異表達分析。登錄號是指NCBI數(shù)據(jù)庫中各自的編號。理論分子量(MW)是從數(shù)據(jù)庫中的序列計算的?！胺e分”是指用MASCOT技術(shù)確定的采樣數(shù)。關(guān)于PMF-積分給出的詳細內(nèi)容是指由MASCOT-服務(wù)器使用的Mouse-積分；一般PMF-積分超過65代表顯著的同一性。最后兩列概括了在良性和惡性組織樣品中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)點的強度定量。
表1
本文中我們參考圖5和

圖10，其中以表格形式顯示伴隨有統(tǒng)計數(shù)據(jù)的21個患者和31個患者的平均顯著差異表達的蛋白點結(jié)果。
不同蛋白的英文同義詞縱覽如下所列。前面所列的號碼相應(yīng)于表1中的編號。
1.gi|1732411泛素-異肽酶T；異肽酶T(SioT)；泛素特異的蛋白酶5；泛素羧基-末端水解酶5；泛素硫酯酶5；泛素特異的加工蛋白酶5；脫泛素化酶5；脫泛素酶。
2.gi|576259血清-淀粉狀蛋白P-成分；鏈A；血清淀粉狀蛋白P成分(SAP)。
3.gi|494781脂肪酸-結(jié)合蛋白3(FABP-3)；乳腺衍生的生長抑制劑(MDGI)；脂肪酸結(jié)合蛋白3(FABP-3)；心型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)；肌肉型脂肪酸結(jié)合蛋白(M-FABP)。
4.gi|4504981半乳凝素；半乳凝素-1；kDaβ-半乳糖苷-結(jié)合凝集素；β半乳糖苷可溶凝集素；β-半乳糖苷結(jié)合凝集素1-14-1；半乳素；可溶半乳糖苷結(jié)合凝集素；S-Lac凝集素1。
5.gi|225159Microsamine蛋白β；β-microseralnoprotein；微精液蛋白β；免疫球蛋白結(jié)合因子(IGBF)；PN44；前列腺分泌的精清蛋白；94個氨基酸的前列腺分泌蛋白(PSP-94)；精清β-抑制素；精清蛋白。
6.未鑒定。
7.gi/662841熱休克蛋白27(HSP27)；熱休克蛋白27；27kDa熱休克蛋白1(HSP-27)；應(yīng)力-應(yīng)答蛋白27(SRP237)；雌激素-調(diào)節(jié)的24kDa蛋白；28kDa熱休克蛋白。
8.gi|450794914-3-3蛋白β；14-3-3蛋白β(14-3-3β)；14-3-3蛋白α(14-3-3α)；蛋白激酶C抑制劑蛋白-1；PKC抑制劑蛋白-1(KCIP-1也為14-3-3ζ)；RNH-1。
9.gi|450795314-3-3蛋白ζ；14-3-3ζ；14-3-3σ；KCIP-1(也為14-3-3β)；YWHAZ；線粒體輸入刺激因子S1(MSF S1)；因子活化外酶S；酪氨酸單加氧酶活化蛋白ζ；色氨酸單加氧酶活化蛋白ζ。
10.gi|2073569核氯離子通道蛋白；氯胞內(nèi)通道1(CLIC-1)；核氯離子通道蛋白(p64CLCP)；核氯通道；氯通道ABP；核氯離子通道27(NCC27)；RNCC蛋白；核氯離子通道27(NCC27)。
11.未鑒定。
12.(膜聯(lián)蛋白A3，見23)。
13.gi|580322714-3-3蛋白質(zhì)τ；14-3-3θ；S15076蛋白激酶調(diào)節(jié)子14-3-3；HS1；酪氨酸5-單加氧酶活化蛋白；色氨酸3-單加氧酶活化蛋白。
14.gi|13129150熱休克蛋白90(HSP90)；熱休克蛋白90(HSP0-90)；熱休克蛋白HSP 90-α；熱休克蛋白90-α；90kDa熱休克蛋白；熱休克蛋白86(HSP86)；Hspca；熱休克90kDa蛋白1；熱休克蛋白1；腫瘤特異的移植86kDa抗原(TSTA)。
15.gi|20070125蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)；蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)；脯氨?；?4-羥化酶β；蛋白質(zhì)二硫鍵氧化還原酶；甲狀腺激素結(jié)合蛋白p55；谷胱甘肽(glutathlone)胰島素轉(zhuǎn)氫酶。
16.gi|4557581表皮脂肪酸-結(jié)合蛋白(E-FABP)；脂肪酸結(jié)合蛋白5(FABP-5)；表皮脂肪酸-結(jié)合蛋白(E-FABP)；牛皮癬-相關(guān)的脂肪酸-結(jié)合蛋白(PA-FABP)；皮膚脂肪酸-結(jié)合蛋白(C-FABP)；角化細胞酸-結(jié)合蛋白(KLBP)；DA11。
17.gi|2707570線粒體烯?；?輔酶-A-水合酶；線粒體烯酰基輔酶A水合酶；線粒體烯?；?CoA-水合酶；短-鏈烯酰基-CoA水合酶，線粒體；短-鏈烯?；o酶A水合酶(SCEH)。
18.gi|6307090核磷蛋白；核磷蛋白；核仁磷蛋白B23；核仁蛋白NO38；核基質(zhì)蛋白；NPM(1)。
19.gi|7768772HES1蛋白，大腸桿菌和斑馬魚ES1蛋白的同系物；抗-σ交叉-反應(yīng)蛋白同系物Iα前體，KNP-la/Kpn-1α，GT335(類似于大腸桿菌SCRP27A和斑馬魚ES1[人類]。
20.gi|4506181蛋白酶體α2-亞基；蛋白酶體亞基HC3，蛋白酶體成分C3；macropain亞基C3；多催化內(nèi)肽酶復(fù)合物亞基C3[人類]。
21.gi|4502171腺嘌呤-磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶；AMP焦磷酸化酶；AMP二磷酸化酶；轉(zhuǎn)磷酸核糖苷酶。
22.gi|11056044無機焦磷酸酶；cylosolic無機焦磷酸酶；無機焦磷酸酶1；焦磷酸酶磷酸-水解酶[人類]。
此外，鑒定在某些患者集合中與對照相比較在癌組織中上-或下調(diào)的四個以上蛋白質(zhì)(成簇分析)。這些是蛋白質(zhì)膜聯(lián)蛋白A3、轉(zhuǎn)凝蛋白、磷酸丙糖異構(gòu)酶和醛縮酶A。在癌組織中膜聯(lián)蛋白A3上調(diào)大約5倍，轉(zhuǎn)凝蛋白下調(diào)大約5倍。磷酸丙糖異構(gòu)酶和醛縮酶A在癌組織中分別上調(diào)大約20％和10％。
在這個方面我們參考顯示成簇分析結(jié)果圖示的圖3。該附圖例證說明了各自由圓形代表的某些患者群(或分別成簇)的癌組織中與健康組織中相比較不同蛋白質(zhì)的上-或下調(diào)。
膜聯(lián)蛋白和轉(zhuǎn)凝蛋白的英文同義詞如下23.gi|4826643膜聯(lián)蛋白A3；膜聯(lián)蛋白III；脂皮質(zhì)蛋白III；抗凝血蛋白III；胎盤抗凝血蛋白III(PAP III)；35α鈣介蛋白。
24.gi|4507359轉(zhuǎn)凝蛋白；SM22-α平滑肌蛋白、22Da肌動蛋白-結(jié)合蛋白、平滑肌22蛋白、肌動蛋白-締合的蛋白p27、25kDa F-肌動蛋白-結(jié)合蛋白。
此外，鑒定在某些患者群的癌組織中與對照相比較顯示不同豐度水平(下或上調(diào))的更多蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)是ATP合酶、膽氯素還原酶B、葡萄糖-調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)、脯氨?；?4-水解酶β和dnak-樣分子伴侶。ATP合酶下調(diào)，其他蛋白上調(diào)。
