專利名稱：一種新型含碘樹脂衍生物用在基于質(zhì)譜的蛋白組學(xué)研究中的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類結(jié)構(gòu)新穎的固體衍生物在生化方面的應(yīng)用尤其是在蛋白組學(xué)研究中的應(yīng)用前景，特別是涉及一類新型含碘樹脂衍生物在生化方面的應(yīng)用尤其是在蛋白組學(xué)研究中的應(yīng)用前景。
背景技術(shù)：
目前，基因組學(xué)的研究已進(jìn)入一個(gè)相對穩(wěn)定的階段，同時(shí)，基因產(chǎn)物(包括RNA和蛋白質(zhì))的研究正吸引著越來越多的目光。其中特別是蛋白質(zhì)的研究，正以蛋白組學(xué)研究的形式，受到了日益的重視。蛋白質(zhì)，作為生物體內(nèi)重要的活性物質(zhì)，其研究的復(fù)雜性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了基因以及RNA。而且蛋白質(zhì)所表現(xiàn)出的多重信息修飾程度，量的變化，結(jié)構(gòu)以及分布的變化都直接與生理功能的變化有關(guān)，所以關(guān)于蛋白質(zhì)的研究是生命研究中最為直接有效的研究方面，也是最富有挑戰(zhàn)性的研究領(lǐng)域之一(參見J.Bio.Chem.2001；4945497-45500)。
對于復(fù)雜的蛋白質(zhì)體系，目前最為普遍和有效的研究過程使用的是二維凝膠電泳分離后，再進(jìn)行質(zhì)譜檢測，完成定性、定量、差異比較的方法。這一方法是目前應(yīng)用范圍最廣，發(fā)展最為完善的蛋白組學(xué)方面的研究方法(參見Anal.Chem.1994，244390-4399；Proteomics 2001 13-12)。但是作為分離手段的二維凝膠電泳，有著其固有的缺點(diǎn)。比如對于分離強(qiáng)酸性及強(qiáng)堿性蛋白，含量低的蛋白，及某些膜蛋白，結(jié)果都不能令人滿意。而且這種方法的自動化程度難以提高，再加上其在進(jìn)行蛋白比較分析方面的局限性(參見Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2000，179390-9395；Trends in analytical chemistry 2003，22273-281)，都促使了新方法的發(fā)展和應(yīng)用。
近年來，隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，特別是軟電離技術(shù)(電噴霧電離ESI技術(shù)，基質(zhì)輔助激光解吸電離MAIDI技術(shù))的出現(xiàn)和發(fā)展，使得質(zhì)譜成為蛋白組學(xué)研究中日益重要的分析研究手段，依賴質(zhì)譜建立的蛋白組學(xué)的研究方法也引起了越來越多的重視和發(fā)展。其中，適合于質(zhì)譜檢測的同位素標(biāo)記方法很令人關(guān)注。這種同位素標(biāo)記方法包括體內(nèi)和體外標(biāo)記兩種。體內(nèi)標(biāo)記是在培養(yǎng)液中引入同位素標(biāo)記部分(參見Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1999，966591-6596；J.Am.Chem.Soc.1999，1217949-7950)，其應(yīng)用范圍有限；而體外標(biāo)記中，同位素標(biāo)記部分是在分析過程中引入，因其應(yīng)用所受到的限制較少，所以近年來受到重視。其中，穩(wěn)定同位素親和標(biāo)記(ICAT)技術(shù)是發(fā)展較為完善的方法(參見Nat.Biotechnol.1999，10994-999)。ICAT方法中，蛋白的標(biāo)記、分離都可以依賴ICAT試劑來實(shí)現(xiàn)，具體過程是此試劑在選擇性標(biāo)記巰基部分的同時(shí)，試劑中的生物素部分又可以用來進(jìn)行標(biāo)記肽的親和分離，極大地簡化了分析物的復(fù)雜程度，提高了分析的效率。這種技術(shù)目前已經(jīng)有商品化產(chǎn)品出現(xiàn)，相應(yīng)的軟件也進(jìn)行了開發(fā)和應(yīng)用。但隨著ICAT試劑的應(yīng)用，出現(xiàn)了越來越多的問題，其中依賴于此試劑中的生物素部分的分離效率問題是一個(gè)很重要的方面。
目前還出現(xiàn)了包含有固體的同位素標(biāo)記的試劑(參見Anal.Chem.2002，194969-4979；Nat.Biotechnol.2002，5512-515)，此類試劑的優(yōu)勢已經(jīng)初步顯示出來。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的要解決的問題是提供一類全新的含有固體的同位素標(biāo)記的試劑在蛋白組學(xué)研究中的應(yīng)用方法。
