專利名稱：鑒別分泌型蛋白標(biāo)志物的系統(tǒng)及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種鑒別分泌型蛋白標(biāo)志物的系統(tǒng)及方法。
背景技術(shù)：
根據(jù)已有的研究發(fā)現(xiàn)，許多疾病(如腫瘤)的發(fā)生與發(fā)展都與由相關(guān)的細(xì)胞或組織中表達(dá)分泌特異性蛋白標(biāo)志物相關(guān)。因此，發(fā)展生物學(xué)的標(biāo)記分子對于盡早檢測以及早期治療多種相關(guān)疾病具有十分重要的意義。
如果能在病人血清中發(fā)現(xiàn)疾病的生物學(xué)標(biāo)記分子，將會對于這些病人的治療帶來很重要的影響。這些生物學(xué)標(biāo)記分子可以被醫(yī)生用來作為確診的測試，醫(yī)生可以通過它們來監(jiān)控單個疾病病例對于治療的反應(yīng)，來預(yù)測什么時候會有這個疾病的復(fù)發(fā)。醫(yī)生可以通過一系列的疾病標(biāo)記分子水平的測定來決定是否要開始，繼續(xù)或者維持治療。
目前，已經(jīng)找到了多種疾病相關(guān)的標(biāo)記分子，特別是腫瘤相關(guān)的標(biāo)記分子。腫瘤中的血清標(biāo)記分子可以被分為腫瘤相關(guān)的癌胚抗原，異常表達(dá)的激素，酶，以及癌癥宿主代謝產(chǎn)物。癌胚蛋白，例如癌胚胎蛋白(AFP)，在胚胎的生命周期中以高水平循環(huán)，但在正常的成體的血清或體液中，只有很少量能被檢測到。然而，在一些特定的癌細(xì)胞中，這些蛋白的合成會再次啟動。在75％的包含卵黃囊成分的睪丸癌(比如畸胎瘤和胚胎細(xì)胞瘤)和80％的原發(fā)性肝細(xì)胞瘤中，AFP的水平都有上升。在高級胃癌和胰腺癌中，它的水平也有上升。另一個癌胚抗原是CA125，它能在上皮性的腫瘤特別是上皮性的卵巢癌中有上調(diào)。然而CA125的敏感性不是很大，因?yàn)樗荒茉?0％的一級卵巢癌中和60％的二級卵巢癌中被檢測到。其他的血清標(biāo)志物分子還包括異常表達(dá)的激素，然而，只有很少的一部份癌癥能穩(wěn)定性的產(chǎn)生一種異常的激素，可以被用來作為病人的血清標(biāo)志物分子，包括人類慢性促性腺激素(hCG)和人類促黃體激素(hLH)。hCG被經(jīng)常用來檢測和監(jiān)控胎盤和睪丸癌癥，但也在肝癌，肺癌，胃癌以及卵巢癌患者的血清中被發(fā)現(xiàn)。血清中的酶也可以被用來作為腫瘤的標(biāo)志物分子，例如胎盤堿性磷酸酯酶和骨堿性磷酸酯酶。前列腺特異性抗原(PSA，一種絲氨酸蛋白酶)也許是最廣泛使用的一種血清標(biāo)志物分子。在血清中的高PSA水平顯示其需要進(jìn)一步的醫(yī)學(xué)評價來確定是否有前列腺癌的存在。有數(shù)據(jù)表明，從1989年開始的PSA測試的使用與前列腺癌早期診斷的增加和晚期診斷的明顯減少相關(guān)。然而假陽性和假陰性的PSA值也是有害的問題。例如，PSA在血清中的水平在一些良性的前列腺腫大，前列腺炎和尿道感染也有上升。少于10％的肺癌病人有產(chǎn)生異常激素的臨床表現(xiàn)。目前，幾乎沒有肺癌的血清標(biāo)志分子存在。在5％的遷移性的鱗癌或者大細(xì)胞肺癌中，高水平的甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白能被檢測到。而小細(xì)胞肺癌則通常更和異常內(nèi)分泌激素(例如促腎上腺皮質(zhì)激素，診斷中的2％)的產(chǎn)生，抗利尿激素和黑素細(xì)胞刺激激素的上調(diào)相關(guān)，但可測量的內(nèi)分泌性血清異常的發(fā)生率也少于所有病人的13％，病人血清中不定期的將會有CA125水平的升高。
迄今為止，對于包括肺癌在內(nèi)的某一特定癌癥的標(biāo)志分子的特異性都不好，一方面是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞的代謝和免疫方面的特性和正常細(xì)胞非常相像。有相當(dāng)一部份人雖然血清中有非正常水平的血清腫瘤標(biāo)志物，但卻是處在非惡性的情況下(假陽性)。同時，有許多惡性腫瘤血清測試方法的敏感性不強(qiáng)，導(dǎo)致了一些假陰性的情況發(fā)生。因此，頻繁發(fā)生的假陽性和假陰性測試導(dǎo)致了腫瘤標(biāo)志分子作為檢測惡性腫瘤手段的局限性。由于這些假陽性和假陰性結(jié)果的發(fā)生頻率是和在某一特定個體中單一腫瘤標(biāo)志物分子的上升相關(guān)，因此，多種腫瘤標(biāo)志物分子的使用將能夠增強(qiáng)這種檢測的特異性和敏感性。例如，一種前列腺癌的新腫瘤標(biāo)志物分子—血清前列腺特異性膜抗原(PSMA)-已在最近進(jìn)行一些測試，它的臨床應(yīng)用還有待探索(12-14)。血清中PSA和PSMA的同時測定，將能夠減少假陽性和假陰性結(jié)果。
