基于多層膠體晶體的生物分子檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明基于多層膠體晶體的生物大分子檢測方法是用于生物樣品中進(jìn)行生物大分子檢測的一種簡單、方便的高通量檢測的方法，生物分子檢測的過程中，以多層膠體晶體膜作為流動(dòng)載體的生物大分子檢測方法如下：第一步，多層膠體晶體膜與的制備；第二步，核酸或蛋白探針分子在多層膠體晶體膜上的固定；第三步，目標(biāo)分子的雜交；第四步，目標(biāo)分子的識別：利用光纖光譜儀確定多層膠體晶體膜的反射譜帶以此來識別生物分子的種類，然后根據(jù)目標(biāo)分子上的熒光信號或光吸收度來確定目標(biāo)分子的存在與否。本發(fā)明雜交速度快，成本低廉，是一種簡單快速的高通量生物檢測方法。
【專利說明】
基于多層膠體晶體的生物分子檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ] 本發(fā)明是用于生物樣品中進(jìn)行生物大分子檢測的一種簡單、方便的高通量檢測的方法?？梢詮V泛應(yīng)用于臨床診斷與檢測、藥物篩選，環(huán)境中微生物樣品的檢測、法醫(yī)鑒定、海關(guān)農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫、基因序列以及功能分析、微生物分形、動(dòng)植物育種等領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著基因組時(shí)代和后基因組時(shí)代的到來，高通量的基因檢測和蛋白質(zhì)的檢測技術(shù)以日益成為這一生命科學(xué)基礎(chǔ)研究的基本手段和工具。高通量生物分子的平行檢測能夠高效率的發(fā)現(xiàn)新的功能基因和蛋白質(zhì)組，廣泛的應(yīng)用于新的功能基因的克隆，表達(dá)以及蛋白質(zhì)組的研究中，而且在開發(fā)新的藥物、臨床檢測以及動(dòng)植物檢疫中都有廣泛的應(yīng)用前景。目前在高通量生物大分子的檢測中，主要依靠的是以玻璃片等為載體依靠位置編碼的生物芯片和以熒光微球?yàn)榱鲃?dòng)載體液相芯片技術(shù)，但這兩種技術(shù)都存在一定的缺陷，生物芯片技術(shù)雖然編碼量大，大需要昂貴的點(diǎn)樣系統(tǒng)，并且雜交速度慢；而液相芯片技術(shù)以熒光微球?yàn)檩d體，采用動(dòng)態(tài)雜交技術(shù)，但由于技術(shù)上的問題，編碼量小。建立雜交速度快并且編碼量大的高通量生物大分子檢測技術(shù)的平臺(tái)從而推動(dòng)生命科學(xué)研究的進(jìn)步是急待解決地問題。我們提出了以膠體晶體膠體晶體作為流動(dòng)載體作為生物檢測中大分子的身份標(biāo)識，從而有望使上述問題得到解決。
[0003]膠體晶體是光子晶體的一種。膠體晶體中球形粒子的周期排列會(huì)形成光帶隙結(jié)構(gòu)從而控制光在其中的傳播。在膠體晶體中，具有和光帶隙相同頻率的光無法被傳播。這些入射光將被膠體晶體反射。在反射光譜上，膠體晶體的光帶隙表現(xiàn)為一個(gè)很強(qiáng)的反射峰。反射峰的位置隨光帶隙而變化。相對于其它種類的具有三維有序結(jié)構(gòu)的膠體晶體來說，膠體晶體具有制備簡便，容易在大面積范圍內(nèi)成膜等優(yōu)點(diǎn)。我們將利用膠體晶體的這一光學(xué)特性實(shí)現(xiàn)對流動(dòng)載體的編碼?；驹砣缦?首先在不同的膠體晶體載體上修飾不同種類的探針分子，由于光帶隙的位置隨組成膠體晶體的球形粒子的大小而變化，因此在任何一種膠體晶體載體上固定的生物分子的種類都可以通過測定光帶隙位置來確定。在檢測時(shí)，將探針分子修飾過的膠體晶體載體與含熒光標(biāo)記過的目標(biāo)分子的檢測液混合，在探針分子和目標(biāo)分子反應(yīng)后，探針分子的種類通過膠體晶體小板的反射光譜確定，而目標(biāo)分子的存在與否則通過熒光光譜確定。在這一階段的研究中我們還需對現(xiàn)有光學(xué)儀器進(jìn)行改進(jìn)，使其可同時(shí)對反射光譜和熒光進(jìn)行檢測.