有趣的是，我們鑒定的許多蛋白質(zhì)涉及脂類代謝。已經(jīng)報道了膜聯(lián)蛋白A3和SAP與脂類的直接結(jié)合。兩個蛋白質(zhì)都涉及吞噬作用。FABP-3和E-FABP是脂肪酸結(jié)合蛋白。線粒體烯?；?輔酶A水合酶涉及脂肪酸的β-氧化。與磷脂相互作用的磷脂酶誘導(dǎo)刺激HSP 27活性的蛋白激酶C。HSP 90也涉及磷脂代謝，因為HSP 90的抑制導(dǎo)致磷脂代謝的變化(Chun Y.等，2003，J.Natl.Cancer Inst.951624-33)。此外，推測PDI也與脂類代謝相關(guān)，因為它作為多功能蛋白質(zhì)發(fā)揮作用，并且除此之外參與甘油三酸酯轉(zhuǎn)移(Horiuchi R.andYamauchi K.，1994，Nippon-Rinsho 52890-5)。而且14-3-3蛋白抑制蛋白激酶C，包含看起來類似于蛋白激酶C的假-底物結(jié)構(gòu)域和膜聯(lián)蛋白C-末端的保守序列。這表明那些不同蛋白質(zhì)之間的功能關(guān)系。
根據(jù)本發(fā)明診斷標記物可用于鑒定不用類型的腫瘤和癌癥疾病。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，將被診斷的癌癥疾病是前列腺癌，特別是前列腺癌瘤。如早先提及的，前列腺體的癌瘤是男性中最普遍的惡性腫瘤。只有在早期階段被檢測到，前列腺癌才可通過預(yù)防性的手術(shù)切除前列腺體而被成功治療。如果疾病發(fā)展，并且不再限于一個器官，預(yù)防性的手術(shù)切除前列腺體是不足夠的。對于不能通過手術(shù)除去的前列腺腫瘤，可考慮抑制雄性激素。這種抑制，優(yōu)選伴隨手術(shù)或藥物的去雄有時可抑制腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，并容許控制腫瘤特定的時間。但是不久大多前列腺腫瘤變得對這種內(nèi)分泌學(xué)治療有抗性。其他治療方式，例如細胞毒性試劑的應(yīng)用、基因治療或免疫治療仍然處于臨床研究，并且尚未成功。因此必須及早檢測前列腺體的腫瘤以能夠通過手術(shù)將其成功除去。根據(jù)本發(fā)明所描述的標記蛋白為前列腺癌的早期檢測提供很大的益處。
在本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案中，某些亞型的癌癥，特別是前列腺癌的亞型可通過定量優(yōu)選的幾個上述蛋白質(zhì)而加以診斷。本發(fā)明人可證明通過所謂的成簇分析，獨特的蛋白質(zhì)模式反映相應(yīng)于獨特患者集合的不同蛋白質(zhì)的特征性上-或下調(diào)。屬于特定集合的患者全部都顯示癌癥，特別是前列腺癌的相同獨特亞型。根據(jù)本發(fā)明，預(yù)期患者將根據(jù)癌癥特定亞型與通過應(yīng)用本發(fā)明的方法所確定的蛋白質(zhì)模式的關(guān)系而被表征，以選擇性地治療這種亞型的癌癥。優(yōu)選應(yīng)分析規(guī)定的蛋白質(zhì)組合。在此方面，我們參考顯示相應(yīng)于不同患者集合的特征性蛋白模式圖示的圖3。圖4中的表格例證了分別代表不同患者集合和前列腺癌亞型的蛋白模式的概要。
為了診斷不同亞型的前列腺癌，應(yīng)優(yōu)選測定不同蛋白質(zhì)組合的豐度。因此下列中的至少一個應(yīng)被測定作為共同的癌癥標記物核磷蛋白、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶、熱休克蛋白90、線粒體輔酶A水合酶的上調(diào)；熱休克蛋白27和/或泛素異肽酶T的下調(diào)。這些可與下列蛋白質(zhì)中的至少一個一起用于分析三種亞型的前列腺癌。
亞型a轉(zhuǎn)凝蛋白的上調(diào)；半乳凝素和微精液蛋白β的實質(zhì)性下調(diào)；脂肪酸結(jié)合蛋白3的下調(diào)；表皮脂肪酸-結(jié)合蛋白沒有或較少變化，核氯離子通道蛋白、14-3-3蛋白β、ζ和τ、醛縮酶A、血清淀粉狀蛋白P成分、磷酸丙糖異構(gòu)酶和/或膜聯(lián)蛋白A3沒有或較少變化。
亞型b蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶、熱休克蛋白90的實質(zhì)性上調(diào)；泛素異肽酶T的實質(zhì)性下調(diào)；14-3-3蛋白β、ζ和τ、醛縮酶A、磷酸丙糖異構(gòu)酶、膜聯(lián)蛋白A3的上調(diào)；轉(zhuǎn)凝蛋白、半乳凝素、微精液蛋白β、血清淀粉狀蛋白P成分的下調(diào)；脂肪酸結(jié)合蛋白3和/或核氯離子通道蛋白沒有或較少變化。
亞型c核氯離子通道蛋白的實質(zhì)性上調(diào)；血清淀粉狀蛋白P成分的下調(diào)；脂肪酸結(jié)合蛋白3、14-3-3蛋白β、ζ和τ、醛縮酶A、磷酸丙糖異構(gòu)酶、膜聯(lián)蛋白A3、表皮脂肪酸-結(jié)合蛋白；微精液蛋白β、半乳凝素、轉(zhuǎn)凝蛋白沒有或較少變化。
根據(jù)本發(fā)明，為了診斷不同亞型的前列腺癌，可能分析至少與作為進一步蛋白質(zhì)的膜聯(lián)蛋白A3組合的至少一個普通癌癥標記物。
在另一個特別優(yōu)選的實施方案中，通過唯一研究膜聯(lián)蛋白A3和/或線粒體烯酰基-輔酶A-水合酶，可能診斷存在于特定患者群中的特異的前列腺癌亞型。
就所描述的蛋白質(zhì)作為診斷標記物的本發(fā)明用途來說，為了分析該蛋白質(zhì)在癌組織(或在被研究的組織中)中與對照組織相比較的發(fā)生率和豐度，其使用可由多種方法構(gòu)成。如果被研究樣品和對照樣品中的蛋白質(zhì)以凝膠電泳，例如在傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠上分離則是特別有利的。然后比較樣品和對照中給定蛋白質(zhì)的豐度。由于必要的分解，雙向凝膠是特別優(yōu)選的。然而，也可能在凝膠電泳分離前進行預(yù)純化，使得用例如單向聚丙烯酰胺凝膠電泳獲得充分的分離和可分析性。其他的蛋白質(zhì)分離方法也可有利地使用，例如，傳統(tǒng)的色譜方法，特別是柱色譜法。如果待研究的樣品和對照樣品以不同的方式，例如使用不同的同位素標識或標記則是特別有利的。這有助于比較待研究樣品和對照中關(guān)于給定蛋白質(zhì)的豐度。在另一個優(yōu)選的實施方案中，質(zhì)譜檢驗待分析的蛋白質(zhì)，以提供對該蛋白質(zhì)的精確鑒定。因此，例如表面增強的激光解析電離法(SELDI方法)可用于組織或體液制品。然而，可能有利的是使用體內(nèi)成像法，特別是電子發(fā)射斷層掃描(PET)。
待研究的蛋白質(zhì)也可借助于相反指向被研究的蛋白質(zhì)并且被用作診斷標記物的分子來被定性和定量地表征。特別有利的方式是，該分子是抗體、特別是多克隆和/或單克隆抗體。然而，本發(fā)明也涵蓋此方面的全部已知的親合試劑。
為了定性以及特別是定量的鑒定，可使用常規(guī)的免疫測定，例如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。也可能使用免疫組化方法和/或蛋白芯片，例如SELDI方法。為了鑒定的目的，可例如研究體液或腫瘤組織?？贵w是特別適于鑒定膜聯(lián)蛋白A3、14-3-3蛋白質(zhì)β、τ和ζ和/或SAP。例如，pan抗-14-3-3 β/ζ單克隆抗體(Stressgen目錄號KAM-CC012C)染色上皮和癌細胞，以及間質(zhì)中的某些淋巴細胞。間質(zhì)，但不是上皮或癌細胞被針對蛋白質(zhì)血清-淀粉狀蛋白P成分(SAP)的單克隆抗體(Stressgen目錄號HYB 281-05，工作稀釋度1∶10)染色。