基于上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本領(lǐng)域還需要尋找一些跟疾病的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的蛋白標(biāo)志物，以能夠及時地判斷出疾病高危人群、進(jìn)行疾病早期診斷、或?qū)膊〉陌l(fā)生和發(fā)展作出準(zhǔn)確的分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種鑒別分泌型蛋白標(biāo)志物的系統(tǒng)及鑒別分泌型蛋白標(biāo)志物方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供一種鑒別分泌型蛋白或跨膜蛋白的系統(tǒng)，所述的系統(tǒng)包括(a)一種酵母細(xì)胞，所述的酵母細(xì)胞不表達(dá)有功能的分泌型蔗糖轉(zhuǎn)化酶(SUC2)；和(b)一種表達(dá)載體，所述的表達(dá)載體含有蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因表達(dá)盒，所述的蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因表達(dá)盒含有缺失信號序列的蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體可自我復(fù)制并且可轉(zhuǎn)入所述的酵母細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因表達(dá)盒從5’至3’依次含有多克隆位點(diǎn)、缺失信號序列的蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因、和終止密碼子。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述多克隆位點(diǎn)包括HindIII位點(diǎn)和NotI位點(diǎn)。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的酵母細(xì)胞選自YT455/SUC2Δ9P。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體選自pRB576L/SUC2ΔSP，或pRB576/SUC2ΔSP在本發(fā)明的第二方面，提供一種鑒別編碼分泌型蛋白或跨膜蛋白的cDNA的方法，所述的方法包括(1)將外源的cDNA片段插入到含有缺失信號序列的蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因的表達(dá)載體中；(2)將步驟(1)獲得的表達(dá)載體導(dǎo)入不表達(dá)有功能的分泌型蔗糖轉(zhuǎn)化酶的酵母細(xì)胞中，并在蔗糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，從而獲得能夠生長的酵母細(xì)胞；(3)鑒定從步驟(2)獲得的酵母細(xì)胞中的外源cDNA片段的信息，基于此獲得編碼分泌型蛋白或跨膜蛋白的cDNA。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，在步驟(3)中，包括分離出插入了外源cDNA片段的表達(dá)載體，并分離所述cDNA片段，基于該片段獲得全長cDNA，所述的全長cDNA即為編碼分泌型蛋白或跨膜蛋白的cDNA。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的酵母轉(zhuǎn)化酶基因表達(dá)盒從5’至3’依次含有多克隆位點(diǎn)、缺失信號序列的酵母轉(zhuǎn)化酶基因、終止密碼子；并且，將外源的cDNA片段插入所述的表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)中。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，提供一種鑒別編碼分泌型蛋白或跨膜蛋白的cDNA的方法，所述的方法包括(1)提供一種表達(dá)載體，所述的表達(dá)載體可自我復(fù)制并且可轉(zhuǎn)入所述的酵母細(xì)胞，并且所述的表達(dá)載體含有SUC2基因表達(dá)盒，所述的SUC2基因表達(dá)盒從5’至3’依次含有多克隆位點(diǎn)、缺失信號序列的SUC2基因(SUC2Δsp)、終止密碼子；(2)將cDNA文庫的cDNA片段插入所述表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)，從而獲得插入外源cDNA片段的表達(dá)載體；(3)用步驟(2)獲得的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，所述的酵母細(xì)胞不表達(dá)SUC2基因，并在蔗糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，從而獲得能夠生長的酵母細(xì)胞；(4)從所述酵母細(xì)胞中，分離出插入了外源cDNA片段的表達(dá)載體，并分離所述cDNA片段；(5)以步驟(4)獲得的cDNA片段為探針，從cDNA文庫中獲得相應(yīng)的全長cDNA；或者測定所述該cDNA片段的序列，并基于該序列獲得相應(yīng)的全長cDNA，所述的全長cDNA即為編碼分泌型蛋白或跨膜蛋白的cDNA。