專(zhuān)利名稱(chēng)：氧化還原酶標(biāo)記的電化學(xué)檢測(cè)生物活性物質(zhì)的方法及裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使用氧化還原酶標(biāo)記電化學(xué)測(cè)量生物活性物質(zhì)的方法，具體涉及一種通過(guò)使用氧化還原酶標(biāo)記的抗體與固載在電極上的作為要檢測(cè)的生物活性物質(zhì)的抗原快速結(jié)合以進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)的方法及其檢測(cè)裝置。
背景技術(shù)：
常用的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)中的雙抗體(原)夾心法為檢測(cè)抗原(體)的常見(jiàn)方法，該方法應(yīng)用針對(duì)抗原兩個(gè)不同決定簇的兩種單抗分別作為固相載體和酶標(biāo)抗體檢測(cè)溶液中的抗原，但該種方法使用的耗材昂貴，檢測(cè)成本較高，且生物活性物質(zhì)分離鑒定試驗(yàn)周期長(zhǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決ELISA法存在的耗材昂貴檢測(cè)成本較高的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種使用氧化還原酶標(biāo)記的測(cè)量生物活性物質(zhì)的電化學(xué)測(cè)試方法，包括將樣品中可能含有的欲檢測(cè)的作為抗原的生物活性物質(zhì)固載在電極表面上；進(jìn)行氧化還原酶標(biāo)記的與欲檢測(cè)的生物活性物質(zhì)相對(duì)應(yīng)的抗體和固載在電極上的待測(cè)樣品可能含有的生物活性物質(zhì)特異性識(shí)別結(jié)合步驟；洗去非特異性結(jié)合的氧化還原酶標(biāo)記的所述抗體制得工作電極；和將由該工作電極和參比電極構(gòu)成的測(cè)試電極組插入到所述氧化還原酶對(duì)應(yīng)的催化底物中，測(cè)量有無(wú)標(biāo)記的氧化還原酶與反應(yīng)槽中的催化底物反應(yīng)而產(chǎn)生的電信號(hào)，進(jìn)而判斷有無(wú)欲測(cè)試的生物活性物質(zhì)的存在。
本發(fā)明另外還提供一種基于該測(cè)試方法的檢測(cè)裝置，包括由表面可能固載有氧化還原酶標(biāo)記的抗體抗原復(fù)合物的工作電極和參比電極組成的測(cè)試電極組；與該氧化還原酶對(duì)應(yīng)的催化底物反應(yīng)槽；和電信號(hào)檢測(cè)裝置。
由于本發(fā)明的檢測(cè)方法中所使用的測(cè)試設(shè)備和使用的耗材價(jià)格便宜，明顯降低了測(cè)試的成本。另外本發(fā)明通過(guò)使用電泳法使氧化還原酶標(biāo)記的抗體和固載在電極上的欲檢測(cè)的生物活性物質(zhì)特異性結(jié)合，明顯的縮短了檢測(cè)的周期，提高了測(cè)試效率。本發(fā)明還提供一種能夠進(jìn)行多通道測(cè)試的電極矩陣，提高了測(cè)試的測(cè)試效率，該電極矩陣由相互平行的至少2個(gè)以上的測(cè)試電極組排列形成的。本發(fā)明的測(cè)試裝置可以進(jìn)一步包括數(shù)據(jù)采集和處理裝置以更精確和直觀地顯示測(cè)得的電信號(hào)，其中多通道數(shù)據(jù)采集卡通過(guò)由數(shù)據(jù)傳輸排線檢測(cè)并收集多個(gè)測(cè)試電極組產(chǎn)生的電信號(hào)，由分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析后將電信號(hào)顯示于屏幕上。使用本發(fā)明的檢測(cè)生物活性物質(zhì)的電化學(xué)方法具有檢測(cè)成本低、速度快的優(yōu)點(diǎn)。


以下附圖用于說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，而不用于限定由權(quán)利要求書(shū)所界定的本發(fā)明范圍。
圖1A表示本發(fā)明的工作電極16和參比電極15的示意圖。
圖1B表示圖1A中部分A處工作電極16表面上固載的抗原與氧化還原酶標(biāo)記的抗體特異性結(jié)合后的經(jīng)放大的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2表示在有欲檢測(cè)的生物活性物質(zhì)的存在時(shí)，本發(fā)明檢測(cè)出的與時(shí)間相對(duì)應(yīng)的電信號(hào)圖譜。
圖3是表示在催化底物溶液中加入硅油和氨基乙醇對(duì)所檢測(cè)的電信號(hào)圖譜的影響圖。
圖4是用于本發(fā)明的測(cè)試方法的電化學(xué)檢測(cè)裝置的示意圖。
具體實(shí)施例方式
以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述。
