專利名稱：檢測多個生物分子的點陣及其使用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測生物分子的方法，特別是一種通過固定在第一個支持體上的抗體點陣與固定在第二個支持體上的蛋白樣品相接觸，抗體將離開第一個支持體而與第二個支持體上的蛋白樣品相結合，從而對多個蛋白進行檢測的方法。這個方法可廣泛用于檢測多個蛋白的表達，活化和功能。
背景技術：
科學技術的飛速發(fā)展，推動了生命科學研究、生物技術研究、藥物開發(fā)和研究等領域的進展。因此，提供一個能夠檢測作為生命基礎的蛋白質的有效方法就變得越來越重要。
目前大量生物試劑的出現(xiàn)，例如成千上萬個DNA克隆序列，眾多抗體和重組蛋白，數(shù)百萬個通過化學合成的分子，推動了在生物研究，臨床診斷和藥物開發(fā)方面利用這些試劑的技術的發(fā)展。特殊生物試劑點陣已經(jīng)出現(xiàn)，在這些點陣中，每個試劑被放在預先指定的位置上以便以后能通過這個位置來識別它。例如，在一個DNA點陣中(也被稱為基因芯片)，大量cDNA或寡核甘酸被固定，每一個被放在各自預先指定的位置，以便通過那個位置來識別每一個cDNA或寡核甘酸。DNA點陣被用在雜交試驗中，來監(jiān)測大量基因的表達(Schena et al。，1995；Science 270467-470；DeRisi et al。，1996，NatureGenetics 14457-460)。編碼蛋白的DNA可放在表達載體中，由這些DNA克隆制成的點陣可被用來在哺乳細胞中表達它們編碼的蛋白(Ziauddin andSabatini，2001，Nature 411，107-110)。
在一個蛋白點陣(或蛋白芯片)中，許多蛋白被固定在一個支持體上。每一個蛋白被放在一個預先指定的位置上以便能通過這個特定的位置將其識別。有兩種類型的蛋白點陣特別有用抗體點陣和重組蛋白點陣，它們分別包括大量不同的抗體和重組蛋白。因為抗體點陣能夠與細胞中表達的蛋白結合，它們在監(jiān)視蛋白的體內活性方面極有用處。利用抗體點陣技術，可以在一次實驗中研究細胞中多種蛋白的性質。具體來講，抗體點陣已被應用在研究體內蛋白與蛋白相互作用，蛋白翻譯后修飾，以及蛋白表達中(美國專利6197599)。
另外，細胞，組織，脂類分子，多肽，藥物或其他化學物質組成的點陣能夠用在醫(yī)療診斷，藥物開發(fā)，分子生物學，免疫和毒理學等方面進行大規(guī)模的篩選檢測實驗中(Kononen，et al。，Nature medicine，4844-7，1998)。
蛋白是細胞的重要組成部分，在多種細胞活動過程中發(fā)揮作用；它們還是許多藥物的作用靶點。整個人類基因組大約編碼4萬個蛋白。盡管一個細胞可能含有編碼所有蛋白的DNA，但它一般僅表達其中的一部分。一個細胞株大約表達1萬個蛋白，一個組織可表達更高數(shù)目的蛋白。細胞中的蛋白表達種類及數(shù)量決定它的形狀和功能，異常的蛋白表達會引起疾病。因此蛋白組學研究的一個主要任務就是檢測一個特定生物樣品中蛋白的表達模式。
由于翻譯后修飾，一種蛋白(有特定的氨基酸一級序列)在細胞中可能以不同的形式出現(xiàn)，從而產(chǎn)生更大數(shù)量的不同蛋白。由于在許多情況下，某些特殊形式的蛋白直接參與細胞的某種特定活動，所以，通過檢測在細胞中出現(xiàn)的這些特殊形式的蛋白，可以為了解細胞的活性和功能提供有價值的信息。
蛋白有很多種不同的翻譯后修飾，如磷酸化，糖基化和泛昆化。絲氨酸，蛋氨酸或酪氨酸殘基的磷酸化在信號傳導上是一個重要的機制。異常的蛋白磷酸化會導致許多人類疾病。
在檢測蛋白磷酸化的方法中，放射性同位素代謝標記和用特異抗體去免疫檢測磷酸化蛋白是最常用的方法。然而這些方法每次只適合于檢測一種或幾種蛋白。盡管抗磷酸化殘基的特異性抗體，例如PY20，4G10，能夠用來展示多個磷酸化蛋白，但是，這些抗體單獨卻不能告訴是哪一個蛋白被磷酸化。所以在信號傳導研究和臨床診斷方面，急需一種新的、能夠同時檢測多個被磷酸化或被其他修飾的蛋白的方法。
定量蛋白表達在多個領域都有應用，包括生物醫(yī)學的研究，疾病診斷，尋找治療指標和藥物靶點，以及在毒理和藥效反映分析方面。在基礎生物醫(yī)學研究方面，經(jīng)常希望知道哪些蛋白在特殊的細胞或特殊條件下表達。通過比較不同類型細胞的蛋白表達，就可能鑒別那些蛋白，它們的表達和活性決定一個細胞的特殊類型。在許多信號傳導通道中，一些蛋白被特異性地激活；檢測這些被激活蛋白，例如磷酸化蛋白，可為了解信號傳導通道的原理提供關鍵的信息。
許多疾病會改變蛋白的表達模式，反過來，在許多情況下，異常的蛋白表達可以引發(fā)疾病。因此，確定蛋白的表達模式以及對比正常和異常細胞的蛋白表達模式，對于了解疾病的機理具有極其重要的意義。
檢測蛋白的表達也能在臨床診斷上發(fā)揮作用。例如，在一個血樣中，同時對幾個病毒蛋白進行檢查，能夠更加有效準確地診斷病毒感染。剖析蛋白表達對于區(qū)分正常細胞，早期癌細胞，惡性癌細胞，轉移癌細胞(真正的致命癌細胞)具有非常重要的價值。
另外，檢測蛋白表達在藥物開發(fā)領域，例如藥物作用靶點的選擇，毒理學及尋找藥物反應的指標方面也是非常有用的。
尋找一個可以準確定量生物樣品中每一個蛋白的表達水平、以及每一個蛋白的不同存在形式的方法，一直是分子生物學者重要研究目標。事實證明，要找到這樣的方法是極其困難的。傳統(tǒng)上，一個或小數(shù)量蛋白的表達可以通過Western印跡法和酶聯(lián)免疫反應(ELISA)等免疫方法來檢測。
