專利名稱：心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體的制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種與心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)特異性結(jié)合的抗體，尤其是與心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)特異性結(jié)合的單克隆抗體及其制備方法。
背景技術(shù)：
心血管類疾病歷來是人們健康的大敵。近年來，隨著生活水平的提高及工作社會壓力的不斷加大，心血管疾病的發(fā)病率歷年增加，心臟病已成為僅次于癌癥的第二大死亡原因。在心臟病中尤其是心絞痛和心肌梗塞等缺血性心臟病的增加特別顯著，大約占了因心臟病死亡的人數(shù)的4成。
脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)是一組至少由6種不同相對分子質(zhì)量組成的蛋白質(zhì)(14,000～15,000)。存在不同臟器中，心臟中的FABP和肝、小腸中的有明顯區(qū)別。它被認(rèn)為是重要的脂肪酸載體蛋白，不僅在脂酸酸代謝中起作用，而且在心臟中的能量代謝中也起重要作用。心肌缺氧時，H-FABP釋放至細(xì)胞外，進入血液循環(huán)，使血中FABP含量升高。特別由于其分子量小和心肌中含量很高(0.46mg/g濕重)因而其特異性相對較高，在急性心肌梗塞(AMI)早期在血中就可查到其升高。肌紅蛋白(Mb)是另一種小分子(18KDa)蛋白質(zhì)，其血漿動力學(xué)與FABP相似，可在心梗后2-3h出現(xiàn)于血中，也是急性心肌梗塞(AMI)早期檢測的有用指標(biāo)，但由于Mb在骨胳肌中含量較高，因而缺乏特異性，其含量升高不能區(qū)分是來源于骨骼肌還是心肌。心臟肌鈣蛋白-I(cTnI)和肌酸激酶同工酶-MB(CK-MB)對心肌損傷有較好的特異性，但對AMI早期診斷不佳，因其在AMI發(fā)生后6-8h才使血中濃度升高。
AMI最主要的搶救措施是溶栓治療，而溶栓治療成功的關(guān)鍵有賴于對AMI的早期診斷。對于急性心?；颊撸瑩尵壬仨毞置氡貭?。目前最主要的搶救措施是溶栓治療，而溶栓治療者的存活率取決于壞死面積的大小，患者越快得到治療，存活的機率就越高。如果能在發(fā)病的4-6小時治療，患者康復(fù)的機會很大，如果過了6小時，往往再搶救也來不及了。
因此本領(lǐng)域迫切需要獲得與心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)特異性結(jié)合的抗體，尤其是心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)特異性結(jié)合的一對單克隆抗體，從而可以開發(fā)出精準(zhǔn)度高的早期診斷急性心梗的試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種與心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)特異性結(jié)合的抗體。
本發(fā)明的另一個目的就是提供一對與心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)特異性結(jié)合的單克隆抗體，并將其用于制備早期快速檢測急性心肌梗塞的試劑盒。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種單克隆抗體，它具有以下特性(a)特異性地與心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白H-FABP結(jié)合；并且(b)所述抗體與抗原結(jié)合的裸鼠腹水效價為1∶50000-1∶1000000。本發(fā)明提供的單克隆抗體與FABP的相對親合力為1×10-6-1×10-12M。
在另一優(yōu)選例中，所述的抗體可靈敏地檢測到ng/ml級的H-FABP(如1ng/ml的H-FABP)，并在1-200ng/ml范圍內(nèi)呈線性。
本發(fā)明提供的單克隆抗體是一對配對的單克隆抗體，包括第一單克隆抗體和第二單克隆抗體，所述的第一單克隆抗體和第二單克隆抗體結(jié)合于H-FABP的不同表位。第一單克隆抗體和第二單克隆抗體與H-FABP的相對親合力為1×10-7-1×10-11M。更佳地，所述第一單克隆抗體和第二單克隆抗體與FABP的相對親合力為1×10-8-1×10-11M。所述的單克隆抗體為IgG類型，包括IgGl、IgG2a和IgG3。
本發(fā)明提供的單克隆抗體重鏈的氨基酸序列為SEQ ID NO1或3，輕鏈的氨基酸序列為SEQ ID NO2或4。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種制備所述的單克隆抗體的方法，它包括步驟(a)用心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白H-FABP免疫小鼠；(b)將免疫小鼠的脾細(xì)胞和鼠骨髓瘤細(xì)胞融合后，獲得雜交瘤細(xì)胞(c)從步驟(b)的雜交瘤細(xì)胞中，選出產(chǎn)生的單克隆抗體與心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白H-FABP結(jié)合的裸鼠腹水效價為1∶50000-1∶1000000的雜交瘤細(xì)胞；(d)從步驟(c)的雜交瘤細(xì)胞中制得單克隆抗體。
在另一優(yōu)選例中，所述的心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白H-FABP是人的H-FABP蛋白。