對(duì)于本發(fā)明，將用于將可能含有欲測(cè)定的生物活性物質(zhì)的樣品固定在工作電極上的方法可以采用非特異性物理吸附法或生物物質(zhì)的特異吸附作用將酶等固定到載體表面的吸附法，以及利用化學(xué)方法將載體活化，再與酶分子上的某些基團(tuán)反應(yīng)，形成共價(jià)的化學(xué)鍵，從而使酶分子結(jié)合到載體上的共價(jià)鍵合法。本發(fā)明優(yōu)選用絲素蛋白固載可能含有欲檢測(cè)的生物活性性物質(zhì)。絲素蛋白是蠶絲經(jīng)過(guò)95％乙醇或無(wú)水乙醇浸泡洗滌后再放入溴化鋰中溶解所得的粘稠液體，是一種天然的生物膠水，用它和檢測(cè)或待測(cè)的作為生物活性物質(zhì)的抗原等量混合，然后經(jīng)過(guò)涂抹而固定在電極表面，固定條件溫和。使用該方法能夠保持生物活性物質(zhì)天然的構(gòu)象，大大減少其活性的喪失，增加其利用效率。應(yīng)該指出只要滿(mǎn)足能夠牢固地將生物活性物質(zhì)固載在工作電極16上，也可以采用其它的固載方法而不會(huì)降低本發(fā)明的實(shí)施效果，如果采用本發(fā)明所述的電泳步驟，所采用的固載方法應(yīng)能夠提供在進(jìn)行電泳時(shí)所需要的不易解離這一要求。
將氧化還原酶標(biāo)記的與欲檢測(cè)的生物活性物質(zhì)相對(duì)應(yīng)的抗體與固載在電極上的樣品中可能含有的生物活性物質(zhì)特異性結(jié)合的方式，可以采用ELISA法的常規(guī)結(jié)合方法。
對(duì)于本發(fā)明優(yōu)選采用本發(fā)明下述的電泳法使其進(jìn)行特異性結(jié)合步驟。將抗欲測(cè)定的生物活性物質(zhì)的經(jīng)氧化還原酶標(biāo)記的抗體與雙濃度巴比妥緩沖液以及蒸餾水以適當(dāng)體積比進(jìn)行稀釋?zhuān)鳛殡娪救芤?。由于欲檢測(cè)的生物活性物質(zhì)有特定的等電點(diǎn)，調(diào)節(jié)巴比妥緩沖液在適當(dāng)pH值，使被檢測(cè)的生物活性物質(zhì)所帶的電荷較少。將固載有待測(cè)樣品的電極接負(fù)極，另插一個(gè)接正極的鉑電極作為輔助電極，形成一個(gè)回路，則抗欲測(cè)定的生物活性物質(zhì)的經(jīng)氧化還原酶標(biāo)記的抗體在溶液中向負(fù)極泳動(dòng)。因樣品中可能含有的欲檢測(cè)的生物活性物質(zhì)已被固定，不易解離，其電泳速度較為緩慢，并在電滲作用影響下，由正極向負(fù)極移動(dòng)。所以，如果固載的樣品中含有欲測(cè)試的生物活性物質(zhì)(抗原)，經(jīng)氧化還原酶標(biāo)記的抗體能與固載在電極上的抗原快速識(shí)別結(jié)合。由于在電場(chǎng)中限制了經(jīng)氧化還原酶標(biāo)記的抗體的自由擴(kuò)散，從而提高了測(cè)試的靈敏度，且大幅度縮短了抗體和抗原的特異性結(jié)合的時(shí)間，從而整體上縮短了檢測(cè)的時(shí)間，提高了效率。另外，可以根據(jù)生物活性物質(zhì)的種類(lèi)以及抗生物活性物質(zhì)的氧化還原酶標(biāo)記的抗體的活性，調(diào)整溶液成分和電場(chǎng)，加速抗原抗體的反應(yīng)時(shí)間。例如采用不同pH值和不同離子濃度的緩沖液，本發(fā)明中電泳溶液的pH值優(yōu)選4-10和離子濃度優(yōu)選0.01-0.1mol/l，電泳溫度優(yōu)選10-40℃?？贵w分子上抗原結(jié)合部位具有與抗原形狀相當(dāng)?shù)姆肿涌臻g，其中的抗體結(jié)合點(diǎn)和抗原決定簇足夠接近時(shí)，借助離子鍵、氫鍵和范德華力的作用將抗體與其抗原特異性結(jié)合在一起形成抗體抗原復(fù)合物。所固載的抗原在與相應(yīng)的抗體結(jié)合時(shí)，自身的立體結(jié)構(gòu)和物性發(fā)生變化，但這個(gè)變化比較小。
圖1B為制得的固載有欲檢測(cè)的抗原和氧化還原酶標(biāo)記的抗體復(fù)合物的工作電極16的圖1A中的A部分的放大示意圖。在工作電極16的表面10上固載有絲素蛋白11，欲檢測(cè)的生物活性物質(zhì)(抗原)13結(jié)合在絲素蛋白11上，氧化還原酶12標(biāo)記的抗體14特異性地和生物活性物質(zhì)(抗原)相結(jié)合在一起形成抗原和氧化還原酶標(biāo)記的抗體的復(fù)合物。
將進(jìn)行完特異性結(jié)合步驟后的可能含有特異性結(jié)合的抗體抗原復(fù)合物的電極浸入PBS緩沖液中，均勻攪拌一段時(shí)間，洗去非特異性結(jié)合的氧化還原酶標(biāo)記的抗體，中間換液兩次，再用去離子水洗去電極表面的無(wú)機(jī)離子，制得可能固載有欲檢測(cè)的抗原和氧化還原酶標(biāo)記的抗體復(fù)合物的工作電極16，待用。由于經(jīng)過(guò)了洗滌步驟之后，工作電極上不會(huì)存在非特異性結(jié)合的氧化還原酶標(biāo)記地抗體的存在，因此如果待測(cè)樣品中沒(méi)有欲檢測(cè)的生物活性物質(zhì)(抗原)，則經(jīng)過(guò)特異性結(jié)合步驟之后的固載有待測(cè)樣品的電極表面上不會(huì)有欲檢測(cè)的抗原和氧化還原酶標(biāo)記的抗體的復(fù)合物的存在，反之則有欲檢測(cè)的抗原和氧化還原酶標(biāo)記的抗體的復(fù)合物的存在。