盡管二維凝膠電泳可以用來分析一個樣品中蛋白的表達，但其程序復雜。而且必須要去確認展示在二維凝膠電泳上的蛋白，這對許多蛋白來說是很難做到的。最近，蛋白點陣技術也被用于研究蛋白的表達。在這種方法中(美國專利6197599，Haab et al.，Genome Biol.2，research0004-0004.13，2001年)，一個抗體點陣與一個蛋白樣品結合，然后與點陣上抗體特異結合的蛋白隨之被檢測出來。
免疫化學染色是一種常用的生物學技術，可以用來確定一個抗原在細胞中的表達和定位(Harlow and Lane，Antibodies，a laboratory manual，Cold Springharbor Press，1988)，這些信息對于生物醫(yī)學研究和臨床醫(yī)學具有極高的價值。現(xiàn)有的許多方法，都是用一個抗體溶液去對細胞進行染色，并一次僅允許用一個或幾個抗體進行細胞染色。這些方法無法滿足大規(guī)模測定不同蛋白的表達和細胞內定位的需要。因此，需要一個能夠用大量不同抗體同時進行細胞染色的新方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題之一，是要描述一種新型生物試劑點陣，一方面可維持試劑在點陣支持體上的位置；另一方面，當試劑與固定在另一個支持體上的分子結合后，可離開點陣支持體。
本發(fā)明要解決的技術問題之二，是要描述制作生物試劑點陣的方法。特別要介紹如何使用不同的支持體材料和固定方法來制作點陣。
本發(fā)明要解決的技術問題之三，就是要介紹如何使用改進的生物試劑點陣來檢測生物分子及其性質，尤其是檢測和對比細胞中蛋白質的表達及其在細胞內的位置。
本發(fā)明提供了在檢測蛋白及其它生物分子領域中使用生物點陣技術的方法。一種方法的一個重要特征是，當固定在第一個固相支持體上的抗體點陣與固定在第二個支持體上的蛋白樣品相接觸時，抗體能夠與抗原特異性相結合，結合之后，當?shù)谝粋€支持體與固定在第二個支持體上的蛋白樣品分開時，抗體能夠保持與第二個支持體上的抗原的結合而與第一個支持體分開。
在一個具體應用中，蛋白樣品可以是固定的細胞。因此，這個發(fā)明提供了一種使用具有大量不同抗體的點陣去染色細胞的方法，每一個抗體在一個預先確定的位置上可以對一部分細胞進行染色。在此方法中，首先按特定順序將抗體固定在一個支持體上形成抗體點陣；然后這個抗體點陣與細胞相接觸，從而允許抗體與它們相應的抗原結合。因此在細胞中多個蛋白的表達和位置能被檢測出來。
在另一種情況下，在把蛋白樣品固定在支持體之前，可根據(jù)分子量和(或)等電點首先將生物樣品中的蛋白質分離，然后把分離好的蛋白質轉移到一個固相支持體上，再與抗體點陣接觸，從而使抗體與其對應的抗原相結合。將點陣支持體同蛋白樣品分離后，抗體仍保持與抗原的結合。之后，與抗原結合的抗體被檢測出來。
這個發(fā)明提供了在固相支持體上固定生物試劑的方法，這個方法特別適合于檢測蛋白。這個方法的主要特征是，每個試劑都被固定在支持體上，但是在某種條件下試劑可從支持體上脫離。在一個具體實例中，充填有生物試劑的毛細管被按著指定的順序捆綁在一起，以便每一個具有特殊試劑的毛細管都能夠通過指定的位置而識別。在某些應用中，可將毛細管束進一步切割以制成合適高度的生物試劑點陣。
檢測多個蛋白的方法，其特征是允許固定的抗體與抗原結合，尤其是所用的抗體點陣能夠使多個抗體與固定在另一支持體上的對應的抗原相結合；每一個抗體與抗原的結合發(fā)生在預先指定的位置。
具體做法是使固定在第一個支持體上的抗體點陣與固定在第二個支持體上的蛋白樣品相接觸，使一些或所有的抗體離開第一個支持體點陣而與第二個支持體上的蛋白樣品相結合。
“點陣”這個術語在這里指的是由一個固相支持體和至少一個生物試劑組成的一個裝置，每個生物試劑被固定在支持體上特定的位置以便能通過這一特定位置來識別它。例如，“抗體點陣”在這里指的是由一個固相支持體和至少一個抗體組成的一個裝置，抗體被固定在支持體上特定的位置以便每一個抗體能通過其特定位置來識別。
“生物試劑”這個術語用在這里指任何感興趣的分子，可以是抗體，重組蛋白，純化的蛋白，合成的酞鏈，其它蛋白質，核酸，脫氧核酸，寡核苷酸，糖類，脂類，小分子化合物，以及它們的溶液或混合物?！霸噭本哂邢嗤暮?。
“固定”這個術語用在這里出于便于描述本發(fā)明和專利權利要求的需要，指的是限制試劑或其它分子在一個支持體上的運動。例如，當一個抗體被固定在一個支持體上時，它就被粘接在支持體上而在一般情況下不會與支持體分離，同時，抗體在支持體上的活動也受到限制。然而，在某些條件下，象發(fā)明中所描述的，一個被固定的試劑能夠與支持體分離。固定方法的物理和化學性質決定一個被固定的試劑是否能夠從支持體上分離及這種分離的效率如何。
“支持體”這個術語用在這里出于便于描述和專利權利要求的需要指的是將生物試劑或分子放置和固定在上面的結構。具體而言，這個支持體可能是硬質材料如硬玻璃或塑料制成的硬片，也可能是由硝酸纖維，尼龍或聚丙烯酰胺等材料制成的膜。膜使用起來方便操作，并且易于將試劑固定在上面。玻璃或塑料制成的硬片能提供堅固的支持，因此在某些特殊的應用中也是不可缺少的。
支持體最好被預先處理，以便能夠將生物試劑以適當?shù)膹姸裙潭ㄔ谏厦?。一種處理方法是在固體支持體上涂上一層多聚體化合物，這些多聚體化合物可通過非特異的非共價鍵與生物試劑發(fā)生相互作用。例如，可以用在載玻片或蓋玻片上涂抹多聚體化合物如polylysine或polyethyleneimine的方法固定生物分子。
將多種試劑放置和固定在固相支持體上的幾個技術，如Lehrach等(Hybridization fingerprinting in genome mapping and sequencing，genomeanalysis，Voll，Davies and Tilgham，Eds，Cold Spring Harbor Press，pp.39-81，1990)及Brown等(美國專利5807522)所描述過的一些方法，使用機械點樣機每次可將一種或幾種試劑放在一個玻璃載玻片上。采用這些方法，可在一個平的固相支持體上，放置大量不同試劑而形成生物試劑點陣，每一個試劑放置在一個預先確定的位置。