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]技術(shù)問題:本發(fā)明是一種用來進(jìn)行生物大分子高通量平行檢測的方法。采用多層膠體晶體膜代替熒光微球作為流動(dòng)載體并為固定其上的某種探針編碼。雜交之后，根據(jù)膠體晶體膜的特征反射譜來確定探針的種類，根據(jù)雜交信號的有無來確定目標(biāo)分子的存在與否。本發(fā)明雜交速度快，成本低廉。是一種簡單快速的高通量生物檢測方法。
[0005]技術(shù)方案:本發(fā)明的基于多層膠體晶體的生物大分子檢測方法在生物分子檢測的過程中，以多層膠體晶體膜作為流動(dòng)載體的生物大分子檢測方法如下:
[0006]第一步，多層膠體晶體膜與的制備:底層聚二甲基硅氧烷膜經(jīng)表面親水處理后，組裝底層膠體晶體膜，底層膠體晶體膜上覆蓋中間層聚二甲基硅氧烷膜，中間層聚二甲基硅氧烷膜上又組裝有頂層膠體晶體膜，頂層膠體晶體膜上覆蓋有頂層聚二甲基硅氧烷膜；頂層膠體晶體膜經(jīng)親水處理之后，再組裝膠體晶體，然后再覆蓋聚二甲基硅氧烷膜，則形成三層的光子晶體膜，依次重復(fù)以上的過程，則可形成四層，五層膠體晶體膜，組成每層膠體晶體膜的膠體粒子的粒徑不同，每層膠體晶體膜的特征反射譜不同，多層膠體晶體膜中層與層之間采用不同的反射譜的組合作為生物大分子的編碼；
[0007]第二步，核酸或蛋白探針分子在多層膠體晶體膜上的固定:核酸或蛋白探針固定在底層聚二甲基硅氧烷膜的下表面與頂層聚二甲基硅氧烷膜的上表面，紫外臭氧或等離子體處理后的PDMS表面產(chǎn)生羥基，然后利用硅烷試劑將探針分子與多層膠體晶體膜偶聯(lián)在一起，不同反射譜帶的多層膠體晶體固定不同的探針分子，從而利用多層膠體晶體膜的特征反射譜帶實(shí)現(xiàn)對生物大分子的編碼；
[0008]第三步，目標(biāo)分子的雜交:目標(biāo)分子在生物樣品中經(jīng)過前處理以后標(biāo)上熒光或者酶，然后與固定在不同多層膠體晶體上的探針分子雜交，目標(biāo)分子中不同的核酸或蛋白特異在不同探針分子上；
[0009]第四步，目標(biāo)分子的識別:利用光纖光譜儀確定多層膠體晶體膜的反射譜帶以此來識別生物分子的種類，然后根據(jù)目標(biāo)分子上的熒光信號或光吸收度來確定目標(biāo)分子的存在與否。
[0010]采用多層膠體晶體膜的特征反射譜對生物大分子進(jìn)行編碼的方法為，組成多層膠體晶體的每層膠體晶體都有特征反射峰，利用多層膠體晶體中每層膠體晶體反射峰的不同組合對生物大分子編碼，實(shí)現(xiàn)編碼量的擴(kuò)大。
[0011]底層聚二甲基硅氧烷膜，中間層聚二甲基硅氧烷膜，頂層聚二甲基硅氧烷膜可由聚苯乙烯，或聚甲丙烯酸甲酯替代。底層膠體晶體膜，頂層膠體晶體膜中的膠體晶體是聚苯乙烯膠體晶體，或聚甲丙烯酸甲酯膠體晶體，或二氧化硅膠體晶體。探針固定在底層聚二甲基硅氧烷膜的下表面與頂層聚二甲基硅氧烷膜的上表面時(shí)采用的是紫外臭氧或等離子體后的硅烷化反應(yīng)作為固定生物大分子的方法。
[0012]本發(fā)明用膠體晶體膜作為流動(dòng)載體，在其上固定生物大分子探針，將靶物質(zhì)與大分子雜交。洗脫之后，利用反射光纖光譜儀測定膠體晶體膜的特征反射光譜，作為識別生物探針分子的標(biāo)識。然后檢測雜交到生物探針上的信號(例如熒光信號、化學(xué)發(fā)光的信號，電化學(xué)信號等)，根據(jù)雜交信號的有無來確定目標(biāo)分子的存在與否。