將該工作電極16和作為參比電極15的鉑電極組成一個(gè)測(cè)試電極組，置于和氧化還原酶相對(duì)應(yīng)的催化底物的反應(yīng)槽中，使用電信號(hào)檢測(cè)裝置進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，以檢測(cè)在工作電極16和參比電極15之間可能產(chǎn)生的電信號(hào)。從上面的描述中能明顯知道，如果檢測(cè)出有顯著電信號(hào)的存在，就說(shuō)明是工作電極上的氧化還原酶催化與其相對(duì)應(yīng)的催化底物發(fā)生了電化學(xué)反應(yīng)，也即工作電極上有特異性結(jié)合的抗體抗原復(fù)合物的存在，即說(shuō)明待測(cè)樣品中有欲檢測(cè)的生物活性物質(zhì)(抗原)的存在。
實(shí)施本發(fā)明方法的電化學(xué)測(cè)試裝置可以是采用常用的如伏安法等可以來(lái)檢測(cè)催化底物在氧化還原酶催化下反應(yīng)產(chǎn)生的電信號(hào)的測(cè)試裝置，可以不需要數(shù)據(jù)采集裝置和相應(yīng)的分析軟件而直接從如電壓表或電流表等測(cè)試裝置上直接觀測(cè)有無(wú)明顯電信號(hào)的產(chǎn)生。本發(fā)明優(yōu)選采用下述方法使用數(shù)據(jù)采集卡來(lái)進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，以更直觀和準(zhǔn)確地檢測(cè)產(chǎn)生的電信號(hào)。
采用常見(jiàn)的方法將工作電極組和參比鉑電極電學(xué)連接到數(shù)據(jù)采集卡上。但優(yōu)選將工作電極組和參比鉑電極的后端以一預(yù)定的間隔電學(xué)連接或接插在數(shù)據(jù)傳輸排線的標(biāo)準(zhǔn)接口上，數(shù)據(jù)傳輸排線另一端的標(biāo)準(zhǔn)插口與數(shù)據(jù)采集卡的接口相連，該數(shù)據(jù)傳輸排線為市場(chǎng)可買(mǎi)到的電腦上常用的排線，其插口處有許多間隔相等的小孔，鉑絲可以插入并不會(huì)掉下來(lái)，如使用其他電極如石墨電極等較粗或較細(xì)的電極可以通過(guò)用合適如銅等的導(dǎo)線纏繞后插接到數(shù)據(jù)傳輸排線的標(biāo)準(zhǔn)接口上，并保持與水平面垂直及互相平行。數(shù)據(jù)傳輸排線的另一端的另一標(biāo)準(zhǔn)接口與數(shù)據(jù)采集卡的插口相匹配，插接后使工作電極組與數(shù)據(jù)采集卡電學(xué)連接。且插接上的工作電極16和參比電極15可以拆卸下來(lái)，進(jìn)行清洗后重復(fù)使用。標(biāo)準(zhǔn)接口使數(shù)據(jù)傳輸排線和數(shù)據(jù)采集卡相連接，如圖4所示，工作電極16以及參比鉑電極與接口的水平面保持垂直。數(shù)據(jù)采集卡及其標(biāo)準(zhǔn)接口可從深圳市研祥智能科技股份有限公司購(gòu)得，型號(hào)為PCL-812PG，該種型號(hào)的數(shù)據(jù)采集卡有8個(gè)通道，既能進(jìn)行單通道測(cè)試，也能同時(shí)進(jìn)行多通道測(cè)試，其采集方法和步驟可按照其說(shuō)明書(shū)的要求操作。應(yīng)該指出，本發(fā)明中使用的數(shù)據(jù)采集卡具有能夠檢測(cè)與其相連接的工作電極16和參比電極15之間的電壓，即具有電壓檢測(cè)功能，如果連接有多組工作電極16和參比電極15可以同時(shí)進(jìn)行多通道的電壓檢測(cè)。本發(fā)明也可以采用其他與上述型號(hào)的數(shù)據(jù)采集卡的基本原理相同的數(shù)據(jù)采集卡，并不影響測(cè)定的技術(shù)效果。
在測(cè)試之前，將由制得的工作電極16與作為參比電極15的鉑金電極組成的測(cè)試電極組一起浸入反應(yīng)槽中的PBS里一定時(shí)間，使初始電壓值穩(wěn)定。再將適量的催化底物加入PBS中，其中催化底物的濃度可在0.01％-1％，并要求使底物濃度相對(duì)于氧化還原酶量飽和，且不能抑制酶的催化活性，具體濃度按實(shí)際情況而定。采用伏安法檢測(cè)該氧化還原對(duì)在相應(yīng)的氧化還原酶催化下的氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的電信號(hào)，使用上述的數(shù)據(jù)采集卡采集電信號(hào)后傳入電腦并經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)分析得出的測(cè)試結(jié)果。將測(cè)得的電信號(hào)顯示在屏幕上，如有響應(yīng)電信號(hào)的出現(xiàn)則表明有欲測(cè)的生物活性物質(zhì)的存在，反之則沒(méi)有欲測(cè)的生物活性物質(zhì)的存在。為了更直觀和精確地觀測(cè)所產(chǎn)生的顯著電信號(hào)，本發(fā)明使用相應(yīng)的分析軟件分析數(shù)據(jù)采集卡收集的數(shù)據(jù)通過(guò)電腦屏幕顯示出來(lái)。本發(fā)明的從深圳市研祥智能科技股份有限公司購(gòu)得的數(shù)據(jù)采集卡本身自帶有數(shù)據(jù)分析軟件，可以使用該分析軟件對(duì)測(cè)試結(jié)果進(jìn)行分析。但另外根據(jù)本發(fā)明的測(cè)試方法的特點(diǎn)以及所采用的數(shù)據(jù)采集卡的數(shù)據(jù)采集方式，也可以在該軟件的基礎(chǔ)上了進(jìn)行編程，使所開(kāi)發(fā)的軟件用于本發(fā)明的分析之用。使用上述的本發(fā)明的測(cè)試方法的最低檢測(cè)濃度1.0×10-11mol/L，響應(yīng)時(shí)間為10s左右。