可將至少1個不同的生物試劑固定在一個支持體上，每一個生物試劑都被固定在一個或多個預先確定的位置上。也可將5到100000個不同的生物試劑固定在一個支持體上，每一個生物試劑都被固定在一個或多個預先確定的位置上?；蛘邔?0到100000個不同的生物試劑固定在一個支持體上，每一個生物試劑都被固定在一個或多個預先確定的位置上。或者將至少100個不同的生物試劑固定在一個支持體上，每一個生物試劑都被固定在一個或多個預先確定的位置上。
抗體和其它生物試劑能通過吸附作用而固定(Trevan，1980，ImmobilizedEnzymesan introduction and their application in biotechnology.Wiley，Chichester)。吸附力可以是非特異的，疏水或離子間相互作用。典型的吸附材料包括粘土，木炭，羥磷灰石，以及許多離子交換材料例如DEAE-交聯(lián)葡萄糖。
包埋(entrapment)是另一種固定抗體和其它生物試劑的方法(Trevan，1980，Immobilized Enzemesan introduction and their application inbiotechnology.Wiley，Chichester)。理論上，被包埋的抗體并沒有與介質結合；僅僅是它們的自由擴散受到限制。一個經(jīng)常使用的介質是多聚酰胺凝膠。在一個具體例子中，毛細管可用來固定生物試劑和制作點陣?！懊毠堋边@個術語指密封的細長結構，能夠用來支持和固定生物試劑。毛細管由塑料或玻璃等材料制成，這些材料不影響生物試劑的性質。毛細管的高度是可以變化的，理論上可從幾微米到幾米。生物試劑通常以液體狀態(tài)充填在毛細管里。填充后， 液體凝固從而使生物試劑固定。固定的強度可隨不同應用而變化。
生物試劑可被直接或者間接地固定在固相支持體上。試劑可以高密度地被直接固定在支持體上，如顯微鏡載玻片上。相類似的技術已被用來制備高密度的DNA芯片(Shalon et al.，Genome Reserch，1996 Jul；6(7)639-645)。試劑也能被間接地固定在支持體上。例如，可以首先將一個中間物，如蛋白A或蛋白G以及它們的突變體固定在支持體上，然后抗體可通過與蛋白A或蛋白G的相互作用而被固定在支持體上。這一方法的優(yōu)點是抗體僅通過恒定區(qū)同蛋白A或G相作用，抗體的可變區(qū)(抗原結合區(qū))則可完全用來與抗原作用。另外一個優(yōu)點是，由于蛋白A或蛋白G與抗體的結合位點可以改變，當使用改變的蛋白A或G時，抗體能以適當?shù)膹姸裙潭ㄔ谥С煮w上。這樣，一方面抗體能夠固定在支持體上從而保持各自位點，另一方面，抗體能夠離開支持體并與具有更高親和力的抗原結合。重組蛋白能通過其特異序列和固定在支持體上的與此特異序列相作用的中間物相結合而被固定。例如，中間物(如谷胱甘肽或鎳)能首先被共價鍵或非共價鍵固定在支持體上，然后帶有特異序列(如GST或6xHis)的重組蛋白通過與中間物的相互作用而被固定在相同的支持體上。通過修飾特異序列和中間物，改變它們之間的親和力，從而以適當?shù)膹姸葘⒅亟M蛋白固定。
雖然抗體經(jīng)常以圓點的形狀放在支持體上，它們也能以其他形狀被放在支持體上。例如，抗體能以長方形的形狀被點在支持體上，(如0.1到10厘米寬，1到50厘米長)。這樣固定而制成的抗體點陣可用來與按分子量分離后的抗原相結合。
一個抗體一般要被固定在支持體上一個特殊位置上。一般來說，要保證當抗體點陣與蛋白樣品相接觸時，每個抗體都能與其抗原相結合。因此，每一個抗體被固定的位置是由抗原的位置來決定的。例如，如果抗原被通過二維凝膠電泳首先分離然后轉移和固定在一個支持體上，那么每一個抗原就被固定在一個由它的分子量和等電點所決定的特殊位置。為了使每一個抗體能與其抗原接觸，抗體需按照抗原在支持體上的位置而被固定在另一個支持體上。
在本發(fā)明中，生物試劑點陣用來檢測生物樣品中的生物分子，如蛋白樣品中的蛋白質等?！暗鞍讟悠贰边@個術語指的是來自某些來源的蛋白混合物。例如，它既可以是細胞系或組織的裂解液，也可以是完整的細胞或固定在支持體上的細胞。蛋白樣品可以有不同的來源可來自培養(yǎng)的細胞系，也可來自于人或動物組織，或來自于血樣。
在一種情況下，培養(yǎng)的細胞或動物組織樣品被放在載玻片上。用之前，細胞被處理以固定并且暴露蛋白。被固定的細胞能維持一定的細胞形態(tài)，同時蛋白停留在它們原來的細胞位置。有多種固定和滲透細胞組織的方法(Harlow and Lane，Antibodies，a laboratory manual，Cold Spring harborPress，1988)。通常使用的固定溶液是福爾馬林或戊二醛溶液，此外還有一種常用的固定溶液含有甲醇。懸浮細胞，如淋巴細胞可通過離心沉降并固定在支持體上。細胞也可包埋在介質(如石蠟，膠原，明膠)中，然后用組織切片機做成切片放在支持體上。用來制備細胞樣品的技術有很多(Jones，T.C，Ward，J.M.，Mohr，U.and Hunt，R.D.(editors)，1990，Hemopoietic System.Berlin，Springer-Verlag；Polak，J.M.and Van Noorden，S.，1997，Introductionto Immunocytochemistry.New York，Springer)。