在進一步優(yōu)選的實施方案中，診斷標記物蛋白的定性和定量測量借助于寡核苷酸，例如在普通的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)期間進行。PCR屬于選擇性擴增確定的DNA-序列的分子遺傳學(xué)的方法學(xué)技能。該方法給出測試蛋白質(zhì)分別在DNA-或RNA-水平的定性或定量檢測。使用合適的寡核苷酸雜交測定，例如普通的Northern-或Southern印跡是可能的；它們也產(chǎn)生關(guān)于該蛋白質(zhì)在DNA-或RNA-水平的定性或定量信息。用寡核苷酸檢測的方法可容易地被自動化，這是其優(yōu)勢之一。另一方面它們只遞送關(guān)于某些DNA-或RNA-序列豐度的信息，而不是關(guān)于相應(yīng)蛋白質(zhì)的真正豐度。在此情況下，必須保證在mRNA-水平獲得診斷標記物蛋白質(zhì)的特征性上-和下調(diào)或該調(diào)節(jié)是否以轉(zhuǎn)錄后的水平發(fā)生。
根據(jù)本發(fā)明測定的不同標記物蛋白質(zhì)豐度的特征性變化也影響各自蛋白質(zhì)的活性，例如其酶促活性。因此有利的是與對照相比較備選地或與其豐度平行測定該蛋白質(zhì)的活性。這也可通過術(shù)語各種蛋白質(zhì)的上-或下調(diào)來理解?？赏ㄟ^技術(shù)人員清楚了解的各自酶的普通酶促測試來進行分別的測定。此外，可用脂肪酸-結(jié)合蛋白進行結(jié)合測定或比較測試，以獲得分別關(guān)于其活性和其上-或下調(diào)的信息。對其他的蛋白質(zhì)進行相同的測試，例如可測量核氯離子通道蛋白(CLIC-1)的通道活性。這可用于多種蛋白質(zhì)作為診斷標記物的應(yīng)用或用于根據(jù)本發(fā)明下文中所描述的診斷試劑盒。此外，測量相應(yīng)蛋白質(zhì)的活性可用于測試本發(fā)明所述癌癥治療的藥物的效果，如下列所描述的在本發(fā)明用于檢驗至少一種蛋白質(zhì)的所述應(yīng)用的進一步優(yōu)選的實施方案中，分離例如來自患者材料的核外體，并分析目標蛋白質(zhì)。特別地測試相應(yīng)于核外體內(nèi)部至少一個蛋白質(zhì)的蛋白模式以確定一個或多個蛋白質(zhì)的診斷相關(guān)的上-和/或下調(diào)。用于從患者材料制備核外體的合適方法可用技術(shù)人員已知的標準方法進行。
此外，本發(fā)明涵蓋包含用于測定根據(jù)本說明書上述報道作為診斷標記物的至少一種蛋白質(zhì)的活性和/或表達的至少一種化合物的診斷試劑盒。這個診斷試劑盒優(yōu)選用于測定下列蛋白質(zhì)中至少一個的活性和/或表達異肽酶T、血清淀粉狀蛋白P成分(SAP)、核氯離子通道蛋白通道1(CLIC-1)、線粒體烯?；?輔酶A水合酶和/或膜聯(lián)蛋白A3。重要的是，這種診斷試劑盒用于測定與對照相比較特征性上-或下調(diào)的這些蛋白質(zhì)中至少一個的各自豐度。第一和最初的豐度反映蛋白質(zhì)的表達。根據(jù)本發(fā)明開發(fā)的試劑盒優(yōu)選適合檢測或篩選癌癥疾病，特別是前列腺癌；它為這些疾病的早期診斷提供特殊的益處。例如這種試劑盒容許區(qū)別良性或健康組織和惡性組織，例如前列腺增生中的良性組織或前列腺癌。優(yōu)選這種試劑盒分別包含與一種或多種所描述的蛋白質(zhì)或相關(guān)核酸相互作用的一種或幾種抗體或一個或幾個寡核苷酸或寡核苷酸對。借助于這些化合物，可獲得關(guān)于該蛋白質(zhì)與對照相比較的定性以及特別是定量的信息。
待測試的樣品和對照取自相同的患者。例如組織樣品，或體液樣品，如血液、淋巴或尿通過技術(shù)人員熟知的方法取得和制備。優(yōu)選地，可能惡性的組織，即將被測試的樣品，和對照組織，即良性組織取自相同的患者并直接加以比較。另一方面可能比較各個蛋白質(zhì)的豐度和已經(jīng)從大量獨立對照樣品統(tǒng)計確定的其他標準。在前列腺癌的情況下，有利的是從已經(jīng)通過手術(shù)被除去前列腺的患者取良性和可能惡性的前列腺組織。來自前列腺增生的良性組織可用作對照。
此外，本發(fā)明涵蓋通過分析所描述蛋白質(zhì)中至少一種的豐度來診斷癌癥的方法。根據(jù)本發(fā)明癌組織中其上-和下調(diào)的分析結(jié)果傳遞了關(guān)于存在癌組織的信息。對于本發(fā)明方法的其他特征，我們參考上述說明。
本發(fā)明也涵蓋與蛋白質(zhì)膜聯(lián)蛋白A3相互作用且尤其影響，優(yōu)選抑制膜聯(lián)蛋白，特別是膜聯(lián)蛋白A3的活性和/或豐度的至少一種活性物質(zhì)，來生產(chǎn)治療前列腺癌，優(yōu)選特定的前列腺癌患者群的藥品的用途。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選該活性物質(zhì)與蛋白質(zhì)膜聯(lián)蛋白A3相互直接作用，由此影響，優(yōu)選抑制其活性和/或豐度。在本發(fā)明的另一個實施方案中，有利的是該活性物質(zhì)與蛋白質(zhì)膜聯(lián)蛋白A3可相互間接作用，其中該活性物質(zhì)是例如直接指向膜聯(lián)蛋白A3的活化劑、抑制劑、調(diào)節(jié)劑和/或生物前體。
在這個應(yīng)用的特別優(yōu)選的實施方案中，該活性物質(zhì)是苯并二氮雜類型的至少一種衍生物(Hofmann等，1998，J.Biol.Chem.273(5)2885-94)。特別優(yōu)選的是BDA250(1，3-二氫-1-甲基-5-苯基-2H-1，4-苯并二氮雜-2-酮)、BDA452(3-(R，S)-(L-色氨酰基)-1，3-二氫-1-甲基-5-苯基-2H-1，4-苯并二氮雜-2-酮)和/或BDA753(3-(R，S)-all-L(NH-Trp-Gly-Tyr-Ala-H)-1，3-二氫-1-甲基-5-苯基-2H-1，4-苯并二氮雜-2-酮)。此外，優(yōu)選使用/應(yīng)用苯甲二氮(Diazepam)(7-氯-1，3-二氫-1-甲基-5-苯基-2H-1，4-苯并二氮雜-2-酮)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選可使用衍生自這些物質(zhì)的其他分子。尤其涉及阻斷膜聯(lián)蛋白A3活性的那些分子。
特別優(yōu)選的方式是，膜聯(lián)蛋白A3-特異的抗體適合作為活性物質(zhì)，特別優(yōu)選的是治療性抗體。這些優(yōu)選阻斷抗體和/或放射性標記的和/或毒素-標記的抗體。放射性標記的抗體可例如攜帶131I。這種抗體有利地使得可能進行如技術(shù)人員已知的放射性免疫治療。然而，技術(shù)人員已知的任何其他試劑也適合作為活性物質(zhì)。
特別優(yōu)選的方式是，這種活性物質(zhì)可用于影響核外體中膜聯(lián)蛋白A3的活性和/或豐度。
影響膜聯(lián)蛋白A3的活性和/或表達的活性物質(zhì)，特別是顯示抑制效果的活性物質(zhì)，可有利地用于生產(chǎn)治療骨關(guān)節(jié)炎退化和/或動脈粥樣硬化損傷的藥品。
