專利名稱：綜合分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及采用分離技術(shù)的組合進(jìn)行化合物尤其是生物分子的分離。
基于膜的電泳是一種新技術(shù)，最初開發(fā)這種技術(shù)是用于分離大分子如蛋白、核苷酸以及復(fù)雜糖類(complex sugars)。最初開發(fā)用于大分子分離的該獨特的制備電泳技術(shù)當(dāng)電場或電壓(potential)施加于膜上時，利用橫跨聚丙烯酰胺膜的切向流。系統(tǒng)的總設(shè)計促進(jìn)蛋白和其他大分子在近乎天然條件下純化。該系統(tǒng)導(dǎo)致更高的產(chǎn)量和優(yōu)異的回收率。此方法提供高的純度、可放大的分離，比當(dāng)今的大分子分離法的得率更快、更便宜和更高。此外，該技術(shù)提供同時使大分子溶液純化和脫毒的潛力。
本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)基于膜的電泳技術(shù)可整合到常規(guī)純化工藝，如那些用于主要的血液分級分離中，而無需取代全部純化工藝。這種整合給總的分離速度和終產(chǎn)物的純度帶來意想不到的提高。
發(fā)明公開在總的方面，本發(fā)明提供基于膜電泳和一種或多種常規(guī)分離技術(shù)組合的應(yīng)用，以從多種化合物的混合物中獲得所需化合物。利用一步或多步基于膜電泳導(dǎo)致所需化合物的更快和更有效地產(chǎn)出。
在第一方面，本發(fā)明提供大規(guī)模從含有多種化合物的混合物的樣品中移出至少一種所需化合物的方法，該方法包括(a)通過一種或多種分離方法處理樣品以獲得至少含有一些所需化合物的樣品組分；(b)將至少一些含有所需化合物的樣品組分置于電泳裝置的第一空隙體積中，所述電泳裝置包括陽極區(qū)的陽極；陰極區(qū)的陰極，所述陰極相對于陽極放置以便適合在陽極和陰極之間施加電壓后在其電場區(qū)產(chǎn)生電場；分離膜，其置于電場區(qū)中；第一限制性膜其置于第一電極區(qū)和分離膜之間，以限定其中的第一空隙體積；第二限制性膜，其置于第二電極區(qū)和分離膜之間，以限定其中的第二空隙體積；(c)給第一空隙體積提供溶劑，其中溶劑具有選擇的pH；(d)在第一和第二空隙體積之間施加電壓，其中施加電壓導(dǎo)致第一空隙體積中所選擇化合物的選擇一部分和其他成分通過分離膜遷移到第二空隙體積中，而第一空隙體積中所選擇的其他化合物和其他成分則被阻止進(jìn)入第二空隙體積；以及(e)維持步驟(d)直到其中一種空隙體積含有所需量的選擇的化合物以形成分離樣品。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的第一方面的方法進(jìn)一步包括(f)至少回收部分分離樣品，并將含有所需化合物的分離樣品以一種以上的分離方法進(jìn)一步進(jìn)行操作以獲得含有所需化合物的純化樣品。
優(yōu)選地，在步驟(a)和(f)中，一種或多種分離方法選自親和層析、大小排阻層析、離子交換層析、疏水作用層析、假親和層析、基于膜的離子交換系統(tǒng)、制備性等電聚焦(IEF)、緩沖液交換/透析處理、沉淀、過濾、巴士德殺菌、鹽/去垢劑處理、離心、超濾及其組合。
優(yōu)選地，步驟(c)導(dǎo)致樣品組分中的一種或多種化合物具有凈電荷或基本上是中性的。
在第二方面，本發(fā)明提供大規(guī)模地從含有多種化合物的混合物的樣品中移出至少一種所需化合物的方法，該方法包括(a)將含有所需化合物的樣品置于電泳裝置的第一空隙體積中，所述電泳裝置包括陽極區(qū)的陽極；陰極區(qū)的陰極，所述陰極相對于陽極放置以便適合在陽極和陰極之間施加電壓后在其電場區(qū)間產(chǎn)生電場；分離膜，其置于電場區(qū)中；第一限制性膜，其置于第一電極區(qū)和分離膜之間，以限定其中的第一空隙體積；第二限制性膜，其置于第二電極區(qū)和分離膜之間以限定其中的第二空隙體積；(b)給第一空隙體積提供溶劑，其中溶劑具有選擇的pH；(c)在第一和第二空隙體積之間施加電壓，其中施加電壓導(dǎo)致第一空隙體積中所選擇化合物的選擇一部分和其他成分通過分離膜遷移到第二空隙體積中，而第一空隙體積中所選擇的其他化合物和其他成分則被阻止進(jìn)入第二空隙體積；以及(d)維持步驟(c)直到其中一種空隙體積含有所需量的選擇化合物以形成樣品組分；(e)通過一種或多種其他分離方法回收樣品組分并處理至少樣品組分的一部分以在分離樣品中獲得所需量的所需化合物。