在本發(fā)明的第三方面，提供了所述的單克隆抗體在制備快速檢測心肌梗塞的測試片或試劑盒中的應(yīng)用。
所述的檢測心肌梗塞的測試卡，含有以下結(jié)構(gòu)，從下至上依次為加入樣品的加樣區(qū)；金標(biāo)抗體點樣區(qū)；讀取結(jié)果的測試區(qū)；吸收區(qū)，吸收區(qū)的位置與加樣區(qū)相對而且吸收區(qū)相對測試卡的其他區(qū)域而言具有吸收能力，從而使得加至加樣區(qū)的樣品層析通過測試區(qū)。
在所述測試區(qū)有包被抗體點樣區(qū)，所述包被抗體點樣區(qū)包含固定化的抗FABP的第二單克隆抗體，在測試卡上設(shè)有金標(biāo)抗體點樣區(qū)，所述的金標(biāo)抗體沿樣品擴散方向擴散至包被抗體點樣區(qū)，最終被吸收區(qū)吸收，并且所述的金標(biāo)抗體點樣區(qū)包含金標(biāo)記的抗H-FABP的第一單克隆抗體，并且所述的第一單克隆抗體和第二單克隆抗體可同時結(jié)合于H-FABP，其中，所述的第一單克隆抗體和第二單克隆抗體是如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，并且結(jié)合于H-FABP的不同表位。
在另一優(yōu)選例中，所述的金標(biāo)抗體點樣區(qū)位于加樣區(qū)和測試區(qū)之間。
在另一優(yōu)選例中，所述檢測卡還具有一基片，加樣區(qū)、金標(biāo)抗體點樣區(qū)、測試區(qū)和吸收區(qū)位于基片上，加樣區(qū)、金標(biāo)抗體點樣區(qū)、測試區(qū)和吸收區(qū)的厚度分別為0.05-5毫米，基片厚度為0.05-10毫米。
在另一優(yōu)選例中，加樣區(qū)為濾血膜；金標(biāo)抗體點樣區(qū)為玻璃纖維膜；檢測區(qū)為硝酸纖維素膜；吸收區(qū)為吸水材料；基片為PVC底板或紙板。
在另一優(yōu)選例中，所述包被抗體點樣區(qū)中抗H-FABP的第二單克隆抗體的數(shù)量為0.01-50μg；金標(biāo)抗體點樣區(qū)中抗FABP的第一單克隆抗體的數(shù)量為0.02-50μg。
在另一優(yōu)選例中，用于此診斷試劑盒的兩個抗體HF2和HF10分別為IgGl和IgG2a亞型。
優(yōu)選例中，至少有一個單抗是膠體金包被。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種檢測試劑盒，它含有上述的測試卡和說明書。
本發(fā)明提供的與心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)特異性結(jié)合的抗體，尤其是心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)特異性結(jié)合的一對單克隆抗體，使得開發(fā)出的早期診斷急性心梗的試劑盒精準(zhǔn)度高。


圖1顯示了Protein A純化的抗H-FABP的單克隆抗體HF2和HF10(經(jīng)臨床檢測，HF2和HF10為最佳配對)。其中各泳道如下泳道1-3單克隆抗體HF2；泳道4-6單克隆抗體HF10；泳道M蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物。
圖2顯示了夾心ELISA測試中H-FABP的濃度曲線。其中，HF2為包被抗體，HF10為標(biāo)記抗體。H-FABP標(biāo)準(zhǔn)液用不含H-FABP的血清配制而成。
圖3顯示了本發(fā)明一種測試條的結(jié)構(gòu)，其中箭頭方向為樣品流動方向。
圖4顯示了H-FABP金標(biāo)快速診斷試劑盒對不同濃度H-FABP蛋白的檢測結(jié)果。圖片下方為檢測樣本中H-FABP的含量(ng/ml)。C處為質(zhì)控線，T處為檢測線。當(dāng)血清中H-FABP濃度為2ng/ml(接近正常人平均值)時，結(jié)果呈陰性；6.5ng/ml(即正常人高限)時，在T處出現(xiàn)微弱條帶；隨著H-FABP濃度(10和20ng/ml)升高，T處紅色加深。
圖5顯示HF10重鏈的測序結(jié)果。
圖6顯示HF10輕鏈的測序結(jié)果。
圖7顯示HF2重鏈的測序結(jié)果。
圖8顯示HF2輕鏈的測序結(jié)果。
圖9A和9B分別顯示了抗體HF10的重鏈和輕鏈的氨基酸序列和DNA序列。
圖10A和10B分別顯示了抗體HF10的重鏈和輕鏈的氨基酸序列和DNA序列。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過多年廣泛而深入的研究，針對臨床上對急性心梗早期診斷的需求，以心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)為靶點，獲得了兩個識別心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白不同表位(抗原決定簇)的、高特異性的抗H-FABP單克隆抗體，并以此用雙抗體夾心法為原理制備了金標(biāo)快速診斷測試片和試劑盒。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)是一種已知蛋白，其氨基酸序列和核苷酸序列都是本領(lǐng)域已知的(見公知的GenBank數(shù)據(jù)庫)。
生產(chǎn)H-FABP的方法也是已知的。例如，通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984；2241431)，可利用H-FABP的多聚核苷酸序列可用來表達或生產(chǎn)重組的H-FABP蛋白。一般來說有以下步驟(1).用編碼人H-FABP蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
