專利名稱：用于簡化復(fù)合肽混合物的方法和試劑盒的制作方法
背景技術(shù)：
用于細(xì)胞中蛋白的鑒定，定量和定位的蛋白質(zhì)組(Proteomic)技術(shù)將大大推進(jìn)通過基因組技術(shù)所獲得的對細(xì)胞功能和發(fā)育的理解。例如，高級質(zhì)譜技術(shù)能夠分析復(fù)合蛋白混合物，例如多蛋白復(fù)合物，細(xì)胞組分和全細(xì)胞提取物有望提供強(qiáng)有力的高通量診斷和篩選方法。
質(zhì)譜可用于鑒定混合物中的一種蛋白或者多種蛋白。另外，質(zhì)譜可用于肽的從頭測序。例如，復(fù)合蛋白混合物(例如，細(xì)胞提取物)的蛋白水解產(chǎn)生的肽的串聯(lián)質(zhì)譜可用于鑒定和定量最初混合物中存在的蛋白。這種結(jié)果的獲得是因?yàn)槟軌蜻x擇單個m/z值并能夠進(jìn)行離子碰撞誘導(dǎo)解離(CID)的串聯(lián)質(zhì)譜可用作肽的測序和鑒定。由肽的CID產(chǎn)生的信息可用于搜索蛋白和核苷酸序列數(shù)據(jù)庫以鑒定譜圖所代表的氨基酸序列，從而鑒定肽所來源的蛋白。
用于鑒定來自降解蛋白的肽的復(fù)合混合物中肽的串聯(lián)質(zhì)譜使用三種類型的信息。首先，獲得肽的質(zhì)量。僅僅這個信息就可以大大降低肽序列的可能數(shù)目，尤其是如果蛋白用序列特異性蛋白酶降解時。第二種類型的信息是由肽離子的CID產(chǎn)生的碎片離子譜。將碎片離子譜和由序列數(shù)據(jù)庫計算產(chǎn)生的理論碎片離子譜比較的分析方法可用來鑒定肽序列。這種方法可以鑒定最匹配肽并且可以統(tǒng)計確定哪種肽序列更可能正確。通過使用多維MS分析重新獲得肽部分的序列能夠進(jìn)一步提高預(yù)測的準(zhǔn)確性。這種直接序列信息可以用于進(jìn)一步提高基于碎片離子譜的預(yù)測準(zhǔn)確性。一旦肽得到鑒定，通過搜索序列數(shù)據(jù)庫可很容易確定產(chǎn)生肽的蛋白。
復(fù)合混合物例如細(xì)胞提取物中的蛋白，可以通過將蛋白酶解，液相色譜分離，串聯(lián)質(zhì)譜，將肽質(zhì)譜和那些基于序列數(shù)據(jù)庫的理論預(yù)測相關(guān)聯(lián)的計算機(jī)算法和從頭測序結(jié)合起來進(jìn)行鑒定。電霧化電離使得液相色譜直接和串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合從而使復(fù)合混合物能夠在導(dǎo)入質(zhì)譜之前而暫時分離?？捎萌蚪M序列的生物體數(shù)目的增加將大大提高利用這種方法分析復(fù)合混合物的價值。
本發(fā)明的概述本發(fā)明的特征在于從含有多種肽的樣品，例如由蛋白混合物，例如從生物樣品獲得的蛋白混合物的蛋白酶降解產(chǎn)生的樣品，獲得簡化肽混合物的方法和試劑。本發(fā)明的方法和試劑可用來根據(jù)合理和受控的方案減少樣品中肽(或者蛋白)的數(shù)量從而獲得含更少量肽的簡化肽樣品。例如，由蛋白酶降解混合蛋白樣品產(chǎn)生的肽樣品開始，可以獲得簡化肽樣品，其含有僅僅一種或者少數(shù)由蛋白降解混合蛋白樣品中每種蛋白所產(chǎn)生的肽。簡化樣品較原始肽樣品更容易分析，而且簡化樣品代表了全部或者接近全部混合蛋白樣品中存在的蛋白，原始和更復(fù)雜肽樣品來自混合蛋白樣品。因此，簡化肽混合物可用于鑒定和定量在原始混合蛋白樣品中的全部或者接近全部的蛋白。即使簡化混合物不包括至少一種來自混合蛋白樣品中每種蛋白的肽，簡化混合物依然有用，因?yàn)樵谝恍┣闆r下，不必須鑒定或者定量混合蛋白樣品中的所有蛋白。
本發(fā)明的方法和組合物可用于分析由復(fù)合蛋白混合物(例如，細(xì)胞提取物)的酶解所產(chǎn)生的肽。本發(fā)明的方法和組合物可用于任一設(shè)置，其中希望的是以受控和特定的方式降低肽混合物的復(fù)雜性，并且尤其在制備用于質(zhì)譜分析的肽樣品中有實(shí)用性。
本發(fā)明的方法需要利用包括氨基酸特異性反應(yīng)基(R)的標(biāo)記部分。標(biāo)記部分在特異性氨基酸位點(diǎn)“標(biāo)記”肽或者蛋白(例如，通過和一個氨基酸反應(yīng)形成共價鍵)，最終能夠分離含有這些特異性氨基酸的肽。由給定標(biāo)記部分標(biāo)記的氨基酸依賴于標(biāo)記部分中存在的R基團(tuán)的鑒定。當(dāng)絲氨酸和蘇氨酸存在于肽的氨基末端時，一個R基團(tuán)(RS/T)標(biāo)記絲氨酸(ser)和蘇氨酸(thr)。另一個R基團(tuán)(RC)在其巰基處標(biāo)記在肽中無論何處存在的半胱氨酸(cys)。另一種R基團(tuán)(RL)在其伯胺處標(biāo)記在肽中無論何處存在的賴氨酸(lys)。
本發(fā)明的特征還在于反應(yīng)部分(RP)，其包括和選擇蛋白共價或者非共價選擇性相互作用的試劑。例如，RP可為被標(biāo)記受體的天然配體或者與被標(biāo)記的第二個蛋白相互作用的蛋白?？梢詾槊傅孜锘蛘咧T如抗體，ATP，GTP，NAD，NADH，NADPH，泛素或者其結(jié)構(gòu)類似物的其它分子識別元件。當(dāng)其使用目的是通過選擇性減少蛋白酶解前混合物蛋白樣品中蛋白的數(shù)量而簡化肽樣品時，RP是R的特殊形式。
標(biāo)記部分的反應(yīng)基直接或者間接和其它有助于標(biāo)記肽分離的基團(tuán)相連。因此，標(biāo)記部分可包括一個連接基團(tuán)(L)，可以將R基團(tuán)連接到一個有助于標(biāo)記肽俘獲的基團(tuán)(B或者M(jìn))上。B基團(tuán)為例如選擇性結(jié)合到俘獲試劑的生物素，例如鏈親和素。M基團(tuán)為磁性粒子，可以通過磁力進(jìn)行吸附。
分離的肽可通過質(zhì)譜或者其它任一期望的方法進(jìn)行分析。例如，質(zhì)譜可用于鑒定和/或定量分析簡化混合物中的一種或者多種肽。