優(yōu)選地，在步驟(e)中，一種或多種分離方法選自親和層析、大小排阻層析、離子交換層析、疏水作用層析、假親和層析、基于膜的離子交換系統(tǒng)、制備性等電聚焦(IEF)、緩沖液交換/透析處理、沉淀、過濾、巴士德殺菌、鹽/去垢劑處理、離心和超濾及其組合。
優(yōu)選地，步驟(b)導(dǎo)致樣品組分中的一種或多種化合物具有凈電荷或基本上是中性的。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明第一或第二方面的方法導(dǎo)致分離樣品中的所需化合物的純度為至少60％，優(yōu)選至少80％，甚至更優(yōu)選至少90％。
在一個優(yōu)選的形式中，樣品是血液衍生的樣品，尤其是血漿，以及所獲得的化合物選自因子VIII、因子IX、因子II、因子X、蛋白質(zhì)C、白蛋白、免疫球蛋白、纖維蛋白原、α1抗胰蛋白酶(AAT)、抗凝血酶III(ATIII)。更優(yōu)選地，該化合物是從Cohn血漿組分中獲得的免疫球蛋白G(IgG)。
在另一優(yōu)選的形式中，樣品是可從任何合適的源如細(xì)胞、培養(yǎng)上清液、牛奶或植物性材料中獲得的重組產(chǎn)物。
在另一優(yōu)選的形式中，樣品含有單克隆抗體。
然而，人們會意識到，為獲得包括來自含有多種復(fù)雜混合物樣品的大分子的化合物，其他大規(guī)模方法可以包括一步或多步基于膜的電泳技術(shù)。
基于膜的電泳技術(shù)的一個優(yōu)點為當(dāng)分離一種或多種化合物時從樣品中去除病原體或感染性介質(zhì)也是可能的。例如，病毒、細(xì)菌、真菌、酵母和朊病毒可被有效、安全地去除而無需條件或處理，所述條件或處理對一種或多種待分離生物分子的功能或完整性也許是有害的。
在另一優(yōu)選的形式中，在原始樣品進(jìn)行一種或多種處理之后，再進(jìn)行步驟(a)-(f)。
在另一優(yōu)選的形式中，在步驟(f)后再進(jìn)行步驟(a)-(e)以獲得形式上基本純的一種或多種化合物。
在生產(chǎn)一種或多種大分子的方法中包括一步或多步基于膜的電泳技術(shù)，其結(jié)果是該方法的總體效率得到提高。
優(yōu)選地，膜是電泳分離膜或限制性膜。
電泳分離膜優(yōu)選地由聚丙烯酰胺制成，并且截留分子量為至少約3kDa。分離膜的截留分子量將依賴于所處理的樣品、樣品中的其他化合物以及所進(jìn)行分離的類型。
限制性膜還優(yōu)選由聚丙烯酰胺制成。限制性膜的截留分子量將依賴于處理的樣品、樣品混合物中的其他化合物以及所進(jìn)行分離的類型。
以電泳膜形式的膜可以多層或三明治排列方式形成。膜的厚度對化合物的分離或移動可能有影響。已發(fā)現(xiàn)膜越薄則移動越快和越有效率。
限制性膜可具有相同或不同的截留分子量，由此形成不對稱的排列。
貫穿本說明書，除非文中另有要求，詞“包括”或其變例如“包含”或“含有”將理解為包括所述的元件、整體或步驟，或成組的元件、整體或步驟，但不排除任何其他元件、整體或步驟或成組的元件、整體或步驟。
對于已包括在本說明書中的文獻(xiàn)、文件、材料、裝置、論文等的討論僅僅是為了提供本發(fā)明上下文的目的。其不應(yīng)看著是承認(rèn)任何或所有這些內(nèi)容形成現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)的部分或是在本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域中的公知的常識，正如在本申請的各個全力要求的優(yōu)先權(quán)日之前澳大利亞已存在。
為了使本發(fā)明可更清晰地理解，優(yōu)選的形式將參照下列附圖和實施例來進(jìn)行描述。
圖2表示對利用基于膜的層析從其他血漿成分中分離出的IgG進(jìn)行SDS PAGE分析的結(jié)果。
圖3表示對利用基于膜的層析和離子交換層析從其他血漿成分中分離出的IgG進(jìn)行非還原性SDS PAGE分析的結(jié)果。
圖4表示對利用流程1從Cohn II、III糊狀物中分離出的IgG進(jìn)行SDS PAGE分析的結(jié)果。
圖5表示對利用流程2從Cohn II、III糊狀物中分離出的IgG進(jìn)行SDS PAGE分析的結(jié)果。