[0013]1.膠體晶體膜的制備:具有特征反射譜的膠體晶體膜按結(jié)構(gòu)可分為蛋白石型(由粒子排列構(gòu)成)和反蛋白石(反蛋白石結(jié)構(gòu))兩種。下面具體說明3種膜的制備。
[0014](I)單層聚合物膠體晶體膜的制備:按10: I: 10的比例將PDMS (聚二甲基硅氧烷)前聚體、固化劑、正己烷混合在一起，灌注在玻璃基底或者硅基底上，高溫固化。固化后的PDMS表面進(jìn)行親水化處理(紫外臭氧處理，然后利用帶不飽和鍵的硅烷試劑處理，再進(jìn)行接枝反應(yīng)；或在紫外光下直接引發(fā)接枝反應(yīng)；氧等離子體處理)。將不同粒徑的聚苯乙烯膠體晶體利用溶劑揮發(fā)法或者垂直提拉法自組裝在PDMS膜上。然后按5: I: 5的比例將PDMS前聚體、固化劑、正己烷混合在一起，灌注在膠體晶體膜上，靜致過夜，然后將其固化。
[0015](2)多層聚合物膠體晶體膜(本方法以雙層聚合物膠體晶體膜為例)的制備:按10: I: 10的比例將PDMS前聚體、固化劑、正己烷混合在一起，灌注在玻璃基底或者硅基底上，高溫固化。固化后的底層PDMS表面進(jìn)行親水化處理(紫外臭氧處理，然后利用帶不飽和鍵的硅烷試劑處理，再進(jìn)行接枝反應(yīng)；或在紫外光下直接引發(fā)接枝反應(yīng)；氧等離子體處理)。將某一粒徑的膠體晶體(PS膠體晶體，PMMA膠體晶體，二氧化硅膠體晶體等)利用溶劑揮發(fā)法或者垂直提拉法自組裝在PDMS膜上，形成底層膠體晶體膜。然后按5: I: 5的比例將PDMS前聚體、固化劑、正己烷混合在一起，灌注在膠體晶體膜上，靜置過夜，然后將其固化，形成中間層PDMS膜。將中間層PDMS膜用同樣的方法進(jìn)行親水化處理，將另一種粒徑的膠體晶體或相同粒徑的不同膠體晶體用自組裝在中間層PDMS膜上，形成頂層膠體晶體膜。按10:1: 10的比例將PDMS前聚體、固化劑、正己烷混合在一起，灌注在膠體晶體膜上，靜置過夜，然后將其固化，形成頂層PDMS膜。
[0016]2.探針的固定=(I)PDMS單層和多層膠體晶體膜的固定方法如下:紫外臭氧處理PDMS膜，APTES與PDMS膜反應(yīng)，通過戊二醛將氨基修飾的核酸探針或抗原、抗體結(jié)合在PDMS膜上。
[0017]3.目標(biāo)分子的雜交:經(jīng)提純、擴(kuò)增后并有可識別標(biāo)記的目標(biāo)分子與固定在不同膜上的不同探針分子混合后，震蕩加速雜交。
[0018]4檢測.利用反射光譜儀檢測膠體晶體膜的反射光譜，來確定探針分子的種類。利用熒光顯微鏡或者分光光度記分別檢測熒光標(biāo)記或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的目標(biāo)分子，然后根據(jù)信號的有無來確定目標(biāo)分子的存在與否。
[0019]有益效果:本發(fā)明利用膠體晶體對生物分子進(jìn)行編碼，從而能夠?qū)崿F(xiàn)目標(biāo)分子檢測時(shí)的動(dòng)態(tài)雜交反應(yīng)，該方法簡單易行。
[0020]1、用膠體晶體替代熒光微球進(jìn)行編碼降低了編碼物質(zhì)的制作成本，并且簡化了檢測儀器，降低了檢測成本。
[0021]2.膠體晶體編碼相比較于熒光微球編碼而言，膠體晶體呈現(xiàn)的顏色是結(jié)構(gòu)色，性質(zhì)穩(wěn)定，而熒光微球易發(fā)生光漂白，