因此，本發(fā)明的特征是減少樣品中存在肽數(shù)量的方法，所述方法包括(a)提供含有三個共價連接部分的標(biāo)記部分R-L-B其中，R為和肽或者蛋白反應(yīng)的反應(yīng)基(例如RS/T，RC，RL或者RP)；L為在直鏈或者支鏈上含有零個或者多個原子以及一個任選選擇性切割位點(diǎn)的連接基團(tuán)；以及B為可以選擇性結(jié)合到俘獲試劑上的基團(tuán)；(b)將樣品和標(biāo)記部分反應(yīng)以提供標(biāo)記肽或者蛋白；(c)將標(biāo)記肽或者蛋白和俘獲試劑接觸以提供俘獲的標(biāo)記肽或者蛋白，并從樣品中其它組分(例如，非標(biāo)記肽或者蛋白)分離俘獲的標(biāo)記肽或者蛋白；(d)從俘獲試劑釋放標(biāo)記肽或者蛋白的至少部分肽或者蛋白以提供釋放的修飾肽或者蛋白；以及(e)通過質(zhì)譜分析釋放的修飾肽或者蛋白或其片段以鑒定樣品中存在的至少一種肽或者蛋白。釋放的修飾肽或者蛋白可以包括所有或者部分R以及所有或者部分L或者不包括L。
此外，本發(fā)明的特征任選在于R-L*-B部分，其中L*為L的同位素標(biāo)記形式。這些同位素標(biāo)記的標(biāo)記部分為兩種或者多種每個彼此相異標(biāo)記并隨后在質(zhì)譜分析前混合在一起的樣品提供了定量方法。同位素標(biāo)記可以為2H，13C，15N，18O，34S或者其它任一合適同位素標(biāo)記。本發(fā)明的特征任選還在于R*-L-B和R-L-B*，其中B*為B的同位素標(biāo)記形式，而R*為R的同位素標(biāo)記形式。本發(fā)明的部分也提供了獲得差示同位素標(biāo)記肽或者蛋白的方法。
另外，在本專利申請中，“肽”可以理解為包括“蛋白”或者“修飾肽或蛋白”。
在其它實(shí)施方案中，蛋白或者肽可被俘獲以通過利用包含以下三種共價連接部分的標(biāo)記部分的質(zhì)譜進(jìn)行分析M-L-R其中M為磁性粒子；L為和M共價連接的連接基團(tuán)，在直鏈或者支鏈上含有零個或者多個原子以及一個任選選擇性切割位點(diǎn)；R為特異性反應(yīng)基，包括和肽或者蛋白反應(yīng)的一種上述特定反應(yīng)基(RS，RC，RL，或RP)。在該實(shí)施方案中，標(biāo)記肽或者蛋白可以分離自未標(biāo)記的肽或者蛋白，通過對M部分選擇性施加磁力進(jìn)行，而不是通過對B部分的選擇性試劑俘獲進(jìn)行。
肽可來自酶解蛋白或者通過其它生物或者合成方法加工而來。蛋白可分離自，例如，病人細(xì)胞樣品，病人血清樣品，或者病人組織樣品。蛋白可來自，例如，培養(yǎng)細(xì)胞，用目的化合物(例如，治療用化合物或者潛在的治療用化合物)處理的培養(yǎng)細(xì)胞，或者植物細(xì)胞，微生物細(xì)胞，病毒，或者遺傳修飾的細(xì)胞。
在不同實(shí)施方案中，RC包括巰基特異性反應(yīng)基(例如，馬來酰亞胺基或者吡啶-聯(lián)硫基)，RL包括一個氨基特異性反應(yīng)基(例如，琥珀酰亞胺基)，以及RS/T包括一個絲氨酸/蘇氨酸特異性反應(yīng)基(例如，酰肼基團(tuán))。RP可以包括RS/T，RC，RL或者酶底物或者其它諸如抗體，或者ATP，GTP，NAD，NADP，NADH，NADPH，泛素或者其結(jié)構(gòu)類似物的其它分子識別元件。
L為單部分或者多部分連接基團(tuán)，可以包括生物學(xué)或者非生物學(xué)寡聚體結(jié)構(gòu)。例如，L可以包括任一序列的多肽鏈，相同氨基酸鏈(例如，聚甘氨酸或者聚丙氨酸)，交替氨基酸鏈或者不同氨基酸鏈。L可以包括例如O，S，NH，CO，COO，COS，S-S，CH2，烷基，烯基，炔基和烷氧基，或者芳基。L可以包括化學(xué)或者酶切位點(diǎn)，能夠從M釋放修飾肽或者蛋白。L可以或者不可以被穩(wěn)定或者放射性同位素原子差示標(biāo)記。
在有些實(shí)施方案中，L是可切割的并含有二硫基或者連位二醇基，或者鄰硝基芐醚，以及在有些實(shí)施方案中，L被同位素標(biāo)記，和/或R被同位素標(biāo)記。
多種類型的化學(xué)切割位點(diǎn)或者酶切位點(diǎn)或者二者可以包括在L中。例如化學(xué)切割可以為利用合適的還原試劑切割的二硫鍵?？梢酝ㄟ^氧化切割乙二醇或者二元醇鍵。可以利用連二亞硫酸鹽切割重氮鍵?？梢岳昧u胺，酸或者堿切割酯?？梢岳煤线m的堿切割砜。如果L包括多肽，可以利用蛋白酶切割?？梢岳弥盖懈视王??？梢岳昧姿崦盖辛柞??？梢岳煤怂崦盖懈疃嗪塑账峄蛘吖押塑账帷?br> 在各種不同實(shí)施方案中，釋放步驟包括將俘獲標(biāo)記多肽與還原劑或者其它切割試劑接觸，在通過質(zhì)譜進(jìn)行分析之前用色譜分離釋放的修飾肽。在其它實(shí)施方案中，俘獲的標(biāo)記肽首先被處理以從俘獲試劑中釋放B(或者從磁場俘獲中釋放M)，然后被處理以從B和所有或者部分L(或者從M和所有或者部分L)釋放修飾肽或者蛋白部分。
M，L和R部分可以多種方式通過合成連接。例如，可以購得市售帶有結(jié)構(gòu)M-L-NH2的磁性粒子。類似的，可以購得市售帶有結(jié)構(gòu)B-L-NH2的俘獲試劑。氨基可以和多種雙功能交聯(lián)劑反應(yīng)從而生成多種通過L連接到M或者B的R基團(tuán)。
其中R共價連接到磁性粒子的標(biāo)記部分有很多優(yōu)點(diǎn)。首先，它們可用來在單個步驟中俘獲肽。相比于下列方法這更高效且更容易進(jìn)行樣品操作肽首先被包含親和標(biāo)記的試劑標(biāo)記，隨后將親和標(biāo)記俘獲到例如珠子或者固體顆粒的固相支持物上，所述珠子或者固體顆粒用連接到親和標(biāo)記的俘獲試劑包被。R共價連接到磁性粒子或者固相材料的標(biāo)記部分避免了為了將俘獲肽和固相支持物連接而要求實(shí)施的兩個連接步驟。此外，通過使用固相支持物，例如M-L-R結(jié)構(gòu)，樣品清除和去除非衍生化的肽可以通過單個步驟完成。這種俘獲更快速且更高效。另外，因?yàn)槔么帕ξ判粤Ｗ拥姆绞椒蛛x標(biāo)記肽，俘獲步驟就不易受到反應(yīng)混合物中存在的組分，例如肽，雜質(zhì)的干擾，因此就不受諸如緩沖條件和溫度等因素的影響。另外，磁性粒子提供了很多優(yōu)點(diǎn)，容易進(jìn)行樣品操作。M-L-R形式的合適標(biāo)記部分可以制備如下。