在另一情況下，蛋白樣品可通過裂解細胞或組織來制備。一種典型的裂解緩沖液包括去污劑如十二烷基硫酸鈉(SDS)，Triton X-100，等。然后蛋白可均勻地放在支持體上并且固定。有很多已知的固定方法可以利用，如通過共價或非共價鍵來固定。固定在支持體上的蛋白樣品的面積大小，可以根據(jù)應用和被固定蛋白樣品的體積和數(shù)量而決定。例如，當用一個膜做支持體時，如果每平方厘米膜可結合10毫克蛋白質，那么，10毫克蛋白就能被固定在1平方厘米大小的膜上。
在許多應用中，可先將生物分子，如蛋白等分離然后再固定在支持體上。有許多已知的蛋白分離方法可以利用。例如，蛋白能根據(jù)分子量通過SDS/PAGE被分離；或根據(jù)分子量和等電點通過二維凝膠電泳來分離。經(jīng)過電泳分離之后，蛋白能被轉移和固定在支持體上。
在另一些情況下，蛋白可通過免疫學方法而被分離，例如通過抗體點陣將蛋白樣品中的各種蛋白分離。做法是，首先將蛋白樣品同第一個固相支持體上的抗體點陣混合，從而可使抗體捕捉并分離蛋白樣品中的抗原。清洗掉非結合的蛋白后，在每一個位點捕捉到的蛋白能夠同抗體分離并被轉移到另一個支持體上并固定。因為抗體和固相支持體之間的相互作用可比抗體和抗原之間的相互作用強得多，所以能夠找到一些條件去打斷抗體和抗原相互作用，同時不影響抗體與第一個支持體的作用。在這種條件下，抗原而不是抗體能被轉移到另一個支持體上并且固定在上面。為了避免抗體同第一個固相支持體分離，可將抗體共價鍵地固定在支持體上。
在一個典型的轉移過程中，帶有抗體和與之相互作用的蛋白的支持體與另一個支持體相接觸，然后它們被放在一個緩沖溶液中以打斷抗體和抗原的相互作用。同時，可以施加電流或其它條件以便分離的蛋白能夠從第一個支持體上轉移到第二個支持體上。完成之后這兩個支持體被分離。蛋白的轉移和固定可以同時進行或分開進行。即蛋白質首先被轉移，然后被固定。蛋白質也可被同時轉移和固定。如果固定并不是象所希望的那樣牢固，可將蛋白質進一步固定，例如通過共價鍵。將蛋白質共價固定在固相支持體上的方法有很多。
然后可以用這樣準備的蛋白樣品與另外一個抗體點陣相結合。這種結合可以這樣進行每個抗體能與它對應的抗原相接觸而特異地結合。在這一點陣上的抗體能與支持體相分離。因此，當將新的抗體點陣支持體與蛋白樣品支持體分離之后，與抗原結合的抗體將轉移到樣品支持體上。通過檢測樣品支持體上的抗體，樣品中的抗原及其數(shù)量能被檢測出來。
在某些條件下，蛋白樣品被牢固地固定，例如，經(jīng)過共價鍵固定在支持體，如載玻片上。將蛋白共價固定在支持體上的方法有很多。
本發(fā)明提供的方法可使被固定在一個支持體上的抗體能夠與固定在另一個支持體上的抗原相結合。具體來說，當將兩個支持體放在一起時，固定在第一個支持體上的抗體與固定在第二個支持體上的抗原發(fā)生作用相結合。結合一定的時間后，兩個支持體被分開。一些抗體由于與抗原的相互作用，將從第一個支持體上分離而結合到固定有抗原的第二個支持體上。第一個支持體上抗體的固定強度需要比抗體和抗原之間的相互作用更弱，也要比抗原在另一個支持體上的固定要弱。特定條件，如電場，特殊溶液，能促進抗體與其支持體的分離。
在這種方法中，當抗原和抗體結合之后，可通過共價交聯(lián)方法使抗原抗體復合物更穩(wěn)定。較好的共價交聯(lián)的方法是使抗體與抗原被交聯(lián)但支持物與抗體不進行交聯(lián)。這可以通過選擇特異的交聯(lián)化合物和特殊的支持體材料來實現(xiàn)。多種帶有不同功能團的化合物可用來交聯(lián)抗體和抗原(Wong，Shan S.，Chemistry of protein conjugation and cross-linking.Boca RatonCRC Press，1993)。很常用的交聯(lián)劑有醛類，如甲醛和戊二醛等。
之后，與抗原結合的抗體能被檢測出來。用來檢測抗體的方法有很多。一個通常使用的方法就是使用酶聯(lián)二抗，例如辣根過氧化酶(horseradishperoxidase)偶聯(lián)的羊抗兔和羊抗鼠的抗體。也可使用熒光標記的二抗。其他技術包括免疫PCR(Sano et al.，1992，Science 258，120-122)，循環(huán)DNA擴增技術(Schweitzer et al.，2000，Proc.natl.Acad.Sci。USA 97，10113-10119)，經(jīng)T7 RNA聚合酶擴增的免疫檢測技術(Zhang etal.，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.98，5497-5502)等。
本發(fā)明一個主要的應用是利用抗體點陣來染色細胞。在這一應用中，抗體被固定在第一個支持體上，需要染色的細胞被固定在第二個支持體上。細胞放在蓋玻片上，培養(yǎng)直到長到合適狀態(tài)。下一步就是固定和滲透細胞以暴露抗原。細胞可在-20度甲醇/丙酮溶液中放置10分鐘而被固定和滲透。這樣處理的細胞與一個抗體點陣接觸使得抗體與它們對應的抗原相結合。隨后，抗體點陣支持體和細胞支持體被分開。由于與抗原的相互作用一些抗體將被轉移到細胞支持體上。
通過檢測細胞支持體上所結合的抗體種類和數(shù)量，可以檢測細胞中表達的抗原的種類和數(shù)量。如果抗體是與酶分子共價連接的，它們可以通過酶反應而被檢測出來。例如，堿性磷酸酶是一個經(jīng)常被使用的酶。它的催化反應可產(chǎn)生不溶的彩色物質。如果用的是熒光分子標記的抗體，那么它們能夠通過熒光顯微鏡直接觀察到。在更多情況下，可以利用熒光或者酶聯(lián)二抗來揭示一抗。為了揭示抗原的表達和定量，可以在低倍顯微鏡下對染色進行觀察。然而，為了揭示抗原的其他性質，例如它們在細胞內的位點，則通常需在高倍鏡下觀察。采用這種方法時，在一個細胞染色實驗中，可以應用1到100000個不同的抗體，也可以是至少5個不同的抗體，還可以是10到100000個不同的抗體，或者是至少100個不同的抗體。
