專利名稱：豆薯抗腫瘤蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
豆薯抗腫瘤蛋白，本發(fā)明涉及有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及到生物化學(xué)中一種具有抑制腫瘤的活性的豆薯抗腫瘤蛋白，及其制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豆薯抗腫瘤蛋白，在本文中，抗腫瘤蛋白是寡聚的或是單肽鏈的蛋白質(zhì)，并至少具有下列活性抑制人腫瘤細(xì)胞株活性或抑制鼠腫瘤細(xì)胞株活性；活性包括一定范圍的拮抗效果，例如部分抑制或致死。
豆薯(Pachyrrhizus erosis)，又名白地瓜、沙葛、沙棘。在植物分類學(xué)上屬于豆科蝶形花亞科豆薯屬，其塊根可當(dāng)菜，也可當(dāng)水果剝皮食用。豆薯種子有毒，民間用來毒魚和殺蟲。郝冰等人(生物化學(xué)雜志1996，12578-582，中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報1999，151006-1008)曾從中提取了Pachyrin I(33kDa，pI4.5)，PachyrinII(28kDa，pI6.5)和PaAFP(14kDa，pI7.5)三種蛋白，蔡建華等人(結(jié)構(gòu)化學(xué)2001，20149-150)從中提取了豆薯抗植物病毒蛋白(15kDa，堿性蛋白)，中國發(fā)明專利CN 1315328A公開了從豆薯種子中分離純化的一種抗植物花葉病毒蛋白PE4，分子量約為9kDa，等電點(diǎn)略偏堿性。而本發(fā)明的目的，是從豆薯種子中經(jīng)過特定的方法純化分離出一種新的豆薯抗腫瘤蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
豆薯抗腫瘤蛋白，本發(fā)明則是從豆薯種子中，采用下述七個步驟分離純化出一種豆薯抗腫瘤蛋白(PeAP)。PeAP顯示出廣譜的抗腫瘤活性。具體步驟如下；1.豆薯種子經(jīng)粉碎后，加生理鹽水抽提、勻漿兩次，置4℃過夜；
2.用鹽酸或醋酸調(diào)pH5，靜置多于2小時，低溫超速離心得上清液；3.進(jìn)一步加固體硫酸銨分級沉淀，低溫超速離心得30％-95％飽和度的硫酸銨沉淀；4.上述硫酸銨沉淀對蒸餾水或?qū)?mMol/L磷酸鹽緩沖液或?qū)?mMol/L醋酸鹽緩沖液透析超過24小時，低溫超速離心得黃色上清液；5.上述上清液上樣于CM-52纖維素柱，該纖維素柱用5mMol/L，pH6.5的磷酸鹽或醋酸鹽緩沖液平衡，收集流出液；6.上述流出液上樣于DEAE-52纖維素柱，該纖維素柱用10mMol/L，pH7.4的Tris-HCl緩沖液平衡，上樣完后，用同一緩沖液洗柱，使280nM檢測達(dá)基線后，用含0-0.5Mol/L NaCl的同一緩沖液作梯度洗脫，收集第1峰，合并該峰組分；7.上述組分對蒸餾水充分透析后，冷凍干燥得凍干粉，就是豆薯抗腫瘤蛋白。
豆薯抗腫瘤蛋白，SDS-PAGE檢測結(jié)果表明其分子量為15.5kDa，等電點(diǎn)小于pH6(pI＜6)，具有抑制肝癌、胃癌和黑色素瘤的活性。
本發(fā)明是首次從豆薯屬植物種子中提取出的具抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的豆薯抗腫瘤蛋白分子量為15.5kDa，等電點(diǎn)小于pH6的酸性蛋白(pI＜6)與此前從豆薯中提取的Pachyrin I(33kDa，pI4.5)Pachyrin II(28kDa，pI6.5，SDS-PAGE檢測14.5kDa)，PaAFP(14kDa，pI7.5)，豆薯抗植物病毒蛋白(15kDa，堿性蛋白，即pI＞7)，和豆薯抗植物花葉病毒蛋白PE4(分子量約為9kDa，等電點(diǎn)略偏堿性)等5種蛋白，在分子量和等電點(diǎn)(pI)性質(zhì)方面均不相同，是一種新的蛋白。


圖1.顯示豆薯抗腫瘤蛋白在DEAE-52纖維素柱上的梯度洗脫圖圖中的洗脫峰1即為豆薯抗腫瘤蛋白。