具有共價連接伯胺基團(tuán)Dynal A/S(Oslo，Norway)的磁性粒子(M部分)可以通過和一種來自Pierce Chemical公司的異二功能交聯(lián)劑N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸(SPDP)反應(yīng)而激活。這種試劑提供了可被含巰基肽的巰基取代的吡啶巰基。肽也可為包括一個連接不同R基團(tuán)一級氨基的合成肽。因此含巰基肽組成了部分L基團(tuán)。含巰基肽可被，例如13C或者氘標(biāo)記。在這種情況下，M-L-R部分命名為M-L*-R。同位素標(biāo)記使得在不同樣品中的肽或者蛋白相對定量，所述不同樣品混合在一起同時通過質(zhì)譜進(jìn)行分析。含有巰基的肽優(yōu)選包括使得俘獲肽釋放的切割位點(diǎn)。切割位點(diǎn)的例子包括那些帶有二硫鍵的位點(diǎn)，能夠進(jìn)行化學(xué)切割，或者例如通過胰蛋白酶進(jìn)行酶切的位點(diǎn)。肽希望含有L基團(tuán)，部分因?yàn)樗鼈兡軌蛳喈?dāng)容易并相對簡單合成。由于它們可被設(shè)計為基本上親水性，基本上疏水性或者二者都不是，因此它們能夠適應(yīng)多種類型的溶液條件。另外，肽具有結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的靈活性。肽可以很容易地設(shè)計為包括化學(xué)切割位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)或者兩種類型的切割位點(diǎn)。
如上所述，含有巰基肽的一級氨基可以和多種部分反應(yīng)以使變化的R部分產(chǎn)生為M-L-R(或者B-L-R)。例如，一級氨基可以和包括酰肼基的部分反應(yīng)。在這種情況下，R部分對在氨基末端含有蘇氨酸或者絲氨酸的肽將是選擇性的?；蛘?，一級氨基可以和含有馬來酰亞胺基的部分反應(yīng)。在這種情況下，R部分將選擇性和含有半胱氨酸的肽反應(yīng)。其它合適和含半胱氨酸肽反應(yīng)的親電R基團(tuán)包括環(huán)氧基，α-鹵代?；?，腈基，磺化烷硫醇基，和磺化芳基硫醇基。R部分也可包括用于和氨基(例如賴氨酸)反應(yīng)的琥珀酰亞胺基團(tuán)。
M-L-R或者B-L-R部分可被用于和(1)肽，包括那些來自酶切蛋白后產(chǎn)生的肽；(2)天然蛋白；(3)變性蛋白；(4)天然膜嵌入式蛋白。
在天然蛋白(以及足夠大到呈現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)的特定肽)的情況下，僅僅那些存在于(即，立體結(jié)構(gòu)合適的)分子外部的特異性氨基酸能夠和M-L-R或者B-L-R部分反應(yīng)。因此，附著使得能夠特異性靶擊蛋白“呈現(xiàn)”的部分。在變形蛋白的情況下，蛋白的所有部分都可能接近。蛋白隨后可被降解為肽組分。M-L-R部分可用于俘獲以天然或者變性形式存在的蛋白。蛋白可被化學(xué)降解或者酶解。M-L-R部分(帶有附著肽)可被清洗以去除未結(jié)合肽(和其它不需要的組分)。隨后，修飾肽釋放出來。在一些情況下，可以希望進(jìn)行多次清洗步驟。例如，標(biāo)記肽或者標(biāo)記多肽可以在俘獲前或俘獲后或者二者情況下進(jìn)行清洗。
在酶解或者化學(xué)降解前標(biāo)記多肽或者蛋白的情況下，若干途徑都是可能的。例如，在樣品中存在的部分多肽可以通過如下方法俘獲和分析(a)提供具有下式的標(biāo)記部分R-L-M，其中，R為和包括選擇性氨基酸的多肽反應(yīng)的反應(yīng)基，L為連接基團(tuán)，以及M為可被磁力吸引的磁性粒子；(b)將樣品和標(biāo)記部分反應(yīng)以提供標(biāo)記多肽；(c)通過施加磁力吸引M以分離標(biāo)記多肽從而提供分離的標(biāo)記多肽；(d)酶解或者化學(xué)降解分離的標(biāo)記多肽以提供分離的標(biāo)記多肽片段；(e)從M基團(tuán)釋放分離的標(biāo)記多肽片段的至少部分多肽片段以提供釋放的修飾多肽片段；以及(f)通過質(zhì)譜分析釋放的修飾多肽。用這種方法，降解步驟發(fā)生在標(biāo)記多肽已被分離以后。步驟的順序可以改變，使得降解發(fā)生在分離標(biāo)記多肽之前。在這個途徑中，該方法包括(a)提供具有下式的標(biāo)記部分R-L-M，其中，R為和包括選擇性氨基酸的多肽反應(yīng)的反應(yīng)基，L為連接基團(tuán)，M為可被磁力吸引的磁性粒子；(b)將樣品和標(biāo)記部分反應(yīng)以提供標(biāo)記多肽；(c)降解標(biāo)記多肽以提供標(biāo)記多肽片段；(d)通過施加磁力吸引M分離標(biāo)記多肽片段以提供分離的標(biāo)記多肽片段；(e)從M基團(tuán)釋放分離的標(biāo)記多肽片段的至少部分多肽片段以提供釋放的修飾多肽片段；以及(f)通過質(zhì)譜分析釋放的修飾多肽。
也可利用R-L-B標(biāo)記部分標(biāo)記完整蛋白或者多肽。因此，本發(fā)明包括的方法含有(a)提供具有下式的標(biāo)記部分R-L-B，其中，R為和包括選擇性氨基酸的多肽反應(yīng)的反應(yīng)基，L為連接基團(tuán)，以及B為可以選擇性結(jié)合到俘獲試劑的基團(tuán)；(b)將樣品和標(biāo)記部分反應(yīng)以提供標(biāo)記多肽；(c)將標(biāo)記多肽片段和俘獲試劑接觸以提供俘獲的標(biāo)記多肽(d)降解俘獲的標(biāo)記多肽以提供俘獲的標(biāo)記多肽片段；(e)從B基團(tuán)釋放俘獲的標(biāo)記多肽片段的至少部分多肽以提供釋放的修飾多肽片段；以及(f)通過質(zhì)譜分析釋放的修飾多肽片段。本發(fā)明還包括的方法含有(a)提供具有下式的標(biāo)記部分R-L-B，其中，R為和包括選擇性氨基酸的多肽反應(yīng)的反應(yīng)基，L為連接基團(tuán)，以及B為可以選擇性結(jié)合到俘獲試劑的基團(tuán)；(b)將樣品和標(biāo)記部分反應(yīng)以提供標(biāo)記多肽；(c)降解俘獲的標(biāo)記多肽以提供俘獲的標(biāo)記多肽片段；(d)將標(biāo)記多肽片段和俘獲試劑接觸以提供俘獲的標(biāo)記多肽片段；(e)從B基團(tuán)釋放俘獲的標(biāo)記多肽片段的至少部分多肽片段以提供釋放的修飾多肽片段；以及(f)通過質(zhì)譜分析釋放的修飾多肽片段。