對于本發(fā)明與心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)特異性結(jié)合的單抗重鏈和輕鏈序列，可以用常規(guī)方法測定。與心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)特異性結(jié)合的單抗V鏈的超變區(qū)或互補決定區(qū)(complementarity determining region，CDR)特別令人感興趣，因為它們中至少部分涉及結(jié)合抗原。因此，本發(fā)明包括那些具有帶CDR的免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變鏈的分子，只要其CDR同與心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)特異性結(jié)合的單抗CDR具有90％以上(較佳地95％以上)的同源性。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆抗體，還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab或(Fab’)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明還提供了編碼單抗的DNA。本發(fā)明的與心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)特異性結(jié)合的單抗的抗原的核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)FABP的核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法制備模板，通過擴增而得到有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
本發(fā)明還提供了上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子。這些DNA分子的序列可以如上用常規(guī)技術(shù)，此外，還可將輕鏈和重鏈的編碼序列融合在一起，形成單鏈抗體。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
本發(fā)明還涉及包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體。這些載體可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、COS7、293細(xì)胞、或Bowes黑素瘤細(xì)胞的動物細(xì)胞等。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔，脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
此外，本發(fā)明還提供了一種檢測急性心梗的試劑盒，它含有上述的免疫球蛋白或免疫偶聯(lián)物，或其活性片段。
另一方面，制備抗H-FABP蛋白抗體的技術(shù)也是本領(lǐng)域中眾所周知。優(yōu)選用于本發(fā)明的抗體是對人H-FABP具有特異性的單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人H-FABP蛋白或其片段。較佳地，指那些能與人H-FABP蛋白或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人H-FABP蛋白的分子，也包括那些并不影響人H-FABP蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人H-FABP基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進行制備。例如，純化的人H-FABP基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達人H-FABP蛋白或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。
單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodiesand T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的單克隆抗體可以利用人H-FABP基因產(chǎn)物或片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人H-FABP基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
特別優(yōu)選的抗體是與H-FABP的相對親合力為1×10-6-1×10-12M的抗體(即當(dāng)抗體濃度為1×10-6-1×10-12M時，可以與1μg/ml H-FABP抗原有明顯結(jié)合(OD405nm大于0.5))。較佳地，與H-FABP的相對親合力為1×10-7-1×10-11M。更佳地，與H-FABP的相對親合力為1×10-8-1×10-11M，最佳地為1×10-9-1×10-11M。
如本文所用，術(shù)語“測試片”、“測試條”或“測試卡”可互換使用，其含義相同。
參見圖3，本發(fā)明的測試片包括可加入樣品的加樣區(qū)30(較佳地，加樣區(qū)還包括覆蓋在上方的濾血膜40)；與加樣區(qū)側(cè)鄰的測試區(qū)20；