本發(fā)明方法涉及到一種新的試劑，是一種含碘樹脂衍生物，其具有如下結(jié)構(gòu)Solid-Link-R’(H/D)-COCH2I其中，Solid為固相部分，是帶有甲氨基作為反應(yīng)基團(tuán)的樹脂，所述的帶有甲氨基作為反應(yīng)基團(tuán)的樹脂優(yōu)選為甲胺基聚丙烯樹脂(Aminomethyl polystyreneresin)；Link為連接部分，是可用于固相合成的連接部分，其中含有對酸的不穩(wěn)定的C-N鍵；R’(H/D)為標(biāo)記部分，是含8-12個(gè)氫/氘取代的鏈狀或支鏈狀的氨基酸(優(yōu)選8-10個(gè)氫/氘取代的鏈狀或支鏈狀的氨基酸)，所述的氨基酸優(yōu)選如亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，甲硫氨酸等；碘乙酰為巰基的選擇反應(yīng)活性部分。
本發(fā)明涉及的含碘樹脂衍生物，其中b)，c)部分提供氨基、羧基基團(tuán)，以使固相，連接，標(biāo)記及活性等部分相互連接。該含碘樹脂衍生物的連接部分提供了能與標(biāo)記部分相連接及在酸性條件發(fā)生裂解的C-N鍵。該含碘樹脂衍生物中存在供電子基團(tuán)有利于質(zhì)譜分析。該含碘樹脂衍生物標(biāo)記部分包括8-12個(gè)氫/氘取代的鏈狀或支鏈狀的氨基酸，含有限定分析物殘基的定位信息。
本發(fā)明涉及的含碘樹脂衍生物，所述的連接部分優(yōu)選的結(jié)構(gòu)通式如下所示，其中含有對酸的不穩(wěn)定的C-N鍵， 所述的取代苯基上的取代基是單取代或多取代的供電子基團(tuán)。所述的供電子基團(tuán)優(yōu)選為C1～C3烷氧基，OH，Me2NCH2CH2O，Et2NCH2CH2O，NH2，C1～C4的烷基。
進(jìn)一步優(yōu)選具有如下結(jié)構(gòu)通式
本發(fā)明涉及的含碘樹脂衍生物，進(jìn)一步優(yōu)選具有如下結(jié)構(gòu)通式 式中resin為如前所述的樹脂。
本發(fā)明涉及的含碘樹脂衍生物中各部分的連接，可以是通過芴甲氧羰基(Fmoc)保護(hù)的氨基，在堿性條件下脫保護(hù)，再與羧基進(jìn)行縮合反應(yīng)，氨基再脫保護(hù)的循環(huán)完成的。
具體來說，本發(fā)明涉及的含碘樹脂衍生物，可通過下述方法合成在非質(zhì)子性溶劑中，帶有苯甲氨基的固相支持物樹脂與連接部分、縮合劑BOP/DCC/DIC、縮合催化劑HOBt的摩爾比優(yōu)選為1∶1～5∶1～5∶1～5，進(jìn)一步優(yōu)選為1∶3∶3∶3，在0℃-50，優(yōu)選為10℃-50℃，反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為0.5～5小時(shí)，進(jìn)一步優(yōu)選為1-3小時(shí)，抽濾，固體部分可以用非質(zhì)子性溶劑，質(zhì)子性溶劑分別洗滌，干燥，稱重，計(jì)算得加載值(loading value)，為1克固體所含活性位點(diǎn)的摩爾數(shù)，單位是毫摩爾/克，應(yīng)用至下面反應(yīng)的投料計(jì)算。(其中BOP是苯并三唑-1-氧-三-(二甲胺基)膦六氟磷酸鹽，DCC是二環(huán)己基碳二亞胺，DIC是二異丙基碳二亞胺，HOBt是羥基苯駢三氮唑)。
將上述固體在非質(zhì)子性溶劑中與醋酐進(jìn)行封頭(capping)反應(yīng)，乙?；捶磻?yīng)的氨基，10-50℃反應(yīng)0.5～3小時(shí)，進(jìn)一步優(yōu)選為1小時(shí)，抽濾，固體可以用用質(zhì)子性溶劑，質(zhì)子性溶劑分別洗滌，干燥，在堿性條件下，脫Fmoc保護(hù)，洗滌干燥后進(jìn)入下一輪的縮合，洗滌，脫保護(hù)過程，最后將活性基團(tuán)碘乙酰胺也接至固體上得目標(biāo)試劑。
下面以下述試劑結(jié)構(gòu)為例來說明本發(fā)明涉及的含碘樹脂試劑的合成路線 合成路線
(2)在非質(zhì)子溶劑中，0-50℃條件下，甲胺基聚丙烯樹脂(AminomethylPolystyrene Resin)、Rink Amide連接臂(Rink Amide Linker，4-[(2，4-dimethoxyphenyl)(Fmoc-amino)methyl]phenoxyacetic acid)、縮合劑、縮合催化劑羥基苯駢三氮唑(HOBt)混合反應(yīng)2-5小時(shí)，各組分的摩爾比為1∶3∶3∶3。抽濾，洗滌干燥得化合物1。稱重計(jì)算加載(loading)值，為1克固體所含活性位點(diǎn)的摩爾數(shù)，單位是毫摩爾/克。
IR3433，1720，1686.