[0022]3.膠體晶體反射光譜窄，并且可以利用多層膠體晶體膜不同反射譜的組合擴(kuò)大編碼量。理論上可編碼上萬種生物分子，而熒光微球目前只能編碼上百種生物分子。
[0023]4.膠體晶體作為流動(dòng)載體的一種，與平板芯片相比較，能加快雜交反應(yīng)速度，從而提聞檢測的效率。
【附圖說明】
[0024]圖1是多層膠體晶體膜的制備以及探針固定與雜交流程圖。
[0025]圖2是是多層膠體晶體膜(以雙層膠體晶體膜為例)的結(jié)構(gòu)以及探針固定與雜交后的不意圖。
[0026]以上的圖中有底層PDMS膜1、底層膠體晶體膜2、中間層PDMS膜3、頂層膠體晶體膜4、頂層PDMS膜5、探針6、目標(biāo)分子7。
【具體實(shí)施方式】
[0027]圖1是多層膠體晶體膜的制備以及探針固定與雜交流程圖:第一步是底層PDMSl在玻璃片或者硅片上的灌注，固化后，從玻璃片上剝離下來.第二步為底層PDMS膜的制備與表面改性，第三步為膠體晶體2在底層PDMS膜的自組裝，第四步為頂層PDMS3的灌注與固化，重復(fù)第二步致第四步，然后形成二層膠體晶體膜，重復(fù)二次形成三層膠體晶體膜，依次類推，第五步是探針的固定，第六步是目標(biāo)分子的雜交。
[0028]圖2是是多層膠體晶體膜(以雙層膠體晶體膜為例)的結(jié)構(gòu)以及探針固定與雜交后的圖:底層PDMS膜I上組裝有底層膠體晶體膜2，底層膠體晶體膜2上覆蓋中間層PDMS膜3，中間層PDMS膜上又組裝有頂層膠體晶體膜4，頂層膠體晶體膜4上覆蓋有頂層PDMS膜5，探針6固定在底層PDMS膜I的下表面與頂層PDMS膜5的上表面，雜交后，目標(biāo)分子7結(jié)合在探針分子6上。
[0029]多種反射譜的多層膠體晶體膜的制備(以具有兩種反射譜的雙層膠體晶體膜為例)以及探針的固定與雜交:
[0030](I)具有多種反射譜的多層膠體晶體膜的制備(以具有兩種反射譜的膠體晶體膜為例):按10: I: 10的質(zhì)量比例將PDMS(聚二甲基硅氧烷)前聚體、固化劑、正己烷混合在一起，灌注在玻璃基底或者硅基底上，高溫固化。固化后的底層PDMSl表面進(jìn)行親水化處理(紫外臭氧處理，使表面的-CH3轉(zhuǎn)化為-OH ;或者紫外臭氧處理之后產(chǎn)生羥基，然后利用帶不飽和鍵的硅烷試劑與之反應(yīng)，再用引發(fā)劑引發(fā)丙稀酸等的接枝反應(yīng)；或在紫外光下直接引發(fā)接枝反應(yīng)；氧等離子體處理產(chǎn)生羥基，或者硅烷化反應(yīng)之后再產(chǎn)生親水化結(jié)果。)。將某一粒徑的膠體晶體(聚苯乙烯膠體晶體，聚甲基丙稀酸甲酯膠體晶體，二氧化硅膠體晶體等)自組裝在PDMS膜上，形成底層膠體晶體膜2。然后按5: I: 5的比例將PDMS前聚體、固化劑、正己烷混合在一起，灌注在膠體晶體膜上，靜置過夜，然后將其固化，形成中間層PDMS膜3。將中間層PDMS膜3用同樣的方法進(jìn)行親水化處理，將另一種粒徑的膠體晶體或相同粒徑的不同膠體晶體用溶劑揮發(fā)法或者垂直提拉法自組裝在中間層PDMS膜上，形成頂層膠體晶體膜4。按10:1: 10的比例將PDMS前聚體、固化劑、正己烷混合在一起，灌注在膠體晶體膜上，靜置過夜，然后將其固化，形成頂層PDMS膜5。
[0031](II)探針的固定:雙層膠體晶體膜的固定方法如下:紫外臭氧或等離子體處理PDMS膜，APTES與PDMS膜反應(yīng)，通過戊二醛將探針6 (氨基修飾的核酸或抗原、抗體)結(jié)合在底層PDMS膜I的小表面和頂層PDMS膜5的上表面上.