吸收區(qū)50，吸收區(qū)50的位置與加樣區(qū)30相對而且吸收區(qū)50相對測試片的其他區(qū)域而言具有吸收能力，從而使得加至加樣區(qū)30的樣品擴散通過測試區(qū)；其中，在所述測試區(qū)有包被抗體點樣區(qū)60，所述包被抗體點樣區(qū)包含固定化的抗H-FABP的第二單克隆抗體，在測試片上設(shè)有金標(biāo)抗體點樣區(qū)62，所述的金標(biāo)抗體點樣區(qū)位置是沿樣品擴散方向的在包被抗體點樣區(qū)的上游，并且所述的金標(biāo)抗體點樣區(qū)包含金標(biāo)記的抗H-FABP的第一單克隆抗體。在圖1所示的優(yōu)選例中，金標(biāo)抗體點樣區(qū)62可位于加樣區(qū)。當(dāng)然，金標(biāo)抗體點樣區(qū)還位于加樣區(qū)和測試區(qū)之間，或者位于測試區(qū)中。
圖3中，80為血樣，當(dāng)血樣滴在點樣區(qū)上后，會被吸收區(qū)吸引向箭頭方向擴散，先與金標(biāo)抗體點樣區(qū)62中金標(biāo)記的抗H-FABP的第一單克隆抗體結(jié)合，形成“第一單克隆抗體-H-FABP”復(fù)合物。該復(fù)合物繼續(xù)向吸收區(qū)擴散，進入測試區(qū)，然后與測試區(qū)中包被抗體點樣區(qū)60中固定化的抗H-FABP的第二單克隆抗體，形成“第一單克隆抗體-H-FABP-第二單克隆抗體”復(fù)合物，并停留在包被抗體點樣區(qū)，并顯出檢測結(jié)果(見圖4)。此外，血樣樣品會繼續(xù)向吸收區(qū)擴散，與對照區(qū)72中固定化的抗金標(biāo)抗體的抗體(如羊抗鼠抗體)或FABP結(jié)合，作為測試條的質(zhì)控對照。
由于本發(fā)明首次采用對H-FABP有高親和力(相對親合力為1×10-6-1×10-12M)，且識別不同表位的單克隆抗體，因此不僅靈敏度非常高，而且可以極其快速地檢測出血液中H-FABP，將現(xiàn)有技術(shù)中需數(shù)小時才能獲得檢測結(jié)果縮短到數(shù)分鐘(通常5分鐘即能讀到結(jié)果)，這對于救治急性心肌梗塞這種爭分奪秒的疾病而言具有極其重大的意義。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(a)本發(fā)明的抗體對H-FABP有極其優(yōu)異的特異性，裸鼠腹水效價為1∶50000-1∶1000000或更高。
(b)本發(fā)明的一對抗體可靈敏地檢測到ng/ml級的FABP，并在1-100ng/ml范圍內(nèi)呈線性。這一結(jié)果為金標(biāo)試劑盒的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1雜交瘤細(xì)胞法制備單克隆抗體A.抗體的制備1.用常規(guī)的方法對BalB/C小鼠進行免疫，免疫原為人心臟組織中分離純化而得的天然H-FABP蛋白(購自美國Life Diagnostic公司)；2.初次免疫將100微克抗原與福氏完全佐劑充分乳化后，腹腔或皮下多點注射。以后每隔兩周，將50微克抗原與不完全佐劑混合后注射，共免疫四次；3.融合前3天加強免疫一次，然后取出脾臟，制備成脾細(xì)胞懸液；4.在PEG融合劑作用下與SP2/0細(xì)胞融合，并在HAT選擇培養(yǎng)基上篩選單克隆；5.經(jīng)幾次融合，得到15株抗H-FABP特異的單克隆抗體株。
B.抗體的配對用于雙抗體夾心法進行免疫檢測的一對抗體必須識別抗原上不同的表位才能配對。在夾心ELISA法中，如包被抗體和標(biāo)記抗體識別抗原上同一位點，則呈陰性結(jié)果；如包被抗體和標(biāo)記抗體識別抗原上不同位點，則呈陽性結(jié)果。本實施例中，對HF10抗體用辣根過氧化酶進行標(biāo)記，以HF2為包被抗體，以不同濃度的天然的H-FABP為夾心抗原，進行雙抗體夾心法檢測。
結(jié)果顯示，HF2和HF10在夾心ELISA試驗中配對良好，對H-FABP濃度的檢測在2ng/ml-100ng/ml范圍內(nèi)呈線性(圖2)。
C.抗體的質(zhì)量控制1.骨髓瘤細(xì)胞SP2/0，本身不合成或不分泌免疫球蛋白，來源歷史明確，保存條件符合要求。
2.細(xì)胞融合末次免疫后第三天取脾制成細(xì)胞懸液，與骨髓瘤細(xì)胞按1∶6到1∶10的比例混合，在PEG作用下進行細(xì)胞融合。
3.克隆化用Elisa法篩選出分泌目的抗體的雜交瘤，經(jīng)有限稀釋法對其進行克隆，直至獲得具有穩(wěn)定分泌單克隆抗體能力的雜交瘤細(xì)胞系。
D.雜交瘤細(xì)胞的鑒定抗體分泌穩(wěn)定性經(jīng)克隆化及連續(xù)傳代檢查，連續(xù)克隆化至檢測單克隆抗體的陽性率達100％。并在體外傳代三個月以上細(xì)胞株能保持穩(wěn)定的分泌抗體。
E.單克隆抗體的鑒定1.亞型分類用Sigma鼠單抗亞型分類試劑盒(MouSe Monoclonalantibody Isotyping reagents)通過Elisa法確定單克隆抗體的亞型。篩到的兩個抗體HF2和HF10分別為IgGl和IgG2a亞型。圖12.親和力的測定Elisa法進行相對親和力的測定用1ug/ml FABP抗原包板，將抗體作系列稀釋，以抗體濃度為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以曲線上趨于平坦段的OD值為100％，查出其OD值為50％點的抗體濃度，此濃度值越低，親和力越高。
HF2和HF10單抗在此體系中測定的相對親和力均達0.5ug/ml.
3.特異性分析將所得到的單克隆抗體與系列無關(guān)抗原進行Elisa反應(yīng)，檢測所得抗體是否與無關(guān)免疫原產(chǎn)生交叉反應(yīng)。檢測結(jié)果，本實施例制得的抗體與其他抗原沒有交叉反應(yīng)。