圖6表示對利用流程3從Cohn II、III糊狀物中分離出的IgG進(jìn)行SDS PAGE分析的結(jié)果。
圖7表示對利用流程4從Cohn II、III糊狀物中分離出的IgG進(jìn)行SDS PAGE分析的結(jié)果。
圖8表示對白蛋白缺乏的血漿(albumin depleted plasma)進(jìn)行SDSPAGE分析的結(jié)果。
圖9表示強(qiáng)陰離子交換純化的SDS PAGE分析。


圖10表示纖溶酶原的蛋白質(zhì)印跡及其對應(yīng)的SDS PAGE分離。
圖11表示弱陰離子交換純化的SDS PAGE分析。
圖12表示對蛋白質(zhì)A層析純化的IgG進(jìn)行SDS PAGE分析的結(jié)果。
實施本發(fā)明的方式裝置電泳系統(tǒng)可適用于本發(fā)明的基于膜的電泳裝置包括(a)陽極區(qū)中的陽極；(b)陰極區(qū)中的陰極，該陰極相對于陽極放置以便適合在陽極和陰極之間施加電壓后在其電場區(qū)間產(chǎn)生電場；(c)分離膜，其置于電場區(qū)中；(d)第一限制性膜，其置于第一電極區(qū)和分離膜之間，以限定其中的第一空隙體積(流1)；(e)第二限制性膜，其置于第二電極區(qū)和分離膜之間，以限定其中的第二空隙體積(流2)；(f)裝置，其適合給陽極區(qū)、陰極區(qū)以及第一和第二空隙體積(流1和流2)中的至少一種提供溶劑；(g)裝置，其適合在第一空隙和第二空隙體積中所選擇的一種中提供樣品組分，其中在施加電壓后，將選擇的分離產(chǎn)物通過至少一種膜從樣品組分中移出，并提供給第一和第二空隙體積的另一種或陽極區(qū)或陰極區(qū)。
在一個優(yōu)選的形式中，該裝置進(jìn)一步包括(h)裝置，其適于去除裝置中所產(chǎn)生的熱。
優(yōu)選地，將樣品和流體通過熱交換器去除在電泳過程中由裝置所產(chǎn)生的熱。
通過任何合適的泵送裝置給陽極區(qū)和陰極區(qū)提供合適的溶劑或緩沖液。將待處理的樣品通過任何合適的泵送裝置直接提供給第一或第二空隙體積。
優(yōu)選地，將區(qū)和空隙體積裝配以允許各自流體/緩沖液和樣品溶液流動形成流。在這種形式中，可快速和有效處理大體積。通常采用合適的泵送裝置，將溶液從各自庫中運動或再循環(huán)通過區(qū)和體積。在優(yōu)選的實施方案中，蠕動泵用作泵送裝置來使樣品、緩沖液和樣品溶液運動。
在一個實施方案中，電極緩沖液、其他緩沖液和樣品溶液通過任何合適裝置冷卻以確保在分離工藝過程中不發(fā)生小分子(mieromolecule)、化合物或大分子的失活，并且維持裝置在使用時的所需溫度。
優(yōu)選地，為了收集和/或濃縮分離的組分，將含有任何分離的成分或分子的體積或流中的至少一種中的溶液收集并用合適的溶劑置換以確保電泳可以有效方式持續(xù)。
通常在使用時，樣品放置在第一空隙體積(流1)中，緩沖液或溶劑提供給電極區(qū)和第二空隙體積(流2)，將電壓施加到電場區(qū)，導(dǎo)致樣品中的至少一種組分運動到陽極區(qū)中的緩沖液/溶劑或第二空隙體積中的緩沖液/溶劑中。
人們會認(rèn)識到，空隙體積的次序可以顛倒過來，其中樣品放置在第二空隙體積中，將緩沖液或溶劑提供給電極區(qū)和第一空隙區(qū)，將電壓施加到電場區(qū)，導(dǎo)致樣品中的至少一種組分運動到陰極區(qū)中的緩沖液或第一空隙體積中的緩沖液中。
將樣品放置在一個(或兩個)電泳區(qū)并移動到在施加電壓過程中所獲得的一個或多個空隙體積中，這也是可行的。
分離膜優(yōu)選是包含聚丙烯酰胺的電泳分離膜，其具有限定的截留分子量。優(yōu)選地，電泳分離膜的截留分子量約為1kDa到約200kDa。選擇分離膜的截留分子量將依賴于處理樣品以及混合物中的其他分子。然而，人們會理解，其他膜化學(xué)或組分可用于本發(fā)明中。
第一和第二限制性膜優(yōu)選由聚丙烯酰胺形成，并且通常具有少于分離膜的截留分子量，優(yōu)選從約1kDa到約1000kDa。選擇限制性膜的截留分子量將依賴于處理樣品以及待移出大分子的大小。限制性膜可具有相同或不同的截留分子量，形成不對稱的排列。
在一個優(yōu)選的形式中，形成第一和第二空隙體積的膜作為位于裝置的電極區(qū)之間的濾筒(cartridge)或盒提供。該濾筒的構(gòu)造優(yōu)選是具有位于第一和第二限制性膜之間分離膜的構(gòu)架，由此形成所需空隙體積。
優(yōu)選地，濾筒或盒可從適合含有或接受該濾筒的電泳裝置中除去。
