專利名稱：作為腫瘤標(biāo)志物的腫瘤相關(guān)分泌蛋白及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種新的腫瘤標(biāo)志物-腫瘤相關(guān)分泌蛋白1(Tumor Associated Secretory Protein1，簡稱為TSP1蛋白)，編碼TSP1蛋白的多核苷酸和經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生這種TSP1蛋白的方法。本發(fā)明還公開了TSP1蛋白及其編碼序列的用途，如用于診斷腫瘤，以及含TSP1蛋白拮抗劑(如抗體和反義核酸)的藥物組合物。
背景技術(shù)：
二十世紀(jì)50年代以來醫(yī)學(xué)科學(xué)有了飛躍的發(fā)展，癌癥治療的進(jìn)展也是卓有成效的，并發(fā)現(xiàn)了不少直接與癌癥發(fā)生相關(guān)的癌基因與抑癌基因。
迄今為止，已在黑色素瘤及包括前列腺癌、胸腺癌、卵巢癌、腸胃癌在內(nèi)的各種腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了不少腫瘤抗原。目前已發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤免疫排斥抗原可分為四種類型。第一類抗原來自于正常基因產(chǎn)物的體細(xì)胞突變，第二類抗原來自于和致癌過程相關(guān)的基因突變。這兩類抗原均為患者特異性抗原，不適合普遍性治療。第三類抗原為那種在正常組織中也有表達(dá)，但在腫瘤中表達(dá)量升高的基因的產(chǎn)物。如果不涉及突變，這類抗原在各種癌癥病人中是具有普遍性的，但它們通常是組織特異的，且并非為腫瘤所特有，在臨床應(yīng)用上意義不大。第四類抗原具有嚴(yán)格的腫瘤特異性，和一般的致癌過程相關(guān)。因此，這類抗原在人類腫瘤中廣泛的表達(dá)，最適合于作為腫瘤標(biāo)志物以及抗腫瘤免疫攻擊的靶點(diǎn)。此外，特別適合用于診斷的腫瘤標(biāo)志物是那些分泌性的蛋白。然而，目前已發(fā)現(xiàn)的抗原中很少是屬于這一類的。
為了治療和診斷目的開發(fā)腫瘤相關(guān)的分泌蛋白具有十分重要意義。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的分泌性的腫瘤標(biāo)志物，用于腫瘤的診斷和治療。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供一種新的人腫瘤標(biāo)志物TSP1蛋白以及其片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。
本發(fā)明經(jīng)過廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)并分離出了新的可作為腫瘤標(biāo)志物的抗原基因TSP1。該基因的表達(dá)產(chǎn)物在肝癌病人的血清中可以檢測到，但是在正常人和其他非肝癌患者中的血清缺檢測不到。這表明TSP1是一特異的分泌性的肝癌標(biāo)志物。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
在本發(fā)明的第一方面，提供新穎的分離出的TSP1多肽，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
較佳地，該TSP1多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長的功能的由(a)衍生的多肽。
更佳地，該多肽具有SEQ ID NO2中1-208位或26-208位的氨基酸序列。
在本發(fā)明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼上述人TSP1多肽的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2中1-208位或26-208位氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中779-1402位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-2978位的序列；(c)具有SEQ ID NO1中854-1402位的序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了制備TSP1蛋白的方法，該方法包含(a)在適合表達(dá)蛋白的條件下，培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出TSP1蛋白。
在本發(fā)明的第五方面，提供了與上述的人TSP1多肽特異性結(jié)合的抗體。還提供了可用作引物或探針的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續(xù)的15-2978個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明的第六方面，提供了模擬、促進(jìn)、拮抗人TSP1多肽活性的化合物，以及抑制人TSP1多肽的表達(dá)的化合物。還提供了篩選和/或制備這些化合物的方法。較佳地，該化合物是人TSP1多肽的編碼序列或其片段的反義序列。
在本發(fā)明的第七方面，提供了檢測樣品中是否存在TSP1蛋白的方法，它包括將樣品與TSP1蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在TSP1蛋白。還提供了一種檢測腫瘤的方法，包括步驟將待檢測個(gè)體的樣品(如血液、尿液、體液、唾液等)與特異性抗TSP1蛋白的抗體接觸，觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示該個(gè)體患有肝癌或肝癌易感性高于正常人群。
在本發(fā)明的第八方面，本發(fā)明還提供了一種檢測腫瘤(尤其是肝癌)的試劑盒，它含有TSP1蛋白的特異性抗體和說明書。