圖2為本發(fā)明通過(guò)電化學(xué)方法測(cè)得的經(jīng)分析軟件處理后的電壓信號(hào)與時(shí)間對(duì)應(yīng)關(guān)系圖。顯示的電壓信號(hào)包括噪音、一般電信號(hào)和顯著電信號(hào)，噪音值的電壓在-30±10mV，而響應(yīng)電信號(hào)值在-195±10mV至-430±10mV，比率為6.5/14.33。表明檢測(cè)效果明顯，抗干擾能力強(qiáng)。
依照本發(fā)明的測(cè)試方法，可以在含催化底物的反應(yīng)槽中加入適量的乙二胺四乙胺(EDTA)，以增強(qiáng)氧化還原酶與催化底物的結(jié)合能力。加入適量的氨基乙醇可以減少噪音，這是因?yàn)榘被掖伎梢詼p少反應(yīng)過(guò)程中的非特異性結(jié)合，降低背景噪音，從而提高了檢測(cè)的靈敏度。另外因?yàn)楣栌褪巧矶栊缘?，介電性能好，所以加入適量的硅油可以增強(qiáng)電信號(hào)。
圖3為響應(yīng)電壓值與硅油、氨基乙醇劑量關(guān)系圖譜，表示在底物反應(yīng)槽中加入硅油以及氨基乙醇對(duì)改善測(cè)試得到的電信號(hào)的效果對(duì)比圖。其中圖的右邊表格中的符號(hào)+表示有對(duì)應(yīng)物質(zhì)的存在，符號(hào)-表示沒(méi)有對(duì)應(yīng)物質(zhì)的存在。從圖中可以看出經(jīng)放大后有噪音，加入硅油可使反應(yīng)體系的介電常數(shù)增加。加入氨基乙醇可使工作電極16表面的非特異性結(jié)合的位點(diǎn)減少，以降低檢測(cè)的背景噪音。
在以上的實(shí)施方式中，可以用鉑電極、石墨電極、玻碳電極、玻璃電極、銻電極等金屬電極，但本發(fā)明優(yōu)選鉑電極。
上面所述的測(cè)試步驟中，也可以使用按照下述的多通道測(cè)試電極矩陣來(lái)代替由單一的工作電極16和參比電極15組成的測(cè)試電極組來(lái)進(jìn)行電信號(hào)的多通道檢測(cè)。該多通道電極矩陣由兩個(gè)以上的測(cè)試電極組構(gòu)成，所述測(cè)試電極組同樣也由按照上面所述步驟制得的固載有氧化還原酶標(biāo)記的抗體抗原復(fù)合物的工作電極16和參比電極組成。其中工作電極16和參比電極15可以通過(guò)常用的方法電學(xué)連接到數(shù)據(jù)采集卡的接口上，為了操作方便也可以將工作電極和參比電極以合適的間距通過(guò)固定板等固定。但本發(fā)明優(yōu)選以下述方法和數(shù)據(jù)采集卡電學(xué)連接。將工作電極16和參比電極15以一預(yù)定的間隔接插在數(shù)據(jù)傳輸排線的標(biāo)準(zhǔn)接口上，且測(cè)試電極組與接口的水平面保持垂直，測(cè)試電極組之間的間距相等，測(cè)試電極組的間距可以根據(jù)反應(yīng)槽的大小確定，測(cè)試電極組之間互相平行，數(shù)據(jù)傳輸排線另一端的標(biāo)準(zhǔn)插口與數(shù)據(jù)采集卡的接口相連。數(shù)據(jù)采集卡中配制的電壓檢測(cè)裝置相應(yīng)地檢測(cè)每一個(gè)測(cè)試電極組的工作電極16和參比電極15間形成的電壓差信號(hào)，并采集后傳給分析軟件。每一個(gè)測(cè)試電極組數(shù)據(jù)占用采集卡的一個(gè)通道，如可以使用8個(gè)測(cè)試電極組構(gòu)成2×4測(cè)試電極組矩陣，8個(gè)測(cè)試電極組分別連接數(shù)據(jù)采集卡的8個(gè)通道。但如果數(shù)據(jù)采集卡能夠提供足夠的通道數(shù)，可以根據(jù)需要擴(kuò)增測(cè)試電極組矩陣的大小，如4×4、8×8等。該種由測(cè)試電極組構(gòu)成的電極矩陣便于洗滌以及重新涂膜和檢測(cè)，且在進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)時(shí)能夠同時(shí)多通道檢測(cè)出多個(gè)電信號(hào)，提高了檢測(cè)的效率。以上的數(shù)據(jù)采集卡可以使用上述的深圳市研祥智能科技股份有限公司型號(hào)為PCL-812PG的數(shù)據(jù)采集卡。