在研究兩個相關蛋白的功能方面，雙染色方法非常有效。比如，兩個蛋白相作用的證據(jù)之一就是兩個蛋白在細胞中表達在同一位置上。在本發(fā)明中，可將兩個或更多的抗體固定在一個支持體上的同一位置，從而在同一位置上同時檢測出兩個或更多個抗原。
在本發(fā)明中，如果用來做點陣的是DNA探針而不是抗體，那么就可以用這種方法來檢測細胞中表達的特異的DNA或RNA靶序列?？梢詫NA探針以特殊的方式固定在一個支持體上，使得每一個探針在支持體上保持特定位置。但是探針的固定最好比探針與靶序列之間的作用要弱。這樣，當探針與靶序列結合后，就可以從支持體上脫離。用這種方法制成的DNA探針點陣可用來同時檢測大量不同的DNA或RNA靶序列。這要比當前原位雜交方法有許多優(yōu)點。準備DNA或RNA探針并把它們點到支持體并固定其上的方法有很多，如在下列文獻中所描述的方法，(Ian A。Darby(Editor)，In SituHybridization Protocols(Methods in Molecular Biology，123)，by Humana Press；ISBN0896036863；2nd edition，2000)。
在本發(fā)明中，抗體點陣可用來檢測蛋白裂解液中的蛋白。具體方法是，固定在第一個支持體上的抗體點陣與固定在第二支持體上的蛋白裂解液接觸。一段時間之后，抗體將與固定在第二個支持體上的蛋白裂解液中的對應抗原相結合，然后第一個支持體與第二個支持體分離。在適當條件下，與抗原連接的抗體將從第一個支持體上分離而轉移到第二個支持體上。被轉移到第二個支持體上的抗體的數(shù)量與蛋白樣品中抗原的數(shù)量是成比例的。因此可以通過檢測第二個支持體上抗體的數(shù)量而得知蛋白樣品中抗原的數(shù)量。
在許多應用中，蛋白需首先被分離和/或濃縮，這對于檢測表達量低的蛋白尤為重要。具體來說，蛋白首先通過一維SDS/PAGE分離并轉移到硝化纖維膜上以便每一個蛋白都根據(jù)分子量不同而被固定在支持體上的不同位置。然后這一支持體同一個抗體點陣相接觸。在點陣中，抗體被固定的形狀可為長方形，而且每一個抗體都處在一個特殊的位置以便都能同抗原相結合。這個特殊的位置是由抗原的分子量決定的。
蛋白也可通過二維凝膠電泳分離。之后轉移到一個PVDF膜上。在這里利用的抗體點陣上，每個抗體都被固定在一個預先確定的位置以便每一個抗體都將與它的抗原相作用。這一位置與抗原的分子量和等電點有關。
在本發(fā)明中，蛋白可通過免疫方法分離和濃縮。其中一種方法是使用抗體點陣。第一個抗體點陣同一個蛋白樣品接觸以便蛋白能被固定在點陣上的抗體結合并分離。點陣上的抗體最好被牢固地固定，例如通過共價鍵?？乖?，抗體結合后，抗原再同抗體分離，轉移和固定在另一個支持體上。這個過程可以通過幾個已知的方法來進行。之后第二個抗體點陣用來檢測抗原。在第二個點陣上的抗體與它們對應的抗原結合之后能夠從點陣支持體上分離。在第一個和第二個點陣上，抗相同抗原的抗體處在對應的位置上；它們可以是相同也可以是不同的抗體。
本發(fā)明提供了一種方便、快速、簡捷地檢測多個生物分子的點陣、多個蛋白的表述、活化和功能的有力方法，有利于推動生命科學研究、生物技術研究、藥物開發(fā)和研究等領域的發(fā)展。


圖1是利用本發(fā)明檢測多個蛋白質方法的圖示。此方法包括以下幾個步驟第一步，制備抗體點陣和培養(yǎng)貼壁細胞；第二步，點陣和細胞相接觸；第三步，讓點陣支持體與細胞分開；第四步，檢測與細胞結合的抗體。
圖2是利用本發(fā)明方法檢測多個蛋白質的例子。MDCK細胞被用一個有200個抗體的點陣染色。染色以BCIP/NBT為底物通過堿性磷酸酶催化的顯色反應來觀察。
圖3a顯示了用抗體點陣進行熒光染色的結果。所使用的是一個具有200個兔多克隆抗體的點陣。圖中顯示了IRF1蛋白在一處的染色結果。圖中標尺代表300微米。
圖3b是圖3a放大圖像的一部分。顯示細胞中IRF1蛋白的表達和分布情況。圖中標尺代表30微米。
圖3c顯示了用抗體點陣進行熒光染色的結果。所使用的是一個具有200個兔多克隆抗體的點陣。圖中顯了14-3-3β信號分子在一處的染色結果。
圖3d是圖3c放大圖像的一部分。顯示細胞中14-3-3β蛋白的表達和分布情況。
圖3e顯示了用抗體點陣進行熒光染色的結果。所使用的是一個具有200個兔多克隆抗體的點陣。圖中顯示了β-catenin蛋白在一處的染色結果。
圖3f是圖3e放大圖像的一部分。顯示細胞中β-catenin蛋白的表達和分布情況。
圖3g顯示了用抗體點陣進行熒光染色的結果。所使用的是一個具有200個兔多克隆抗體的點陣。圖中顯示了Ets-1轉錄因子在一處的染色結果。
圖3h是圖3g放大圖像的一部分。顯示細胞中Ets-1蛋白的表達和分布情況。
圖4a顯示了使用一個抗體點陣對A431細胞進行熒光染色的結果，在這個抗體點陣中兔抗YY1抗體(左圖)，鼠抗p130cas抗體(中圖)，以及YY1抗體和p130cas抗體(右圖)被放在3個相鄰的位置上，這一實驗使用了Cy2標記的羊抗兔二抗和Cy3標記的羊抗鼠二抗。
圖4b是圖4a雙染色(YY1和p130cas)的放大圖像。
圖5是檢測和比較兩個生物樣品中蛋白表達的例子。左側顯示的是在ME180細胞中蛋白質的表達，右側顯示的是在A431細胞中蛋白質的表達。這里所使用的是一個有240個抗體的點陣。染色是通過堿性磷酸酶催化的顯色反映來觀察的。