在本發(fā)明的第九方面，提供了本發(fā)明多肽和編碼序列的用途。例如本發(fā)明多肽可被用于篩選促進(jìn)人TSP1多肽活性的激動(dòng)劑，或者抑制人TSP1多肽活性的拮抗劑、或者被用于肽指紋圖譜鑒定。本發(fā)明的人TSP1蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或者用于制造基因芯片或微陣列。
在本發(fā)明的第十方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明的人TSP1拮抗劑以及藥學(xué)上可接受的載體。優(yōu)選的TSP1拮抗劑是抗TSP1的抗體和TSP1反義序列。這些藥物組合物可治療腫瘤。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1顯示了TSP1蛋白的表達(dá)。其中，圖A是誘導(dǎo)前后的表達(dá)情況，泳道1.pT7470-TSP1-HMS174(DE3)誘導(dǎo)前；2.pT7470-TSP1-HMS174(DE3)誘導(dǎo)后；3.pT7470-TSP1-HMS174(DE3)包涵體；4.標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量。圖B為純化前后的電泳圖，泳道1.標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量；2.pT7470-TSP1-HMS174(DE3)包涵體；3.pT7470-TSP1-HMS174(DE3)第二次超聲上清；4.TSP1蛋白割膠后濃縮樣。圖C為Western印跡檢測結(jié)果(1∶10000)，泳道1.pT7470-TSP1-HMS174(DE3)誘導(dǎo)前菌體；2.TSP1蛋白樣品。
圖2顯示了在小鼠血清中對TSP1蛋白的檢測結(jié)果。各泳道如下A、電轉(zhuǎn)空載體質(zhì)粒的小鼠血清經(jīng)免疫共沉淀后B、TSP1蛋白表達(dá)的陽性對照C、電轉(zhuǎn)TSP1質(zhì)粒的小鼠血清經(jīng)免疫共沉淀后(分別為5ul和10ul樣品)D、電轉(zhuǎn)TSP1質(zhì)粒小鼠血清未經(jīng)免疫共沉淀。
圖3顯示了對部分病人血清的Western Blot結(jié)果。各泳道如下A、TSP1蛋白表達(dá)的陽性對照；H1-H5、HBV陽性的肝炎患者血清；K1-K5、肝癌患者血；N1-N3、正常人血清。
圖4是pT7470載體的結(jié)構(gòu)圖。
發(fā)明詳述在本發(fā)明中，術(shù)語“TSP1蛋白”、“TSP1多肽”或“腫瘤標(biāo)志物TSP1”可互換使用，都指具有人腫瘤標(biāo)志物TSP1氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。它們還包括不含有信號(hào)肽(1-23位)的成熟TSP1。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的TSP1蛋白或多肽”是指TSP1多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化TSP1蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括人TSP1蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然人TSP1蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個(gè)化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人TSP1多肽”指具有人TSP1蛋白活性的SEQ ID NO2序列的全長多肽或成熟多肽。該術(shù)語還包括具有與人TSP1蛋白相同功能(如促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長的功能)的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)一個(gè)或多個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括人TSP1蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與人TSP1 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人TSP1多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人TSP1多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了人TSP1多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人TSP1多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供人TSP1蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人TSP1多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括；體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“人TSP1蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1