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的cDNA片段來源于cDNA文庫，并且所述的cDNA片段是富集了5’端cDNA的cDNA片段。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的cDNA文庫為疾病相關(guān)的細(xì)胞或組織的cDNA文庫。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的cDNA文庫中富集疾病特異性或組織特異性cDNA。
另一方面，本發(fā)明還提供一種通過所述的方法獲得的分泌型蛋白或跨膜蛋白的cDNA，以及由該cDNA編碼的蛋白。
在本發(fā)明的第三方面，提供一種酵母細(xì)胞，所述的酵母細(xì)胞不表達(dá)有功能的分泌型酵母轉(zhuǎn)化酶。
本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1為一組示意圖。
其中，圖1(a)顯示了分泌形式的蔗糖轉(zhuǎn)化酶將酵母細(xì)胞外的蔗糖水解為葡萄糖和果糖，葡萄糖和果糖被轉(zhuǎn)運(yùn)到酵母體內(nèi)作為碳源，使細(xì)胞能夠在YEP-SA培養(yǎng)基上生長的流程示意圖。圖1(b)顯示了刪除掉信號序列的SUC2基因(SUC2ΔSP)編碼的蔗糖轉(zhuǎn)化酶不能分泌到酵母細(xì)胞外，不能將蔗糖水解為葡萄糖和果糖，酵母細(xì)胞無法在YEP-SA培養(yǎng)基上生長。圖1(c)顯示了用含有信號序列的cDNA和刪除掉信號序列的SUC2基因(SUC2ΔSP)的載體轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞能夠在YEP-SA培養(yǎng)基上生長。
圖2顯示了載體pRB420、pRB576和pRB576L的結(jié)構(gòu)示意圖。其中，質(zhì)粒pRB420中插入了野生型的SUC2基因，質(zhì)粒pRB576中插入缺失信號序列(第3第20個密碼子)的SUC2基因，將pRB576中的起始密碼子刪除，插入一個Not I酶切位點(diǎn)(pRB576L)。
圖3顯示了用肺癌細(xì)胞株H125建肺特異性cDNA富集的cDNA文庫，用差減雜交的方法扣除M663細(xì)胞株的mRNA。
圖4顯示了富集5’端cDNA的PCR的方法cDNA的5’端和3’端分別接上Hind III和Not I的酶切位點(diǎn)。
圖5顯示了克隆cDNA的5’-端片段進(jìn)入pRB576L上Hind III和Not I的酶切位點(diǎn)的過程。
圖6顯示了利用酵母篩選包含信號序列的cDNA。
圖7顯示了進(jìn)一步篩選陽性克隆的方法。
圖8顯示了利用酵母系統(tǒng)捕獲信號序列的實(shí)驗(yàn)。用野生型SUC2基因(SUC2Δsp)(A、B)，刪除信號序列的SUC2基因(C、D)或者TGF-β信號序列(E、F)轉(zhuǎn)化酵母菌株YT455(SUC2Δ9，ade2-101，ura3-52)，然后將酵母涂在SDA平板上估計轉(zhuǎn)化效率(A、C、E)；將酵母涂在YEP-EA平板上觀察蔗糖酶的能力(B、D、F)，平板在30℃條件下培養(yǎng)三天，拍照。在SUC2Δsp中引入TGF-β的信號序列就能使酵母在蔗糖培養(yǎng)基上生長(F)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過長期的研究，開發(fā)了一種利用改造的酵母細(xì)胞(即缺失SUC2基因或SUC2基因不表達(dá)的酵母細(xì)胞)作為宿主，篩選分泌蛋白或跨膜蛋白的方法。本發(fā)明人設(shè)計的方法比其它方法更簡單，快速，并且具有高的檢測靈敏度和特異性。因此，可以采用本發(fā)明的方法來鑒別出分泌蛋白或跨膜蛋白；尤其是可針對一些疾病，找出疾病特異性分泌型蛋白標(biāo)志物。基于此完成了本發(fā)明。
如本文所用，術(shù)語“分泌型蛋白”是指一類蛋白，其能夠在細(xì)胞中被表達(dá)，并且能夠通過細(xì)胞膜，被分泌到細(xì)胞外。通常，分泌型蛋白的氨基(N)端帶有一段長度不等(一般約幾十到幾百bp的核苷酸)的信號肽。