此外，本發(fā)明涵蓋影響異肽酶T的活性和/或表達和/或蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)的活性和/或表達的至少一種活性物質(zhì)用于開發(fā)癌癥治療藥品的應(yīng)用。如先前描述的，癌組織中這些蛋白質(zhì)的豐度已經(jīng)特征性地改變。特別地泛素-異肽酶T的豐度是顯著降低的，而蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)的豐度增加。這些蛋白質(zhì)的表達或活性改變至對照組織中所示正常水平表示了治愈癌癥疾病的可能方式。因此要求保護增加泛素-異肽酶T的活性和/或豐度的活性物質(zhì)的用途。此外，要求保護抑制PDI活性和/或豐度的活性物質(zhì)的用途。通過這種活性物質(zhì)，所述蛋白的活性被調(diào)節(jié)至正常水平，以使得癌癥疾病可被有效治療。
本發(fā)明也涵蓋影響線粒體烯酰基-輔酶A-水合酶的活性和/或豐度的至少一種活性物質(zhì)用于生產(chǎn)治療癌癥的藥品的用途。優(yōu)選這可與影響脂肪酸-結(jié)合蛋白3(FABP-3)和/或表皮脂肪酸-結(jié)合蛋白(E-FAPB)組合進行。優(yōu)選該使用由線粒體烯酰基-輔酶A-水合酶和/或E-FABP的活性和/或豐度的抑制活性物質(zhì)，分別地FABP-3的活性和/或豐度的增加活性物質(zhì)構(gòu)成。
本發(fā)明也涵蓋影響以及特別是增加血清淀粉狀蛋白P成分(SAP)的活性豐度和/或定位的至少一種活性物質(zhì)用于生產(chǎn)治療癌癥的藥品的用途。已經(jīng)顯示，癌組織中SAP的定位可被改變。因此發(fā)明性地優(yōu)選通過使用至少一種活性物質(zhì)影響SAP的定位。該活性物質(zhì)可例如是包括膜聯(lián)蛋白A3的癌細胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域和SAP的免疫反應(yīng)-影響結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。SAP是例如位于前列腺組織中的間質(zhì)細胞上，但不在健康的上皮細胞或轉(zhuǎn)化的癌細胞上。癌組織中膜聯(lián)蛋白A3是豐富的。也已知膜聯(lián)蛋白出現(xiàn)在細胞表面上。由于SAP作為蛋白成分參與免疫系統(tǒng)而癌細胞不從免疫系統(tǒng)被消除，癌細胞表面上SAP的免疫反應(yīng)-影響結(jié)構(gòu)域相對于癌細胞產(chǎn)生改變的免疫反應(yīng)。
此外本發(fā)明涵蓋影響-優(yōu)選抑制-14-3-3蛋白質(zhì)τ的活性和/或表達的至少一種活性物質(zhì)用于開發(fā)癌癥治療的藥品的應(yīng)用。
此外本發(fā)明涵蓋影響-優(yōu)選抑制-核氯離子通道蛋白1(CLIC-1)的活性和/或表達的至少一種活性物質(zhì)用于開發(fā)癌癥治療，特別是前列腺癌治療的藥品的應(yīng)用。
此外本發(fā)明涵蓋影響-優(yōu)選抑制-HES1的活性和/或表達的至少一種活性物質(zhì)用于開發(fā)癌癥治療的藥品的應(yīng)用。
此外本發(fā)明涵蓋影響-優(yōu)選抑制-蛋白酶體α2-亞基的活性和/或表達的至少一種活性物質(zhì)用于開發(fā)癌癥治療，特別是前列腺癌治療的藥品的應(yīng)用。
此外本發(fā)明涵蓋影響-優(yōu)選抑制-腺嘌呤-磷酸核糖基-轉(zhuǎn)移酶的活性和/或表達的至少一種活性物質(zhì)用于開發(fā)前列腺癌治療的藥品的應(yīng)用。
此外本發(fā)明涵蓋影響-優(yōu)選抑制-特別是核外體中無機焦磷酸酶的活性和/或表達的至少一種活性物質(zhì)用于開發(fā)前列腺癌治療的藥品的應(yīng)用。
此外本發(fā)明涵蓋影響-優(yōu)選刺激-下列蛋白質(zhì)中至少一種的活性和/或表達的至少一種活性物質(zhì)用于開發(fā)前列腺癌治療的藥品的應(yīng)用泛素-異肽酶T、血清-淀粉狀蛋白P-成分(SAP)、脂肪酸-結(jié)合蛋白3(FABP-3)、半乳凝素-1、微精液蛋白β、熱休克蛋白27(HP27)和轉(zhuǎn)凝蛋白。此外，本發(fā)明涵蓋影響-優(yōu)選抑制-下列蛋白質(zhì)中至少一種的活性和/或表達的至少一種活性物質(zhì)用于開發(fā)癌癥治療的藥品的應(yīng)用14-3-3蛋白質(zhì)β、14-3-3蛋白質(zhì)ζ、核氯離子通道蛋白1(CLIC-1)、14-3-3蛋白質(zhì)τ、熱休克蛋白90(HSP 90)、蛋白質(zhì)-二硫鍵-異構(gòu)酶(PDI)、表皮脂肪酸-結(jié)合蛋白(E-FABP)、輔酶A水合酶、核磷蛋白、膜聯(lián)蛋白、特別是膜聯(lián)蛋白A3、磷酸丙糖-異構(gòu)酶、醛縮酶A、蛋白酶體α-2-亞基、腺嘌呤-磷酸核糖基-轉(zhuǎn)移酶和無機焦磷酸酶。給出的特別優(yōu)選是相對于至少兩個不同蛋白質(zhì)的兩個或多個活性物質(zhì)的組合。此外，優(yōu)選該活性物質(zhì)與增加特別是核外體中膜聯(lián)蛋白A1、A2、A4、A7和/或A10活性和/或豐度的一種或一種以上的這些活性物質(zhì)一起使用。
根據(jù)本發(fā)明對于這些蛋白質(zhì)中的每一個，證明與對照相比較它們在癌組織中被特征性上-或下調(diào)。因此，根據(jù)本發(fā)明要求保護通過各自的活性物質(zhì)相反下-或上調(diào)這些蛋白質(zhì)，以獲得活性，特別是健康組織的酶促活性，或抑制和/或殺死癌細胞。這使得成功治療各種癌癥成為可能。特別優(yōu)選生產(chǎn)用于治療前列腺癌，優(yōu)選特異的前列腺癌亞型的藥品。
根據(jù)本發(fā)明所使用的活性物質(zhì)可以是肽、蛋白質(zhì)、小分子化合物或多核苷酸。具有影響不同蛋白質(zhì)的活性和/或表達的已知機制的已知活性物質(zhì)被考慮作為新的活性物質(zhì)。這些活性物質(zhì)直接尋址所描述的蛋白質(zhì)。另一方面如果這些活性物質(zhì)尋址這些不同蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)劑，特別是活化劑或抑制劑和/或生物前體，則可能是有利的。取決于某些活性物質(zhì)是否發(fā)揮抑制或刺激各自蛋白質(zhì)的活性和/或表達的作用，它們可以是激動劑或拮抗劑。拮抗劑的進一步實例是可通過遺傳工程構(gòu)建的缺陷或顯性失活突變體。它們顯示沒有酶促活性，但它們競爭將被抑制的蛋白質(zhì)或酶的各自底物，這導(dǎo)致該蛋白質(zhì)活性的降低。拮抗劑的另一個實例是可通過已知的方式降低特定蛋白質(zhì)表達的反義-分子。激動劑可以是促進特定基因表達或促進mRNA翻譯成為活性基因產(chǎn)物的物質(zhì)。這可能是特異的轉(zhuǎn)錄因子，或調(diào)節(jié)所提及的蛋白表達水平的相似化合物。特別地，小分子化合物可有利地用于這個目的。
在本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案中，活性物質(zhì)可以是作為抑制抗體可減少或阻斷給定蛋白質(zhì)，優(yōu)選膜聯(lián)蛋白A3的活性的治療性抗體。該治療性抗體的特征還在于例如，攜帶毒性或放射性標記，僅僅通過與例如膜聯(lián)蛋白A3相互作用而將所述標記帶至癌細胞。這可在例如放射性免疫治療期間使用攜帶放射性標記，例如131I的抗體。根據(jù)本發(fā)明，活性物質(zhì)可以是分子量(MW)＜1000、抑制膜，優(yōu)選核外體和/或基質(zhì)小泡中離子通道活性的小分子化合物。