本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼TSP1的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個(gè)序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％，最佳地至少90％或95％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時(shí)加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時(shí)才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段，包括正義和反義的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼TSP1蛋白的多核苷酸。由于TSP1是一具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長的蛋白，因此反義的核酸片段可以用于抑制TSP1的表達(dá)。
本發(fā)明的人TSP1核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成。可用常規(guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或TSP1蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)，可利用本發(fā)明的多核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的TSP1多肽。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼人TSP1多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，人TSP1多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。總之，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含人TSP1編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、COS、或293細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞等。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
重組的人TSP1蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)用于篩選對抗TSP1蛋白功能的抗體、多肽或其它物質(zhì)。
另一方面，本發(fā)明還包括對人TSP1 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人TSP1基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人TSP1基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體。
抗人TSP1蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測活檢標(biāo)本中的人TSP1蛋白。
本發(fā)明抗體可用于治療或預(yù)防人TSP1蛋白相關(guān)疾病如腫瘤。一種方法是用巰基交聯(lián)劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結(jié)合于抗體上，這種雜交抗體可用于殺滅人TSP1蛋白陽性的細(xì)胞，如腫瘤細(xì)胞。
利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與TSP1蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑、激動(dòng)劑或拮抗劑等。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、激動(dòng)劑、拮抗劑或受體等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
TSP1拮抗劑(如抗體和反義序列)可直接用于疾病治療，例如，用于腫瘤方面的治療。此外，還可聯(lián)用其他治療劑，如TNF-α、TNF-β等。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明TSP1拮抗劑(如抗體和反義序列)以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克-10毫克/千克體重。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測人TSP1蛋白水平的診斷試驗(yàn)方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的。試驗(yàn)中所檢測的人TSP1蛋白水平，可以用于診斷腫瘤。
一種檢測樣品中是否存在TSP1蛋白的方法是利用TSP1蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測，它包括將樣品與TSP1蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在TSP1蛋白。
TSP1蛋白的多核苷酸可用于TSP1蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列或DNA芯片上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷?？筎SP1的抗體可以固定在蛋白質(zhì)芯片上，用于檢測樣品中的TSP1蛋白。
本發(fā)明還提供了一種檢測腫瘤的試劑盒，它含有特異性擴(kuò)增TSP1的引物對和/或TSP1特異性抗體。此外，還可含有特異性探針和/或PCR緩沖液等。