本發(fā)明的原理和應(yīng)用本發(fā)明的系統(tǒng)包括(a)一種酵母細(xì)胞，所述的酵母細(xì)胞不表達(dá)有活性SUC2基因；和(b)一種表達(dá)載體，所述的表達(dá)載體可自我復(fù)制并且可轉(zhuǎn)入所述的酵母細(xì)胞，并且所述的表達(dá)載體含有SUC2基因表達(dá)盒，所述的SUC2基因表達(dá)盒從5’至3’依次含有多克隆位點(diǎn)、缺失信號序列的SUC2基因(SUC2Δsp)、終止密碼子。
可用于本發(fā)明的不表達(dá)SUC2基因的酵母細(xì)胞，可用常規(guī)方法制備。例如可通過基因破壞法對SUC2基因進(jìn)行定位突變。在本發(fā)明中，表達(dá)無活性SUC2的酵母細(xì)胞仍視為不表達(dá)SUC2的酵母序列。
可用于本發(fā)明的含有SUC2基因表達(dá)盒的表達(dá)載體沒有特別限制，可以是任何能夠構(gòu)建入所述含有SUC2基因表達(dá)盒，只要其能夠自我復(fù)制，并且能夠轉(zhuǎn)入到酵母細(xì)胞中進(jìn)行目的基因的表達(dá)。
在本發(fā)明中，鑒別分泌型蛋白或跨膜蛋白是基于利用酵母細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的蔗糖轉(zhuǎn)化酶的分泌特性來實(shí)現(xiàn)的。
具體地，一些酵母細(xì)胞(如Saccharomyces cerevisiae)產(chǎn)生的蔗糖轉(zhuǎn)化酶具有兩種形式一種是包含信號肽的分泌形式，另一種是缺乏信號肽的胞內(nèi)蛋白形式。所述的這兩種形式的蛋白由酵母中的同一個基因SUC2編碼。其中，分泌形式的蔗糖轉(zhuǎn)化酶能將細(xì)胞外的蔗糖水解為葡萄糖和果糖，葡萄糖和果糖會被轉(zhuǎn)運(yùn)到酵母體內(nèi)作為碳源，從而可作為酵母生長的能量來源(碳源)，如圖1(a)所示。反之，如果酵母細(xì)胞產(chǎn)生的是胞內(nèi)蛋白形式的蔗糖轉(zhuǎn)化酶，沒有產(chǎn)生分泌到細(xì)胞外的蔗糖轉(zhuǎn)化酶，則酵母細(xì)胞外的蔗糖不能水解為葡萄糖和果糖，而酵母不能利用蔗糖作為碳源的，如圖1(b)所示。
可用cDNA文庫來替代SUC2中的信號序列，將cDNA文庫中的各種cDNA片段連接到含有SUC2ΔSP表達(dá)載體的SUC2ΔSP基因的5’端位置(即對應(yīng)于SUC2野生型序列的信號序列位置)，將所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入酵母細(xì)胞中，使酵母在以蔗糖為唯一碳源的培養(yǎng)基(如YEP-SA培養(yǎng)基)上生長。由此，只有包含有信號序列的cDNA片段轉(zhuǎn)化的酵母才能在以蔗糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上長出克隆，如圖1(c)所示。通過上述步驟，可將包含有信號序列的cDNA片段從cDNA文庫中分離出來。通過這部分cDNA片段為探針，通過如PCR方法，可在cDNA文庫中得到全長的cDNA序列，所述序列編碼的蛋白是分泌型蛋白或?yàn)榭缒さ鞍住?br> 因此，本發(fā)明的方法可用于針對多種疾病的相關(guān)細(xì)胞或組織，構(gòu)建所述疾病相關(guān)的細(xì)胞或組織的cDNA文庫，從中鑒定出編碼分泌型蛋白或跨膜蛋白的cDNA。進(jìn)而可進(jìn)一步鑒定出疾病相關(guān)的特異性的分泌型蛋白標(biāo)志物。
優(yōu)選的，所述的cDNA文庫中富集了疾病特異性cDNA，其中扣除了一些非該疾病特異性的cDNA。比如可通過差減雜交的方法來進(jìn)行所述扣除。從這些疾病特異性的cDNA中找到能夠編碼分泌到細(xì)胞外的蛋白的cDNA，則該cDNA對應(yīng)的蛋白很可能是一種疾病相關(guān)標(biāo)志物。
所述的疾病可以是任何一種在正常個體與患病個體中蛋白表達(dá)呈現(xiàn)差異(優(yōu)選顯著差異)的疾??；更特別的，所述的疾病為腫瘤，比如肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌等。
分泌型蛋白的分析通過如上方法獲得分泌型蛋白后，進(jìn)一步的，可通過許多方法來對所述的分泌型蛋白進(jìn)行分析，以從中找到有價值的蛋白標(biāo)志物，用于臨床診斷和分析。
優(yōu)選的，可采用斑點(diǎn)印跡和Northern印跡分析，所述分析手段能夠進(jìn)一步驗(yàn)證基因表達(dá)是否屬于相關(guān)組織(如肺組織)，或者是否具有相關(guān)組織或疾病(如肺癌)的特異性。此外，利用DNA測序和計算機(jī)搜尋同源序列，可以得知所獲得的帶有信號序列的cDNA是編碼新的基因，還是編碼已知基因，如圖7所示。
如果cDNA編碼新的基因，而且表達(dá)模式具有組織特異性，可分離全長的cDNA，進(jìn)而獲得其編碼的蛋白。然后利用DNA和蛋白質(zhì)的同源性搜索，尋找可能存在的模體以幫助鑒定蛋白質(zhì)的功能。