所得化合物再在非質(zhì)子性溶劑中與醋酐在10-50℃反應(yīng)1小時(shí)，乙?；捶磻?yīng)的氨基。其中所用縮合劑可以是BOP，苯并三唑-1-氧-三-(二甲胺基)膦六氟磷酸鹽(benzotriazol-l-yloxy)tris(dimethylamino)phosphonium hexafluoro-phosphate)，二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，二異丙基碳二亞胺(DIC)等，非質(zhì)子溶劑可以是N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，二氯甲烷(CH2Cl2)，三氯甲烷(CHCl3)等；洗滌所用溶劑依次為N，N-二甲基甲酰氨(DMF)，二氯甲烷(CH2Cl2)，甲醇(CH3OH)；氨基的保護(hù)反應(yīng)所用的條件是苯-醋酐(1∶1)。
(3)在堿性條件下，化合物1脫Fmoc保護(hù)，洗滌干燥得化合物2。其中所用的堿性條件是哌啶/DMF(20-40％)。洗滌所用溶劑同上。
IR3433，3428，1665.
(4)在非質(zhì)子溶劑中和0-50℃條件下，化合物2、Fmoc-leu(10H/D)、縮合劑、縮合催化劑HOBt混合反應(yīng)1-5小時(shí)，抽濾，洗滌干燥得化合物3。各組分的摩爾比，縮合劑，非質(zhì)子溶劑，洗滌所用溶劑同上。
IR3430，3328，1676，1610.
Fmoc-leu(H/D)由leu(H/D)制備，操作參照文獻(xiàn)進(jìn)行(參見Int.J.
Pept.Protein Res.27(4)，398-400，1986)。
(5)在堿性條件下，化合物3脫Fmoc保護(hù)，洗滌干燥得化合物4。
IR3381，3375，1669，1610.
(6)在非質(zhì)子溶劑中和0-50℃條件下，化合物4、碘乙酸、縮合劑、縮合催化劑HOBt混合反應(yīng)1-5小時(shí)，各組分的摩爾比為1∶6∶3∶3。
洗滌干燥后得化合物5。其它條件同上。
IR3427，3301，1670，1610，538.
含碘量分析I(含碘量)5.60％.
計(jì)算可得此含碘固相試劑活性基團(tuán)數(shù)為0.44mmol/g.
本發(fā)明涉及的含碘樹脂試劑的合成方法中，每一步縮合反應(yīng)都可以用以靈敏茚三酮反應(yīng)檢測殘余氨基判斷反應(yīng)是否完全。若發(fā)現(xiàn)不完全，重復(fù)縮合步驟至反應(yīng)完全。洗滌所用的溶劑優(yōu)選為DMF，CH2Cl2，CH3OH等。脫Fmoc保護(hù)所用的堿性試劑優(yōu)選為哌啶/DMF(20-40％)。所用的裝置優(yōu)選是帶有聚丙烯材質(zhì)的三通活塞的玻璃器，在振蕩器上反應(yīng)。
本發(fā)明提供了一種將上述試劑應(yīng)用在半胱氨酸、含半胱氨酸的肽、蛋白質(zhì)定性定量研究中的方法，其中用在半胱氨酸、含半胱氨酸的肽的定性與相對定量的測定方法包括下列步驟a)目標(biāo)分析物經(jīng)還原；b)目標(biāo)分析物與試劑反應(yīng)；c)反應(yīng)猝滅；d)洗滌之后，進(jìn)行標(biāo)記片段回收待分析部分；e)濃縮提純后，將待分析部分溶于緩沖溶液，μLC-MS分析；所述的目標(biāo)分析物是半胱氨酸，含半胱氨酸的肽，所述與目標(biāo)分析物反應(yīng)的試劑是前述的含碘樹脂試劑。
其中用在含半胱氨酸的蛋白質(zhì)定性與相對定量的測定方法，此方法包括下列步驟a)目標(biāo)分析物經(jīng)提純、變性、還原；b)酶解；c)目標(biāo)分析物與試劑反應(yīng)；d)反應(yīng)猝滅；e)洗滌之后，進(jìn)行標(biāo)記片段回收待分析部分；f)濃縮提純后，將待分析部分溶于緩沖溶液，μLC-MS分析；所述的目標(biāo)分析物是含半胱氨酸的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)混合物或不同生理狀態(tài)下的生物體蛋白提取物，所述與目標(biāo)分析物反應(yīng)的試劑是前述的含碘樹脂試劑上述測定方法優(yōu)選的反應(yīng)條件如下所述的a)步驟是將目標(biāo)分析物(一對)置于緩沖溶液中，變性之后，加入還原試劑打開二硫鍵；所述的b)、c)步驟是將溶液稀釋之后加入胰蛋白酶酶解，在目標(biāo)分析物溶液中分別加入一對含碘樹脂試劑，反應(yīng)兩小時(shí)之后，加入β-巰基乙醇猝滅反應(yīng)，所述的d)步驟是將反應(yīng)所得的液體部分保留分析，固體部分抽濾洗滌后，進(jìn)行標(biāo)記片段回收；所述的e)步驟是回收的待分析部分濃縮后，加入無水乙醚，有沉淀產(chǎn)生，抽濾或萃取后，溶于水溶液，μLC-MS分析。