此外，鑒于TSP1是一個(gè)腫瘤細(xì)胞特有的免疫性抗原，分泌到體液中。因此，血樣或尿液中的TSP1的直接測定除了可以作為腫瘤的輔助診斷和愈后的觀察指標(biāo)之外，也可作為腫瘤早期診斷的依據(jù)。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)TSP1僅存在于肝癌病人血清中，而在正常人或非肝癌患者的血清中不能檢測到。因此，假陽性率低。
(2)TSP1是一分泌性蛋白，便于應(yīng)用于肝癌的血清學(xué)診斷、預(yù)后監(jiān)測，并且可作為基因治療、研制基因工程藥物或作為設(shè)計(jì)抗癌新藥的靶分子。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1TSP1的獲得TSP1是通過用常規(guī)方法構(gòu)建人胎兒cDNA文庫獲得的。取3、6、9月齡胎兒組織，用Trizol試劑(GIBCO BRL公司)按廠方說明書提取總RNA，用mRNA提純試劑盒(Pharmacia公司)提取mRNA。用pCMV-script TMXR cDNA文庫構(gòu)建試劑盒(Stratagene公司)構(gòu)建上述mRNA的cDNA文庫。其中反轉(zhuǎn)錄酶改用MMLV-RT-Superscript II(GIBCO BRL)，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在42℃進(jìn)行。轉(zhuǎn)化XL 10-Gold感受細(xì)胞，獲得了1×106cfu/μg cDNA滴度的cDNA文庫。第一輪隨機(jī)挑取cDNA克隆，其后以高豐度cDNA克隆和已證明有促癌細(xì)胞生長功能的cDNA克隆為探針，雜交篩選cDNA文庫，挑取弱陽性及陰性克隆。用Qiagen 96孔板質(zhì)粒抽提試劑盒，按廠家說明書進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提取。質(zhì)粒DNA和空載體同時(shí)轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系7721。100ng DNA酒精沉淀干燥后，加6μl H2O溶解，待轉(zhuǎn)染。每份DNA樣品中加0.74μl脂質(zhì)體及9.3μl無血清培液，混勻后，室溫放置10分鐘。每管中加150μl無血清培液，均分加入3孔生長于96孔板的7721細(xì)胞中，37℃放置2小時(shí)，每孔再加50μl無血清培液，37℃24小時(shí)。每孔換100μl全培液，37℃24小時(shí)，換含G418的全培液100μl，37℃24-48小時(shí)，邊觀察，邊換G418濃度不等的培液。約2-3次后，直到鏡檢細(xì)胞有克隆形成，計(jì)數(shù)。發(fā)現(xiàn)TSP1克隆有促進(jìn)癌細(xì)胞克隆形成作用，結(jié)果如下表所示。
cDNA克隆轉(zhuǎn)染細(xì)胞(7721)克隆形成情況

對cDNA克隆采用雙脫氧終止法，在ABI377 DNA自動(dòng)測序儀上測定其核苷酸序列，獲得全長序列SEQ ID NO1，ORF位于779-1402位，編碼一個(gè)208個(gè)氨基酸的TSP1蛋白(分子量約21Kda)，其中信號(hào)肽位于1-23位，因此成熟蛋白具有SEQ ID NO2中第26-208位的氨基酸序列。
1MGTGGSLLCG CSLVLSCLCP SASLPDPGNS TWPPGAQAGL PAALALPLPR LPRILFPMAG61 RPARPSSDFV GCAQGMCCHG RQGTVHIHTS SVSCWTPCPV TGTGGTAVSR KDRVLPHRRQ121 VSLACVCAVG ERAGQLWSQK PVQMARPSAR HLLPRGSSPN SQAVLLPSVC PVPWPPVGPS181 PGQGEGLSPA FPGVGTDRGD SWALVLQV(SEQ ID NO2)實(shí)施例2從胎盤或胎兒cDNA中PCR獲得全長基因取3、6、9月齡的胎兒組織，用Trizol試劑(GIBCO BRL公司)按廠方說明書提取總RNA，用mRNA提純試劑盒(Pharmacia公司)提取mRNA。用MMLV-RT-Superscript II(GIBCO BRL)，反轉(zhuǎn)錄酶在42℃進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得胎盤或胎兒cDNA。利用特異引物(如下表所示)，按97℃3’1個(gè)循環(huán)。94℃30″60℃30″72℃1’35個(gè)循環(huán)，72℃10’1個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得含有完整開放閱讀框序列的各蛋白基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序驗(yàn)證，與實(shí)施例1測得的序列相符。
基因特異引物

實(shí)施例3TSP1蛋白重組表達(dá)和純化在該實(shí)施例中，以實(shí)施例2中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用序列如下的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得人TSP1 DNA作為插入片段。
5’端寡核苷酸引物序列為5’-GCCCGAATTCGACCCTGGCAACAGCACCTGG-3’(SEQID NO5)。該引物含有EcoRI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是不含信號(hào)肽序列的部分編碼序列；3’端引物序列為5’-GCCCAAGCTTCTACACCTGAAGGACCAATG-3’(SEQ ID NO6)。該引物含有HindIII限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、翻譯終止子和人TSP1的部分編碼序列。