圖4為用于本發(fā)明描述的檢測(cè)生物活性物質(zhì)的方法的測(cè)試裝置的一種實(shí)施方式的示意圖。數(shù)據(jù)傳輸排線1的標(biāo)準(zhǔn)接口3由可升降的固定裝置9固定。一個(gè)固定裝置9沿著其移動(dòng)的柱狀體8垂直固定在底座上，固定裝置9將標(biāo)準(zhǔn)接口3固定在水平位置，其中標(biāo)準(zhǔn)接口3上插接有與標(biāo)準(zhǔn)接口3面垂直的單一的測(cè)試電極組4或者測(cè)試電極組矩陣。底物反應(yīng)槽5置于底座上，且與標(biāo)準(zhǔn)接口3上插接的測(cè)試電極組4相對(duì)應(yīng)。標(biāo)準(zhǔn)接口3通過(guò)數(shù)據(jù)傳輸排線1的導(dǎo)線和安裝在計(jì)算機(jī)內(nèi)的數(shù)據(jù)采集卡相連接。欲進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，使標(biāo)準(zhǔn)接口3的固定裝置9下降到能使插接在標(biāo)準(zhǔn)接口3上的可能固載有氧化還原酶標(biāo)記的抗體抗原復(fù)合物的工作電極16和參比電極15組成的測(cè)試電極組或者由該種測(cè)試電極組組成的測(cè)試電極組矩陣與底物反應(yīng)槽5中的底物溶液相接觸，通過(guò)數(shù)據(jù)收集卡檢測(cè)并采集電極組之間的電壓差信號(hào)，傳輸給計(jì)算機(jī)，計(jì)算機(jī)運(yùn)用相應(yīng)的分析軟件進(jìn)行分析處理后，將電信號(hào)顯示在計(jì)算機(jī)屏幕上，通過(guò)判斷有無(wú)響應(yīng)的顯著電信號(hào)的存在來(lái)檢測(cè)有無(wú)欲測(cè)試的生物活性物質(zhì)的存在。
本發(fā)明的測(cè)試方法可檢測(cè)兔IgG、沙門(mén)氏菌、豬霍亂沙門(mén)氏菌的O7單抗和雞白痢等，其測(cè)試范圍廣。
使用本發(fā)明測(cè)試方法，即使按照鉑絲(尺寸為_(kāi)0.4mm×1cm)以16根計(jì)，150-200人民幣，且可重復(fù)利用；數(shù)據(jù)采集卡1500-3000人民幣；所用的酶標(biāo)抗體及其它試劑的量是ELISA的五分之一，電腦4000人民幣左右。而用于ELISA測(cè)試法用的熒光標(biāo)記的酶為千元左右，ELISA還要用到以增加熒光強(qiáng)度便于檢測(cè)一抗二抗甚至三抗等，增加開(kāi)支。用于熒光檢測(cè)的讀取器(ELISA Reader)需48000左右人民幣，進(jìn)口的全自動(dòng)熒光檢測(cè)的讀取器價(jià)格可高達(dá)上百萬(wàn)美元。因此本測(cè)試方法能夠很明顯地節(jié)約測(cè)試成本。此外，ELISA測(cè)試中要用到供氧體常用的如鄰苯二胺和四甲基聯(lián)苯胺等供氫體具有強(qiáng)烈的致癌作用，具有較高的操作危險(xiǎn)性。此外，通過(guò)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
可以看出，由于本測(cè)試方法中采用了電泳步驟和基于自動(dòng)檢測(cè)和分析的電化學(xué)測(cè)試技術(shù)，使得本發(fā)明方法的定性檢測(cè)生物活性物質(zhì)的時(shí)間降低為1小時(shí)左右，比ELISA方法所需的檢測(cè)時(shí)間1.5-24小時(shí)有明顯降低。
下面以實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1將尺寸為_(kāi)0.4mm×1cm的鉑金電極用蒸餾水清洗后晾干，將4.1×10-7mol/L兔IgG溶于200uLpH7.6的NaOH-KH2PO4緩沖液中制成含抗原的溶液的待測(cè)樣品。兔IgG是抽取兔血清，室溫離心10000rpm，5分鐘，取上清而得的。將抗原溶液與絲素蛋白溶液等體積混合后，涂膜該鉑電極面，在室溫下自然涼干成膜。其中絲素蛋白是蠶絲經(jīng)過(guò)95％乙醇或無(wú)水乙醇浸泡洗滌后再放入溴化鋰中溶解所得的粘稠液體。
將辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的購(gòu)于華美生物工程公司的山羊抗兔IgG。與雙濃度巴比妥緩沖液以及蒸餾水以體積比為2∶2∶1進(jìn)行稀釋?zhuān)涑蓀H8.6，C＝0.05mol/l雙濃度巴比妥緩沖液作為電泳溶液，將固定有抗原兔IgG的鉑電極接負(fù)極，另插一個(gè)接正極的鉑電極作為輔助電極，形成一個(gè)回路，37℃恒溫，電泳儀恒流0.5mA，電泳30min，則抗體在溶液中向負(fù)極泳動(dòng)，與固定在鉑電極上的兔IgG結(jié)合。
將結(jié)合了酶標(biāo)抗體的鉑電極浸入pH7.4 PBS緩沖液中，均勻攪拌10min，洗去非特異性結(jié)合的酶標(biāo)抗體，中間換液兩次，再用去離子水洗去傳感器表面的無(wú)機(jī)離子，制得工作鉑電極。
將工作鉑電極和一個(gè)作為參比電極15的鉑電極插接入數(shù)據(jù)傳輸排線的標(biāo)準(zhǔn)接口板的插口處，標(biāo)準(zhǔn)接口板由固定裝置固定在水平位置，數(shù)據(jù)傳輸排線與數(shù)據(jù)采集卡相連。接通計(jì)算機(jī)電源，調(diào)整數(shù)據(jù)采集卡的測(cè)試范圍至-500mv到+500mv之間。打開(kāi)深圳市研祥智能科技股份有限公司購(gòu)得的型號(hào)為PCL-812PG的數(shù)據(jù)采集卡本身自帶分析軟件。向下調(diào)整固定裝置的位置，使工作鉑電極浸入置于底座上的含有氨基乙醇和硅油的PBS溶液的反應(yīng)槽內(nèi)，將測(cè)試電極組浸入兩分鐘待使初始電壓值穩(wěn)定后，將0.05％(質(zhì)量百分比)的H2O2加入PBS中，HRP催化H2O2產(chǎn)生電子，其反應(yīng)公式為反應(yīng)30分鐘，使其反應(yīng)充分，抗體上標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶催化H2O2發(fā)生氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生電信號(hào)。在此過(guò)程中，與計(jì)算機(jī)相連的數(shù)據(jù)采集卡可以每秒10至100次的速率采集工作電極與參比電極間傳送來(lái)的電信號(hào)，分析軟件讀取數(shù)據(jù)采集卡的電壓值進(jìn)行處理，將響應(yīng)電信號(hào)顯示在屏幕上。通過(guò)該方法的經(jīng)過(guò)分析處理后，最后形成結(jié)論檢測(cè)到明顯的電信號(hào)，存在欲檢測(cè)的物質(zhì)。檢測(cè)全過(guò)程少于90分鐘。