為了增加所描述蛋白質(zhì)，特別是異肽酶T、FABP-3、半乳凝素-1、微精液蛋白β、HSP27和轉(zhuǎn)凝蛋白的活性，可使用具有相當或相似酶促活性的化合物。此外，所存在的酶分子的活性可通過各自的化合物誘導(dǎo)或增加。另一方面可能使用適合誘導(dǎo)或增加意味著相應(yīng)酶促分子合成的表達的活性物質(zhì)。該活性物質(zhì)也可尋址酶或其他蛋白質(zhì)的確定前體分子、調(diào)節(jié)劑、活化劑或抑制劑。
此外，如果激素或具有相似效果的物質(zhì)以所需要的方式影響各自蛋白質(zhì)的活性，則可使用其作為活性物質(zhì)。例如類似于黃體酮的分子可用于抑制烯?；?輔酶A水合酶。
在本發(fā)明應(yīng)用的特別優(yōu)選的實施方案中，活性物質(zhì)是至少一種蛋白質(zhì)其本身泛素-異肽酶T、血清-淀粉狀蛋白P-成分(SAP)、脂肪酸-結(jié)合蛋白3(FABP-3)、半乳凝素-1、微精液蛋白β、熱休克蛋白27(HSP27)和/或轉(zhuǎn)凝蛋白。本發(fā)明人可證明這些蛋白質(zhì)的豐度在癌組織中是更低的，因此根據(jù)本發(fā)明旨在使用該蛋白質(zhì)本身作為活性物質(zhì)用于刺激其活性和/或表達。為了這個目的，可使用單個的蛋白質(zhì)或優(yōu)選幾個不同蛋白質(zhì)的組合。此外，預(yù)期這些蛋白質(zhì)的部分，例如衍生自該蛋白質(zhì)的肽或分子可用作本發(fā)明所述的活性物質(zhì)。
在本發(fā)明應(yīng)用的特別優(yōu)選的實施方案中，一種或多種有效物質(zhì)可作為核外體遞送，或該活性物質(zhì)的應(yīng)用可通過核外體介導(dǎo)。這可優(yōu)選特別通過調(diào)節(jié)T-細胞應(yīng)答來影響患者的免疫應(yīng)答。核外體是優(yōu)選通過造血細胞分泌的膜-包被囊泡。已知例如小鼠中，通過樹突狀細胞產(chǎn)生的核外體刺激有效的抗-腫瘤應(yīng)答。
根據(jù)本發(fā)明通過應(yīng)用活性物質(zhì)來治療癌癥，可有益地獲得腫瘤發(fā)育或生長的降低或抑制，和/或腫瘤的轉(zhuǎn)移可部分地減少或完全避免。
此外，本發(fā)明涵蓋包含至少一種上述活性物質(zhì)和至少一種藥物學(xué)上可接受載體的藥物組合物。對于涉及藥物組合物或活性物質(zhì)的細節(jié)，我們參考上述說明。合適的藥物學(xué)上可接受的載體是技術(shù)人員清楚了解的。
此外，本發(fā)明涵蓋通過應(yīng)用至少一種所描述的活性物質(zhì)來治療癌癥疾病，例如前列腺癌的方法。對于這個癌癥治療方法的進一步細節(jié)，我們參考上述說明。
對于所施用的活性物質(zhì)，可使用不同方式的給藥，例如，口服、靜脈內(nèi)、局部或借助吸入給藥。各自的配方是技術(shù)人員已知的。給藥方式依賴于待治療的疾病以及毫無疑問取決于患者的身體素質(zhì)。細節(jié)是技術(shù)人員熟知的。
最后，本發(fā)明涵蓋尋求用于癌癥治療，特別是前列腺癌治療的活性物質(zhì)的方法。使用這個方法，將使用可選自下列的至少一種蛋白質(zhì)泛素-異肽酶T、血清-淀粉狀蛋白P-成分(SAP)、脂肪酸-結(jié)合蛋白3(FABP-3)、半乳凝素、微精液蛋白β、熱休克蛋白27(HSP27)、14-3-3蛋白質(zhì)β、14-3-3蛋白質(zhì)ζ、核氯離子通道蛋白1(CLIC-1)、14-3-3蛋白質(zhì)τ、熱休克蛋白90(HSP90)、蛋白質(zhì)-二硫鍵-異構(gòu)酶(PDI)、表皮脂肪酸-結(jié)合蛋白(E-FABP)、線粒體烯?；?輔酶A-水合酶、核磷蛋白、膜聯(lián)蛋白，特別是膜聯(lián)蛋白A3、轉(zhuǎn)凝蛋白、磷酸丙糖異構(gòu)酶、醛縮酶A、HES1、蛋白酶體的α2-亞基、腺嘌呤-磷酸核糖基-轉(zhuǎn)移酶和無機焦磷酸酶1。優(yōu)選有利的是異肽酶T、血清-淀粉狀蛋白P-成分(SAP)、核氯離子通道蛋白1(CLIC-1)、14-3-3蛋白質(zhì)τ、線粒體烯酰基-輔酶A-水合酶和/或膜聯(lián)蛋白A3。此外可使用這些蛋白質(zhì)的衍生物，特別是已經(jīng)通過分子生物學(xué)方法產(chǎn)生的該蛋白質(zhì)的同源序列或突變形式。此外可使用這些蛋白質(zhì)各自的部分或亞區(qū)域或多種蛋白質(zhì)和/或其衍生物的組合。該方法的實施是技術(shù)人員熟知的，例如蛋白質(zhì)或其衍生物可用合適的表達系統(tǒng)表達。借助于這個系統(tǒng)，可研究與潛在配體，特別是抑制劑或活化劑的相互作用。例如雙雜交系統(tǒng)適合于研究這些相互作用。
本發(fā)明所描述的特征和進一步特點從優(yōu)選實施方案的下列說明聯(lián)系以下權(quán)利要求和附圖可清楚了解。單個的特征可單獨或相互組合識別。
實施例為了鑒定本發(fā)明所述的相關(guān)蛋白質(zhì)，檢查兩個患者群(組A23個患者，組B33個患者)的組織樣品。在各個情況下制備癌組織和對照組織，并經(jīng)受雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D-PAGE)。在pH 4-7和pH 6-11進行等電聚焦。來自組A的兩個患者的凝膠電泳結(jié)果不適于進一步的分析。就另兩個患者來說，在pH 6-11的結(jié)果不是令人滿意的。因此，可能評估21個患者在pH范圍4-7，和19個患者在pH范圍6-11的結(jié)果。來自組B兩個患者在pH 4-7的結(jié)果不適于進一步的分析。因此，可評估在pH范圍4-7的31個患者的全部結(jié)果。
在各個情況下每個患者的兩個不同樣品用混合的不同同位素標記，并在單個的雙向聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離。然后相互獨立地檢測各個同位素的信號，以使得可直接比較兩種組織樣品的蛋白質(zhì)樣品(ProteoTope-技術(shù))。
對于放射性標記樣品的蛋白質(zhì)分析數(shù)量(＜1μg)的最后鑒定，與相同樣品未標記蛋白質(zhì)的制備數(shù)量(＞200μg)一起在制備性凝膠中分離。切下銀染制備性凝膠的相關(guān)蛋白質(zhì)點，用胰蛋白酶酶促消化，通過Bruker Biflex或Ultra-Flex上基質(zhì)輔助的飛行質(zhì)譜激光解吸電離時間(MALDI-TOF MS)來鑒定。部分地進行電噴射電離離子陷阱質(zhì)譜(ESI-MS)(Bruker Esquire)。
通過這個方法，多種蛋白質(zhì)得以鑒定，其特異地顯示與對照組織相比較，癌組織中豐度的相應(yīng)上調(diào)或下調(diào)。
對于這些分析，部分地形成其中研究不同蛋白質(zhì)豐度的特定患者群。在這個所謂的成簇分析中(Clustan Graphics 6.4)，測定來自組A的3個患者群和來自組B的2個患者群，其在各自的情況下，揭示特征性的蛋白質(zhì)表達/豐度模式。借助于這個方法，鑒定對于特異的患者顯示特征性豐度的蛋白質(zhì)膜聯(lián)蛋白A3、轉(zhuǎn)凝蛋白、磷酸丙糖-異構(gòu)酶和醛縮酶A。
組織樣品在prostectomy后，從患者獲得健康的前列腺組織和惡性的前列腺組織。篩選患者的PSA(前列腺特異的抗原)，并通過超聲波掃描證實腫瘤。在手術(shù)前得到每個患者的首肯。