實施例2小鼠腹水法制備單克隆抗體A.抗體的制備1.制備腹水用的小鼠均為SPF級小鼠，生產(chǎn)小鼠均經(jīng)過檢查并有合格證明，生產(chǎn)過程中如發(fā)生動物不健康、咬傷或感染則立即廢棄。
2.動物設(shè)備設(shè)施動物試驗均在上海第二醫(yī)科大學(xué)動物中心進行，為SPF級動物房，符合國家規(guī)定。
3.細(xì)胞庫的建立為了保證長期穩(wěn)定地生產(chǎn)出符合要求的高質(zhì)量單抗，首先要建立高標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞庫，包括原始細(xì)胞庫、種子細(xì)胞庫和生產(chǎn)細(xì)胞庫，細(xì)胞管的位置、代數(shù)、管數(shù)、凍存、復(fù)蘇的情況均有專人負(fù)責(zé)，每次生產(chǎn)腹水時取生產(chǎn)細(xì)胞管一支復(fù)蘇擴增及生產(chǎn)，不再回凍。
4.細(xì)胞接種制備腹水的過程均在無菌條件下完成，注射雜交瘤細(xì)胞之前每只小鼠腹腔注射降植烷(Sigma)0.5ml，一周后每只小鼠注射雜交瘤細(xì)胞3x106。
5.腹水的采集注射細(xì)胞后一般7至10天一次性采集腹水，離心分離出上清即為粗提抗體，注明批號、采集日期，置-20°保存。
6.粗制抗體檢測用Elisa法測定抗體的效價，達到106以上為合格，可用于抗體純化。
B.抗體純化和鑒定一般用Protein A或protein G親和層析法純化，親和柱填料為美國Sigma公司產(chǎn)品，純化方法參照產(chǎn)品說明書。經(jīng)純化后的抗體需經(jīng)過一下檢測1.活性檢測用Elisa法測定抗體與抗原的反應(yīng)活性2.純度測定SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定抗體純度，必要時還可用HPLC法測定。
3.蛋白含量測定Biorad BCA蛋白定量試劑盒，并以IgG標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線進行比較定量。
4.特異性的確定用Elisa法檢測與無關(guān)蛋白的反應(yīng)以確定抗體的反應(yīng)特異性。
實施例3抗體的測序目前應(yīng)用的快速序列測定技術(shù)是Sanger等(1977)提出的酶法。首先合成互相獨立的若干組帶熒光標(biāo)記的寡核苷酸，每組寡核苷酸都有固定的起點，但卻隨機終止于特定的一種或者多種殘基上。由于DNA上的每一個堿基出現(xiàn)在可變終止端的機會均等，因此，上述每一組產(chǎn)物都是一些寡核苷酸混合物，這些寡核苷酸的長度由某一種特定堿基在原DNA全片段上的位置所決定。然后在可以區(qū)分長度僅差一個核苷酸的不同DNA分子的條件下，對各組寡核苷酸進行電泳分析，只要把幾組寡核苷酸加樣于測序凝膠中若干個相鄰的泳道這上，即可從凝膠的熒光機上直接讀出DNA上的核苷酸順序。測序結(jié)果見圖5-8。
HF10的重鏈氨基酸序列如SEQ ID NO1所示，DNA序列如SEQ ID NO5所示。
HF10的輕鏈氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，DNA序列如SEQ ID NO6所示。
HF2的重鏈氨基酸序列如SEQ ID NO3所示，DNA序列如SEQ ID NO7所示。
HF2的輕鏈氨基酸序列如SEQ ID NO4所示，DNA序列如SEQ ID NO8所示。
實施例4膠體金法檢測H-FABP的方法和試劑盒根據(jù)臨床資料，H-FABP在正常人血清中的濃度高限為6.5ng/ml，一旦急性心梗發(fā)作，H-FABP的濃度馬上升高，甚至可達幾百到上千ng/ml。故將6.5ng/ml設(shè)為本試劑盒的臨界值。
(a)膠體金顆粒的制備(1)將HauCl4先配制成0.01％水溶液，取100ml加熱至沸。
(2)攪動下準(zhǔn)確加入1％檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7·2H2O)水溶液1.0ml。
(3)繼續(xù)加熱煮沸15min。此時可觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很快變灰色，續(xù)而轉(zhuǎn)成黑色，隨后逐漸穩(wěn)定成紅色。全過程約2～3min。
(4)冷卻至室溫后用去離子水恢復(fù)至原體積。
用分光光度計掃描λmax來測量金顆粒的粒徑及均勻度。結(jié)果表明，制備的膠體金的可見光區(qū)最高吸收峰在525nm，估測制備的膠體金顆粒的直徑在35nm。吸收峰的峰形表明膠體金的均勻度較好。
(b)金標(biāo)抗體的制備(1)在電磁攪拌下，將1ml抗體溶液(HF2或HF10，濃度為1mg/ml)加入50ml膠體金溶液中，加入抗體時應(yīng)逐滴加入，繼續(xù)攪拌10分鐘。
(2)在磁性攪拌下加入牛血清白蛋白(BSA)，冰箱過夜。以保持標(biāo)記膠體金的穩(wěn)定。
(3)標(biāo)記好的金標(biāo)抗體溶液在4℃，10000xg，離心30min。吸取沉淀金復(fù)溶至5ml，在可見光區(qū)吸收峰為520nm處測得OD值。制備不同OD值的金標(biāo)抗體(OD＝30，35，40)供金標(biāo)抗體濃度的優(yōu)化實驗用。
(c)抗體濃度的優(yōu)化實驗分別把OD值為20、30、40、50的金標(biāo)抗體溶液取1ul噴在玻璃纖維膜上，把濃度為0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml抗體溶液取1ul噴在硝酸纖維素膜上，用正交法決定出0.4mg/ml符合檢測靈敏度的抗體濃度為金標(biāo)抗體OD值為30，檢測線上的抗體濃度為0.4mg/ml。
