專利名稱：一種用于生物分子多重靶標檢測的通用標簽、探針及檢測方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于生物分子檢測技術(shù)領域，具體地，本發(fā)明涉及一種用于生物分子多重 靶標檢測的通用標簽、探針及檢測方法。
背景技術(shù)：
隨著人類基因組計劃(Human genome project, HGP)的完成，大量的動植物、微 生物基因組序列得以測定，基因數(shù)據(jù)以前所未有的速度增加。面對如此眾多的基因，如何 能夠同時大規(guī)模研究基因的生物學信息并解析其在生命活動過程中所擔負的功能，就成 了科研工作者研究的熱點課題。在這一背景下，以基因芯片技術(shù)為主體的生物芯片誕生 了，它被譽為20世紀90年代中期以來影響最為深遠的重大科技進展之一 [1-4]?；蛐?片(gene chip)，又稱 DNA 芯片(DNA chip)、DNA 微陣列(DNAmicroarray)、寡核苷酸陣列 (oligonucleotide array)，是指用原位合成(in situsynthesis)或微量點樣技術(shù)，將數(shù)以 百計或數(shù)以千計的DNA探針固定于固相支持物表面，從而產(chǎn)生二維的DNA探針微陣列，然 后依據(jù)核酸雜交的原理與標記的樣品進行雜交，通過檢測雜交信號從而實現(xiàn)對生物樣品快 速、平行、高效的檢測與分析。目前，基因芯片技術(shù)已廣泛應用于分子生物學和醫(yī)學研究等 各個方面，在基因表達、單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)、基因組 研究、疾病診斷和藥物篩選等領域顯示出良好的應用前景。雖然基因芯片在多重、快速、平行檢測樣品分子中顯示出了無比的優(yōu)越性，但仍有 一些瓶頸因素限制了基因芯片的實際應用和推廣，其中一個重要因素就是在進行雜交前 需要對待測樣品進行標記，而標記樣品的步驟較為繁瑣，需要專業(yè)人員操作，標記過程要用 到反轉(zhuǎn)錄酶、聚合酶等，標記效率較低，且這個過程不能在檢測現(xiàn)場進行，這些都增加了檢 測成本和操作步驟，不利于芯片技術(shù)的推廣和實際應用。本發(fā)明的目的就是克服現(xiàn)有標記 方法的不足，尋求一種簡便、快速的生物分子多重靶標通用標記檢測方法。我們知道，穩(wěn)定核酸雙螺旋的主要因素有兩個一個是互補堿基對之間形成的氫 鍵，它主要維系核酸雙螺旋的橫向穩(wěn)定；另一個是同一核酸鏈上相鄰堿基之間的堿基堆積 作用，它是維系核酸雙螺旋縱向穩(wěn)定的主要因素。這兩個因素協(xié)同作用，共同維護核酸雙螺 旋的穩(wěn)定，氫鍵的形成有利于堿基的堆積作用，而堿基堆積又有利于氫鍵的形成。20世紀 90年代中期以來，俄羅斯國家科學院院士 MirZabek0V(已故)領導的研究小組系統(tǒng)研究并 闡述了堿基堆積雜交(Base stackinghybri dization,BSH)的理論[5-9]。堿基堆積雜交 也被稱為鄰近堆積雜交(Contiguous stacking hybridization, CSH)，它是指當一條短的 寡核苷酸單鏈與互補的DNA/RNA長鏈雜交時，形成的雙鏈結(jié)構(gòu)往往是不穩(wěn)定的；但如果有 另一條與之鄰近的寡核苷酸單鏈也與互補的DNA/RNA長鏈雜交，那么這種雙鏈結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定 性會極大的提高(圖1)。基于以上這些科學研究成果，本發(fā)明提出了用于生物分子多重靶 標檢測的通用標記方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于生物分子多重靶標檢測的通用標簽。本發(fā)明的再一目的是提供一種生物分子多重靶標檢測的探針。本發(fā)明的另一目的是提供一種生物分子多重靶標檢測方法。根據(jù)本發(fā)明的用于生物分子多重靶標檢測的通用標簽，可以是一段DNA、RNA、 PNA (肽核酸)、LNA (Locked nucleic acids)等；其長度變動范圍為3_20mer ；設計時其堿 基序列應進行比對，盡量避免與待檢樣品具有同源性。根據(jù)本發(fā)明的用于生物分子多重靶標檢測的探針，所述探針由3’端至5’端依次 包括與靶分子或靶分子的一部分反向互補的核苷酸序列、以及與通用標簽反向互補的核 苷酸序列，也可以在3’端增加一段寡聚T或寡聚A以減少固相載體的界面影響；或者，所述 探針由3’端至5’端依次包括與通用標簽反向互補的核苷酸序列、與靶分子或靶分子的一 部分反向互補的核苷酸序列，也可以在5’端增加一段寡聚T或寡聚A以減少固相載體的界 面影響。