另外，還可制備該基因產(chǎn)物的抗體。制備抗體的方法有好幾種，可以通過在細(xì)菌中合成GST-cDNA融合蛋白，然后膠純化或者按照cDNA序列直接合成肽鏈，將兩種方法得到的蛋白送往商業(yè)公司由他們在家兔體內(nèi)制備抗體。抗體將應(yīng)用親和純化法進(jìn)行純化，并利用Western Blot和免疫組化檢測，以估計組織(如肺組織)的特異性和相關(guān)疾病(如肺癌)的選擇性。如果抗體可以用來鑒別組織(如肺組織)的特異性(作為理想中的組織特異性蛋白)，EILSA經(jīng)過發(fā)展后就可以用來監(jiān)測正常個體和患有疾病(如肺癌)的個體血清中的組織(如非組織)特異性蛋白。
此外，可用以上所描述的方法純化蛋白質(zhì)和抗體，并研究它們對細(xì)胞生長的影響。還可構(gòu)建有義和反義哺乳動物表達(dá)載體，并將其穩(wěn)定地轉(zhuǎn)入相關(guān)的細(xì)胞系，以調(diào)控蛋白質(zhì)的表達(dá)。用上述兩個方法可以監(jiān)測細(xì)胞生物功能的變化。可以通過一批放射雜交繪制基因圖譜，這樣可以判斷該基因是否與相關(guān)疾病(如腫瘤)中的變化相一致。而且，在將來的實(shí)驗(yàn)中還可以研究敲除該基因的小鼠，也可以研究組織(如肺組織)特異性蛋白的編碼序列的啟動增強(qiáng)子區(qū)域，從而鑒定組織(如肺組織)的特異轉(zhuǎn)錄因子。
分泌型蛋白的應(yīng)用這些通過本發(fā)明的方法初步獲得的cDNA或其編碼的蛋白也可構(gòu)成一個篩選庫，以便于人們最終可以從中篩選出能夠用于臨床疾病診斷和分析的有用的蛋白標(biāo)志物。
經(jīng)過鑒定，可從中找到疾病相關(guān)的特異性的cDNA或其編碼的蛋白，它們可作為判斷相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展的標(biāo)志物，從而能夠及時地判斷出疾病高危人群、進(jìn)行疾病早期診斷、或?qū)膊〉陌l(fā)生和發(fā)展作出準(zhǔn)確的分析。
針對一種疾病，通過本發(fā)明的方法可以找到多種相關(guān)的分泌型蛋白標(biāo)志物。這些找到的分泌型蛋白標(biāo)志物可單一地或復(fù)合地用于相關(guān)疾病的檢測，以達(dá)到正確分析的目的。同時或先后對多個分泌型蛋白標(biāo)志物進(jìn)行檢測，可更準(zhǔn)確地反應(yīng)疾病的狀況，提高疾病診斷、預(yù)后的準(zhǔn)確率，避免假陽性或假陰性的發(fā)生。
或者，通過本發(fā)明的方法獲得的疾病相關(guān)的分泌型蛋白標(biāo)志物，還能夠用于對疾病進(jìn)行輔助性地診斷或分析，便于醫(yī)師能夠?qū)膊〉陌l(fā)生以及發(fā)展做出更準(zhǔn)確的判斷，提高臨床方案的有效性。
肺癌特異性分泌蛋白的篩選在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，本發(fā)明人改造了酵母株YT455使其SUC2基因不表達(dá)；因此，改造后的酵母株不能生長在以蔗糖為唯一碳源的培養(yǎng)基(如YEP-SA培養(yǎng)基)中。將野生型的SUC2基因克隆到pRB420載體中，刪除掉信號序列的SUC2基因(SUC2ΔSP)克隆到pRB576載體中，如圖2所示。當(dāng)包含SUC2基因的質(zhì)粒pRB420轉(zhuǎn)化酵母株YT455，酵母株能夠在YEP-SA培養(yǎng)基中生長。但是當(dāng)包含SUC2ΔSP的質(zhì)粒pRB576轉(zhuǎn)化酵母株YT455，酵母株則不能在YEP-SA培養(yǎng)基中生長，因?yàn)镾UC2ΔSP不能合成分泌形式的蔗糖轉(zhuǎn)化酶。
在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，本發(fā)明人用肺癌的cDNA文庫替代SUC2中的信號序列，并用構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母株YT455，這樣就能從cDNA文庫中篩選到大量的肺癌特異性的分泌蛋白和/或跨膜蛋白的序列。只有包含有信號序列的cDNA轉(zhuǎn)化的酵母才能在YEP-SA培養(yǎng)基上長出克隆。接下來，本發(fā)明人可從陽性克隆中抽提質(zhì)粒，質(zhì)粒中包含的cDNA片段編碼的蛋白要么是分泌蛋白要么是跨膜蛋白。用該cDNA片段作為探針，將分離出全長的cDNA用以檢測其編碼的蛋白表達(dá)的特異性。更特別的，還可制備抗該蛋白的抗體，從而在肺癌病人的血清中檢測該蛋白表達(dá)的特異性和敏感性，從而可進(jìn)一步篩選到具有臨床應(yīng)用價值的肺癌血清標(biāo)志分子。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)本發(fā)明的方法可方便地鑒別出一些新的疾病特異性的分泌型蛋白；所述方法在簡單，快速的同時，又具有很高的靈敏度和特異性。