實(shí)施例2將尺寸為_(kāi)0.4mm×1cm的16個(gè)鉑金電極用蒸餾水清洗后晾干備用。將4.1×10-7mol/L兔IgG溶于200uLpH7.6的NaOH-KH2PO4緩沖液中制成含有抗原溶液的待測(cè)樣品，兔IgG是抽取兔血清，室溫離心10000rpm，5分鐘，取上清而得的。將抗原溶液與絲素蛋白溶液等體積混合后，涂膜上述8個(gè)鉑電極的表面，在室溫下自然涼干成膜。其中絲素蛋白是蠶絲經(jīng)過(guò)95％乙醇或無(wú)水乙醇浸泡洗滌后再放入溴化鋰中溶解所得的粘稠液體。
將辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的購(gòu)于華美生物工程公司的山羊抗兔IgG與雙濃度巴比妥緩沖液以及蒸餾水以體積比為2∶2∶1進(jìn)行稀釋?zhuān)涑蓀H8.6，C＝0.05mol/l雙濃度巴比妥緩沖液作為電泳溶液，將固定有抗原兔IgG的8個(gè)鉑電極接負(fù)極，另外的8個(gè)鉑電極接正極作為參比電極，形成回路，37℃恒溫，電泳儀恒流0.5mA，電泳30min，則酶標(biāo)抗體在溶液中向負(fù)極泳動(dòng)，與固定在鉑電極上的兔IgG結(jié)合。
將結(jié)合了酶標(biāo)抗體的鉑電極浸入pH7.4PBS緩沖液中，均勻攪拌10min，洗去非特異性結(jié)合的酶標(biāo)抗體，中間換液兩次，再用去離子水洗去傳感器表面的無(wú)機(jī)離子，制得8個(gè)工作鉑電極。
將每個(gè)工作電極分別和一個(gè)作為參比電極的鉑電極構(gòu)成8個(gè)測(cè)試電極組，將該8個(gè)測(cè)試電極組按一預(yù)定的間距插接入數(shù)據(jù)傳輸排線的標(biāo)準(zhǔn)接口板的插口處，并與深圳市研祥智能科技股份有限公司購(gòu)得的型號(hào)為PCL-812PG的數(shù)據(jù)采集卡相連，組成2×4測(cè)試電極組矩陣，每一個(gè)測(cè)試電極組對(duì)應(yīng)于數(shù)據(jù)采集卡的一個(gè)通道。標(biāo)準(zhǔn)接口板由固定裝置固定在水平位置。接通計(jì)算機(jī)電源，調(diào)整數(shù)據(jù)采集卡的測(cè)試范圍至-500mv到+500mv之間。打開(kāi)該數(shù)據(jù)采集卡本身自帶分析軟件。向下調(diào)整固定裝置的位置，使工作電極16浸入置于底座上的含有氨基乙醇和硅油的PBS溶液的反應(yīng)槽內(nèi)，將測(cè)試電極組浸入兩分鐘待使初始電壓值穩(wěn)定后，將0.05％(質(zhì)量百分比)的H2O2加入PBS中，HRP催化H2O2產(chǎn)生電子，其反應(yīng)公式為等待30分鐘，使其充分反應(yīng)，抗體上標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶催化H2O2發(fā)生氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生電信號(hào)。在此過(guò)程中，與計(jì)算機(jī)相連的數(shù)據(jù)采集卡的8個(gè)通道可以每秒10至100次的速率同時(shí)采集8個(gè)測(cè)試電極組傳送來(lái)的電信號(hào)，分析軟件讀取數(shù)據(jù)采集卡的電壓值進(jìn)行處理，將8個(gè)通道測(cè)得的電信號(hào)經(jīng)處理后顯示在屏幕上?？梢?個(gè)通道上都有響應(yīng)電信號(hào)出現(xiàn)。檢測(cè)全過(guò)程少于90分鐘。最后形成結(jié)論檢測(cè)到顯著電信號(hào)，存在欲檢測(cè)的物質(zhì)。
實(shí)施例3將尺寸為_(kāi)0.4mm×1cm的16個(gè)鉑金電極用蒸餾水清洗后晾干備用。將2.7×104個(gè)/ml沙門(mén)氏菌溶于200uLpH7.6的NaOH-KH2PO4緩沖液中制成含抗原溶液的待測(cè)樣品，將此樣品溶液與絲素蛋白溶液等體積混合后，涂膜上述8個(gè)鉑電極的表面，在室溫下自然涼干成膜。其中絲素蛋白是蠶絲經(jīng)過(guò)95％乙醇或無(wú)水乙醇浸泡洗滌后再放入溴化鋰中溶解所得的粘稠液體。
將辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的法國(guó)巴斯德研究所提供的沙門(mén)氏菌抗體與雙濃度巴比妥緩沖液以及蒸餾水以體積比為2∶2∶1進(jìn)行稀釋?zhuān)涑蓀H8.6，C＝0.05mol/l雙濃度巴比妥緩沖液作為電泳溶液，將固定有抗原沙門(mén)氏菌的8個(gè)鉑電極接負(fù)極，另外的8個(gè)鉑電極接正極的作為輔助電極，形成回路，37℃恒溫，電泳儀恒流0.37mA，電泳35min，則抗體在溶液中向負(fù)極泳動(dòng)，與固定在鉑電極上的沙門(mén)氏菌結(jié)合。