根據(jù)本發(fā)明的探針，其中，所述端基為氨基、巰基、羧基或生物素等。根據(jù)本發(fā)明的生物分子多重靶標檢測方法包括以下步驟1)制備上述通用標簽，通用標簽可標記指示劑如熒光染料、量子點、納米金、同位 素、生物素等從而適用熒光顯微鏡、芯片掃描儀、銀染顯色法、酶反應顯色法等手段檢測；2)制備上述探針，首先依據(jù)待檢靶標設計探針，探針除了具有與靶分子或靶分子 的一部分反向互補的一段核酸序列外，還額外增加了一段核酸序列與上述的通用標簽反向 互補，探針的端部修飾以便于與固相載體連接；3)將探針連接到經(jīng)過修飾的固相載體上；4)將通用標簽、處理后的待測樣品溶于雜交液中，與探針陣列雜交；或者分兩步 進行，即首先將待測樣品與探針雜交，經(jīng)漂洗后再將通用標簽與探針陣列雜交；4)漂洗除去多余的樣品及通用標簽；5)檢測并分析雜交信號。根據(jù)本發(fā)明的方法，其中，檢測對象不僅包括DNA、RNA，還包括蛋白質(zhì)、糖分子等。根據(jù)本發(fā)明的方法，其中，所述固相載體為玻璃片、塑料基片、硅片、微珠或聚合物膜等。根據(jù)本發(fā)明的方法，其中，所述固相載體經(jīng)多聚賴氨酸、醛基、羧基或巰基等修飾。使用本發(fā)明的通用標簽、探針進行檢測，在獲取樣品后，不用標記即可直接進行檢 測，大幅度的降低了成本，有利于現(xiàn)場檢測，簡化了實驗步驟，操作簡單，非專業(yè)人員也可操 作，便于推廣。而且使用本發(fā)明的標簽探針可以實現(xiàn)生物分子多重靶標檢測。


圖1堿基堆積雜交示意圖。圖2通用標記方法用于臨床多種病源菌的檢測示意圖。圖3通用標記方法用于miRNA圖譜分析示意圖。圖4通用標記方法用于蛋白靶標多重檢測示意圖。
具體實施例方式實施例1本發(fā)明的方法用于臨床多種病源菌的檢測以肺炎呼吸道中五種病源菌為例加以說明(如圖2所示)肺炎克雷伯菌 (K. pneumoniae)、陰溝腸桿菌(E. cloacae)、綠月農(nóng)桿菌(P. aeruginosa)、金黃色葡萄球菌 (S. aureus)、腸球菌(Enterococcus)。所用到的探針及通用標簽如表1所示。表1.檢測肺炎呼吸道標本五種病源菌所用到的探針、通用標簽名稱及序列 1、選擇五種病源菌的16SRNA作為檢測的靶標，分別合成五種探針，探針的5’端是 poly(T) 12、中間一段序列與靶分子的一部分互補、3’端一段序列與通用標簽互補，探針的 5’端進行氨基修飾；2、合成通用標簽，并在5’端修飾熒光素；3、用傳統(tǒng)的化學修飾法處理玻片，制備醛基化基片；4、將探針溶解于點樣緩沖液中，點樣制備寡核苷酸陣列；5、將病人呼吸道分泌物加熱裂解，或者經(jīng)細菌培養(yǎng)后將菌液加熱裂解，然后與通 用標簽溶解于雜交液中，與探針陣列雜交；6、漂洗除去多余的樣品及通用標簽；7、熒光顯微鏡或芯片掃描儀檢測并進行分析。由于堿基堆積雜交的作用，只有當完全互補的靶分子與探針結(jié)合后，通用標簽才 可以穩(wěn)定地結(jié)合到探針上；而當錯配的靶分子與探針結(jié)合后，不能穩(wěn)定通用標簽與探針的 結(jié)合。五種探針分別與五種病源菌的16SRNA雜交，因而可以判斷出感染病源菌的種類和含 量，以指導臨床用藥。實施例2本發(fā)明的方法用于miRNA圖譜分析以肝組織中四種miRNA為例加以說明(如圖3所示)has-mir-194、has-mir-122、 has-mir-148、has-mir_192。所用到的探針及通用標簽如表2所示。表2.檢測肝組織中四種miRNA所用到的探針、通用標簽名稱及序列
1、依據(jù)miRNA文庫制備上述四種miRNA的相應探針，探針的5’端是poly (A) 10、中 間一段序列與miRNA互補、3’端一段序列與通用標簽互補，探針的5’端進行氨基修飾；2、合成通用標簽，并在5’端修飾納米金；3、用傳統(tǒng)的化學修飾法處理玻片，制備醛基化基片；