切除后，前列腺體被立即轉(zhuǎn)移至無菌盒并冷卻。制備0.5-1cm厚度的組織切片并分為左右兩半。將其嵌入冷凍基質(zhì)并休克冷凍。剩余的前列腺體固定在甲醛溶液中，根據(jù)常規(guī)的標準方法進一步加以處理。為了制備組織樣品，取前列腺體兩側(cè)的薄切片，并用蘇木精曙紅染色。這些切片儲存在-80℃?zhèn)溆?。從無腫瘤的區(qū)域取對照組織樣品并相同處理。
樣品制備蛋白質(zhì)用含有2％SDS，0.1M Tris pH8.8的100μl沸騰溶液裂解，用雙金雞寧酸方法測定蛋白質(zhì)的濃度。
分別用125I或131I碘化，根據(jù)常規(guī)方案(Cahill等，2003 RapidCommunication in Mass Spectrometry 171283-1290)進行雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳和數(shù)據(jù)分析。放射性碘購買自Amersham Bioscience(Freiburg，德國)。用等濃度的125I或131I分別進行碘化反應(yīng)。
聚丙烯酰胺凝膠電泳為了加樣到聚丙烯酰胺凝膠上，混合相同數(shù)量的標記樣品(癌組織和對照組織)蛋白質(zhì)。為了在pH 4-7和6-11的范圍等電聚焦(IEF)，樣品在共同的樣品緩沖液中稀釋，并加載到18cm pH-梯度(IPG)條(Amersham Bioscience)上。蛋白質(zhì)的IEF第一向分離通過2D-PAGE在Multiphor設(shè)備(Amersham Bioscience)上進行。第二向(SDS-PAGE)在ISO-DALT設(shè)備(Hfer)上進行。凝膠在80μM塑料膜上干燥、制成薄片，進行兩種放射性同位素信號的最后測量。
使用分析不同放射性同位素的選擇方法，可獲得來自不同樣品的蛋白質(zhì)的定量多色差異顯示。因此，在一個凝膠上分離的蛋白質(zhì)點的積累強度的直接比較可用于進一步的分析。單個凝膠上的分析提供使得兩個或多個凝膠當中變化的系統(tǒng)誤差不相關(guān)的優(yōu)點。最大可能的誤差來源是用任一個同位素標記時的不同化學(xué)當量。這可通過進行凝膠的相反標記來排除，即對照樣品和癌癥樣品用任一個同位素各自標記并相反比較。使相反標記步驟的蛋白表達模式相匹配，因此完成定量標準。通過計算機輔助的方法，以不同的顏色(藍色或橙色)可視觀察不同同位素的信號，從而樣品當中豐度的一致差異以相應(yīng)于用于標記的同位素的一種或兩種顏色顯示。關(guān)于這個方法學(xué)的細節(jié)在Cahill等.，2003 Rapid Communications in Mass Spectrometry 171283-1290中提及。
成像分析蛋白質(zhì)表達的差異分析是以所描述的聚丙烯酰胺-凝膠中蛋白質(zhì)點的可靠差異定量為基礎(chǔ)的。對于定量成像分析，使用由本發(fā)明人進行特殊改進的軟件Phoretix 2D Advanced(Nonlinear Dynamics)。
通過質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)原則上使用質(zhì)譜的兩種不同方法。另一方面，高豐度蛋白質(zhì)的快速和可靠鑒定借助于具有MALDI-TOF MS的肽質(zhì)譜指紋。極低豐度蛋白質(zhì)的鑒定利用耗費更多時間的ESI-Ion-Trap-MS/MS或MALDI-TOF-TOF方法進行。總而言之，切下包含所選擇蛋白點的凝膠塊，凝膠塊中的蛋白質(zhì)用胰蛋白酶消化。首先通過具有MALDI-TOF MS的肽質(zhì)譜指紋分析所得到的溶液。對于不能如此被明確鑒定的蛋白質(zhì)點，進行基于MALDI-TOF-TOF或LC-ESI-Ion-Trap-MS/MS的較慢片段化分析。這些方法的詳細描述可在Vogt等，2003，MolecularCellular Proteomic 2795中找到。
蛋白質(zhì)的鑒定對于蛋白質(zhì)的鑒定，已經(jīng)通過質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)的其肽質(zhì)譜利用NCBI-數(shù)據(jù)庫分析。這用程序MASCOT 1.9版(Matrix Science，London，UK)進行。
定量的成像分析定量分析利用已經(jīng)通過圖像矩陣每個像素的放射成像光電倍增管記錄的數(shù)字數(shù)據(jù)進行。蛋白質(zhì)點的限制借助于軟件Phoretix 2DAdvanced(Nonlinear Dynamics)限定，在減去合適的背景信號后，累積點區(qū)域內(nèi)的像素結(jié)果?；谒a(chǎn)生的完整數(shù)據(jù)，進行所檢測蛋白質(zhì)點的細致定量。表1概括了這些結(jié)果。
圖1和圖2分別顯示在pH 4-7(圖1)和第二種情況下在pH 6-11(圖2)等電聚焦后所選擇點的位置。
圖例說明圖1具有分離蛋白質(zhì)的雙向聚丙烯酰胺凝膠的圖像。在pH 4-7進行等電聚焦。通過數(shù)字標記的蛋白質(zhì)點顯示其豐度分別不同于癌性組織和對照組織的那些蛋白質(zhì)。該數(shù)字引用表格1中的數(shù)字。
圖2具有分離蛋白質(zhì)的雙向聚丙烯酰胺凝膠的呈現(xiàn)。在pH 6-11進行等電聚焦。通過數(shù)字標記的蛋白質(zhì)點顯示其豐度分別不同于癌性組織和對照組織的那些蛋白質(zhì)。該數(shù)字指向表格1中的數(shù)字。
圖3表征獨特患者集合，即前列腺癌獨特亞型的蛋白質(zhì)表達模式的圖表呈現(xiàn)。統(tǒng)計顯著的p＜0.01結(jié)果以黑色描繪，t-檢驗p-值為0.01＜p＜0.1的結(jié)果以灰色描繪。不同簇內(nèi)具有不同表達的蛋白質(zhì)顯示在框中。
圖4與良性(健康)相比較，患者集合1至3中蛋白質(zhì)表達不同水平的表格表示。該數(shù)據(jù)是指癌組織中伴隨標準差的蛋白質(zhì)點的大小相對于總體積的蛋白質(zhì)點(良性+惡性)的百分比。t-檢驗概率代表兩種給定集合的點分數(shù)分布是顯著差異的可能性。超過99％概率的t-檢驗結(jié)果以粗體印刷。概率低于95％的結(jié)果以淺灰色印刷。
圖5該表格列出基于雙色ProteoTope分析，比較良性(健康)和惡性組織，在所有患者中具有顯著差異表達的蛋白質(zhì)點。“No.Obs.代表其中可觀察到點的患者的編號。良性組織(良性部分)和惡性組織(癌癥部分)的具有標準誤差的點-分數(shù)是指總體積的蛋白質(zhì)點(良性+惡性)的百分比。t-檢驗概率代表當考慮全部的患者時，良性組織中點分數(shù)分布顯著不同于癌組織中分布的可能性。在t-檢驗概率達到至少99％的條件下選擇點。
圖6具有來自組B的14個患者的分離蛋白質(zhì)的雙向聚丙烯酰胺凝膠的呈現(xiàn)。對照樣品和癌組織樣品都用131I和125I標記并相反比較。不同的同位素信號在各自情況下以另外的顏色(藍色/橙色)成為可見的，以使得在各個顏色的樣品之間如終存在蛋白質(zhì)豐度的差異，作為所選同位素標記的功能。
圖7表示利用B組實施例的Proteo-Tope測量值的精度和統(tǒng)計顯著性的圖表a.再現(xiàn)用125I和131I標記的凝膠的差異豐度比率M的差異和其算術(shù)平均數(shù)之間的比率的Bland和Altman圖，b.再現(xiàn)用125I和131I標記的凝膠的差異豐度比率M的差異和強度A的算術(shù)平均數(shù)之間的比率的圖，c.再現(xiàn)用125I和131I標記的凝膠的差異豐度比率M和強度A之間的比率的MA圖，其中M＝log2·(I2/I1)和A＝0.5·log2·(I1·I2)(I＝測量的強度)。