電極間的距離對通過膜分離樣品組分的移動具有影響。電極間的距離越短，則組分的泳動越快。已發(fā)現(xiàn)約6mm的距離對實驗室規(guī)模的裝置是合適的。對于放大版本來說，距離將依賴于分離膜的數(shù)目和類型、樣品室的大小和體積、緩沖液和分離的產(chǎn)物。優(yōu)選的距離將在約6mm到約10cm的級別。距離還會涉及所施加到裝置上的電壓。
電場的效應(yīng)基于下列等式e＝V/d(e＝電場，V＝電壓，d＝距離)所以，電極間的距離越小，則分離越快。優(yōu)選地，為了增加電場強(qiáng)度，電極間的距離應(yīng)減小，由此進(jìn)一步提高通過膜的轉(zhuǎn)移速率。
樣品/緩沖液/流體的流速對分離組分具有影響。所用速率為從ml/分鐘到多達(dá)1/分鐘，這依賴于裝置的構(gòu)造、待分離樣品的性質(zhì)和體積。當(dāng)前在實驗室規(guī)模的儀器中，優(yōu)選的流速約為20±5ml/分鐘。然而，從約0ml/分鐘到約50,000ml/分鐘的流速用于越過各種分離組件(regimes)。最大流速甚至更高，這依賴于泵送裝置和裝置大小。流速的選擇依賴于待轉(zhuǎn)移產(chǎn)物、轉(zhuǎn)移效率、前和后安置的其他應(yīng)用。
選擇或應(yīng)用所施加的電壓和/或電流依賴于分離而發(fā)生變化。通常采用高達(dá)數(shù)千伏的電壓，但電壓的選擇和變化將依賴于裝置的構(gòu)造、緩沖液以及待分離的樣品。在實驗室規(guī)模的儀器中，優(yōu)選的電壓約為250V。然而，依賴于轉(zhuǎn)移、效率、放大以及特定方法，采用從約0V到約5000V的電壓。也可考慮更高的電壓，這取決于裝置和待處理樣品。
任選地，電壓可被周期性停止和/或逆轉(zhuǎn)以導(dǎo)致已進(jìn)入膜的組分返回到其來自的體積或流，而基本上不會導(dǎo)致已完全通過膜的任何組分反過來再通過膜。
電位的逆轉(zhuǎn)是任選的，但是另一替代是休止期。休止(不施加電位的時期)是任選的步驟，其可代替任選的電勢逆轉(zhuǎn)或包括在任選電位逆轉(zhuǎn)之前或之后。該休止技術(shù)經(jīng)?？舍槍μ囟ǖ姆蛛x應(yīng)用進(jìn)行操作，作為逆轉(zhuǎn)電壓的替代或輔助技術(shù)。
為了方便起見，第一空隙體積或流稱為流1，以及第二空隙體積或流稱為流2。通常，樣品放置于流1中，以及導(dǎo)致組分通過分離膜移動到流2中。
上述系統(tǒng)由Gradipore Limited，Australia生產(chǎn)，并且稱為GradiflowTM技術(shù)。GradiflowTM是Gradipore Limited的商標(biāo)。應(yīng)用本發(fā)明的一個應(yīng)用在于商業(yè)化處理血漿以生產(chǎn)衛(wèi)生行業(yè)中所用的眾多血液產(chǎn)物。其他應(yīng)用包括但不限于從奶源中分離重組蛋白以及分離單克隆抗體。
對血漿蛋白生產(chǎn)中所用的柱層析流程的初步研究已鑒定了若干要點的基于膜電泳技術(shù)的應(yīng)用。圖1突出了這些方面。綜合要點1冷沉是最初的分級分離步驟，并且是在純化流程中仍采用沉淀的唯一要點。結(jié)果，這僅是需要離心和/或過濾的階段，由此擔(dān)當(dāng)整個流程中的瓶頸。
然而，這是將因子VIII從von Willibrand因子(VWF)和纖維蛋白原中分離的步驟。因子VIII是血漿分級分離市場的傳統(tǒng)成本驅(qū)動器之一，并且許多其他下游處理都是基于因子VIII的需求和供給。用基于膜的電泳技術(shù)取代冷沉將保證便宜同時更有效的蛋白預(yù)分級分離的方法。綜合要點2止血因子II、IX、X和蛋白C的生產(chǎn)中的中間離子交換步驟是可采用基于膜的電泳技術(shù)的一個點。該工藝中需要兩個或多個柱步驟可由單個基于膜的電泳工藝所取代，因此，由于基于膜的電泳可擔(dān)當(dāng)并存的去污染步驟，無需額外的質(zhì)量保證(QA)，使病原體污染的風(fēng)險最低。該綜合的要點還會縮短處理時間并提高處理的效率以及產(chǎn)物的天然性。綜合要點3白蛋白和IgG生產(chǎn)中的最終中間步驟是最可能的用基于膜的電泳技術(shù)取代的候選步驟。離子交換和凝膠過濾步驟是相對非特異的(不象親和層析)，因此可容易被新技術(shù)所替代。當(dāng)它們在利用常規(guī)技術(shù)的流程中較早期得到純化時，消除了使其他有價值的血漿組分(即止血因子)失活的風(fēng)險。多柱步驟可被去除，結(jié)果，效率得到提高，以及減少了QA的要求。除此以外，本發(fā)明人知曉基于膜的電泳技術(shù)為生產(chǎn)高質(zhì)量白蛋白和IgG增添了相當(dāng)可觀的優(yōu)勢。