(2)針對一種疾病同時找到多個疾病相關(guān)的分子標(biāo)志物，擁有不只一個的蛋白標(biāo)志物，從而可以大大的降低假陽性和假陰性的發(fā)生率。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
實(shí)施例1酵母株的改造和載體構(gòu)建采用定點(diǎn)突變的方法，對釀酒酵母株YT455(ade2-101，ura3-52)(購自ATCC，編號為208956)進(jìn)行改造，改變SUC2基因中編碼SUC蛋白第9位氨基酸的位點(diǎn)，經(jīng)改變后，該酵母株不能表達(dá)蔗糖轉(zhuǎn)化酶。本發(fā)明人將該酵母細(xì)胞株命名為YT455(SUC2Δ9P，ade2-101，ura3-52)。
以下實(shí)施例中采用的載體pRB420、pRB576和pRB576L的結(jié)構(gòu)示意圖見圖2。
在質(zhì)粒YCp50(購自ATCC編號87555)的EcoRI和Hind III位點(diǎn)中插入野生型的SUC2基因(GenBank登錄號854644)，構(gòu)成質(zhì)粒pRB420/SUC2，見圖2(a)。
在質(zhì)粒YCp50(購自ATCC編號87555)的EcoRI和Hind III位點(diǎn)中插入缺失信號序列(第3-第20個密碼子)的SUC2基因，構(gòu)成質(zhì)粒pRB576/SUC2Δsp，見圖2(b)。
將pRB576/SUC2Δsp中的起始密碼子刪除，插入一個Not I酶切位點(diǎn)，構(gòu)成pRB576L/SUC2Δsp，見圖2(c)。
實(shí)施例2pRB576L/SUC2Δsp系統(tǒng)的有效性試驗(yàn)在本實(shí)施例中，本發(fā)明人將人類的轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β-1基因(GenBank登錄號NM_000660)編碼序列中含有信號序列的5’-區(qū)域(前述序列的前384個核苷酸)接入pRB576L/SUC2Δsp載體的Hind III/NotI酶切位點(diǎn)中，作為陽性對照。
當(dāng)用前述構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母YT455時，酵母可在僅以蔗糖作為唯一糖源的YEP-SA培養(yǎng)基平板上生長。相反，轉(zhuǎn)入沒有TGF-β-1基因信號序列的pRB576L/SUC2Δsp質(zhì)粒，則酵母不能夠在蔗糖上生長，見圖8。
用含有野生型SUC2基因，刪除信號序列的SUC2基因(SUC2Δsp)或者TGF-β信號序列的載體轉(zhuǎn)化酵母菌株YT455(SUC2Δ9P，ade2-101，ura3-52)，然后將酵母涂在SDA(0.66％酵母氮基，2％葡萄糖，200μg/ml腺嘌呤)平板上估計轉(zhuǎn)化效率；將酵母涂在YEP-EA(1％酵母抽提物，2％蛋白胨，2％蔗糖，1μg/ml抗霉素A)平板上觀察蔗糖酶的能力，平板在30℃條件下培養(yǎng)3天，拍照。在SUC2Δsp中引入TGF-β的信號序列就能使酵母在蔗糖培養(yǎng)基上生長。
圖8中，A為用含野生型SUC2基因的pRB420載體轉(zhuǎn)化酵母菌株YT455，將酵母涂于SDA平板上，酵母能夠生長。
圖8B為用含野生型SUC2基因的pRB420載體轉(zhuǎn)化酵母菌株YT455，將酵母涂于YEP-EA平板上，酵母能夠生長。
圖8C為用含刪除信號序列的SUC2基因(SUC2Δsp)的pRB576L/SUC2Δsp載體轉(zhuǎn)化酵母菌株YT455，將酵母涂于SDA平板上，酵母能夠生長。
圖8D為用含刪除信號序列的SUC2基因(SUC2Δsp)的pRB576L/SUC2Δsp載體轉(zhuǎn)化酵母菌株YT455，將酵母涂于YEP-EA平板上，酵母不能生長。
圖8E為用含TGF-β信號序列且含刪除信號序列的SUC2基因(SUC2Δsp)的pRB576L/SUC2Δsp載體轉(zhuǎn)化酵母菌株YT455，將酵母涂于SDA平板上，酵母能夠生長。
圖8F為用含TGF-β信號序列且含刪除信號序列的SUC2基因(SUC2Δsp)的pRB576L/SUC2Δsp載體轉(zhuǎn)化酵母菌株YT455，將酵母涂于YEP-EA平板上，酵母不能生長。
上述結(jié)果說明，利用pRB576L/SUC2Δsp的系統(tǒng)是有效的。
實(shí)施例3編碼肺癌分泌型(或跨膜)蛋白的cDNA的鑒別腫瘤標(biāo)志物通常具有兩個特性組織特異性和腫瘤特異性。不過，所述特性對本實(shí)施例沒有影響。腫瘤標(biāo)志物通常不是特異地在某種腫瘤中存在，而是在組織的不同發(fā)育階段特異地存在。胚胎細(xì)胞中可能合成大量的某種蛋白，但是在同種組織中的正常細(xì)胞有可能低表達(dá)這種蛋白。比如說，PSA并不是特異地表達(dá)在前列腺癌細(xì)胞中，而是特異地表達(dá)在前列腺組織的細(xì)胞中。