當(dāng)利用一種本發(fā)明的標(biāo)記部分標(biāo)記多肽或者蛋白時，應(yīng)該理解所述多肽或者蛋白不必要是完整的天然存在的多肽或者蛋白(雖然其可能是)。有時，天然存在或者多肽可以在標(biāo)記之前進(jìn)行預(yù)處理減小其大小。
在另一具體提及膜嵌入式和/或不溶性蛋白的實(shí)施方案中，含有結(jié)構(gòu)基團(tuán)M，L，Sol和R的標(biāo)記部分可用于簡化蛋白和肽混合物以進(jìn)行質(zhì)譜分析。在這個標(biāo)記部分，M為磁性粒子，L為連接基團(tuán)，Sol為不透膜的可溶性基團(tuán)，以及R為化學(xué)反應(yīng)基可以選擇性地結(jié)合于特異性氨基酸或者修飾氨基酸，諸如上述的那些。增溶劑基團(tuán)可以為聚合物物種，諸如聚乙二醇(PEG)或者甲氧基化的聚乙二醇(MPEG)，其可以提高連接到R基團(tuán)的蛋白的溶解性。當(dāng)?shù)鞍滓坏哪ぶ幸谱?，其本身在水溶液中不充分溶解的情況，這種途徑尤其有用。這些組分可以采用的各種組合包括M-L-Sol-R，M-SOL-L-R，M-L-Sol-L-R，M-L-R-Sol，M-L-R-L-Sol，以及 在M，Sol或者R基團(tuán)之間可以提供一個或者多個化學(xué)切割位點(diǎn)(例如，如上所述)，但是在最優(yōu)選實(shí)施方案中，L基團(tuán)在接近磁性粒子處包括一個切割位點(diǎn)，切割后產(chǎn)生用于連接到R，L和Sol的蛋白的肽。切割位點(diǎn)可以包括二硫化物或者可酶解寡肽。因此，切割后，Sol基團(tuán)提高了連接蛋白的水溶解性。溶解性的提高對于在質(zhì)譜分析以前蛋白必須經(jīng)受的利用諸如電噴霧的流體電離技術(shù)的過程很有益處。第二個切割位點(diǎn)可用于釋放Sol基團(tuán)，離開連接到所有或者部分R以及所有或者部分L或者不含L的肽或蛋白。
任選地，一個或者多個L，R和Sol可進(jìn)行同位素標(biāo)記。
如上所述，B基團(tuán)可代替M基團(tuán)使用。因此，生物素或者其它一些親和性堿基可以代替磁性粒子使用。在這些情況下，可以利用，例如，鏈親和素-包被的磁性粒子俘獲標(biāo)記肽。在這種情況下，由R，L，Sol和B組成的增溶劑可以起到阻止氨基酸特異性試劑(R)跨過脂膜的轉(zhuǎn)移的作用。因此，該試劑可以有效用于選擇給脂膜外側(cè)呈現(xiàn)外貌的特異性膜內(nèi)蛋白，此外，在蛋白酶解和LCMS分析上游的其它樣品制備步驟過程中對這些蛋白進(jìn)行增溶。
也應(yīng)用由R，L和Sol組成的通用溶解試劑一般用于溶解膜結(jié)合蛋白。并不經(jīng)常需要固相俘獲。例如，多種液相色譜裝置可被用于分離膜來源的組分。
本發(fā)明的特征還在于含有具如下化學(xué)式標(biāo)記部分的試劑盒R-L-BR-L-MR，L，Sol和MR，L，Sol和B，以及R，L和Sol其中R包括一種以上四種詳述的反應(yīng)基(RS/T，RC，RL或RP)，L如上所述為連接基團(tuán)，B如上所述為能夠選擇性結(jié)合俘獲試劑的基團(tuán)；并且任選一種蛋白水解酶。在多個實(shí)施方案中，L或者R被同位素標(biāo)記(表示為L*或者R*)，RS含有式-CO-NH-NH2的結(jié)構(gòu)，以及整個標(biāo)記部分為生物素酰肼。
在其它實(shí)施方案中，試劑盒進(jìn)一步包括俘獲試劑，俘獲試劑含有結(jié)合到諸如乳膠粒子或者磁性粒子的固相支持物的親和素和鏈親和素；D-生物素，氧化劑(例如，偏高碘酸鈉)和能夠猝滅氧化試的試劑，以及特異性配比用于優(yōu)化涉及的反應(yīng)和分離的緩沖液。
在其它實(shí)施方案中，質(zhì)譜的分析包括確定至少一個釋放的修飾肽和/或至少一個釋放修飾肽的至少部分氨基酸序列的分子量，肽在和標(biāo)記部分反應(yīng)之前進(jìn)行化學(xué)處理。
本發(fā)明的方法是有用的，部分因?yàn)閺?fù)合肽混合物的分析非常困難并且耗時。由酶解或者其他方法從全細(xì)胞提取物，細(xì)胞器，蛋白復(fù)合物或者組織樣品產(chǎn)生的肽混合物可以包括異常多的肽。例如，全哺乳動物細(xì)胞裂解物的胰蛋白酶酶解產(chǎn)物可以含有1,000,000或者更多的肽。分析這樣混合物中每種肽的含量，雖然大大低于每種肽的身份識別，但依然是一個繁重的任務(wù)。嘗試鑒定肽所來源的蛋白進(jìn)一步提高了分析的復(fù)雜程度。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，在混合物中存在的給定蛋白可以基于一種或者少數(shù)幾種由蛋白質(zhì)降解所產(chǎn)生的肽而加以鑒定和定量分析。通過結(jié)合特異于該蛋白的抗體來鑒定蛋白的存在是生物學(xué)上普遍接受的應(yīng)用，即使抗體僅僅識別和結(jié)合所有蛋白結(jié)構(gòu)的很少部分。換言之，可以通過檢測較所有來自蛋白降解產(chǎn)生的肽少的樣品就可以鑒定一種蛋白。因此，通過分離混合物中存在的肽亞群以控制和可預(yù)測的方式降低肽混合物復(fù)雜性的方法可以大大利于產(chǎn)生肽混合物的蛋白的鑒定和/或定量分析。
分析之所以被促進(jìn)是因?yàn)橛糜跀?shù)據(jù)庫搜索鑒定混合物中存在肽(和肽來源的蛋白)所需要的時間和存儲大大減少。由本發(fā)明方法獲得的速度，簡化性以及分析可靠性的提高可得以實(shí)現(xiàn)，最多只損失少量信息。信息的損失可能發(fā)生，例如，因?yàn)樵谝恍┣闆r下，一些少量蛋白部分不能產(chǎn)生可被指定R基團(tuán)標(biāo)記的肽。因此，在一些條件下，少量蛋白不能被檢測到。但是通過進(jìn)行其它分析困難可被大大克服。例如，連接不同R基團(tuán)的標(biāo)記部分可用于其它分析。在利用RS/T標(biāo)記部分的情況下，原始混合蛋白樣品中的蛋白可以交替方式進(jìn)行降解，即從在第一種降解條件下不產(chǎn)生這些肽的蛋白中產(chǎn)生氨基末端絲氨酸肽和/或氨基末端蘇氨酸肽。這就強(qiáng)調(diào)了本發(fā)明所述方法的一個重點(diǎn)，也就是其依賴于蛋白中存在的序列信息，意味著用不同特異性的酶切割蛋白將產(chǎn)生一組可以接近正交于原始組的肽。來自二次分析的結(jié)果可以和初次分析的結(jié)果結(jié)合從而建立原始樣品中存在蛋白的完全分析。