圖6顯示用Western印跡法驗證圖5例子中蛋白質表達的結果。圖中顯示了通過Western印跡法在測定ME180細胞中(左帶)和在A431細胞中(右?guī)?19種蛋白質的表達。它們分別是A，Cb1(120kD)；B，Cdc2(34kD)；C，Cortactin(80kD)；D，Neu(185kD)；E，ERK1(44kD)；F，Ets-1(51kD)；G，GSK-3αt(51kD)；H，HSP 70(70kD)；I，JNK1(46kD)；J，Lyn(56kD)；K，NFκB p50(50kD)；L，Skp2 p45(45kD)；M，p53(53kD)；N，Plk3(70kD)；O，SH-PTP2(60kD)；P，Raf-1(74kD)；Q，Rb p107(107kD)；R，Stat1(84kD)；S，Stat5a(95kD)。每個抗體在圖5中的對應位置標在上面。
圖7是將A431細胞的蛋白裂解液通過SDS/PAGE分離后用抗體點陣來檢測蛋白質表達的一個例子。12種蛋白質的抗體被固定在相應的位置上。被檢測出的蛋白質是1，IKK beta；2，E2F1；3，ERK2；4，14-3-3；5，Rb p107；6，ERK1(control，抗體被固定在沒有其抗原的位置)；7，Ets-1；8，ERK1；9，Stat1；10，14-3-3(control，抗體被固定在沒有其抗原的位置)；11，JNK1；12，Stat2；13，Lyn；14，p38。每個抗體的對應位置被標示在相應印跡點的右邊。
具體實施例方式本發(fā)明有很多不同用途，而且依不同用途而有所變化。下面的例子只是發(fā)明技術的部分應用和部分具體實施方法，本發(fā)明的應用不止于此。比如，盡管本發(fā)明主要描述的是使用抗體點陣的例子，但是也可同理使用其它生物試劑點陣。這些生物分子包括但并不局限于重組蛋白，重組抗體，單鏈重組抗體，核苷酸，寡核苷酸，cDNA探針，糖類，脂類，小分子化合物等。例如，應用本發(fā)明中的方法，一個cDNA探針點陣能被用在原位雜交中揭示多個信使RNA(mRNA)在細胞中的表達。
例1制作抗體點陣。
首先用一個機械點樣機把抗體(大約0.5微克/每微升)點到尼龍膜上。點樣機用0.6毫米的點樣頭把大約80納升抗體溶液(大約40納克)滴到每一個點上。點與點之間的距離大約0.6毫米。抗體非共價鍵地與尼龍膜結合。用此法制做的抗體點陣可立刻使用或保持在4℃的環(huán)境下在48小時之內使用。
例2在免疫化學染色中使用抗體點陣。
這個例子是應用例1描述的方法制備的抗體點陣進行免疫化學染色。這個點陣含有200個抗體。
將MDCK細胞在蓋玻片上培養(yǎng)2天直到長滿。然后將細胞放在零下20度的甲醇/丙酮(1∶1比例)混合溶液中固定和滲透10分鐘。用生理鹽水清洗之后，MDCK細胞與抗體點陣接觸大約1小時。然后抗體點陣支持體和細胞及其支持體分開。用生理鹽水再一次清洗細胞后，加上堿性磷酸酶標記的二抗反應半小時。清洗后，通過以5-bromo-4 chloro-indolyl-phosphatase(BCIP)and nitroblue tetrazolium(NBT)為底物的顯色反映來觀察染色。通過用生理鹽水清洗終止顯色反映。顯色的圖像被數(shù)字掃描儀掃描(見圖二)。在很多地方的細胞被抗體染色，而且抗體并沒有擴散，這一點可以從固定抗體位置間無染色可以看出。染色的位置與抗體被固定的位置相吻合。
例3在熒光免疫化學染色中使用抗體點陣。
在這個例子中，點樣機用0.3毫米的點樣頭把大約10納升抗體溶液(大約5納克)滴到每一個點上。點與點之間的距離大約0.3毫米。然后應用圖一中所示方法，使用抗體點陣對A431細胞進行染色。與例2類似，只不過用了熒光標記的二抗，而且在熒光顯微鏡下觀察染色(見圖三)。細胞與熒光標記的二抗結合半個小時。清洗之后，在熒光顯微鏡下觀察細胞。細胞在幾個不同的位置被抗體染色，同時看不見抗體的擴散，這從不同的抗原具有不同的亞細胞位點以及被固定的抗體之間的區(qū)域沒被染色的事實就可以得到這一結論。在低倍鏡下可以觀察到有規(guī)則的熒光點，與抗體被固定在支持體上的模式相符。高倍鏡下可觀察到細微的染色結構，例如IRF1在細胞核中的染色，14-3-3β和ETS-1蛋白在細胞質中的染色，β-catatin蛋白在細胞聯(lián)接間的染色。本方法的染色結果與一般染色方法所得到的結果一致。
例4用毛細管做成的抗體點陣。
這個例子是用毛細管做成的抗體點陣去染色細胞。每個抗體都與低凝固點瓊脂糖溶液混合，注射到一個高1厘米，外徑2毫米，壁厚0.2毫米的塑料毛細管中。當瓊脂固定后，按特定順序將毛細管固定在一起并橫切，制成大約1毫米高的點陣。然后抗體點陣被放在一個玻璃支持體上與固定在另一個玻璃支持體上的細胞相接觸?？贵w與抗原因此有機會相結合。之后，如例3一樣通過熒光標記的二抗來檢測并且在顯微鏡下觀察與抗原相結合的抗體。
例5用毛細管做成的抗體點陣進行熒光染色。
首先將熒光標記的抗體與低熔點瓊脂糖凝膠在高溫下混合。然后將抗體溶液注射到毛細管中并降低溫度以使毛細管中的溶液凝固。20個固定有抗體的毛細管按一定順序排列做成毛細管點陣。之后，毛細管被切成薄的點陣，不高于1毫米，然后放在一個塑料支持體上并且粘固在上面。將點陣與放在蓋破片上固定的細胞相接觸以使抗體和抗原相連接。然后細胞和抗體點陣在37度結合2小時。降低溫度后，點陣和細胞被分離。將蓋玻片上的細胞用生理鹽水清洗之后在熒光顯微鏡下觀察。
例6使用抗體點陣進行雙染色。
首先制備一個含有100個位點的抗體點陣，每個位點陣有1個或2個抗體。當兩個不同的抗體被固定在同一位點上時，一個是鼠的單克隆抗體，另一個是兔的多克隆抗體。之后這個點陣用來染色A431細胞。染色之后，cy3熒光標記的羊抗鼠二抗和cy2熒光標記的羊抗兔二抗與一抗結合?？乖奈稽c可通過熒光顯微鏡來觀察(圖4a和4b)。在有兩個抗體的位置上，能夠觀察并區(qū)別兩個相應的抗原，每個都有它特殊的細胞位點。比如在圖4中，YY1蛋白的細胞核染色和p130cos蛋白的細胞膜染色可被分別觀察到(圖4a左和右)或同時觀察到(圖4b)。