在本實(shí)施例中，本發(fā)明人選擇來源于腺癌的H125細(xì)胞株(購自中國細(xì)胞庫典藏細(xì)胞中心，編號QK10231)構(gòu)建cDNA文庫，從中篩選肺癌分泌型蛋白標(biāo)志物。腺癌在北美是發(fā)病率最高的一種肺癌，占所有肺癌的40％，因此其是具有代表性的。
首先，采用常規(guī)的方法，用非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H125構(gòu)建一個cDNA文庫，并用差減雜交的方法扣除骨肉瘤細(xì)胞株MG63(購自ATCC，編號CRL-142)、前列腺細(xì)胞株LNCaP(購自ATCC，編號CRL-1740)和粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株HL60(購自ATCC，編號CCL-240)三株非肺癌細(xì)胞株的mRNA，以富集肺癌特異性的基因。
具體操作流程見圖3。根據(jù)Invitrogen提供的差減雜交試劑盒(SubtractorKit，Invitrogen，CA)的使用說明，本發(fā)明人用反轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物從H125細(xì)胞株的mRNA合成cDNA的第一條鏈。用生物素標(biāo)記的MG63、LNCaP和HL60細(xì)胞株的mRNA的混合物與合成的cDNA第一條鏈雜交，用酚/氯仿便可抽提掉與鏈霉親和素結(jié)合的雜交混合物，從而扣除掉非肺癌特異性的cDNAs。
因?yàn)樾盘栃蛄写蠖鄶?shù)定位于基因的氨基酸末端區(qū)域，所以本發(fā)明人采用PCR方法富集5’末端的cDNA，具體步驟見圖4，簡述如下將經(jīng)減除的肺癌細(xì)胞系H125特異性的單鏈cDNA的3’末端加上dC-尾巴；然后將經(jīng)減除的肺癌細(xì)胞系H125特異性cDNA與含Hind III位點(diǎn)的引物(5’ATGCTCGGACTGCAAGCTTCGAAGGGGGGGGGG 3’(SEQ ID NO1))退火；接著合成第二鏈；然后超聲降解雙鏈cDNA并鈍化；接著在3’端連接Not I酶切位點(diǎn)(使用NotI的雙鏈連接片斷)；最后通過使用以下引物僅擴(kuò)增cDNA文庫的5’片段5’GCTCGGACTGCAAGCTTCGAA 3’(SEQ ID NO2)；5’CACCTCATTACCATGCGG CCGCCTCT 3’(SEQ ID NO3)。
基于上述PCR程序，本發(fā)明人在每條cDNA的5’-末端添加了Hind III酶切位點(diǎn)，3’-末端添加了Not I酶切位點(diǎn)，然后將各cDNA片斷用Hind III/Not I酶切后，凝膠電泳分離400-1000bp的cDNA片段，將所述片段插入到質(zhì)粒pRB576L/SUC2Δsp的相應(yīng)Hind III/Not I酶切位點(diǎn)中，構(gòu)建含有肺癌特異性cDNA的pRB576L/SUC2Δsp載體，具體見圖5。
將上述構(gòu)建的含有肺癌特異性cDNA的pRB576L/SUC2Δsp載體轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞YT455(SUC2Δ9P，ade2-101，ura3-52)。將所述酵母細(xì)胞涂在以蔗糖作為唯一糖源的YEP-SA培養(yǎng)平板上，30℃培養(yǎng)。
經(jīng)過培養(yǎng)，能夠存活下來的陽性克隆即為能夠分泌蔗糖轉(zhuǎn)化酶的酵母克隆，轉(zhuǎn)化入該酵母的質(zhì)粒中的cDNA含有信號序列，也即轉(zhuǎn)化入該酵母的質(zhì)粒中攜帶分泌或跨膜相關(guān)的cDNA。
從酵母中分離攜帶分泌或跨膜相關(guān)的cDNA的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌擴(kuò)增質(zhì)粒，見圖6。
通過PCR技術(shù)、DNA測序、斑點(diǎn)印跡和Northern印跡分析驗(yàn)證，這些質(zhì)粒載有信號序列及其起始密碼。
用Hind III/Not I進(jìn)行酶切，從攜帶分泌或跨膜相關(guān)的cDNA的質(zhì)粒中切出所述的分泌或跨膜相關(guān)的cDNA。以該cDNA為探針，通過PCR反應(yīng)，從前述構(gòu)建的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H125 cDNA文庫中獲得全長的cDNA，即為編碼分泌型(或跨膜)蛋白的cDNA。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院<120>鑒別分泌型蛋白標(biāo)志物的系統(tǒng)及方法<130>063625<160>3<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>1atgctcggac tgcaagcttc gaaggggggg ggg33<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>2gctcggactg caagcttcga a 21<210>3<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3cacctcatta ccatgcggcc gcctct2權(quán)利要求