所述的標(biāo)記片段回收優(yōu)選的條件是在酸性溶液中反應(yīng)，0.5～5小時(shí)后(優(yōu)選兩小時(shí)后)將兩反應(yīng)體系的液體部分混合，在氮?dú)饬飨聺饪s后，加入無水乙醚，有沉淀產(chǎn)生，抽濾或萃取后，溶于水溶液，μLC-MS分析。
所述的緩沖溶液中優(yōu)選含有8M的尿素，0.2M的碳酸氫氨，0.02M的氯化鈣，PH 8.2，優(yōu)選將目標(biāo)分析物置于此溶液中，37℃一小時(shí)完成初步變性過程。
所述的還原劑優(yōu)選是三丁基膦(TBP)或二硫蘇糖醇(DTT)。還原劑的加入比例優(yōu)選是二十倍的蛋白摩爾數(shù)，還原條件優(yōu)選是37℃1小時(shí)。
所述的樣品溶液優(yōu)選在3毫克/毫升的濃度下完成變性和還原操作，然后在稀釋至1毫克/毫升的濃度下，按重量比10∶1分兩次加入胰蛋白酶(2毫克/毫升)在37℃酶解20小時(shí)。
所述的反應(yīng)所用的裝置優(yōu)選是帶有聚丙烯材質(zhì)的三通活塞的玻璃器，在振蕩器上反應(yīng)。
所述的回收標(biāo)記片段所用的酸性溶液優(yōu)選是三氟乙酸、乙二硫醇、苯硫基甲烷、苯酚和水的混和溶液；或者三氟乙酸和DMF的混和溶液；或者三氟乙酸和CH2Cl2的混和溶液；或者三氟乙酸和乙腈的混和溶液。進(jìn)一步優(yōu)選的酸性溶液是三氟乙酸∶乙二硫醇∶苯硫基甲烷∶苯酚∶水＝80～95∶1～3∶1～10∶1～10∶2～17；或者三氟乙酸∶DMF＝80～95∶5～20；或者三氟乙酸∶CH2Cl2＝80～95∶5～20；或者三氟乙酸∶乙腈＝80～95∶5～20。尤其優(yōu)選的酸性溶液是三氟乙酸∶乙二硫醇∶苯硫基甲烷∶苯酚∶水＝81.5∶2.5∶5∶5∶6。
洗滌所用的溶劑優(yōu)選為DMF，CH2Cl2，CH3OH等。
μLC-MS分析所用的優(yōu)選條件是A相含0.1％甲酸的水溶液；B相含0.1％甲酸的乙腈溶液。梯度洗脫，60分鐘內(nèi)B相3-65％。
之后圖譜解析，進(jìn)行定性定量分析。
本發(fā)明在半胱氨酸、含半胱氨酸的肽、蛋白質(zhì)定性與相對定量研究中有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)首先，在分離方面，本發(fā)明的應(yīng)用不依賴二維凝膠電泳作為分離手段，而是利用共價(jià)鍵的形成、洗脫、最后回收待分析片段來完成分離提純過程，操作簡便分離效率高，并且兼容任何量的從體液、細(xì)胞或任何生長條件下的組織中收集的蛋白質(zhì)，而且特別是此試劑的使用條件與蛋白酶解的溶液條件一致，有利于低豐度蛋白的分析；其次，此方法的標(biāo)記部分(約170Da)的修飾部分較小，并且結(jié)構(gòu)簡單，在MS后續(xù)分析中不會使數(shù)據(jù)庫的檢索復(fù)雜化，并且此試劑輕與重的標(biāo)記部分之間差10Da，有利于質(zhì)譜圖中一組峰的區(qū)分辨認(rèn)以及避免與一些常規(guī)小分子丟失相混淆；最后，本發(fā)明中，回收待分析部分的反應(yīng)條件溫和回收率高，并且操作便捷，還可以進(jìn)一步與質(zhì)譜測定過程進(jìn)行結(jié)合，達(dá)到更好的蛋白比較分析的結(jié)果。


圖1是實(shí)施例1中含半胱氨酸的肽段的提取分析的實(shí)驗(yàn)步驟圖2是實(shí)施例2中蛋白混合物的比較分析的實(shí)驗(yàn)步驟具體實(shí)施方法通過一下具體實(shí)施方法將有助于理解本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明的內(nèi)容。