(d)試劑盒的制備檢測試劑盒的主要結(jié)構(gòu)包括上樣區(qū)，測試區(qū)和吸收區(qū)。上樣區(qū)由全血濾膜和帶有金標(biāo)記抗體的玻璃纖維膜組成，測試區(qū)為硝酸纖維膜，上有檢測線和質(zhì)控線，吸收區(qū)由吸水濾紙組成(見圖3)。三區(qū)按順序裝配在塑料底板上并經(jīng)切割包裝即完成。
(e)實驗室檢測結(jié)果用不含H-FABP的血清為稀釋液配成含不同濃度的H-FABP蛋白的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用本金標(biāo)試劑盒進行檢測。
結(jié)果如圖4所示，C處為質(zhì)控線，T處為檢測線。當(dāng)血清中FABP濃度為2ng/ml(接近正常人平均值)時，結(jié)果呈陰性；6.5ng/ml(即正常人高限)時，在T處出現(xiàn)微弱條帶；隨著FABP濃度(10和20ng/ml)升高，T處紅色加深。H-FABP含量越高，信號越強。
實施例5臨床初試結(jié)果用實施例3制備的心肌梗塞試劑盒，對26例病人的126個血清(含發(fā)病后的不同時間點)和12個正常人的血樣進行檢測。
26個心梗病人的120個血樣進行測試后，陽性符合率超過99％，僅一個病人的發(fā)病后1.5小時樣品未見明顯陽性，其它陽性標(biāo)本全部符合。而其他現(xiàn)有試劑盒如CK-MB和肌鈣蛋白I和T等在發(fā)病3小時前幾乎不能測出。12個正常人的血樣11個顯示陰性，一個顯示為極弱陽性。這些數(shù)據(jù)初步提示了FABP診斷盒在臨床上的靈敏度和準(zhǔn)確性。
此外，本發(fā)明試劑盒只需5分鐘即能讀到結(jié)果，這對于診治急性心肌梗塞這種爭分奪秒的疾病而言優(yōu)勢是顯而易見的。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海單抗制藥技術(shù)有限公司<120>心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體的制備方法及其用途<130>057978<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>138<212>PRT<213>小鼠(Mus Musculus)<400>1Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly15 10 15Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ser20 25 30Val Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Lys Lys Arg Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Ser Ile Ser Asp Gly Gly Tyr Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys50 55 60Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Ser Leu65 70 75 80Gln Met Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr85 90 95Arg Ile Ser Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Ser Leu Asp Val Trp Gly100 105 110Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser115 120 125Val Tyr Pro Leu Ala Leu Glu Ser Leu Gly130 135<210>2<211>131<212>PRT
<213>小鼠(MuS Musculus)<400>2Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly1 5 10 15Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser20 25 30Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro35 40 45Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His65 70 75 80Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg85 90 95Glu Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala100 105 110Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Val Glu Lys115 120 125Ser Leu Gly130<210>3<211>148<212>PRT<213>小鼠(Mus Musculus)<400>3Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Thr Tyr20 25 30Val Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Asp Trp Val35 40 45Ala Ser Ile Ser Arg Asp Gly Gly Tyr Ile Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Ash