1.一種鑒別分泌型蛋白或跨膜蛋白的系統(tǒng)，其特征在于，所述的系統(tǒng)包括(a)一種酵母細(xì)胞，所述的酵母細(xì)胞不表達(dá)有功能的分泌型蔗糖轉(zhuǎn)化酶；和(b)一種表達(dá)載體，所述的表達(dá)載體含有蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因表達(dá)盒，所述的蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因表達(dá)盒含有缺失信號序列的蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因。
2.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述的蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因表達(dá)盒從5’至3’依次含有多克隆位點(diǎn)、缺失信號序列的蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因、和終止密碼子。
3.如權(quán)利要求2所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述多克隆位點(diǎn)包括HindIII位點(diǎn)和Not I位點(diǎn)。
4.一種鑒別編碼分泌型蛋白或跨膜蛋白的cDNA的方法，其特征在于，所述的方法包括(1)將外源的cDNA片段插入到含有缺失信號序列的蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因的表達(dá)載體中；(2)將步驟(1)獲得的表達(dá)載體導(dǎo)入不表達(dá)有功能的分泌型蔗糖轉(zhuǎn)化酶的酵母細(xì)胞中，并在蔗糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得能夠生長的酵母細(xì)胞；(3)鑒別從步驟(2)獲得的酵母細(xì)胞中的外源cDNA片段的信息，基于該信息獲得編碼分泌型蛋白或跨膜蛋白的cDNA。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的酵母轉(zhuǎn)化酶基因表達(dá)盒從5’至3’依次含有多克隆位點(diǎn)、缺失信號序列的酵母轉(zhuǎn)化酶基因、終止密碼子；并且，將外源的cDNA片段插入所述的表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)中。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的cDNA片段來源于cDNA文庫，并且所述的cDNA片段是富集了5’端cDNA的cDNA片段。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的cDNA文庫為疾病相關(guān)的細(xì)胞或組織的cDNA文庫。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的cDNA文庫中富集疾病特異性或組織特異性cDNA。
9.一種酵母細(xì)胞，其特征在于，所述的酵母細(xì)胞不表達(dá)有功能的分泌型酵母轉(zhuǎn)化酶基因。
10.一種通過權(quán)利要求5所述的方法獲得的分泌型蛋白或跨膜蛋白的cDNA，以及由該cDNA編碼的蛋白。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種鑒別分泌型蛋白或跨膜蛋白的系統(tǒng)。本發(fā)明還公開了一種從cDNA文庫中鑒別編碼分泌型蛋白或跨膜蛋白的cDNA的方法。本發(fā)明所述方法具有很高的靈敏度和特異性，可方便地鑒別出一些新的疾病特異性的分泌型蛋白，例如篩選和鑒別肺癌特異性的分泌型蛋白標(biāo)志物。
文檔編號C12Q1/00GK101093226SQ20061002806
公開日2007年12月26日 申請日期2006年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月23日
發(fā)明者謝東 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院