將結(jié)合了抗體的鉑電極浸入pH7.4 PBS緩沖液中，均勻攪拌10min，洗去非特異性結(jié)合的酶標(biāo)抗體，中間換液兩次，再用去離子水洗去傳感器表面的無(wú)機(jī)離子，制得8個(gè)工作鉑電極。
將每個(gè)工作電極分別和作為參比電極的鉑電極構(gòu)成8個(gè)測(cè)試電極組，將該8個(gè)測(cè)試電極組按一預(yù)定的間距插接入數(shù)據(jù)傳輸排線的標(biāo)準(zhǔn)接口板的插口處，并與深圳市研祥智能科技股份有限公司購(gòu)得的型號(hào)為PCL-812PG的數(shù)據(jù)采集卡相連，組成2×4測(cè)試電極組矩陣，每一個(gè)測(cè)試電極組對(duì)應(yīng)于數(shù)據(jù)采集卡的一個(gè)通道。標(biāo)準(zhǔn)接口板由固定裝置固定在水平位置。接通計(jì)算機(jī)電源，調(diào)整數(shù)據(jù)采集卡的測(cè)試范圍至-500mv到+500mv之間。打開(kāi)該數(shù)據(jù)采集卡本身自帶分析軟件。向下調(diào)整固定裝置的位置，使工作電極16浸入置于底座上的含有氨基乙醇和硅油的PBS溶液的反應(yīng)槽內(nèi)，將測(cè)試電極組浸入兩分鐘待使初始電壓值穩(wěn)定后，將0.05％(質(zhì)量百分比)的H2O2加入PBS中，HRP催化H2O2產(chǎn)生電子，其反應(yīng)公式為等待30分鐘，使其充分反應(yīng)，抗體上標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶催化H2O2發(fā)生氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生電信號(hào)。在此過(guò)程中，與計(jì)算機(jī)相連的數(shù)據(jù)采集卡的8個(gè)通道可以每秒10至100次的速率同時(shí)采集8個(gè)測(cè)試電極組傳送來(lái)的電信號(hào)，分析軟件讀取數(shù)據(jù)采集卡的電壓值進(jìn)行處理，將8個(gè)通道測(cè)得的電信號(hào)經(jīng)處理后顯示在屏幕上?？梢?個(gè)通道上都有響應(yīng)電信號(hào)出現(xiàn)。檢測(cè)全過(guò)程少于90分鐘。最后形成結(jié)論檢測(cè)到顯著電信號(hào)，存在欲檢測(cè)的物質(zhì)。
實(shí)施例4

將尺寸為20mm×_6mm的光譜純石墨電極用蒸餾水清洗后晾干，將4.1×10-7mol/L兔IgG溶于200uLpH7.6的NaOH-KH2PO4緩沖液中制成含有抗原溶液的待測(cè)樣品。兔IgG是抽取兔血清，室溫離心10000rpm，5分鐘，取上清而得的。將此溶液與絲素蛋白溶液等體積混合后，涂膜該石墨電極表面，在室溫下自然涼干成膜。其中絲素蛋白是蠶絲經(jīng)過(guò)95％乙醇或無(wú)水乙醇浸泡洗滌后再放入溴化鋰中溶解所得的粘稠液體。
將辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的購(gòu)于華美生物工程公司的山羊抗兔IgG與雙濃度巴比妥緩沖液以及蒸餾水以體積比為2∶2∶1進(jìn)行稀釋?zhuān)涑蓀H8.6，C＝0.05mol/l雙濃度巴比妥緩沖液作為電泳溶液，將固定有抗原兔IgG的石墨電極接負(fù)極，另插一個(gè)接正極的鉑電極作為輔助電極，形成一個(gè)回路，37℃恒溫，電泳儀恒流0.5mA，電泳30min，則抗體在溶液中向負(fù)極泳動(dòng)，與固定在石墨電極上的兔IgG結(jié)合。
將結(jié)合了抗體的石墨電極浸入pH7.4 PBS緩沖液中，均勻攪拌10min，洗去非特異性結(jié)合的酶標(biāo)抗體，中間換液兩次，再用去離子水洗去傳感器表面的無(wú)機(jī)離子，制得工作石墨電極。
將工作石墨電極通過(guò)導(dǎo)線纏繞后由導(dǎo)線插入標(biāo)準(zhǔn)接口，以及將一個(gè)作為參比電極的鉑電極插接入數(shù)據(jù)傳輸排線的標(biāo)準(zhǔn)接口板的插口處，標(biāo)準(zhǔn)接口板由固定裝置固定在水平位置，數(shù)據(jù)傳輸排線與數(shù)據(jù)采集卡相連。接通計(jì)算機(jī)電源，調(diào)整數(shù)據(jù)采集卡的測(cè)試范圍至-500mv到+500mv之間。打開(kāi)深圳市研祥智能科技股份有限公司購(gòu)得的型號(hào)為PCL-812PG的數(shù)據(jù)采集卡本身自帶分析軟件。向下調(diào)整固定裝置的位置，使測(cè)試電極組浸入置于底座上的含有氨基乙醇和硅油的PBS溶液的反應(yīng)槽內(nèi)，浸入兩分鐘使初始電壓值穩(wěn)定后，將0.05％(質(zhì)量百分比)的H2O2加入PBS中，HRP催化H2O2產(chǎn)生電子，其反應(yīng)公式為反應(yīng)30分鐘，使其反應(yīng)充分，抗體上標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶催化H2O2發(fā)生氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生電信號(hào)。在此過(guò)程中，與計(jì)算機(jī)相連的數(shù)據(jù)采集卡每秒10至100次的速率采集工作電極16傳送來(lái)的電信號(hào)，分析軟件讀取數(shù)據(jù)采集卡的電壓值進(jìn)行處理，將響應(yīng)電信號(hào)顯示在屏幕上。通過(guò)該方法的經(jīng)過(guò)分析處理后。最后形成結(jié)論檢測(cè)到顯著電信號(hào)，存在欲檢測(cè)的物質(zhì)。檢測(cè)全過(guò)程少于90分鐘。