本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在下列的詳細(xì)描述和權(quán)利要求中一目了然。
附圖簡述

圖1顯示了由胰蛋白酶降解線蟲(C.Elegans)所有蛋白質(zhì)組的生物信息模型產(chǎn)生的肽/蛋白的分布。
圖2顯示了由胰蛋白酶降解線蟲所有蛋白質(zhì)組的生物信息模型產(chǎn)生，隨后選擇含半胱氨酸肽的含半胱氨酸肽/蛋白的分布。
圖3顯示了由胰蛋白酶降解線蟲所有蛋白質(zhì)組的生物信息模型產(chǎn)生，隨后選擇氨基端絲氨酸和氨基端蘇氨酸肽的氨基端絲氨酸和氨基端蘇氨酸肽/蛋白的分布。
圖4顯示了生物素酰肼的結(jié)構(gòu)。
圖5A-5C顯示了各種M-L-R標(biāo)記部分。
圖6顯示了一個B-L-Sol-L-R標(biāo)記部分。
本發(fā)明的詳細(xì)描述利用本發(fā)明的方法，復(fù)合肽混合物可以通過分離肽進(jìn)行簡化，所述肽包括特定氨基酸(例如，具有氨基端絲氨酸的肽(“氨基端絲氨酸肽”)或者氨基端蘇氨酸的肽(“氨基端蘇氨酸肽”))。通過將肽和標(biāo)記部分反應(yīng)分離所述肽，所述標(biāo)記部分和目的肽反應(yīng)并且通過俘獲試劑的俘獲將它們標(biāo)記。標(biāo)記部分包括反應(yīng)基(R)，連接基團(tuán)(L)，和能夠選擇性結(jié)合到俘獲試劑的基團(tuán)(B)，或者代替B，對磁力有反應(yīng)的磁性基團(tuán)(M)。標(biāo)記肽的俘獲和分離方法是將它們與俘獲試劑(例如，結(jié)合到固體支持物上的俘獲試劑)接觸，其中標(biāo)記部分包括B基團(tuán)，或者用施加的磁力吸引標(biāo)記肽，其中標(biāo)記部分包括M基團(tuán)。依賴于使用的R基團(tuán)的類型，含有半胱氨酸的肽，含有賴氨酸的肽或者具有氨基端絲氨酸或者氨基端蘇氨酸的肽可以自混合物中存在的其它組分(例如，其它肽)分離。分離后，俘獲肽從俘獲試劑釋放并通過質(zhì)譜進(jìn)行分析。肽可通過選擇性切割標(biāo)記部分中的連接基團(tuán)或者破裂俘獲試劑和選擇性結(jié)合到俘獲試劑的基團(tuán)之間的相互作用而得以釋放。在很多情況下，釋放肽為修飾肽，因?yàn)樗鼈兛赡馨▉碜詷?biāo)記部分的組分，例如所有或者部分連接基團(tuán)(L)和/或所有或者部分反應(yīng)基(R)。在一些情況下也可以以基本上未修飾的形式釋放肽。
俘獲試劑可以為親和素或者鏈親和素或者修飾的親和素或者鏈親和素，標(biāo)記部分可以包括生物素或者修飾的生物素?；蛘撸@試劑可以為生物素或者修飾的生物素，而且標(biāo)記部分可以包括親和素或者鏈親和素或者修飾親和素或者鏈親和素。為了有助于將標(biāo)記肽和其它組分分離，俘獲試劑可以結(jié)合于，優(yōu)選共價結(jié)合于諸如玻璃珠，微量滴定板的微孔，磁性粒子等固相支持物上。因此，標(biāo)記肽可以利用親和素或者鏈親和素包被的磁性粒子進(jìn)行俘獲。
肽，例如氨基端絲氨酸和氨基端蘇氨酸肽可以通過切割蛋白或者蛋白混合物產(chǎn)生。切割可用酶解。例如，可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)利用胰蛋白酶降解蛋白或者蛋白混合物產(chǎn)生。
用于質(zhì)譜分析的氨基端絲氨酸和氨基端蘇氨酸肽的制備如下。含有蛋白混合物的樣品置于變性條件下。變性蛋白用胰蛋白酶降解。存在于氨基端絲氨酸肽和氨基端蘇氨酸肽的β-氨基醇部分通過向溶解于pH7磷酸緩沖液的肽混合物加入偏高碘酸鈉進(jìn)行選擇性氧化以制成40mM的高碘酸鹽溶液。在室溫黑暗條件下保溫5分鐘，通過加入乙二醇將多余的氧化劑猝滅。修飾肽通過直接向反應(yīng)混合物加入生物素酰肼并保溫30分鐘進(jìn)行生物素酰化。然后選擇性生物素酰化的肽被俘獲到單體鏈親和素包被的顆粒上。在沖走非修飾肽并用HPLC起始緩沖液清洗以后，通過用游離D-生物素置換從顆粒中洗脫肽。或者，含有可切割連接基團(tuán)的特定生物素-酰肼可用于生物素酰化步驟，可加入選擇性切割試劑以從顆粒釋放結(jié)合肽。可以摻入接頭的可切割基團(tuán)的例子包括二硫基(用TCEP切割)，或者鄰位二醇基(用偏高碘酸鈉切割)。一旦分離肽從顆粒中釋放，通過將樣品注射到液相色譜-質(zhì)譜儀(LC/MS)可以直接進(jìn)行分析。
前面描述的獲得簡化肽混合物的方法已經(jīng)利用半胱氨酸(cys)的活性巰基分離含有半胱氨酸肽。通過分離含有氨基端絲氨酸或者氨基端蘇氨酸的肽，本發(fā)明的方法可以更簡化，很少或者沒有蛋白損失數(shù)量的增加。通常，簡化性的提高以及部分序列信息的知識使得人們能夠進(jìn)行更限制性的數(shù)據(jù)庫搜索，并用更快的搜索產(chǎn)生更小的數(shù)據(jù)庫，不需要加強(qiáng)使用處理容量和存儲。另外，利用本發(fā)明的方法，每種分析肽的一部分是已知的(例如，已知存在氨基端絲氨酸或者蘇氨酸或者已知存在半胱氨酸或者已知存在賴氨酸)。這就限制了數(shù)據(jù)庫搜索，并有助于MS/MS裂解圖譜(fragmentation pattern)的解釋。此外，在氨基端修飾的肽的分析可以較內(nèi)部修飾肽的分析容易。本發(fā)明的方法降低了峰停駐(peak parking)的必要性，因此引起樣品通量的增加，因?yàn)楣蚕疵摲宓陌l(fā)生頻率減少。