4、將探針溶解于點樣緩沖液中，點樣制備寡核苷酸陣列；5、將樣品裂解或是抽提總RNA并分離富集小RNA(sRNA)后，再與通用標簽溶解于 雜交液中，與探針雜交；6、漂洗除去多余的樣品及通用標簽；7、加入銀增效劑增強信號；8、采用平板掃描儀對信號檢測并進行分析，判斷miRNA的表達譜。實施例3本發(fā)明的方法用于蛋白靶標多重檢測以人血清中甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、總前列腺特異性抗原(TPSA)為例加 以說明(如圖4所示)，所用到的探針、生物條形碼、通用標簽如表3所示。表3.檢測人血清中三種抗原所用到的探針、生物條形碼、通用標簽名稱及序列 1、將三種待檢抗原相對應的抗體連接到磁珠上，然后將連接有抗體的磁珠與樣品 溶液反應，形成抗原抗體復合物；2、磁分離除去多余的樣品，再將修飾有抗體與生物條形碼(三種待檢抗原對應三 種不同的條形碼核酸序列)的納米金與抗原抗體復合物進行反應，形成磁珠_抗原_納米 金的復合物；3、磁分離除去多余的納米金，再用DTT溶液將生物條形碼從納米金上釋放出來；4、將釋放出來的生物條形碼與標記有FAM的通用標簽溶于雜交液中與探針陣 列雜交(探針的3’端與通用標簽互補，中間一部分與對應的生物條形碼互補，5’端是 Poly(T) 10,5'端修飾有氨基以固定于醛基化玻片上)；5、經(jīng)過漂洗除去多余的通用標簽；6、熒光顯微鏡或芯片掃描儀檢測并進行分析，以判斷血清樣品中這三種抗原的種 類和含量。參考文獻[IjFodor SP,Read JL,Pirrung MC,Stryer L，Lu AT,Solas D. Light-direeted, spatiallyaddressable parallel ehemical synthesis. Science 199IFeb 15;
7251 (4995) 767-773.[2]Breakthrough of the year.The runners-up.Science.1998Dec 18 ； 282(5397) :2157_2161·[3]Marshall A，Hodgson J.DNA chips :an array of possibilities. Nat Biotechnol. 1998 Jan ； 16(1) :27_3L[4] Service RF. Microchip arrays put DNA on the spot. Science. 19980ct 16; 282(5388) :396-399.[5]Yrrshov G， Barsky V， Belgovskiy A， Kirillov E， Kreindlin E， Ivanov I，Parinov S，Gusehin D，Drobishev A，Dubiley S，Mirzabekov A. DNA analysis and diagnostics onoligonucleotide microchips. Proc Natl Acad Sci USA. 1996 Mayl4 ； 93 (Io) :4913-4918.[6]Parinov S， Barsky V， Yershov G， Kirillov E， Timofeev E， Belgovskiy A，Mirzabekov A. DNA sequencing by hybridization to microchip octa—and decanucIeotides extended bystacked pentanucIeotides. Nucleic Acids Res. 1996Aug 1 ；24(15) :2998-3004.[7]Dubiley S，KiriIlov E，Lysov Y，Mirzabekov A. Fractionation, phosphorylation andligation on oligonucleotide microchips to enhance sequeneing by hybridization. Nucleic Acids Res. 1997Jun 15 ；25(12) :2259_2265·[8]Parallel thermodynamic analysis of duplexes on oligodeoxyribonucleotide microchips. Fotin AV,Drobyshev AL,Proudnikov DY,Perov AN, Mirzabekov AD. Nucleic AcidsRes. 1998Mar 15 ；26 (6) :1515_1521·[9] Vasi 1 i skov VA, Prokopenko DV, Mirzabekov AD. Parallel muItiplexthermodynamic analysis of coaxial base stacking in DNA duplexes byoligodeoxyribonucleotide microchips. Nucleic Acids Res. 2001 Jun 1 ；29 (11) 2303-2313.