[0032](III)目標(biāo)分子的雜交:經(jīng)提純、擴(kuò)增后并有可識別標(biāo)記的目標(biāo)分子7與固定在不同膜上的不同探針分子混合后，震蕩加速雜交。
[0033](IV)檢測.利用反射光譜儀檢測膠體晶體膜的兩種反射光譜，來確定探針分子的種類。利用熒光顯微鏡或者分光光度記分別檢測熒光標(biāo)記或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的目標(biāo)分子，然后根據(jù)信號的有無來確定目標(biāo)分子的存在與否。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種基于多層膠體晶體的生物大分子檢測方法，其特征在于生物分子檢測的過程中，以多層膠體晶體膜作為流動(dòng)載體的生物大分子檢測方法如下: 第一步，多層膠體晶體膜與的制備:底層聚二甲基硅氧烷膜(I)經(jīng)表面親水處理后，組裝底層膠體晶體膜(2)，底層膠體晶體膜(2)上覆蓋中間層聚二甲基硅氧烷膜(3)，中間層聚二甲基硅氧烷膜上又組裝有頂層膠體晶體膜(4)，頂層膠體晶體膜(4)上覆蓋有頂層聚二甲基硅氧烷膜(5);頂層膠體晶體膜經(jīng)親水處理之后，再組裝膠體晶體，然后再覆蓋聚二甲基硅氧烷膜，則形成三層的光子晶體膜，依次重復(fù)以上的過程，則可形成四層，五層膠體晶體膜，組成每層膠體晶體膜的膠體粒子的粒徑不同，每層膠體晶體膜的特征反射譜不同，多層膠體晶體膜中層與層之間采用不同的反射譜的組合作為生物大分子的編碼； 第二步，核酸或蛋白探針分子在多層膠體晶體膜上的固定:核酸或蛋白探針￠)固定在底層聚二甲基硅氧烷膜(I)的下表面與頂層聚二甲基硅氧烷膜(5)的上表面，紫外臭氧或等離子體處理后的PDMS表面產(chǎn)生羥基，然后利用硅烷試劑將探針分子與多層膠體晶體膜偶聯(lián)在一起，不同反射譜帶的多層膠體晶體固定不同的探針分子，從而利用多層膠體晶體膜的特征反射譜帶實(shí)現(xiàn)對生物大分子的編碼； 第三步，目標(biāo)分子的雜交:目標(biāo)分子(7)在生物樣品中經(jīng)過前處理以后標(biāo)上熒光或者酶，然后與固定在不同多層膠體晶體上的探針分子(6)雜交，目標(biāo)分子(7)中不同的核酸或蛋白特異在不同探針分子(6)上； 第四步，目標(biāo)分子的識別:利用光纖光譜儀確定多層膠體晶體膜的反射譜帶以此來識別生物分子的種類，然后根據(jù)目標(biāo)分子(7)上的熒光信號或光吸收度來確定目標(biāo)分子的存在與否。2.如權(quán)利要求1所述的基于多層膠體晶體的生物大分子檢測方法，其特征在于采用多層膠體晶體膜的特征反射譜對生物大分子進(jìn)行編碼的方法為，組成多層膠體晶體的每層膠體晶體都有特征反射峰，利用多層膠體晶體中每層膠體晶體反射峰的不同組合對生物大分子編碼，實(shí)現(xiàn)編碼量的擴(kuò)大。3.如權(quán)利要求1所述的基于多層膠體晶體的生物大分子檢測方法，其特征在于底層聚二甲基硅氧烷膜(I)，中間層聚二甲基硅氧烷膜(3)，頂層聚二甲基硅氧烷膜(5)可由聚苯乙烯，或聚甲丙烯酸甲酯替代。4.如權(quán)利要求1所述的基于多層膠體晶體的生物大分子檢測方法，其特征在于底層膠體晶體膜(2)，頂層膠體晶體膜(4)中的膠體晶體是聚苯乙烯膠體晶體，或聚甲丙烯酸甲酯膠體晶體，或二氧化硅膠體晶體。5.如權(quán)利要求1所述的基于多層膠體晶體的生物大分子檢測方法，其特征在于探針(6)固定在底層聚二甲基硅氧烷膜(I)的下表面與頂層聚二甲基硅氧烷膜(5)的上表面時(shí)采用的是紫外臭氧或等離子體后的硅烷化反應(yīng)作為固定生物大分子的方法。
【文檔編號】G01N21/31GK105891166SQ201410666174
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年11月8日
【發(fā)明人】何飛, 林向楊
【申請人】重慶市丹青生物技術(shù)有限公司