本發(fā)明方法獲得的簡化可以通過檢查復(fù)合產(chǎn)自基因組的蛋白質(zhì)組進(jìn)行描述。圖1-3顯示了胰蛋白酶降解全線蟲蛋白質(zhì)組的生物信息分析結(jié)果。圖1顯示了由胰蛋白酶降解所有蛋白質(zhì)組產(chǎn)生的肽/蛋白的分布。圖2顯示了由胰蛋白酶降解所有蛋白質(zhì)組產(chǎn)生的含半胱氨酸肽/蛋白的分布。圖3顯示了由胰蛋白酶降解所有蛋白質(zhì)組產(chǎn)生的氨基端絲氨酸和氨基端蘇氨酸肽/蛋白的分布。這些計算結(jié)果提示通過選擇氨基端絲氨酸和氨基端蘇氨酸肽比選擇含半胱氨酸肽可以獲得更大程度的簡化。這些計算顯示用每種方法大約5％的蛋白質(zhì)組是不可檢測的(具有0個肽/蛋白的蛋白部分)。這些計算已經(jīng)去除了作為酶切結(jié)果含3個或者更少氨基酸的肽。
圖4顯示了生物素酰肼的結(jié)構(gòu)。這個化合物是B-L-RS/T標(biāo)記部分的一個例子。其包括一個含有生物素2的B基團(tuán)和L基團(tuán)4，以及含有酰肼基團(tuán)6的RS/T基團(tuán)。
圖5A-5C顯示了M，L和R的示例組合(即，M-L-R標(biāo)記部分)。圖5A顯示適合俘獲具有氨基端絲氨酸或者蘇氨酸的肽的標(biāo)記部分。標(biāo)記部分包括磁性粒子8，和含有一個二硫鍵切割位點(diǎn)12的L基團(tuán)10，以及含有酰肼基團(tuán)14的反應(yīng)基。圖5B顯示了適合俘獲具有半胱氨酸肽的標(biāo)記部分。標(biāo)記部分包括磁性粒子16，和含有一個二硫鍵切割位點(diǎn)20的L基團(tuán)18，以及含有馬來酰亞胺基團(tuán)22的反應(yīng)部分。圖5C顯示了適合俘獲具賴氨酸肽的標(biāo)記部分。標(biāo)記部分包括磁性粒子24，和含有一個二硫鍵切割位點(diǎn)28的L基團(tuán)26，以及包含琥珀酰亞胺基團(tuán)30的反應(yīng)部分。
標(biāo)記部分可被同位素標(biāo)記，例如通過用穩(wěn)定的同位素原子取代連接基團(tuán)或者反應(yīng)部分中的一個或者多個原子，例如一個或者多個氫原子可被氘取代，或者一個或者多個12C可被13C取代，或14N可被15N取代，或者將它們組合。當(dāng)使用同位素標(biāo)記的標(biāo)記部分時，釋放的修飾肽可進(jìn)行同位素標(biāo)記。當(dāng)兩種肽樣品和差示同位素標(biāo)記，但是化學(xué)上相同的標(biāo)記部分反應(yīng)時，有助于兩個樣品中肽相對含量的定量。這是因?yàn)閮煞N肽樣品的混合物，一種用“輕”形的標(biāo)記修飾，另一種用“重”形的標(biāo)記修飾，含有兩種化學(xué)上實(shí)體相同的輕形和重形。因此，這種方法已被用于定量分析含有半胱氨酸的肽(Gygi等人，(1999)Nature Biotech.17994；和PCT申請WO 00/11208)，而類似方法可被用于定量分析氨基端絲氨酸肽和氨基端蘇氨酸肽和含賴氨酸肽。
兩種不同肽樣品，例如一種來自與選擇化合物接觸的細(xì)胞的樣品，另一種來自與選擇化合物未接觸的細(xì)胞的樣品，可以利用本發(fā)明的標(biāo)記部分進(jìn)行差示同位素標(biāo)記。來自兩種樣品的分離的修飾差示同位素標(biāo)記肽可以混合在一起通過質(zhì)譜進(jìn)行分析。
圖6描述了一個B-LA-Sol-LB-R標(biāo)記部分的例子。這個標(biāo)記部分的R基團(tuán)為生物素32，LB基團(tuán)34為至少13長的鏈。包括甲氧基聚乙二醇(MPEG)的Sol基團(tuán)36通過酰胺鍵38在一端連接到LB基團(tuán)，而通過酰胺鍵40在另一端連接到標(biāo)記部分的剩余部分。MPEG的分子量可以為5,000道而頓或者高于5,000道而頓，并可以包括一個或者多個與L基團(tuán)和R基團(tuán)反應(yīng)的親核和親電基團(tuán)。Sol基團(tuán)36通過第二個連接區(qū)LA44連接到R基團(tuán)42上，所述LA44包括一個可容易切割的二硫鍵46。R基團(tuán)42為琥珀酰亞胺基團(tuán)，能夠選擇性和氨基反應(yīng)(例如，含有賴氨酸的肽)。
實(shí)施例根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法用胰蛋白酶(Promega，Inc)分別降解牛血清白蛋白(BSA；Sigma化學(xué)公司)和馬肌紅蛋白(Sigma化學(xué)公司)。降解產(chǎn)生的肽混合物用NaIO4處理。隨后通過加入乙二醇將多余的氧化劑猝滅。通過將肽混合物和生物素酰肼(Pierce化學(xué)公司；圖4)溫育30分鐘對修飾肽進(jìn)行選擇性生物素酰化。利用MPG鏈親和素包被的磁性粒子(CPG公司)俘獲生物素?；?。利用KingFisher自動磁性粒子加工機(jī)(Lab Systems公司)對樣品進(jìn)行加工。
利用Surveyor HPLC(ThermoFinnigan公司)分析樣品，設(shè)定成毫微級的流動操作，連接到毫微噴射源裝置的LCQDeca質(zhì)譜儀(ThermoFinnigan公司)。利用PicoFrit填充柱(Packed tip)(NewObjective)(75um內(nèi)徑，10cm長)進(jìn)行反相HPLC，標(biāo)準(zhǔn)反相梯度的流速為100nL/分鐘。
基于BSA的序列，胰蛋白酶降解可以產(chǎn)生六種蘇氨酸/絲氨酸氨基端肽?；隈R肌紅蛋白的序列，胰蛋白酶降解應(yīng)產(chǎn)生一種蘇氨酸/絲氨酸氨基端肽。BSA的六種預(yù)計的肽和肌紅蛋白的一種預(yù)計的肽是在俘獲部分觀察到的唯一肽。
所有本申請中引用的參考文獻(xiàn)，專利和公開專利申請的內(nèi)容此處全部引作參考。
其它實(shí)施方案可以聯(lián)合使用兩種或者多種具有不同R基團(tuán)的標(biāo)記部分。能夠選擇性和含有半胱氨酸的肽反應(yīng)的標(biāo)記部分可用于從目的樣品的一個部分中分離含半胱氨酸肽。能夠選擇性和氨基端絲氨酸和氨基端蘇氨酸肽反應(yīng)的標(biāo)記部分可用于從目的樣品的第二個部分中分離氨基端絲氨酸和氨基端蘇氨酸肽。利用兩種類型的標(biāo)記部分分離的修飾肽可以組合在一起并通過質(zhì)譜進(jìn)行分析，或者可以單獨(dú)分析，并將結(jié)果合并。如果可以利用相同俘獲試劑俘獲標(biāo)記部分，標(biāo)記肽(含半胱氨酸，氨基端絲氨酸，和氨基端蘇氨酸肽混合物)可以在單獨(dú)反應(yīng)中用俘獲試劑進(jìn)行俘獲。釋放的修飾肽混合物可通過質(zhì)譜進(jìn)行分析。差示同位素標(biāo)記的標(biāo)記部分可用于差示標(biāo)記在兩種或者多種不同樣品中的肽。釋放肽可通過除了質(zhì)譜以外的方法進(jìn)行分析。因此，本發(fā)明的多種標(biāo)記部分和方法可用于分離和純化用于任何目的的肽或者簡化復(fù)合混合物。