1.試劑合成部分實(shí)施例1Rink Amide-AM樹脂(Rink Amide-AM Resin)(1)的合成將200mg(0.22mmol，1.1mmol/g)甲胺基聚丙烯樹脂，360mg(0.66mmol)Rink Amide連接臂，300mg(0.66mmol)BOP，100mg(0.66mmol)HOBt置于反應(yīng)器中，加入5ml N，N-二甲基甲酰氨(DMF)，在室溫下，將反應(yīng)器置于震蕩器中反應(yīng)1小時(shí)。抽濾，固體用DMF，CH3OH，CH2Cl2分別洗滌三遍，干燥稱重得296mg淡黃色固體，計(jì)算加載(loading)值為0.89mmol/g。在將此固體置于反應(yīng)器中，加入5ml醋酐，5ml苯，室溫下震蕩反應(yīng)1小時(shí)，抽濾后，固體用DMF，CH3OH，CH2Cl2分別洗滌三遍后，干燥，得微黃色固體，化合物1。
IR1750實(shí)施例2脫Fmoc保護(hù)的Rink Amide-AM樹脂(RinkAmide-AMResin)(2)的合成將100mg化合物1置于反應(yīng)器中，加入10ml 20％哌啶的DMF溶液，室溫下震蕩反應(yīng)5分鐘，抽濾，固體用DMF，CH3OH，CH2Cl2分別洗滌三遍后，再加入10ml 20％哌啶的DMF溶液，室溫下震蕩反應(yīng)15分鐘，抽濾，固體用DMF，CH3OH，CH2Cl2分別洗滌三遍，干燥，得微黃色固體，化合物2。
實(shí)施例3Fmoc保護(hù)的亮氨酸(10個(gè)氫或氘取代)取代的RinkAmide-AM樹脂(N-(Fmoc-Leu(10H/D))Rink Amide-AM Resin)(3)的合成將86mg(0.077mmol)化合物2置于反應(yīng)器中，加入102mg(0.231mmol)BOP，31mg(0.231mmol)HOBt，和81mg(0.231mmol)Fmoc-leu-(D10)置于反應(yīng)器中，加入5ml DMF。室溫反應(yīng)1小時(shí)，抽濾，固體用DMF，CH3OH，CH2Cl2分別洗滌三遍，干燥，用靈敏茚三酮反應(yīng)(Kaiser’s顏色反應(yīng))檢測殘余氨基，判斷反應(yīng)是否完全(參見Anal.Biochem.1970，34595-598)，若未完全，重復(fù)上述反應(yīng)至反應(yīng)完全，得微黃色固體，化合物3。
實(shí)施例4亮氨酸(10個(gè)氫或氘取代)取代的Rink Amide-AM樹脂(N-Leu(10H/D)-RinkAmide-AM Resin)(4)的合成將86mg(0.077mmol)化合物3置于反應(yīng)器中，脫Fmoc保護(hù)，操作同實(shí)施例2，洗滌干燥，得微黃色固體，化合物4。
實(shí)施例5含碘樹脂衍生物的合成(5)將50mg(0.045mmol)化合物4，62mg(0.135mmol)BOP，22mg(0.135mmol)HOBt，和50mg(0.27mmol)碘乙酸置于反應(yīng)器中，加入5ml N，N-二甲基甲酰氨(DMF)，在室溫下，將反應(yīng)器置于震蕩器中反應(yīng)1小時(shí)。抽濾，固體用DMF，CH3OH，CH2Cl2分別洗滌三遍，干燥，得淡黃色固體，化合物5。
2.試劑應(yīng)用部分原理如下式
實(shí)施例1含半胱氨酸的肽段的提取分析實(shí)驗(yàn)步驟如圖1所示操作步驟如下1.將肽混合物1含10mnol LT-9(LLGTGSFCT)，10nmol MN-8(MGNWLMGN)，20nmol GS-10(GTLFQKMNGS)，20nmol SF-9(SLRGKPHSF)，肽混合物2含20nmol LT-9(LLGTGSFCT)，20nmol MN-8(MGNWLMGN)，10nmol GS-10(GTLFQKMNGS)，10nmol SF-9(SLRGKPHSF)，分別溶于500μL of 0.03M的碳酸氫氨的水溶液(pH8.0-8.2)中，加入2μmol的三丁基膦(TBP)，震蕩反應(yīng)30分鐘。
2.在含肽混合物1的反應(yīng)液中加入5mg的10個(gè)氫取代的含碘樹脂(10H)，在含肽混合物2的反應(yīng)液中加入5mg的10個(gè)氘取代的含碘樹脂(10D)，震蕩反應(yīng)1小時(shí)，在兩反應(yīng)液中分別加入2μl的β-巰基乙醇猝滅反應(yīng)，抽濾，收集濾液，此濾液也進(jìn)行μLC-MS分析，標(biāo)記為洗脫液，固體用水，甲醇，二氯甲烷分別洗滌三遍，干燥。