權(quán)利要求
一種用于生物分子多重靶標檢測的通用標簽，其特征在于，所述通用標簽為一段DNA、RNA、肽核酸或LNA；其長度為3 20mer。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的通用標簽，其特征在于，所述通用標簽標記包括熒光染料、量子 點、納米金、同位素、和/或生物素的指示劑。
3.一種用于生物分子多重靶標檢測的探針，其特征在于，所述探針由3’端至5’端依次包括與靶分子或靶分子的一部分反向互補的核苷酸序 列、以及與通用標簽反向互補的核苷酸序列；或者，所述探針由3’端至5’端依次包括與通用標簽反向互補的核苷酸序列、與靶分 子或靶分子的一部分反向互補的核苷酸序列，其中，所述通用標簽為一段DNA、RNA、肽核酸或LNA ；其長度為3-20mer。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的探針，其特征在于，所述端基為氨基、巰基、羧基或生物素。
5.一種生物分子多重靶標檢測方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟1)制備權(quán)利要求1所述的通用標簽；2)制備權(quán)利要求2所述的探針；3)將探針連接到經(jīng)過修飾的固相載體上；4)將通用標簽、待測樣品溶于雜交液中，與探針陣列雜交，或者先將待測樣品與探針雜 交，經(jīng)漂洗后再將通用標簽與探針陣列雜交；5)漂洗除去多余的樣品及通用標簽；6)檢測并分析雜交信號。
6.如權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，所述固相載體為玻璃片、塑料基片、硅片、微珠 或聚合物膜。
7.如權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，所述固相載體經(jīng)環(huán)氧基、氨基、多聚賴氨酸、醛 基、羧基或巰基修飾。
8.如權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，所述檢測方法的檢測對象為DNA、RNA、蛋白質(zhì) 和/或糖分子。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物分子檢測技術(shù)領域，具體地，本發(fā)明涉及一種用于生物分子多重靶標檢測的通用標簽、探針及檢測方法。根據(jù)本發(fā)明的通用標簽為一段DNA、RNA、肽核酸或LNA；其長度為3-20mer。根據(jù)本發(fā)明的探針由3′端至5′端依次包括與靶分子或靶分子的一部分反向互補的核苷酸序列、以及與通用標簽反向互補的核苷酸序列；或者，所述探針由3′端至5′端依次包括與通用標簽反向互補的核苷酸序列、與靶分子或靶分子的一部分反向互補的核苷酸序列。使用本發(fā)明的通用標簽、探針進行檢測，在獲取樣品后，不用標記即可直接進行檢測，大幅度的降低了成本，有利于現(xiàn)場檢測，簡化了實驗步驟，操作簡單，非專業(yè)人員也可操作，便于推廣。
文檔編號C12Q1/68GK101892291SQ20091008356
公開日2010年11月24日 申請日期2009年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月8日
發(fā)明者曹榕, 李炯, 段德民, 鄭克孝 申請人:中國科學院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所