圖2.顯示豆薯抗腫瘤蛋白的SDS-PAGE圖，橫座標(biāo)為遷移率，縱座標(biāo)為蛋白分子量的對數(shù)，■為分子量標(biāo)準(zhǔn)對照，▲為豆薯抗腫瘤蛋白。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1.從豆薯種子中提取豆薯抗腫瘤蛋白(PeAP)取200g豆薯種子，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，加生理鹽水勻漿二次，置4℃抽提(大于24小時)其間多次攪拌，然后低溫超速離心得粗抽提液，加固體硫酸銨分級沉淀，低溫超速離心得30％-95％飽和度的硫酸銨沉淀；沉淀溶于少量磷酸鹽緩沖液(5mMol/L，pH6.5)，對同一緩沖液透析超過24小時，其間至少三次更換透析外液，透析后的樣品低溫超速離心后得淡黃色上清液，加樣上CM-52纖維素柱(Watman公司產(chǎn)品，預(yù)先用5mMol/L，pH6.5的磷酸鹽緩沖液平衡好)，收集流出液，將流出液加樣上DEAE-52纖維素柱(Watman公司產(chǎn)品，預(yù)先用10mMol/L Tris-HCl，pH7.4平衡好)然后用10mMol/L Tris-HCI，pH7.4，0-0.5Mol/L NaCl梯度洗脫，收集洗脫峰1，即是豆薯抗腫瘤蛋白；見圖1。
實(shí)施例2.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)豆薯抗腫瘤蛋白(即洗脫峰1)，在Bio-Rad公司的微量垂直平板電泳儀上進(jìn)行SDS-PAGE，SDS-PAGE按Leammli的方法進(jìn)行，分離膠濃度為12％，濃縮膠濃度為4％，電泳后按郭堯君方法(1991，生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1832-37)，用考馬斯亮蘭染色，以牛血清白蛋白(MW~68kDa)，卵清白蛋白(MW~43kDa)，天花粉蛋白(MW~27kDa)，胰蛋白酶(MW~22.4kDa)和溶菌酶(MW~14kDa)為分子量標(biāo)準(zhǔn)對照，SDS-PAGE結(jié)果見附圖2。
實(shí)施例3.
本發(fā)明的豆薯抗腫瘤蛋白(PeAP)，用MTT法測試(Mosmann，T.J.Immunal.Meth.1983，6555)表明，PeAP具有強(qiáng)烈的抑制人胃癌MGC、人肝癌Bel和鼠黑色素瘤B16細(xì)胞株的活性，其半數(shù)抑制濃度IC50分別為3.38×10-7，2.98×10-7，2.84×10-7Mol/L，與天花粉蛋白和八棱絲瓜蛋白l相當(dāng)，見表1。
表1三種蛋白對胃癌、肝癌、鼠黑色素瘤細(xì)胞株的半數(shù)抑制濃度(×10-7Mol/L)胃癌MGC 803 肝癌Bel 7404 鼠黑色素瘤B16豆薯抗腫瘤蛋白3.38 2.982.84天花粉蛋白2.25 2.612.38八棱絲瓜蛋白1 2.11 4.211.78
權(quán)利要求
1.豆薯抗腫瘤蛋白，其特征在于該蛋白是一種等電點(diǎn)小于pH6的酸性蛋白質(zhì)，分子量為15.5kDa；該蛋白由以下7個步驟分離得到的(1)豆薯種子經(jīng)粉碎后，加生理鹽水抽提、勻漿兩次，置4℃過夜；(2)用鹽酸或醋酸調(diào)pH5，靜置多于2小時，低溫超速離心得上清液；(3)進(jìn)一步加固體硫酸銨分級沉淀，低溫超速離心得30％-95％飽和度的硫酸銨沉淀；(4)上述硫酸銨沉淀對蒸餾水或?qū)?mMol/L磷酸鹽緩沖液或?qū)?mMol/L醋酸鹽緩沖液透析超過24小時，低溫超速離心得黃色上清液；(5)上述上清液上樣于CM-52纖維素柱，該纖維素柱用5mMol/L，pH6.5的磷酸鹽或醋酸鹽緩沖液平衡，收集流出液；(6)上述流出液上樣于DEAE-52纖維素柱，該纖維素柱用10mMol/L，pH7.4的Tris-HCl緩沖液平衡，上樣完后，用同一緩沖液洗柱，使280nM檢測達(dá)基線后，用含0-0.5Mol/L NaCl的同一緩沖液作梯度洗脫，收集第1峰，合并該峰組分；(7)上述組分對蒸餾水充分透析后，冷凍干燥得凍干粉，就是豆薯抗腫瘤蛋白。
2.權(quán)利要求1的蛋白的用途，其特征在于該蛋白作為制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用。
全文摘要
豆薯抗腫瘤蛋白，本發(fā)明涉及一種具有抑制腫瘤的活性的新型蛋白的制備和應(yīng)用。從豆薯種子中經(jīng)過特定的方法純化分離出一種新的豆薯抗腫瘤蛋白。本發(fā)明提供的豆薯抗腫瘤蛋白具有抑制肝癌、胃癌和黑色素瘤的活性。
文檔編號C07K14/415GK1580074SQ0315415
公開日2005年2月16日 申請日期2003年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月13日
發(fā)明者陳明晃, 葉曉明 申請人:中國科學(xué)院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所