例7使用抗體點陣染色比較兩種不同細胞的蛋白表達。
同樣，可利用通過上述方法制成的含有240個鼠單克隆抗體和兔多克隆抗體的點陣來檢測和對比兩個不同細胞樣品中240種蛋白的表達情況。在此采用的是研究中常用的兩種細胞，A431細胞和ME180細胞。結果表明，兩種細胞樣品具有明顯不同的蛋白表達模式(圖五)。例如，與ME180細胞比較，A431細胞表達更多的Cbl，cortactin，Neu，HSP70，JNK1，p53，Raf-1，和Statl；但表達較少的GSK-3alpha，Skp2 p45，Plk3，和Stat5a。這些蛋白的表達也可以通過西雜交的方法來測定(圖六)。兩種實驗結果相似，證明抗體點陣是一種檢測蛋白表達的有效方法。
例8用抗體點陣檢測激活路徑。
可將抗激活蛋白(磷酸化蛋白)的特異性抗體做成抗體點陣，用這個點陣來檢測生物樣品中表達的激活蛋白。有激活蛋白的出現(xiàn)就說明某些信號傳遞途徑被激活。
例9在蛋白裂解液中檢測特異的蛋白。
將50微克合有Statl重組蛋白的細菌裂解液固定在1平方厘米的硝化纖維膜上，然后將這個膜同一個固定在尼龍膜上包括多個抗體(含有Statl抗體)的抗體點陣相接觸，1-2小時之后，抗體與裂解液中對應的抗原相結合。當裂解液支持體與抗體點陣分開之后，一些抗體由于與抗原的相互作用而與抗體點陣支持體分離并結合在裂解液支持體上。結合到裂解液支持體上的抗體的數(shù)量與裂解液中的抗原的數(shù)量有關?？蓱美备^氧化酶聯(lián)接的二抗來檢測抗體，利用ECL反應來進行顯示。
例10用辣根過氧化酶聯(lián)接的一抗來檢測Statl蛋白。
這個例子與例6很相似，只不過使用了辣根過氧化酶聯(lián)接的Statl一抗。因此不需要使用酶聯(lián)二抗來檢測。
例11用通過蛋白A突變體固定的抗體點陣進行染色。
在這個例子中，帶有一個抗體結合區(qū)的重組蛋白A突變體被首先固定在一個支持體上，然后抗體通過與蛋白A突變體的相互作用而被固定制成一個抗體點陣。這樣制成的抗體點陣與固定在另外一個支持體上的蛋白裂解液相接觸。1小時之后，除去抗體點陣，通過HRP聯(lián)接的二抗來檢測與蛋白樣品支持體相結合的抗體。
例12檢測通過SDS/PAGE分離蛋白樣品。
在這個例子中，使用簾狀凝膠將A431細胞的裂解液中的蛋白通過SDS/PAGE首先分離然后轉移到一個PVDF膜上。12個重要蛋白的抗體被以長方形形狀固定在尼龍膜上而制成點陣。每一個抗體都放在一個特殊位置，該位置取決于抗原在PVDF膜上的位置(取決于抗原的分子量)。因此當點陣與蛋白樣品接觸時，每個抗體都能與它的抗原相接觸并結合。抗體與它們的抗原結合后，點陣的尼龍膜與PVDF膜分開。那些由于同抗原作用而轉移到PVDF膜上的抗體可通過用辣根過氧化酶聯(lián)接的二抗來檢測。如圖七所示，一些蛋白被檢測到并且每一個蛋白都是在正確的分子量的位置上被檢測到的。而那些被有意放在錯誤位置上的抗體沒有檢測到真正的強信號，證明這個方法能夠有效準確的檢測蛋白表達。
例13檢測經(jīng)二維凝膠電泳分離之后的蛋白樣品。
這個例子類似例12，只不過蛋白樣品經(jīng)二維凝膠電泳分離之后被轉移到一個PVDF膜上，然后蛋白樣品同一個抗體點陣相接觸?？贵w點陣包括多個抗體，每個抗體都被固定在一個預先確定的位置上以便每一個抗體都能與它的抗原相接觸?？乖赑VDF膜上的位置(也就是抗體在點陣上的位置)取決于抗原的分子量和等電點。
例14檢測通過抗體點陣分離的蛋白樣品。
在這個例子中，蛋白經(jīng)抗體點陣首先分離并濃縮。通過在一個支持體上共價固定抗體制成第一個點陣；然后將這個點陣同一個蛋白樣品放在一起以便蛋白能夠與被固定在點陣上的每一個抗體所結合。這樣，樣品中的蛋白質就被分離并濃縮。然后抗原與抗體分開，轉移并固定在一個樣品支持體上。因為抗體被共價固定，很少抗體被轉移到樣品支持體上。在第二個抗體點陣上，抗體可以離開支持體。抗相同抗原的抗體在第一個抗體點陣和第二抗體點陣上的相對位置一致。這樣當?shù)诙€抗體點陣與樣品支持體相接觸時，每個抗體都將與相應的抗原接觸并結合。結合之后，點陣與樣品支持體分離。因為一些抗體與它們的抗原相結合，所以這些抗體將與點陣支持體分開而結合到樣品支持體上。
權利要求
1.一個用于檢測生物分子的生物試劑點陣，其特征是此點陣至少有一個生物試劑被固定在第一個支持體上，當此點陣用來檢測固定在第二個支持體上的生物分子時，固定在第一個支持體上的生物試劑與固定在第二個支持體上的生物分子相接觸，至少一個生物試劑與所說的第二個支持體上的生物分子相結合，然后第一個支持體與第二個支持體分離，至少一個生物試劑離開所說的第一個支持體而結合在所說的第二個支持體上。
2.根據(jù)權利要求1所述的生物試劑點陣，其特征是所說的生物試劑為抗體。
3.根據(jù)權利要求1所述的一個用于檢測生物分子的生物試劑點陣，其特征是所說的生物試劑為重組蛋白。
4.根據(jù)權利要求1所述的生物試劑點陣，其特征是所說的生物試劑為核酸。
5.根據(jù)權利要求1所述的一個用于檢測生物分子的生物試劑點陣，其特征是所說的生物試劑為寡核苷酸。
6.根據(jù)權利要求1所述的一個用于檢測生物分子的生物試劑點陣，其特征是所說的第一個支持體的材料為尼龍，或玻璃，或塑料，或硝酸纖維，或聚丙烯酰胺，或它們的衍生物。
7.根據(jù)權利要求1所述的一個用于檢測生物分子的生物試劑點陣，其特征是所說的第一個支持體為一個或多個毛細管。
8.根據(jù)權利要求1所述的一個用于檢測生物分子的生物試劑點陣，其特征是生物試劑以長方形，或多邊形的形狀固定在所說的第一個支持體上。
9.根據(jù)權利要求1所述的一個用于檢測生物分子的生物試劑點陣，其特征是首先將中間物固定在所說的第一個支持體上，然后通過與中間物的作用將生物試劑固定在所說的第一個支持體上。