等同物只利用常規(guī)試驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到或者能夠確定很多本發(fā)明所述的特定實(shí)施方案的等同物。這些等同物包括在下列權(quán)利要求中。
權(quán)利要求
1.一種鑒定樣品中存在的至少一種肽的方法，所述方法包括(a)提供具有下式的標(biāo)記部分R-L-B其中，R為和帶有氨基端絲氨酸或氨基端蘇氨酸的肽反應(yīng)的反應(yīng)基，L為一個連接基團(tuán)；以及B為可以選擇性結(jié)合到俘獲試劑的基團(tuán)；(b)將樣品和標(biāo)記部分反應(yīng)以提供標(biāo)記肽；(c)將標(biāo)記肽和俘獲試劑接觸以提供俘獲的標(biāo)記肽；(d)從俘獲試劑釋放俘獲的標(biāo)記肽的至少部分肽以提供釋放的修飾肽；以及(e)通過質(zhì)譜分析釋放的修飾肽。
2.權(quán)利要求1的方法，其中R包括-CO-NH-NH2。
3.權(quán)利要求1的方法，其中B包括生物素。
4.權(quán)利要求1的方法，其中B包括d-亞氨基生物素。
5.權(quán)利要求3的方法，其中俘獲試劑包括親和素或者鏈親和素。
6.權(quán)利要求3的方法，其中釋放步驟包括將俘獲的標(biāo)記多肽與生物素接觸。
7.權(quán)利要求3的方法，其中俘獲試劑包括針對生物素的選擇性抗體。
8.權(quán)利要求1的方法，其中標(biāo)記部分為生物素酰肼。
9.權(quán)利要求1的方法，其中在樣品接觸標(biāo)記部分之前，將樣品與氧化劑接觸。
10.權(quán)利要求1的方法，其中L包括一個二硫基。
11.權(quán)利要求1的方法，其中L包括一個鄰位二醇基。
12.權(quán)利要求1的方法，其中L為同位素標(biāo)記。
13.權(quán)利要求1的方法，其中釋放的修飾肽在質(zhì)譜分析之前通過色譜分離。
14.權(quán)利要求1的方法，其中R為同位素標(biāo)記。
15.權(quán)利要求1的方法，其中質(zhì)譜分析包括鑒定至少一種肽。
16.權(quán)利要求1的方法，其中質(zhì)譜分析包括對至少一種肽進(jìn)行定量。
17.一種試劑盒，包括一種具有下式的標(biāo)記部分R-L-B其中R為和帶有氨基端絲氨酸或氨基端蘇氨酸的肽反應(yīng)的反應(yīng)基，L為一個連接基團(tuán)；以及B為可以選擇性結(jié)合俘獲試劑的基團(tuán)。
18.權(quán)利要求17的試劑盒，進(jìn)一步包括一種蛋白水解酶。
19.權(quán)利要求17的試劑盒，進(jìn)一步包括一種俘獲試劑。
20.權(quán)利要求17的試劑盒，其中R包括-CO-NH-NH2。
21.權(quán)利要求17的試劑盒，其中標(biāo)記部分為生物素酰肼。
22.權(quán)利要求21的試劑盒，進(jìn)一步包括含有結(jié)合到固相支持物上的親和素或者鏈親和素的俘獲試劑；和D-生物素。
23.權(quán)利要求22的試劑盒，進(jìn)一步包括一種氧化劑。
24.權(quán)利要求23的試劑盒，其中氧化試劑為偏高碘酸鈉，以及試劑盒進(jìn)一步包括能夠猝滅氧化劑的試劑。
25.權(quán)利要求17的試劑盒，其中L或者R為同位素標(biāo)記。
26.一種鑒定樣品中存在的至少一種肽的方法，所述方法包括(a)提供具有下式的標(biāo)記部分R-L-M其中，R為和包含選擇性氨基酸的肽反應(yīng)的反應(yīng)基，L為連接基團(tuán)，以及M為可被磁力吸引的磁性粒子；(b)將樣品和標(biāo)記部分反應(yīng)以提供標(biāo)記肽；(c)通過施加磁力吸引M以分離標(biāo)記肽；(d)從M基團(tuán)釋放俘獲的標(biāo)記肽的至少部分肽以提供釋放的修飾肽；以及(e)通過質(zhì)譜分析釋放的修飾肽。
27.權(quán)利要求26的方法，其中L為同位素標(biāo)記。
28.一種試劑盒，包括一種具有下式的標(biāo)記部分R-L-M其中，R為和包含選擇性氨基酸的肽反應(yīng)的反應(yīng)基，L為連接基團(tuán)，以及M為可被磁力吸引的磁性粒子。
29.權(quán)利要求28的試劑盒，其中R包括(a)一種氨基反應(yīng)部分，(b)-CO-NH-NH2，(c)一種巰基反應(yīng)部分，或者
30.權(quán)利要求28的試劑盒，其中L為同位素標(biāo)記。
31.權(quán)利要求28的試劑盒，其中R為同位素標(biāo)記。
32.一種鑒定樣品中存在的至少一種肽的方法，所述方法包括(a)提供具有如下組分的標(biāo)記部分R，L，Sol和M其中，R為和包含選擇性氨基酸的肽反應(yīng)的反應(yīng)基，L為連接基團(tuán)，Sol為親水聚合物，以及M為可被磁力吸引的磁性粒子；(b)將樣品和標(biāo)記部分反應(yīng)以提供標(biāo)記肽；(c)將標(biāo)記肽和可通過磁力結(jié)合到磁性粒子上的俘獲表面接觸以提供俘獲的標(biāo)記肽；(d)從俘獲表面釋放俘獲的標(biāo)記肽的至少部分肽以提供釋放的修飾肽；以及(e)通過質(zhì)譜分析釋放的修飾肽。
33.一種含有部分的試劑盒，包括一種具有式R-L-Sol-M、R-L-Sol-L-M或者R-Sol-L-M的標(biāo)記部分，其中R為和包含選擇性氨基酸的肽反應(yīng)的反應(yīng)基，L為連接基團(tuán)，Sol為親水聚合物，以及M為可被磁力吸引的磁性粒子；
34.權(quán)利要求33的試劑盒，其中R包括(a)一種氨基反應(yīng)部分，(b)一種巰基反應(yīng)部分，(c)-CO-NH-NH2，或者(d)一種酶底物或者諸如ATP，GTP，NAD，NADP，NADH，NADPH，泛素或者其結(jié)構(gòu)類似物的其它非共價分子識別元件。
35.權(quán)利要求33的試劑盒，其中R或者L為同位素標(biāo)記。