3.將上述固體置于酸性溶液中，酸性溶液的成分為三氟乙酸-乙二硫醇-苯硫基甲烷-苯酚-水＝81.5∶2.5∶5∶5∶6，震蕩反應(yīng)2.5小時(shí)。抽濾，濾液在氮?dú)饬飨聺饪s至于，加入5ml乙醚，可以看到有白色固狀物產(chǎn)生，再加入100μl 0.03M的碳酸氫氨的水溶液(PH8.0-8.2)，震蕩后溶液分層，移去大部分乙醚層后，離心，取水層濃縮后，進(jìn)行μLC-MS分析，標(biāo)記為回收液。
4.μLC-MS分析所用的條件是A相含0.1％甲酸的水溶液；B相含0.1％甲酸的乙腈溶液。梯度洗脫，60分鐘內(nèi)B相3-65％。
μLC-MS分析后，結(jié)果如下1.洗脫液中沒有發(fā)現(xiàn)含半胱氨酸肽段LT-9(LLGTGSFCT)的信號，但有其它三個(gè)不含半胱氨酸的肽段MN-8(MGNWLMGN)，GS-10(GTLFQKMNGS)，SF-9(SLRGKPHSF)。這說明含碘樹脂對含半胱氨酸的肽段具有選擇性結(jié)合的作用。
2.回收液中只發(fā)現(xiàn)含半胱氨酸肽段LT-9(LLGTGSFCT)+標(biāo)記部分(170/180Da)的信號。沒有其它三個(gè)不含半胱氨酸肽段的信號。這說明沒有與含碘樹脂結(jié)合的肽段都可以通過洗滌除去。
3.回收液中，LT-9+標(biāo)記部分(170/180Da)的信噪比明顯優(yōu)于混合肽的LT-9的信噪比。這說明此含碘樹脂對含半胱氨酸肽段的提取和回收效率都是很高的。
4.回收液中含10H取代的含碘樹脂標(biāo)記的LT-9的信號強(qiáng)度是10D取代的含碘樹脂標(biāo)記的LT-9信號強(qiáng)度的1/2，這與兩肽混合物中LT-9的含量呈正比。這說明此種方法可以用來進(jìn)行不同樣品的比較分析。
實(shí)施例2蛋白混合物的比較分析實(shí)驗(yàn)步驟如圖2所示1.將蛋白混合物1溶菌酶(30nmol)，過氧化氫酶(50nmol)，細(xì)胞色素C(50nmol)，卵清蛋白(30nmol)和牛血清蛋白(50nmol)，蛋白混合物2溶菌酶(40nmol)，過氧化氫酶(30nmol)，細(xì)胞色素C(30nmol)，卵清蛋白(50nmol)和牛血清蛋白(20nmol)，分別溶于200μL緩沖液中，此緩沖液中含有8M尿素，0.2M碳酸氫氨，和0.02M氯化鈣(CaCl2)，pH8.2。在含蛋白混合物1，2的溶液中分別加入5μmol三丁基膦(TBP)，置于37℃恒溫箱中保溫1小時(shí)。
2.將蛋白混合物用0.03M的碳酸氫氨的水溶液(pH8.0-8.2)稀釋1倍后，再用純水再稀釋1倍。在含蛋白混合物1，2的溶液中加入2％胰蛋白酶溶液10μl，將兩溶液置于37℃恒溫箱中保溫8小時(shí)后，再加入2％胰蛋白酶溶液10μl，37℃保溫15小時(shí)，留出10μl進(jìn)行μLC-MS分析，標(biāo)記為酶解產(chǎn)物。
3.在蛋白混合物1的反應(yīng)液中加入5mg的10個(gè)氫取代的含碘樹脂(10H)，在蛋白混合物2的反應(yīng)液中加入5mg的10個(gè)氘取代的含碘樹脂(10D)，震蕩反應(yīng)2小時(shí)后，在兩反應(yīng)液中分別加入2μl的β-巰基乙醇猝滅反應(yīng)，抽濾，收集濾液，此濾液也進(jìn)行μLC-MS分析，標(biāo)記為洗脫液，固體用水，甲醇，二氯甲烷分別洗滌三遍，干燥。
4.將上述固體置于酸性溶液中，酸性溶液的成分為三氟乙酸-乙二硫醇-苯硫基甲烷-苯酚-水＝81.5∶2.5∶5∶5∶6。震蕩反應(yīng)2.5小時(shí)。抽濾，濾液在氮?dú)饬飨聺饪s至干，加入5ml乙醚，可以看到有白色固狀物產(chǎn)生，再加入100μl 0.03M的碳酸氫氨的水溶液(PH8.0-8.2)，震蕩后溶液分層，移去大部分乙醚層后，離心，取水層濃縮后，進(jìn)行μLC-MS分析，標(biāo)記為回收液。
5.μLC-MS分析所用的條件是A相含0.1％甲酸的水溶液；B相含0.1％甲酸的乙腈溶液。梯度洗脫，80分鐘內(nèi)B相3-85％。