Ile Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Leu Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85 90 95Ser Arg Val Ser Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Ser Phe Asp Val Trp100 105 110Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro115 120 125Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Glu Ala Trp Glu Ser Arg Gly Leu Ala130 135 140Ala Gly Ser Met145<210>4<211>132<212>PRT<213>小鼠(Mus Musculus)<400>4Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly1 5 10 15Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser20 25 30Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro35 40 45Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His65 70 75 80Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg85 90 95Glu Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Glu Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala100 105 110Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Val Asp Lys
115 120 125Leu Gly Asn His130<210>5<211>414<212>DNA<213>小鼠(Mus Musculus)<400>5gaagtgaaac tggtggagtc tgggggagac ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt acttctgtca tgtcttgggt tcgtcaaact120ccaaagaaaa ggctggagtg ggtcgcatcc attagtgatg gtggttacat ttattatcct180gacagtgtga agggccgatt caccatgtcc agagacaatg ccaggaacat cctgtccctt240caaatgagcc gtctgaggtc tgaggacacg gccatgtatt actgtacaag aatctcttat300tactacggta gtagtccgtc cctcgatgtc tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc360tcagccaaaa cgacaccccc atcagtctat cccttggccc tggaaagctt ggga 414<210>6<211>393<212>DNA<213>小鼠(Mus Musculus)<400>6gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60atctcataca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggaac120caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatc ttgtatccaa cctagaatct180ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat240cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acattaggga gctttacacg300ttcggagggg ggaccaagct ggaaataaaa cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc360ttcccaccat ccagtgtcga aaaaagtttg ggg 393<210>7<211>444<212>DNA<213>小鼠(Mus Musculus)<400>7gaagtgaaac tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60tcctgtgcag cctctggatt cactttcggt acttatgtca tgtcttgggt tcgtcagact120ccagaaaaga gactggactg ggtcgcatcc attagtcgtg atggtggtta catttattat180cctgacactg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaggaa catcctgtac240ctgcaattga gcagtctgag gcctgaggac acggccatgt attactgttc aagagtctct300tattactacg gtagtagtcc gtccttcgat gtctggggcg cagggaccac ggtcaccgtc360tcctcagcca aaacgacacc cccatctgtc tatccattgg cccctgaagc ttgggaatcc420