權(quán)利要求
1.一種使用氧化還原酶標(biāo)記的測(cè)量生物活性物質(zhì)的電化學(xué)測(cè)試方法，包括將樣品中可能含有的欲檢測(cè)的作為抗原的生物活性物質(zhì)固載在電極表面上；進(jìn)行氧化還原酶標(biāo)記的與欲檢測(cè)的生物活性物質(zhì)相對(duì)應(yīng)的抗體和固載在電極上的待測(cè)樣品中可能含有的生物活性物質(zhì)特異性識(shí)別結(jié)合步驟；洗去非特異性識(shí)別結(jié)合的氧化還原酶標(biāo)記的所述抗體制得工作電極；和將由該工作電極和參比電極構(gòu)成的測(cè)試電極組插入到所述氧化還原酶對(duì)應(yīng)的催化底物中，測(cè)量有無(wú)標(biāo)記的氧化還原酶與反應(yīng)槽中的催化底物反應(yīng)而產(chǎn)生的電信號(hào)，進(jìn)而判斷有無(wú)欲測(cè)試的生物活性物質(zhì)的存在。
2.如權(quán)利要求1所述的測(cè)量生物活性物質(zhì)的電化學(xué)測(cè)試方法，其特征在于所述的特異性識(shí)別結(jié)合采用電泳法。
3.如權(quán)利要求1所述的測(cè)量生物活性物質(zhì)的電化學(xué)測(cè)試方法，其特征在于所述測(cè)試電極組為由相互平行的至少2個(gè)以上的測(cè)試電極組排列形成的能夠進(jìn)行多通道測(cè)試的電極組矩陣。
4.如權(quán)利要求1所述的測(cè)量生物活性物質(zhì)的電化學(xué)測(cè)試方法，其特征在于使用與計(jì)算機(jī)相聯(lián)的數(shù)據(jù)采集卡測(cè)試和采集反應(yīng)產(chǎn)生的電信號(hào)。
5.如權(quán)利要求4所述的測(cè)量生物活性物質(zhì)的電化學(xué)測(cè)試方法，其特征在于工作電極和參比電極電學(xué)連接在接數(shù)據(jù)采集卡的數(shù)據(jù)傳輸排線的標(biāo)準(zhǔn)接口上，且可以拆卸。
6.如權(quán)利要求1所述的測(cè)量生物活性物質(zhì)的電化學(xué)測(cè)試方法，其特征在于固載采用絲素蛋白和待測(cè)的樣品混合后涂抹在電極上。
7.如權(quán)利要求2所述的測(cè)量生物活性物質(zhì)的電化學(xué)測(cè)試方法，其特征在于所述電泳的電泳溶液的pH值4-10，離子濃度為0.01-0.1mol/l。
8.如權(quán)利要求1所述的測(cè)量生物活性物質(zhì)的電化學(xué)測(cè)試方法，其特征在于催化底物的反應(yīng)槽中至少含有乙二胺四乙酸、氨基乙醇和硅油中的至少一種。
9.一種用于權(quán)利要求1-8所述的任一種電化學(xué)測(cè)試方法的測(cè)試裝置，包括由表面可能固載有氧化還原酶標(biāo)記的抗體抗原復(fù)合物的工作電極和參比電極組成的測(cè)試電極組；與該氧化還原酶對(duì)應(yīng)的催化底物反應(yīng)槽；和電信號(hào)檢測(cè)裝置。
10.如權(quán)利要求9所述的測(cè)試裝置，其特征在于進(jìn)一步包括數(shù)據(jù)采集裝置和處理裝置。
全文摘要
一種使用氧化還原酶標(biāo)記的測(cè)量生物活性物質(zhì)的電化學(xué)檢測(cè)方法，以解決解決ELISA法存在的檢測(cè)成本較高的問(wèn)題，該檢測(cè)方法包括將樣品中可能含有的欲檢測(cè)的作為抗原的生物活性物質(zhì)固載在電極表面上；進(jìn)行氧化還原酶標(biāo)記的與欲檢測(cè)的生物活性物質(zhì)相對(duì)應(yīng)的抗體和固載在電極上的待測(cè)樣品可能含有的生物活性物質(zhì)特異性識(shí)別結(jié)合步驟；洗去非特異性結(jié)合的氧化還原酶標(biāo)記的所述抗體制得工作電極；和將由該工作電極和參比電極構(gòu)成的測(cè)試電極組插入到所述氧化還原酶對(duì)應(yīng)的催化底物中，測(cè)量有無(wú)標(biāo)記的氧化還原酶與反應(yīng)槽中的催化底物反應(yīng)而產(chǎn)生的電信號(hào)，進(jìn)而判斷有無(wú)欲測(cè)試的生物活性物質(zhì)的存在。本發(fā)明另外還提供一種基于該測(cè)試方法的檢測(cè)裝置。
文檔編號(hào)G01N33/561GK1447114SQ03115418
公開(kāi)日2003年10月8日 申請(qǐng)日期2003年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月14日
發(fā)明者李偉, 陳石燕, 潘寧, 李幼榮, 黃文尉, 劉凱, 徐炳文 申請(qǐng)人:李偉, 陳石燕