盡管Cohn分級分離是用于分級分離血漿的主要過程，但是其他過程采用硫酸銨和PEG沉淀。因而，基于膜的電泳技術(shù)也可用于這些過程中以獲得有用的產(chǎn)物。試驗I、代替Cohn-Oncley冷乙醇沉淀背景及目的Cohn-Oncley乙醇分級分離仍以修飾形式用于大規(guī)模血漿分級分離的早期階段。眾多生產(chǎn)商將這-老法與陰離子交換層析、巴士德殺菌以及化學(xué)處理一起用于他們當(dāng)今免疫球蛋白生產(chǎn)流程中。以基于膜相關(guān)的電泳技術(shù)來取代此過程的Cohn分級分離成分是有潛力的。采用IgG為模型，本項目旨在研究電泳的潛在用途并將所得產(chǎn)物與采用常規(guī)流程的產(chǎn)物進(jìn)行比較，以及通過膜相關(guān)的電泳建立IgG純化。大小截留這些試驗的目的是采用膜相關(guān)的電泳把血漿處理成高和低分子量的組分。血漿蛋白的這種區(qū)段化將簡化它們進(jìn)一步的純化，模仿Cohn/Oncley乙醇沉淀過程。方法進(jìn)行三個實驗來確定那個濾筒構(gòu)造將產(chǎn)生所需的分離。15ml的1∶3稀釋的血漿用作流1中的出發(fā)材料，以及10ml的緩沖液用作流2中的出發(fā)材料。利用65mM Tris/硼酸緩沖液pH 9.0進(jìn)行實驗，大約1.8L的緩沖液裝載到緩沖液流中。所用的三個濾筒構(gòu)造如下5-‘100’-5(上限膜-‘分離膜’-下限膜)5-‘200’-5(上限膜-‘分離膜’-下限膜)5-‘500’-5(上限膜-‘分離膜’-下限膜)所有分離以250V、150mA在正向極性下進(jìn)行約500分鐘。每小時收集流2，用10ml的緩沖液替換。利用0D280nm的吸光度、SDS-PAGE以及濁度測定法進(jìn)行分析。結(jié)果在運轉(zhuǎn)過程中，所有分離導(dǎo)致出發(fā)樣品中的絕大多數(shù)IgG保留到流1中。選擇使用5-‘200’-5濾筒的分離具有最好的結(jié)果，因為其在流1中保留了＞80％的IgG而使得白蛋白幾乎全部轉(zhuǎn)移到流2中。這是有利的，因為白蛋白在人血漿中是最豐度的蛋白。圖2表示兩個凝膠分析5-‘200’-5運轉(zhuǎn)的流1和流2樣品。結(jié)論利用5-‘200’-5濾筒進(jìn)行分離導(dǎo)致兩個組分。一個組分是含有大小大于～150kDa的絕大多數(shù)蛋白的高分子量樣品。另一組分是含有大小小于～120kDa的絕大多數(shù)蛋白的低分子量樣品。這些組分可用作進(jìn)一步純化的出發(fā)材料。
利用離子交換從高分子量組分中部分純化IgG這些實驗的目的是利用離子交換層析從高分子量組分中部分純化IgG。方法所用的層析系統(tǒng)是Amersham Pharmacia的AKTA Prime元件。柱為Pharmacia的5ml HiTrap-Q Sepharose HP離子交換柱。結(jié)合緩沖液為20mM Tris/HCl pH8.0，洗脫緩沖液為20mM Tris/HCl pH8.0+1MNaCl。采用下列方案100％洗脫緩沖液100％結(jié)合緩沖液用結(jié)合緩沖液注射樣品40-90％洗脫梯度，25ml＠3ml/分鐘3ml組分100％洗脫緩沖液利用非還原性SDS-PAGE、天然PAGE對組分進(jìn)行分析，以及蛋白質(zhì)印跡分析非還原性SDS-PAGE上的IgG。結(jié)果單一峰跨越組分3-6(圖3)。圖4所示的非還原性SDS-PAGE顯示絕大多數(shù)蛋白在組分4和5中。
該凝膠的蛋白質(zhì)印跡導(dǎo)致組分4和5中的大多數(shù)蛋白產(chǎn)生陽性信號。結(jié)論在運轉(zhuǎn)前僅進(jìn)行預(yù)防性注射器過濾，通過整合到層析系統(tǒng)從出發(fā)材料中獲得純的IgG。這與大多數(shù)Cohn/Oncley制劑形成對比，所述制劑在傳遞到進(jìn)一步層析處理之前要求離心。II.利用基于膜的電泳從Cohn II、III糊狀物中純化IgG目的利用電泳裝置(Gradipore BF200)從Cohn II、III糊狀物中純化IgG至高的純化程度，來代替常規(guī)純化流程中的層析位置。方法在源自Sigma的Cohn II、III糊狀物上進(jìn)行IgG純化流程的開發(fā)。開發(fā)出若干條路線，各路線提供稍有差異的結(jié)果的組合。若干條流程包括為應(yīng)用特異制成的膜。下列是所選擇的最終方案的總結(jié)。結(jié)果流程1濾筒構(gòu)造5-‘200’-5(上限膜-‘分離膜’-下限膜)-分離膜允許IgG通過。