在Novagen公司pET21a+載體的N端加入了6XHis tag序列后形成的質(zhì)粒pT7470(圖4)人TSP1蛋白cDNA PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)EcoRI，HindIII雙酶切，與雙酶切的pT7470載體連接形成載體pT7470-TSP1并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌HMS174(DE3)(Novagen公司)，挑取陽性克隆鑒定后純化并測序(ABI公司的377型測序儀，BigDye Terminator試劑盒，PE公司)。測序證實(shí)插入完整的TSP1編碼序列。
挑表達(dá)TSP1的陽性大腸桿菌DE3克隆接種于10ml LB培養(yǎng)基中，37℃300rpm振蕩培養(yǎng)過夜，1∶100稀釋于接種于LB培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)2.5hr，加100mM IPTG至0.1mM后37℃誘導(dǎo)2-3hr，5,000g 4℃離心10min去上清，置冰上用50ml上樣緩沖液(0.5M NaCl，20mM咪唑2.7mM KCl，10.1mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH8.0)重懸，超聲(B.Braun Labsonic U)破碎，然后12,000g 4℃離心10min，上清用0.8μm濾膜過濾后，過1ml Ni2+金屬螯合Sepharose 4B層析柱，上樣緩沖液充分洗滌后，加入500ul咪唑洗脫緩沖液(0.5M NaCl，500mM咪唑2.7mM KCl，10.1mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH8.0)室溫靜置30分鐘后收集洗脫液，重復(fù)洗脫2-3次，得到人TSP1蛋白。
結(jié)果如圖1A和1B所示，TSP1蛋白的分子量約為21Kda，與預(yù)測值相符。
實(shí)施例4抗TSP1蛋白抗體的產(chǎn)生將實(shí)施例3中獲得的重組人TSP1蛋白用來免疫動(dòng)物以產(chǎn)生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進(jìn)行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用150μg/0.2ml乳化過的蛋白，對兔子(新西蘭兔)進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對兔子以50-100μg/0.2ml的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。每隔14天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，至少進(jìn)行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀人TSP1蛋白基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評估。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗體可特異性地與本發(fā)明蛋白發(fā)生結(jié)合(圖1C)。
實(shí)施例5TSP1電轉(zhuǎn)小鼠試驗(yàn)將TSP1編碼區(qū)序列克隆到市售的pCDNA3.1載體，質(zhì)粒DNA與空載體分別電轉(zhuǎn)到BALB/e小鼠。具體方法是取BALB/e小鼠16-18只，在兩側(cè)大腿肌肉注射DNA(每只小鼠20ug DNA，溶解于100ul生理鹽水中)。立即電擊注射的肌肉部位。
三周后小鼠處死，從眼球采血，分離血清。用免疫共沉淀的方法鑒定血清中是否存在TSP1蛋白。取小鼠血清20ul，加入蛋白A/G瓊脂糖珠(Invitrogen公司)1ul，混勻后，4℃放置1小時(shí)。離心2,000g×2min，取上清。加入蛋白A/G瓊脂糖珠10ul，和兔抗TSP1多克隆抗體10ul?；靹蚝?，4℃放置過夜。離心2000g×2min，取沉淀。沉淀用PBS反復(fù)洗5次后，加入1×樣品緩沖液15ul，混勻后置于100℃5分鐘。SDS PAGE電泳15％分離膠，5％濃縮膠。電泳條件100V×10min，200V×50min。電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，轉(zhuǎn)移條件40V×35min。PVDF膜用PBST漂洗后，在室溫下用含有5％脫脂奶粉的PBST封閉4小時(shí)。加兔抗TSP1多克隆抗體(1∶2000稀釋)，4℃過夜。用PBST洗膜3次。加入帶有辣根過氧化物酶的鼠抗兔抗體(Invitrogen，1∶2500稀釋)，室溫放置1小時(shí)。PBST洗膜3次。用Super Signal West Femto MaximumSensitivity Substrate(PIERCE，辣根過氧化物酶底物)處理后，壓X光片。
結(jié)果如圖2所示，在小鼠血清中檢測到分泌表達(dá)的TSP1蛋白。
實(shí)施例6TSP1在肝炎、肝癌病人血清中的檢測用Wester Blot檢測病人血清中TSP1蛋白。
樣品處理血清樣品2ul，6×樣品處理液1.67ul，H2O 6.33ul。100℃，3分鐘。高速離心(13,000rpm，3min)。取上清上樣。
SDS-PAGE電泳分析12％分離膠，4％濃縮膠。
電轉(zhuǎn)移(濕式)到protran膜(Schleicher & Schuell)400mA 3小時(shí)。
膜用PBST漂洗后，在室溫下用含有5％脫脂奶粉的PBST封閉4小時(shí)。加兔抗TSP1多克隆抗體(1∶500稀釋)，4℃16小時(shí)。加入帶有辣根過氧化物酶的鼠抗兔抗體(Invitrogen，1∶2000稀釋)，室溫放置1小時(shí)。用Super Signal West Femto MaximumSensitivity Substrate(PIERCE，辣根過氧化物酶底物)處理后，壓X光片。