10.根據(jù)權利要求9所述的一個用于檢測生物分子的生物試劑點陣，其特征是所述的中間物為蛋白A或蛋白G，或它們的突變體。
11.根據(jù)權利要求1所述的一個用于檢測生物分子的生物試劑點陣，其特征是至少有5個不同的生物試劑，每一個生物試劑被固定在第一個支持體上至少一個預先確定的位置上。
12.根據(jù)權利要求1所述的一個用于檢測生物分子的生物試劑點陣，其特征是至少有10個不同的生物試劑，每一個生物試劑被固定在第一個支持體上至少一個預先確定的位置上。
13.根據(jù)權利要求1所述的一個用于檢測生物分子的生物試劑點陣，其特征是至少有100個不同的生物試劑，每一個生物試劑被固定在第一個支持體上至少一個預先確定的位置上。
14.檢測多個生物分子的方法，其特征是將至少一個生物試劑固定在第一個支持體上，每一個生物試劑被固定在預先確定的位置上，以便可以通過這個位置來確定這一生物試劑；把生物分子固定在第二個支持體上；將固定在第一個支持體上的生物試劑與固定在第二個支持體上的生物分子相接觸，至少一個生物試劑與所說的生物分子相結合；然后第一個支持體與第二個支持體上的生物分子分離，至少一個與所說生物分子結合的生物試劑從第一個支持體分離而結合在所說的第二個支持體上；檢測結合在所說的第二個支持體上的生物試劑。
15.根據(jù)權利要求14所述的檢測多個生物分子的方法，其特征在于所述的生物試劑包括抗體。
16.根據(jù)權利要求14所述的檢測多個生物分子的方法，其特征在于所述的生物試劑包括重組蛋白。
17.根據(jù)權利要求14所述的檢測多個生物分子的方法，其特征在于所述的生物試劑包括核酸。
18.根據(jù)權利要求14所述的檢測多個生物分子的方法，其特征在于所述的生物試劑包括寡核苷酸。
19.根據(jù)權利要求14所述的檢測多個生物分子的方法，其特征在于所述的生物分子在固定在第二個支持體上之前被分離。
20.根據(jù)權利要求19所述的檢測多個生物分子的方法，其特征在于所述的生物分子在固定在第二個支持體上之前先通過凝膠電泳進行分離。
21.根據(jù)權利要求19所述的檢測多個生物分子的方法，其特征在于所述的生物分子在固定在第二個支持體上之前先根據(jù)分子量進行分離。
22.根據(jù)權利要求19所述的檢測多個生物分子的方法，其特征在于所述的生物分子在固定在第二個支持體上之前先通過免疫方法被進行分離。
23.根據(jù)權利要求19所述的方法，其特征在于所述的生物分子在固定在第二個支持體上之前先通過抗體點陣進行分離。
24.根據(jù)權利要求14所述的檢測多個生物分子的方法，其特征是在第一個支持體與第二個支持體分離之前先用交聯(lián)劑將所說的相結合的生物試劑與生物分子共價聯(lián)接。
25.根據(jù)權利要求24所述的檢測多個生物分子的方法，其特征在于所說的交聯(lián)劑為醛類，包括甲醛和戊二醛。
26.根據(jù)權利要求14所述的檢測多個生物分子的方法，其特征是生物試劑以長方形，或多邊形的形狀固定在支持體上。
27.檢測多個蛋白的細胞染色方法，其特征是將至少一個抗體固定在第一個支持體上，每一個抗體被固定在預先確定的位置上，以便可以通過這個位置來確定這一抗體；把細胞放在第二個支持體上；將固定在第一個支持體上的抗體與固定在第二個支持體上的細胞相接觸，至少一個抗體與所說的細胞中的抗原相結合；然后第一個支持體與第二個支持體上的細胞分離，至少一個與所說抗原結合的抗體從第一個支持體分離而結合在所說的第二個支持體上；檢測結合在所說的第二個支持體上的抗體。
28.根據(jù)權利要求27所述的檢測多個蛋白的細胞染色方法，其特征在于所述的細胞在第二個支持體上被固定和滲透。
29.根據(jù)權利要求27所述的檢測多個蛋白的細胞染色方法，其特征在于所述的細胞為組織切片。
30.根據(jù)權利要求27所述的檢測多個蛋白的細胞染色方法，其特征在于所述的抗體是抗磷酸化蛋白的抗體。
31.根據(jù)權利要求27所述的檢測多個蛋白的細胞染色方法，其特征是至少有5個不同的抗體，每一個抗體被固定在第一個支持體上至少一個預先確定的位置上。
32.根據(jù)權利要求27所述的檢測多個蛋白的細胞染色方法，其特征是至少有10個不同的抗體，每一個抗體被固定在第一個支持體上至少一個預先確定的位置上。
33.根據(jù)權利要求27所述的檢測多個蛋白的細胞染色方法，其特征是至少有100個不同的抗體，每一個抗體被固定在第一個支持體上至少一個預先確定的位置上。
34.根據(jù)權利要求27所述的檢測多個蛋白的細胞染色方法，其特征是第一個支持體材料為尼龍，或玻璃，或塑料，或硝酸纖維，或聚丙烯酰胺，或它們的衍生物。
35.根據(jù)權利要求27所述的檢測多個蛋白的細胞染色方法，其特征是第一個支持體材料為尼龍，或其衍生物。
全文摘要
檢測多個生物分子的點陣及其使用方法，其特點包括此點陣至少有一個生物試劑被固定在第一個支持體上，當此點陣用來檢測固定在第二個支持體上的生物分子時，固定在第一個支持體上的生物試劑與固定在第二個支持體上的生物分子相接觸，至少一個生物試劑與所說的第二個支持體上的生物分子相結合，然后第一個支持體與第二個支持體分離，至少一個生物試劑離開所說的第一個支持體而結合在所說的第二個支持體上。本發(fā)明提供了一種方便、快速、簡捷地檢測多個生物分子的點陣、多個蛋白的表述、活化和功能的有力方法，有利于推動生命科學研究、生物技術研究、藥物開發(fā)和研究等領域的發(fā)展。
文檔編號G01N33/68GK1472534SQ02132698
公開日2004年2月4日 申請日期2002年7月30日 優(yōu)先權日2002年7月30日
發(fā)明者王穎劍 申請人:王穎劍