緩沖液具有0.1％Tween 20的GABA/醋酸＠pH5.0。
運轉(zhuǎn)時間160分鐘流2中產(chǎn)率＞90％流程2濾筒構(gòu)造5-‘100’-5(上限膜-‘分離膜’-下限膜)分離膜阻止IgG通過。
緩沖液具有0.1％Tween 20的GABA/硼酸＠pH9.0。
運轉(zhuǎn)時間180分鐘流1中產(chǎn)率＞90％流程3濾筒構(gòu)造5-‘100’-5(上限膜-‘分離膜’-下限膜)-分離膜阻止IgG通過。
緩沖液具有0.1％Tween 20的GABA/醋酸＠pH5.0。
運轉(zhuǎn)時間180分鐘流2中產(chǎn)率＞90％流程4-兩相第一相濾筒構(gòu)造5-‘100’-5(上限膜-‘分離膜’-下限膜)分離膜阻止IgG通過。
第一相緩沖液具有0.1％Tween 20的Tris/硼酸＠pH9.0第一相運轉(zhuǎn)時間180分鐘第一相產(chǎn)率＞90％第二相濾筒構(gòu)造5-‘100’-5(上限膜-‘分離膜’-下限膜)分離膜阻止IgG通過。
第二相緩沖液具有0.1％Tween 20的GABA/乙酸＠pH5.0第二相運轉(zhuǎn)時間240分鐘第二相產(chǎn)率～70％。
利用濁度測定法獲得產(chǎn)率結(jié)果以及利用SDS-PAGE分析確定純度。除了兩相方案以外，運轉(zhuǎn)導(dǎo)致IgG大于90％的回收率。與治療性IVIG產(chǎn)品Gamimune(Bayer)比較，所達(dá)到的純化程度是相似的。流程1、3和4中所用的分離膜也顯示在實驗中，其中加入豬細(xì)小病毒以限制豬細(xì)小病毒進(jìn)入流1中，而讓IgG轉(zhuǎn)移到流2中。
流程1、2、3和4的分離結(jié)果分別顯示在圖4、5、6和7中。結(jié)論上述方案可用于以高純度和高產(chǎn)率從Cohn II、III中純化IgG。絕大多數(shù)污染物已去除到顯著水平。這對劣級的出發(fā)材料來說產(chǎn)生好的結(jié)果。III.利用各種層析方法從白蛋白-缺乏的血漿中純化IgG背景及目的一種基于膜的電泳的商業(yè)化應(yīng)用是實施到常規(guī)的血液分級分離流程中。為了提高分離，設(shè)計方法去掩蓋實施該過程內(nèi)的不同點的一個或多個電泳步驟。在此實驗中，利用層析方法(與那些商業(yè)化生產(chǎn)中日常所用的方法相似)，將通過基于膜的電泳所得到的樣品進(jìn)一步純化。該方案的目的是從利用基于膜的電泳技術(shù)所衍生的白蛋白缺乏的血漿樣品中純化IgG。出發(fā)材料采用下列構(gòu)造進(jìn)行大規(guī)模(100×)基于膜的電泳運轉(zhuǎn)膜塊5kd-200Kd-5kD(上限膜-‘分離膜’-下限膜)×5緩沖液具有0.1％Tween 20的Tris硼酸pH8出發(fā)樣品2L 1∶3 Clinisys血漿(以1∶3稀釋在緩沖液中)運轉(zhuǎn)條件590V、25A、10C、5小時，每隔0.5小時收集這種運轉(zhuǎn)的目的是將絕大多數(shù)白蛋白轉(zhuǎn)移到流2中。流1中剩余的樣品是白蛋白缺乏的血漿。圖8是該樣品的SDS-PAGE分析。利用強(qiáng)陰離子交換層析從白蛋白缺乏的人血漿(利用基于膜的電泳技術(shù)制備)中純化IgG目的為了在廠商文件中所提供的條件下，利用強(qiáng)陰離子交換層析，從白蛋白缺乏的人血漿中純化IgG。方法為實驗設(shè)計下列系統(tǒng)元件AktaPrime APBiotech層析系統(tǒng)柱APBiotech的5ml HiTrapQ HP強(qiáng)陰離子交換柱結(jié)合緩沖液20mM Bis-Tris丙烷pH6.5(用HCl調(diào)節(jié)pH)洗脫緩沖液20mM Bis-Tris丙烷pH6.5(用HCl調(diào)節(jié)pH)+1MNaCl出發(fā)材料用結(jié)合緩沖液1∶5稀釋的5ml白蛋白缺乏的血漿。