μLC-MS分析后，結(jié)果如下1.通過對酶解產(chǎn)物的μLC-MS分析，獲得了各蛋白的典型酶解片段的信號，但有相當(dāng)大的一部分發(fā)生了信號重疊。肽段的歸屬是應(yīng)用ExPASy Molecular Biology Server(http//cn.expasy.org/sprot/)上的Tagldent工具進(jìn)行檢索得到的，所用的數(shù)據(jù)庫是41.10。
2.通過對濾液的μLC-MS分析，發(fā)現(xiàn)含半胱氨酸的肽段信號明顯降低，有的甚至信號消失，其它肽段的信號強(qiáng)度基本未變。
3.通過對回收液的μLC-MS分析，只發(fā)現(xiàn)了含有半胱氨酸肽段的信號，其強(qiáng)度與酶解產(chǎn)物結(jié)果中相應(yīng)片段的強(qiáng)度相當(dāng)，但信噪比有明顯改善。
4.在回收液的μLC-MS分析結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)一系列質(zhì)量數(shù)相差10Da的信號的組峰，通過檢索，一組峰即對應(yīng)著一個(gè)含半胱氨酸肽段(m/z為肽段分子量+標(biāo)記部分分子量170/180Da)。每一組兩峰的強(qiáng)度比與蛋白混合物1，2中相應(yīng)蛋白的含量成正比，以此定量的誤差小于5％。
權(quán)利要求
1.一種用在半胱氨酸、含半胱氨酸的肽的定性與相對定量的測定方法，此方法包括下列步驟a)目標(biāo)分析物經(jīng)還原；b)目標(biāo)分析物與試劑反應(yīng)；c)反應(yīng)猝滅；d)洗滌之后，進(jìn)行標(biāo)記片段回收待分析部分；e)濃縮提純后，將待分析部分溶于緩沖溶液，μLC-MS分析；其特征是所述的目標(biāo)分析物是半胱氨酸，含半胱氨酸的肽，所述與目標(biāo)分析物反應(yīng)的試劑是含碘樹脂試劑，它具有如下結(jié)構(gòu)Solid-Link-R’(H/D)-COCH2I，其中，Solid為固相部分，該部分是帶有甲氨基作為反應(yīng)基團(tuán)的樹脂；Link為連接部分，該部分是可用于固相合成的連接部分；R’(H/D)為標(biāo)記部分，該部分是含8-12個(gè)氫/氘取代的鏈狀或支鏈狀的氨基酸；活性基團(tuán)部分是碘乙?；?。
2.一種用在含半胱氨酸的蛋白質(zhì)定性與相對定量的測定方法，此方法包括下列步驟a)目標(biāo)分析物經(jīng)提純、變性、還原；b)酶解；c)目標(biāo)分析物與試劑反應(yīng)；d)反應(yīng)猝滅；e)洗滌之后，進(jìn)行標(biāo)記片段回收待分析部分；f)濃縮提純后，將待分析部分溶于緩沖溶液，μLC-MS分析；其特征是所述的目標(biāo)分析物是含半胱氨酸的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)混合物或不同生理狀態(tài)下的生物體蛋白提取物，所述與目標(biāo)分析物反應(yīng)的試劑是含碘樹脂試劑，它具有如下結(jié)構(gòu)Solid-Link-R’(H/D)-COCH2I，其中，Solid為固相部分，該部分是帶有甲氨基作為反應(yīng)基團(tuán)的樹脂；Link為連接部分，該部分是可用于固相合成的連接部分；R’(H/D)為標(biāo)記部分，該部分是含8-12個(gè)氫/氘取代的鏈狀或支鏈狀的氨基酸；活性基團(tuán)部分是碘乙?；?br> 3.如權(quán)利要求1或2所述的測定方法，其特征是所述的d)步驟是用酸性溶液進(jìn)行標(biāo)記片段回收待分析部分。
4.如權(quán)利要求3所述的測定方法，其特征是所述的酸性溶液是三氟乙酸、乙二硫醇、苯硫基甲烷、苯酚和水的混和溶液；或者三氟乙酸和DMF的混和溶液；或者三氟乙酸和CH2Cl2的混和溶液；或者三氟乙酸和乙腈的混和溶液。
5.如權(quán)利要求3所述的測定方法，其特征是所述的酸性溶液是三氟乙酸∶乙二硫醇∶苯硫基甲烷∶苯酚∶水＝80～95∶1～3∶1～10∶1～10∶2～17；或者三氟乙酸∶DMF＝80～95∶5～20；或者三氟乙酸∶CH2Cl2＝80～95∶5～20；或者三氟乙酸∶乙腈＝80～95∶5～20。