結(jié)果如圖3所示。共檢測了肝癌病人血清21例，其中15例檢測到TSP1蛋白(陽性率71.4％)；正常人血清3例、HBV陽性的肝炎病人血清16例、卵巢癌病人血清4例、胰腺癌病人血清3例、結(jié)腸癌病人血清4例、胃癌病人血清4例、直腸癌病人血清1例、盆腔癌病人血清1例、腦癌病人血清1例，TSP1蛋白檢測均為陰性。這表明TSP1是一種特異的分泌性的肝癌標(biāo)志物。
實(shí)施例7檢測試劑盒在本實(shí)施例中，制備檢測TSP1的診斷試劑盒，該試劑盒含有200微升實(shí)施例4制備的抗TSP1的特異性抗血清以及描述如何使用試劑盒來檢測TSP1的說明材料。試劑盒還可含有下組中的一種或多種用于協(xié)助檢測的各種標(biāo)記物或標(biāo)記試劑；用于雜交的試劑(包括緩沖液等)；采樣裝置，包括細(xì)針頭等；以及陽性和陰性雜交對照等。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海新世界基因技術(shù)開發(fā)有限公司<120>作為腫瘤標(biāo)志物的腫瘤相關(guān)分泌蛋白及其用途<130>032890<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2978<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(779)..(1402)<223>
<400>1ggcttactgc ggaacagcag gttggtgtcc acagcattca gcatctggaa cacggcctgg 60gggtggtagc agatggtgtg gcctgtgtaa cagacgggca gctggtggct cagggctccc120tgtctcctgg ggggctgtag cccacccctg cccctcttca gccccaagct cctcctcatc180cacccccttt cctctcttgt gggtggtgag tcagggaggg tcaagggtgc ttgggtgggg240gcaggcctgg gggtctttaa gcccggcctc gccctcccac ctatgaagag tgtcacccag300gtcttgatgt ggcaggagtg gctgtgcagg tagctgaggg cctgtgacaa gtggatgctg360aattcctcct ggctgcgggt catctggccg gaggagagca cacctggctg ggacgggctg420ggggccctgg gcataccagg gtcctccagc cccagtttgc cttgcccagc ccctggagct480gctatagcag ctgtgtgtga gacgggagtg aatgggggag ccgcaagcct ggtctccccc540actccctggc cctgttcctc cccaccgatc ccaggcctct caccaggcag gtccagagga600agtggcgggc gctgaggccc ctctcccagg ccagcgtgca gaagagggtg tgcagtagcc660gccagcggag cagcacagca cagcggtaga aggtgaactt ggcctgctgc agggacaggc720gtggagggtc acccaccgcc tatgtctgag ccctttcccc tagaggccac aggcctcc 778
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權(quán)利要求
1.一種分離的人TSP1多肽，其特征在于，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長的功能的由(a)衍生的多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽具有選自下組的氨基酸序列SEQ ID NO2中1-208位或26-208位氨基酸序列。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)編碼如權(quán)利要求1所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中779-1402位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-2978位的序列；(c)具有SEQ ID NO1中854-1402位的序列。
5.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
6.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求5所述的載體。
7.一種TSP1蛋白的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出TSP1蛋白。
8.一種能與權(quán)利要求1所述的TSP1蛋白特異性結(jié)合的抗體。
9.一種檢測樣品中是否存在TSP1蛋白的方法，其特征在于，包括將樣品與TSP1蛋白特異性結(jié)合的抗體接觸，觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在TSP1蛋白。
10.一種檢測癌癥的試劑盒，其特征在于，它含有權(quán)利要求8所述的抗體和說明書。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的腫瘤標(biāo)志物－TSP1蛋白，編碼TSP1蛋白的多核苷酸和經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生這種TSP1蛋白的方法。本發(fā)明還公開了TSP1蛋白及其編碼序列的用途，如用于診斷肝癌。本發(fā)明還提供了檢測TSP1蛋白的試劑盒。
文檔編號(hào)G01N33/68GK1626550SQ20031010930
公開日2005年6月15日 申請日期2003年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月12日
發(fā)明者顧健人, 萬大方 申請人:上海新世界基因技術(shù)開發(fā)有限公司