該系統(tǒng)旨在結(jié)合絕大多數(shù)的污染蛋白，并在結(jié)合步驟過程中讓IgG流過。結(jié)果獲得洗脫到組分2和組分3中的肩峰。在圖9道3和道4中可見SDS-PAGE分析的組分。
兩個IgG組分的濁度測定顯示存在于出發(fā)材料中的～80％的IgG洗脫在組分中。
利用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)，也進(jìn)行纖溶酶原去除的分析。將富含IgG的組分與血漿和白蛋白缺乏的血漿出發(fā)材料比較。印跡和相應(yīng)的SDS-PAGE的結(jié)果顯示于下圖10中。
印跡顯示層析步驟純化IgG，而沒有可見的纖溶酶原存在于樣品中。結(jié)論采用強(qiáng)陰離子交換成功地從通過基于膜的電泳所獲得的白蛋白-缺乏的血漿樣品中純化IgG。IgG的純度是極佳的，其在用考馬斯亮蘭染色的SDS PAGE上為單一條帶。在回收的出發(fā)材料中，IgG的產(chǎn)率大于80％。純化還顯示纖溶酶原的含量降低到可檢測限度以下。這說明了用層析使基于膜的電泳產(chǎn)物更純的優(yōu)點。利用弱陰離子交換層析從白蛋白缺乏的人血漿中純化IgG目的為了在廠商文件中所提供的條件下，利用弱陰離子交換樹脂，從白蛋白缺乏的人血漿中純化IgG。方法為實驗設(shè)計下列系統(tǒng)元件AktaPrime APBiotech層析系統(tǒng)柱APBiotech的20ml HiPrep 16/10 DEAE FF弱陰離子交換柱結(jié)合緩沖液20mM L-組氨酸pH5.20(用HCl調(diào)節(jié)pH)洗脫緩沖液20mM L-組氨酸pH5.20(用HCl調(diào)節(jié)pH)+1M NaCl出發(fā)材料用結(jié)合緩沖液1∶5稀釋的5ml白蛋白缺乏的血漿。
該系統(tǒng)旨在結(jié)合絕大多數(shù)的污染蛋白，并在結(jié)合步驟過程中讓IgG流過。結(jié)果產(chǎn)生洗脫到組分3到組分5的寬峰。在圖11道4到道6中可見SDS-PAGE分析的組分。
IgG組分的濁度測定法顯示，檢測到僅～30％的IgG存在于出發(fā)材料中。結(jié)論采用弱陰離子交換成功地從通過基于膜的電泳所獲得的白蛋白-缺乏的血漿樣品中純化IgG。低回收率可能是離子交換層析程序的特點。利用蛋白A親和柱層析從白蛋白缺乏的人血漿中純化IgG目的為了利用蛋白A親和柱層析和開發(fā)的應(yīng)用方法從白蛋白缺乏的人血漿中純化IgG。方法所用方法是采用柱，基于由APBiotech提供的應(yīng)用模板。為實驗設(shè)計下列系統(tǒng)元件AktaPrime APBiotech層析系統(tǒng)柱APBiotech的1ml HiTrap蛋白A結(jié)合緩沖液100mM磷酸鈉+100mM檸檬酸鈉pH7.0(用NaOH調(diào)節(jié)pH)洗脫緩沖液100mM磷酸鈉+100mM檸檬酸鈉pH3.0(用HCl調(diào)節(jié)pH)出發(fā)材料用結(jié)合緩沖液1∶5稀釋的5ml白蛋白缺乏的血漿。
該系統(tǒng)旨在使IgG結(jié)合到柱上，并讓絕大多數(shù)污染物流過柱。然后洗脫和收集IgG。結(jié)果獲得主要洗脫到第2組分和第3組分中的窄峰。在圖12道5和道6中可見SDS-PAGE分析的組分。
IgG組分的濁度測定法顯示，檢測到70％以上的IgG存在于出發(fā)材料中。結(jié)論采用蛋白A親和層析成功地從通過基于膜的電泳所獲得的白蛋白-缺乏的血漿樣品中純化IgG。IgG的純度是良好的，在IgG的單一條帶下方僅有微不足道的蛋白污點(正如在用考馬斯亮蘭染色的SDSPAGE上所見)。通過檢測主要的IgG組分，出發(fā)材料中IgG的產(chǎn)率大于70％。
人們會認(rèn)識到，蛋白G還可用于不結(jié)合蛋白A的免疫球蛋白。
基于膜的電泳整合到現(xiàn)有血漿分級分離流程中的優(yōu)點Cohn組分取代本發(fā)明在此方式中的優(yōu)點包括-來自Cohn組分的回收率可比利用層析得到的更高。只有層析通常產(chǎn)生不大于70％的出發(fā)產(chǎn)物，而基于膜的電泳可產(chǎn)生80％和更高的回收率。差異是顯著大的，因為每1％的IVIG產(chǎn)物約等于900萬美元的銷售額。