圖8Volcano曲線圖，顯示來自癌癥和健康組織相反檢測標記蛋白質(zhì)的平均強度之間的區(qū)別。
圖9Pavlidis模板相配分析的圖表，就來自B組的癌癥患者來說，其提供兩個亞組的蛋白質(zhì)豐度比率模式。一個組由22個患者組成，同時另一個與其顯著不同的組由9個患者組成。該蛋白質(zhì)的編號相應(yīng)于圖10表格中的編號。在22個患者的亞組中，在膜聯(lián)蛋白A3(蛋白質(zhì)14)的相對豐度中存在顯著差異。就患者14、11、10、21、3、1、6、22、23、7、4、19和27來說，惡性前列腺組織中該蛋白質(zhì)比患者29、28、32、15、31、24、25、30和33中更豐富。
圖10顯示來自全部31個患者(B組)、具有22個和9個患者的組的差異分析的蛋白質(zhì)點的表格(通過Pavlidis模板相配分析獲得)。登錄號相應(yīng)于來自NCBI數(shù)據(jù)庫的編號。利用MASCOT技術(shù)獲得積分。相應(yīng)于PMF積分的指標與MASCOT服務(wù)器所使用的mouse積分相關(guān)，并且一般，超過65的PMF積分代表明顯的等同。通過LC/MS/MS確定帶星號蛋白質(zhì)的身份。給出帶有標準誤差的癌性組織平均點分數(shù)作為總點量(健康的+惡性的)的百分比。也給出這個模型的P值。表格中的標桿給出了標明的患者組中良性(深藍色)和癌性(淺橙色)樣品中各個蛋白質(zhì)的平均豐度百分比。
權(quán)利要求
1.蛋白質(zhì)膜聯(lián)蛋白A3作為前列腺癌的診斷標記物的用途。
2.權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于它涉及前列腺癌特異亞型。
3.權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于研究與對照相比較的膜聯(lián)蛋白A3的上調(diào)。
4.前述權(quán)利要求中之一項所述的用途，其特征在于研究與膜聯(lián)蛋白A1、膜聯(lián)蛋白A2和/或膜聯(lián)蛋白A5的下調(diào)相結(jié)合的膜聯(lián)蛋白A3的上調(diào)。
5.與蛋白質(zhì)膜聯(lián)蛋白A3相互作用并特別影響，優(yōu)選抑制蛋白質(zhì)膜聯(lián)蛋白A3的活性和/或豐度的至少一種活性物質(zhì)用于生產(chǎn)治療前列腺癌、優(yōu)選特定前列腺癌患者群的藥品的用途。
6.權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于該活性物質(zhì)是激動劑、拮抗劑、缺陷性突變體、顯性失活突變體和/或反義分子。
7.權(quán)利要求5或6所述的用途，其特征在于該活性物質(zhì)是抗體，優(yōu)選是治療性抗體。
8.權(quán)利要求5至7中之一項所述的用途，其特征在于該活性物質(zhì)是至少一種苯并二氮雜衍生物，優(yōu)選BDA250和/或BDA452。
9.權(quán)利要求5至8中之一項所述的用途，其特征在于核外體中蛋白質(zhì)膜聯(lián)蛋白A3的活性和/或豐度受到影響。
10.權(quán)利要求5至9中之一項所述的用途，其特征在于該活性物質(zhì)是用于抑制膜、優(yōu)選核外體和/或基質(zhì)小泡中離子通道活性的分子量(MW)＜1000的“小分子化合物”。
11.蛋白質(zhì)線粒體烯?；?輔酶A-水合酶作為癌癥的診斷標記物的用途。
12.權(quán)利要求11所述的用途，其特征在于研究與對照相比較的線粒體烯?；?輔酶A-水合酶的上調(diào)。
13.蛋白質(zhì)泛素-異肽酶T和/或蛋白質(zhì)-二硫鍵-異構(gòu)酶(PDI)作為癌癥的診斷標記物的用途。
14.權(quán)利要求13所述的用途，其特征在于研究與對照相比較的泛素-異肽酶T的下調(diào)和/或蛋白質(zhì)-二硫鍵-異構(gòu)酶(PDI)的上調(diào)。
15.蛋白質(zhì)血清-淀粉狀蛋白P-成分(SAP)作為癌癥的診斷標記物的用途。
16.權(quán)利要求15所述的用途，其特征在于研究與對照相比較的血清-淀粉狀蛋白P-成分(SAP)的下調(diào)。
17.蛋白質(zhì)-核氯離子通道蛋白作為前列腺癌的診斷標記物的用途。
18.權(quán)利要求17所述的用途，其特征在于當與對照相比較時研究核氯離子通道蛋白的上調(diào)。
19.蛋白質(zhì)HES1作為癌癥的診斷標記物的用途。
20.權(quán)利要求19所述的用途，其特征在于研究與對照相比較的HES1的上調(diào)。
21.蛋白酶體α2-亞基作為癌癥的診斷標記物的用途。
22.權(quán)利要求21所述的用途，其特征在于研究與對照相比較的蛋白酶體α2-亞基的上調(diào)。
23.蛋白質(zhì)腺嘌呤-磷酸核糖基-轉(zhuǎn)移酶作為前列腺癌的診斷標記物的用途。
24.權(quán)利要求23所述的用途，其特征在于研究與對照相比較的腺嘌呤-磷酸核糖基-轉(zhuǎn)移酶的上調(diào)。
25.蛋白質(zhì)無機焦磷酸酶作為前列腺癌的診斷標記物的用途。
26.權(quán)利要求25所述的用途，其特征在于研究與對照相比較的無機焦磷酸酶的上調(diào)。
27.蛋白質(zhì)泛素-異肽酶T和血清-淀粉狀蛋白P-成分(SAP)作為癌癥的診斷標記物的用途，其中優(yōu)選研究與對照相比較的所述蛋白質(zhì)的下調(diào)。
28.選自泛素-異肽酶T、熱休克蛋白27(HSP27)、熱休克蛋白90(HSP90)、蛋白質(zhì)-二硫鍵-異構(gòu)酶(PDI)、線粒體烯酰基-輔酶A-水合酶和核磷蛋白的至少兩種蛋白質(zhì)作為癌癥的診斷標記物的用途，其中研究與對照相比較的泛素-異肽酶T和/或熱休克蛋白27(HSP27)的下調(diào)、和/或熱休克蛋白90(HSP90)、蛋白質(zhì)-二硫鍵-異構(gòu)酶(PDI)、線粒體烯?；?輔酶A-水合酶和/或核磷蛋白的上調(diào)。
29.前述權(quán)利要求中之一項的用途，其特征在于該癌癥是前列腺癌。
30.前述權(quán)利要求中之一項的用途，其特征在于通過研究癌癥的一種或多種蛋白質(zhì)亞型，特別是前列腺癌被診斷。
31.權(quán)利要求30所述的用途，其特征在于研究與選自血清-淀粉狀蛋白P-成分(SAP)、脂肪酸-結(jié)合蛋白3(FABP-3)、半乳凝素、微精液蛋白β、14-3-3蛋白質(zhì)β、14-3-3蛋白質(zhì)ζ、核氯離子通道蛋白、14-3-3蛋白質(zhì)τ、表皮脂肪酸-結(jié)合蛋白(E-FABP)、膜聯(lián)蛋白A3、轉(zhuǎn)凝蛋白、磷酸丙糖異構(gòu)酶和醛縮酶A的至少一種蛋白質(zhì)組合的權(quán)利要求28所述的至少一種蛋白質(zhì)，發(fā)生的研究為與對照相比較SAP的無或較小改變、FABP-3的下調(diào)、半乳凝素的強烈下調(diào)、微精液蛋白β的強烈下調(diào)、14-3-3蛋白質(zhì)β的無或較小變化、14-3-3蛋白質(zhì)ζ的無或較小變化、核氯離子通道蛋白的無或較小變化、14-3-3蛋白質(zhì)τ的無或較小變化、E-FABP的無或較小變化、膜聯(lián)蛋白A3的無或較小變化、轉(zhuǎn)凝蛋白的上調(diào)、磷酸丙糖異構(gòu)酶的無或較小變化和/或醛縮酶A的無或較小變化。