6.如權(quán)利要求1或2所述的測定方法，其特征是所述的含碘樹脂衍生物，它具有如下結(jié)構(gòu)Solid-Link-R’(H/D)-COCH2I，其中，a)Solid為固相部分，該部分是帶有甲氨基作為反應(yīng)基團(tuán)的樹脂；b)Link為連接部分，該部分結(jié)構(gòu)通式如下所示，其中含有對酸的不穩(wěn)定的C-N鍵，酸不穩(wěn)定C-N鍵 n＝1，2，4，5R為取代苯基，R4＝H或取代苯基所述的取代苯基上的取代基是單取代或多取代的供電子基團(tuán)；c)R’(H/D)為標(biāo)記部分，該部分是含8-12個(gè)氫/氘取代的鏈狀或支鏈狀的氨基酸；d)活性基團(tuán)部分，該部分是碘乙?；?br> 7.如權(quán)利要求1或2所述的測定方法，其特征是所述的氨基酸是亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，甲硫氨酸等；所述的帶有甲氨基作為反應(yīng)基團(tuán)的樹脂為甲胺基聚丙烯樹脂(Aminomethyl polystyrene resin)。
8.如權(quán)利要求1或2所述的含碘樹脂衍生物，其特征是所述的連接部分Link為結(jié)構(gòu)通式如下所示，其中含有對酸的不穩(wěn)定的C-N鍵，酸不穩(wěn)定C-N鍵 n＝1，2，4，5R1，R2，R3＝H或C1～C4的烷氧基 R5＝C1～C4的烷氧基，m＝1～3；所述的標(biāo)記部分R’(H/D)是 式中X＝H或D
9.如權(quán)利要求2所述的測定方法，其特征是所述的a)步驟是將一對目標(biāo)分析物置于緩沖溶液中，變性之后，加入還原試劑打開二硫鍵；所述的b)、c)步驟是將溶液稀釋之后加入胰蛋白酶酶解，在目標(biāo)分析物溶液中分別加入一對如權(quán)利要求2所述的含碘樹脂試劑，反應(yīng)0.5～5小時(shí)之后，加入β-巰基乙醇猝滅反應(yīng)，所述的d)步驟是將反應(yīng)所得的液體部分保留分析，固體部分抽濾洗滌后，進(jìn)行標(biāo)記片段回收；所述的標(biāo)記片段回收是在酸性溶液中反應(yīng)，0.5～5小時(shí)后將兩反應(yīng)體系的液體部分混合，在氮?dú)饬飨聺饪s后，加入無水乙醚，有沉淀產(chǎn)生，抽濾或萃取后，溶于水溶液，μLC-MS分析；所述的e)步驟是回收的待分析部分濃縮后，加入無水乙醚，有沉淀產(chǎn)生，抽濾或萃取后，溶于水溶液，μLC-MS分析，然后經(jīng)圖譜解析，進(jìn)行定性定量分析。。
10.如權(quán)利要求9所述的測定方法，其特征是所述的緩沖溶液中含有8M的尿素，0.2M的碳酸氫氨，0.02M的氯化鈣，PH8.2，將目標(biāo)分析物置于此溶液中，37℃一小時(shí)完成初步變性過程。
11.如權(quán)利要求1或2所述的測定方法，其特征是所述的還原劑是三丁基膦(TBP)或二硫蘇糖醇(DTT)；還原劑的加入比例是二十倍的蛋白摩爾數(shù)，還原條件是37℃1小時(shí)。
12.如權(quán)利要求2所述的測定方法，其特征是所述的樣品溶液在3毫克/毫升的濃度下完成變性和還原操作，然后在稀釋至1毫克/毫升的濃度下，按重量比10∶1分兩次加入胰蛋白酶(2毫克/毫升)在37℃酶解20小時(shí)。
13.如權(quán)利要求1或2所述的測定方法，其特征是所述的反應(yīng)所用的裝置是帶有聚丙烯材質(zhì)的三通活塞的玻璃器，在振蕩器上反應(yīng)。
14.如權(quán)利要求1或2所述的測定方法，，其特征是洗滌所用的溶劑為DMF，CH2Cl2，CH3OH等。
15.如權(quán)利要求1或2所述的測定方法，其特征是μLC-MS分析所用的條件是A相含0.1％甲酸的水溶液；B相含0.1％甲酸的乙腈溶液。梯度洗脫，60分鐘內(nèi)B相3-65％。
全文摘要
本發(fā)明涉及一類含碘及同位素標(biāo)記的樹脂衍生物在基于質(zhì)譜的蛋白組學(xué)研究中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的試劑的結(jié)構(gòu)為Solid－Link－R
文檔編號G01N33/68GK1563996SQ20041001766
公開日2005年1月12日 申請日期2004年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月14日
發(fā)明者郭寅龍, 張立 申請人:中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所