36.一種鑒定樣品中存在的至少一種肽的方法，所述方法包括(a)提供具有如下組分的標(biāo)記部分R，L，Sol和B其中，R為和包含選擇性氨基酸的肽反應(yīng)的反應(yīng)基，L為連接基團(tuán)，Sol為親水聚合物，以及B為可以選擇性結(jié)合俘獲試劑的基團(tuán)；(b)將樣品和標(biāo)記部分反應(yīng)以提供標(biāo)記肽；(c)將標(biāo)記肽和可通過磁力結(jié)合到磁性粒子上的俘獲表面接觸以提供俘獲的標(biāo)記肽；(d)從俘獲表面釋放俘獲的標(biāo)記肽的至少部分肽以提供釋放的修飾肽；以及(e)通過質(zhì)譜分析釋放的修飾肽以鑒定樣品中存在的至少一種肽。
37.一種含有部分的試劑盒，包括一種具有式R-L-Sol-B或者R-Sol-L-B的標(biāo)記部分，其中，R為和包含選擇性氨基酸的肽反應(yīng)的反應(yīng)基，L為連接基團(tuán)，Sol為親水聚合物，以及B為可以選擇性結(jié)合到俘獲試劑的基團(tuán)。
38.權(quán)利要求37的試劑盒，其中R包括(a)一種氨基反應(yīng)部分，(b)一種巰基反應(yīng)部分，(c)-CO-NH-NH2，或者(d)一種酶底物或者諸如ATP，GTP，NAD，NADP，NADH，NADPH，泛素或者其結(jié)構(gòu)類似物的其它非共價分子識別元件。
39.權(quán)利要求37的試劑盒，其中R或者L為同位素標(biāo)記。
40.一種含有部分的試劑盒，包括一種具有式R-L-Sol的標(biāo)記部分，其中，R為和包含選擇性氨基酸的肽反應(yīng)的反應(yīng)基，L為連接基團(tuán)，以及Sol為親水聚合物。
41.權(quán)利要求40的試劑盒，其中R包括(a)一種氨基反應(yīng)部分，(b)一種巰基反應(yīng)部分，(c)-CO-NH-NH2，或者(d)一種酶底物或者諸如ATP，GTP，NAD，NADP，NADH，NADPH，泛素或者其結(jié)構(gòu)類似物的其它非共價分子識別元件。
42.權(quán)利要求37的試劑盒，其中R或者L為同位素標(biāo)記。
43.一種用于分析樣品中存在的部分多肽的方法，所述方法包括(a)提供具有下式的標(biāo)記部分R-L-M其中，R為和包含選擇性氨基酸的多肽反應(yīng)的反應(yīng)基，L為連接基團(tuán)，以及M為可被磁力吸引的磁性粒子；(b)將樣品和標(biāo)記部分反應(yīng)以提供標(biāo)記多肽；(c)通過施加磁力吸引M以分離標(biāo)記多肽從而提供分離的標(biāo)記多肽；(d)酶解分離的標(biāo)記多肽以提供分離的標(biāo)記多肽片段；(e)從M基團(tuán)釋放分離的標(biāo)記多肽片段的至少部分多肽片段以提供釋放的修飾多肽片段；以及(f)通過質(zhì)譜分析釋放的修飾多肽片段。
44.一種分析樣品中存在部分多肽的方法，所述方法包括(a)提供具有下式的標(biāo)記部分R-L-M，其中，R為和包含選擇性氨基酸的多肽反應(yīng)的反應(yīng)基，L為連接基團(tuán)，以及M為可被磁力吸引的磁性粒子；(b)將樣品和標(biāo)記部分反應(yīng)以提供標(biāo)記多肽；(c)降解標(biāo)記多肽以提供標(biāo)記多肽片段；(d)通過施加磁力吸引M以分離標(biāo)記多肽片段從而提供分離的標(biāo)記多肽片段；(e)從M基團(tuán)釋放分離的標(biāo)記多肽片段的至少部分多肽片段以提供釋放的修飾多肽片段；以及(f)通過質(zhì)譜分析釋放的修飾多肽片段。
45.一種分析樣品中存在的部分多肽的方法，所述方法包括(a)提供具有下式的標(biāo)記部分R-L-B其中，R為和包含選擇性氨基酸的多肽反應(yīng)的反應(yīng)基，L為連接基團(tuán)，以及B為可以選擇性結(jié)合到俘獲試劑的基團(tuán)；(b)將樣品和標(biāo)記部分反應(yīng)以提供標(biāo)記多肽；(c)將標(biāo)記多肽片段和俘獲試劑接觸以提供俘獲的標(biāo)記多肽；(d)降解俘獲的標(biāo)記多肽以提供俘獲的標(biāo)記多肽片段；(e)從B基團(tuán)釋放俘獲的標(biāo)記多肽片段的至少部分多肽以提供釋放的修飾多肽片段；以及(f)通過質(zhì)譜分析釋放的修飾多肽片段。
46.一種分析樣品中存在的部分多肽的方法，所述方法包括(a)提供具有下式的標(biāo)記部分R-L-B，其中，R為和包含選擇性氨基酸的多肽反應(yīng)的反應(yīng)基，L為連接基團(tuán)，以及B為可以選擇性結(jié)合到俘獲試劑的基團(tuán)；(b)將樣品和標(biāo)記部分反應(yīng)以提供標(biāo)記多肽；(c)降解標(biāo)記多肽以提供標(biāo)記多肽片段；(d)將標(biāo)記多肽片段和俘獲試劑接觸以提供俘獲的標(biāo)記多肽片段；(e)從B基團(tuán)釋放俘獲的標(biāo)記多肽片段的至少部分多肽片段以提供釋放的修飾多肽片段；以及(f)通過質(zhì)譜分析釋放的修飾多肽片段。
47.權(quán)利要求43-46任一項(xiàng)的方法，其中L為同位素標(biāo)記。
48.權(quán)利要求43-46任一項(xiàng)的方法，其中R為同位素標(biāo)記。
全文摘要
本發(fā)明公開了從含有多種肽的樣品中獲得簡化肽混合物的方法和試劑。簡化樣品比原來的肽樣品更容易分析，而且簡化樣品代表了混合蛋白樣品中存在的全部或者接近全部的蛋白，原來的和更復(fù)雜的肽樣品來自所述混合蛋白樣品。本發(fā)明方法需要使用包括氨基酸特異性反應(yīng)基(R)的標(biāo)記部分。標(biāo)記部分在特異氨基酸位點(diǎn)“標(biāo)記”肽或者蛋白(例如，通過和一個氨基酸反應(yīng)形成共價鍵)，最終能夠分離含有這些特異氨基酸的肽。其它方法需要使用反應(yīng)部分(R
文檔編號G01N33/532GK1516741SQ02810202
公開日2004年7月28日 申請日期2002年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月3日
發(fā)明者克里斯多佛·貝克, 克里斯多佛 貝克 申請人:塞莫費(fèi)尼根股份有限公司