32.權(quán)利要求30所述的用途，其特征在于研究與選自血清-淀粉狀蛋白P-成分(SAP)、脂肪酸-結(jié)合蛋白3(FABP-3)、半乳凝素、微精液蛋白β、14-3-3蛋白質(zhì)β、14-3-3蛋白質(zhì)ζ、核氯離子通道蛋白、14-3-3蛋白質(zhì)τ、表皮脂肪酸-結(jié)合蛋白(E-FABP)、膜聯(lián)蛋白A3、轉(zhuǎn)凝蛋白、磷酸丙糖異構(gòu)酶和醛縮酶A的至少一種蛋白質(zhì)組合的權(quán)利要求28所述的至少一種蛋白質(zhì)，發(fā)生的研究為與對照相比較PDI的強烈上調(diào)、HSP90的強烈上調(diào)、泛素-異肽酶T的強烈下調(diào)、SAP的下調(diào)、FABP-3的無或較小變化、半乳凝素的下調(diào)、微精液蛋白β的下調(diào)、14-3-3蛋白質(zhì)β的上調(diào)、14-3-3蛋白質(zhì)ζ的上調(diào)、14-3-3蛋白質(zhì)τ的上調(diào)、核氯離子通道蛋白的無或較小變化、膜聯(lián)蛋白A3的上調(diào)、轉(zhuǎn)凝蛋白的下調(diào)、磷酸丙糖異構(gòu)酶的上調(diào)和/或醛縮酶A的上調(diào)。
33.權(quán)利要求30所述的用途，其特征在于研究與選自血清-淀粉狀蛋白P-成分(SAP)、脂肪酸-結(jié)合蛋白3(FABP-3)、半乳凝素、微精液蛋白β、14-3-3蛋白質(zhì)β、14-3-3蛋白質(zhì)ζ、核氯離子通道蛋白、14-3-3蛋白質(zhì)τ、表皮脂肪酸-結(jié)合蛋白(E-FABP)、膜聯(lián)蛋白A3、轉(zhuǎn)凝蛋白、磷酸丙糖異構(gòu)酶和醛縮酶A的至少一種蛋白質(zhì)組合的權(quán)利要求28所述的至少一種蛋白質(zhì)，發(fā)生的研究為與對照相比較SAP的下調(diào)、FABP-3的無或較小變化、半乳凝素的無或較小變化、微精液蛋白β的無或較小變化、14-3-3蛋白質(zhì)β的無或較小變化、14-3-3蛋白質(zhì)ζ的無或較小變化、核氯離子通道蛋白的強烈上調(diào)、14-3-3蛋白質(zhì)τ的無或較小變化、E-FABP的無或較小變化、膜聯(lián)蛋白A3的無或較小變化、轉(zhuǎn)凝蛋白的無或較小變化、磷酸丙糖異構(gòu)酶的無或較小變化和/或醛縮酶A的無或較小變化。
34.前述權(quán)利要求中之一項所述的用途，其特征在于借助于聚丙烯酰胺凝膠電泳、特別是雙向凝膠電泳、質(zhì)譜、正電子-輻射斷層攝影術(shù)(PRT)、抗體、ELISA、免疫組織化學(xué)、蛋白質(zhì)芯片和/或寡核苷酸，特別是聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)來檢測至少一種蛋白質(zhì)。
35.前述權(quán)利要求中之一項所述的用途，其特征在于分離核外體和/或分析研究至少一種蛋白質(zhì)。
36.診斷試劑盒，包括用于檢測選自泛素-異肽酶T、血清-淀粉狀蛋白P-成分(SAP)、核氯離子通道蛋白、線粒體烯酰基-輔酶A-水合酶和膜聯(lián)蛋白A3的至少一種蛋白質(zhì)的活性和/或豐度的至少一種物質(zhì)，來鑒定癌癥疾病，特別是前列腺癌。
37.影響泛素-異肽酶T和蛋白質(zhì)-二硫鍵-異構(gòu)酶(PDI)的活性和/或豐度的至少一種活性物質(zhì)用于生產(chǎn)治療癌癥的藥品的用途，其中優(yōu)選該活性物質(zhì)增加泛素-異肽酶T的活性和/或豐度和/或該活性物質(zhì)抑制蛋白質(zhì)-二硫鍵-異構(gòu)酶(PDI)的活性和/或豐度。
38.影響蛋白質(zhì)線粒體烯?；?輔酶A-水合酶的活性和/或豐度的至少一種活性物質(zhì)用于生產(chǎn)治療癌癥的藥品的用途。
39.權(quán)利要求38所述的用途，其特征在于該活性物質(zhì)抑制線粒體烯酰基-輔酶A-水合酶的活性和/或豐度。
40.影響以及特別是增加蛋白質(zhì)血清-淀粉狀蛋白P-成分(SAP)的活性、豐度和/或定位的至少一種活性物質(zhì)用于生產(chǎn)治療癌癥的藥品的用途。
41.影響，特別是抑制蛋白質(zhì)核氯離子通道蛋白的活性和/或豐度的至少一種活性物質(zhì)用于生產(chǎn)治療前列腺癌的藥品的用途。
42.影響，特別是抑制蛋白質(zhì)HES1的活性和/或豐度的至少一種活性物質(zhì)用于生產(chǎn)治療癌癥的藥品的用途。
43.影響，特別是抑制蛋白酶體α2-亞基的活性和/或豐度的至少一種活性物質(zhì)用于生產(chǎn)治療癌癥的藥品的用途。
44.影響，特別是抑制腺嘌呤-磷酸核糖基-轉(zhuǎn)移酶的活性和/或豐度的至少一種活性物質(zhì)用于生產(chǎn)治療前列腺癌的藥品的用途。
45.影響，特別是抑制蛋白質(zhì)無機焦磷酸酶的活性和/或豐度的至少一種活性物質(zhì)用于生產(chǎn)治療前列腺癌的藥品的用途。
46.權(quán)利要求37至45中之一項所述的用途，其特征在于所述癌癥是前列腺癌，優(yōu)選是特定的前列腺癌亞型。
47.權(quán)利要求37至46中之一項所述的用途，其特征在于所述活性物質(zhì)是激動劑、拮抗劑、缺陷性突變體、顯性失活突變體和/或反義分子。
48.權(quán)利要求37至47中之一項所述的用途，其特征在于該活性物質(zhì)是抗體，優(yōu)選是治療性抗體。
49.權(quán)利要求37至48中之一項所述的用途，其特征在于該活性物質(zhì)是用于抑制膜、優(yōu)選核外體和/或基質(zhì)小泡中離子通道活性的分子量(MW)＜1000的“小分子化合物”。
50.前述權(quán)利要求中之一項所述的用途，其特征在于該活性物質(zhì)是選自泛素-異肽酶T、血清-淀粉狀蛋白P-成分(SAP)、脂肪酸-結(jié)合蛋白3(FABP-3)、膜聯(lián)蛋白A3、半乳凝素、微精液蛋白β、熱休克蛋白27(HSP27)和轉(zhuǎn)凝蛋白的至少一種蛋白質(zhì)。
51.前述權(quán)利要求中之一項所述的用途，其特征在于該活性物質(zhì)以核外體的形式提供。
52.藥物組合物，包括前述權(quán)利要求中之一項所述的至少一種活性物質(zhì)和至少一種藥物學(xué)上可接受的載體。
53.尋求用于治療癌癥的活性物質(zhì)的方法，其特征在于使用選自泛素-異肽酶T、血清-淀粉狀蛋白P-成分(SAP)、核氯離子通道蛋白、14-3-3蛋白質(zhì)τ、線粒體烯?；?輔酶A-水合酶、膜聯(lián)蛋白A3、HES1、蛋白酶體α2-亞基、腺嘌呤-磷酸核糖基-轉(zhuǎn)移酶和無機焦磷酸酶的至少一種蛋白質(zhì)和/或至少一種其衍生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及多種蛋白質(zhì)作為癌癥疾病的診斷標記物的用途。特別地，膜聯(lián)蛋白A3蛋白質(zhì)的用途是優(yōu)選的。優(yōu)選與對照比較分析膜聯(lián)蛋白A3的增加調(diào)節(jié)。本發(fā)明也涉及生產(chǎn)用于癌癥治療的藥品的活性物質(zhì)的用途，所述物質(zhì)影響多種特征蛋白質(zhì)的活性和/或豐度。
文檔編號G01N33/574GK101027099SQ200580011377
公開日2007年8月29日 申請日期2005年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月16日
發(fā)明者M·卡希爾, H·克洛克, H·羅加特施 申請人:蛋白質(zhì)系統(tǒng)股份公司