cgcggactgg cggccgggag catg 444<210>8<211>396<212>DNA<213>小鼠(Mus Musculus)<400>8gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60atctcataca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggaac120caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatc ttgtatccaa cctagaatct180ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat240cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acattaggga gctttacacg300ttcggagggg agaccaagct ggaaataaaa cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc360ttcccaccat ccagtgtcga caagcttggg aatcac 39權(quán)利要求
1.一種單克隆抗體，其特征在于，它具有以下特性(a)特異性地與心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白H-FABP結(jié)合；并且(b)所述抗體與抗原結(jié)合的裸鼠腹水效價為1∶50000-1∶1000000。
2.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于，它是一對配對的單克隆抗體，包括第一單克隆抗體和第二單克隆抗體，所述的第一單克隆抗體和第二單克隆抗體結(jié)合于H-FABP的不同表位。
3.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于，所述的單克隆抗體與FABP的相對親合力為1×10-6-1×10-12M。
4.如權(quán)利要求3所述的單克隆抗體，其特征在于，所述第一單克隆抗體和第二單克隆抗體與FABP的相對親合力為1×10-8-1×10-11M。
5.如權(quán)利要求3所述的單克隆抗體，其特征在于，所述的單克隆抗體重鏈的氨基酸序列為SEQID NO1或3，并且輕鏈的氨基酸序列為SEQID NOID NO2或4。
6.如權(quán)利要求3所述的單克隆抗體，其特征在于，所述的單克隆抗體為IgG類型，包括IgG1、IgG2a和IgG3。
7.一種制備權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的方法，其特征在于，它包括步驟(a)用心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白H-FABP免疫小鼠；(b)將免疫小鼠的脾細(xì)胞和鼠骨髓瘤細(xì)胞融合后，獲得雜交瘤細(xì)胞(c)從步驟(b)的雜交瘤細(xì)胞中，選出產(chǎn)生的單克隆抗體與心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白H-FABP結(jié)合的裸鼠腹水效價為1∶50000-1∶1000000的雜交瘤細(xì)胞；(d)從步驟(c)的雜交瘤細(xì)胞中制得單克隆抗體。
8.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體在制備快速檢測心肌梗塞的測試片或試劑盒中的應(yīng)用。
9.一種檢測心肌梗塞的測試卡，其特征在于，該測試卡含有以下結(jié)構(gòu)，從下至上依次為加入樣品的加樣區(qū)；金標(biāo)抗體點樣區(qū)讀取結(jié)果的測試區(qū)；吸收區(qū)，吸收區(qū)的位置與加樣區(qū)相對而且吸收區(qū)相對測試卡的其他區(qū)域而言具有吸收能力，從而使得加至加樣區(qū)的樣品層析通過測試區(qū)；其中，在所述測試區(qū)有包被抗體點樣區(qū)，所述包被抗體點樣區(qū)包含固定化的抗FABP的第二單克隆抗體，在測試卡上設(shè)有金標(biāo)抗體點樣區(qū)，所述的金標(biāo)抗體沿樣品擴散方向擴散至包被抗體點樣區(qū)，最終被吸收區(qū)吸收，并且所述的金標(biāo)抗體點樣區(qū)包含金標(biāo)記的抗H-FABP的第一單克隆抗體，并且所述的第一單克隆抗體和第二單克隆抗體可同時結(jié)合于H-FABP，其中，所述的第一單克隆抗體和第二單克隆抗體是如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，并且結(jié)合于H-FABP的不同表位。
10.一種檢測試劑盒，其特征在于，它含有權(quán)利要求9所述的測試卡和說明書。
全文摘要
本發(fā)明的目的就是提供一種與心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H－FABP)特異性結(jié)合的單克隆抗體，尤其是能與心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H－FABP)特異性結(jié)合的一對配對的單克隆抗體，可以開發(fā)出特異性好、精準(zhǔn)度高的早期診斷急性心梗的試劑盒。
文檔編號G01N33/577GK1978465SQ200510111160
公開日2007年6月13日 申請日期2005年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月6日
發(fā)明者陳克勤, 勞燁, 黃大慶, 包維麗, 朱亞, 鄭健紅 申請人:上海單抗制藥技術(shù)有限公司