-基于膜的電泳的樣品制備比用柱即預(yù)過濾更少-在大小和/或電荷基礎(chǔ)上所獲得的高純度-特異污染物的去除-原位病毒、細(xì)菌和朊病毒以及熱原清除-可線性放大規(guī)模與常規(guī)方法整合-回收率比Cohn分級分離更高。通常Cohn導(dǎo)致可得到的IVIG損失大約50％。如上所討論，這等于相當(dāng)可觀的貨幣成本-單相與多沉淀步驟相反。這不需要基本設(shè)施，導(dǎo)致引入污染物的機(jī)會更小，以及使質(zhì)量保證成本最低-無需離心/過濾去除沉淀材料，因為靶分子在全過程中都維持在溶液中。這是當(dāng)今過程中的主要瓶頸-在基于膜的電泳粗捕獲之后的產(chǎn)物比由Cohn所得到的更精細(xì)。這潛在地導(dǎo)致在若干修飾步驟后的產(chǎn)品比當(dāng)今可得到的質(zhì)量更高-在流程中病毒和朊病毒以及熱原清除-利用層析去除特異污染物基于膜的電泳與其他純化方法整合的總體優(yōu)點-最低限度的中斷總的處理流程-由于現(xiàn)有Cohn和層析技術(shù)，資本支出較少-作為已經(jīng)認(rèn)可的現(xiàn)有技術(shù)，調(diào)節(jié)干擾較少-產(chǎn)品更安全-柱壽命長-柱效率提高-無需基本設(shè)施-由于利用的是可代替/一次性濾筒，無需重新裝填柱-不要求柱殺菌過程盡管從血漿中分離血液產(chǎn)品已經(jīng)被舉例，本發(fā)明可適用于其他大規(guī)模的商業(yè)化純化方法，包括從細(xì)胞和細(xì)胞裂解液、牛奶和奶制品中生產(chǎn)重組蛋白、抗生素以及其他微生物產(chǎn)品。
本領(lǐng)域中專業(yè)技術(shù)人員會認(rèn)識到，可對本發(fā)明作出各種各樣的變化和/或修飾，正如在特定的實施方案中所示，而無需背離本發(fā)明所泛述的實質(zhì)或范圍。所以，本實施方案在所有方面被當(dāng)作是說明性的而非限制性的。
權(quán)利要求
1.一種大規(guī)模從含有多種化合物的混合物的樣品中移出至少一種所需化合物的方法，該方法包括(a)通過一種或多種分離方法處理樣品以獲得至少含有一些所需化合物的樣品組分，所述分離方法選自親和層析、大小排阻層析、離子交換層析、疏水作用層析、假親和層析、基于膜的離子交換系統(tǒng)、制備性等電聚焦(IEF)、緩沖液交換/透析處理、沉淀、過濾、巴士德殺菌、鹽/去垢劑處理、離心、超濾及其組合；(b)將至少一些含有所需化合物的樣品組分置于電泳裝置的第一空隙體積中，所述電泳裝置包括陽極區(qū)的陽極；陰極區(qū)的陰極，所述陰極相對于陽極放置以便適合在陽極和陰極之間施加電壓后在其電場區(qū)間產(chǎn)生電場；分離膜，其置于電場區(qū)中；第一限制性膜，其置于第一電極區(qū)和分離膜之間以限定其中的第一空隙體積；第二限制性膜，其置于第二電極區(qū)和分離膜之間以限定其中的第二空隙體積；(c)給第一空隙體積提供溶劑，其中溶劑具有選擇的pH；(d)在第一和第二空隙體積之間施加電壓，其中施加電壓導(dǎo)致第一空隙體積中所選擇化合物的選擇一部分和其他成分通過分離膜遷移到第二空隙體積中，而第一空隙體積中所選擇化合物的其他部分和其他成分則被阻止進(jìn)入第二空隙體積；以及(e)維持步驟(d)直到其中一種空隙體積含有所需量的選擇化合物以形成分離樣品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包括(f)至少回收分離樣品的一部分，并將含有所需化合物的分離樣品以一種以上的分離方法進(jìn)一步進(jìn)行操作以獲得含有所需化合物的純化樣品，所述分離方法選自親和層析、大小排阻層析、離子交換層析、疏水作用層析、假親和層析、基于膜的離子交換系統(tǒng)、制備性等電聚焦(IEF)、緩沖液交換/透析處理、沉淀、過濾、巴士德殺菌、鹽/去垢劑處理、離心、超濾及其組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中步驟(c)導(dǎo)致樣品組分中的一種或多種化合物具有凈電荷或基本上是中性的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其導(dǎo)致分離樣品中的所需化合物純度至少為70％。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其導(dǎo)致分離樣品中的所需化合物純度至少為80％。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其導(dǎo)致分離樣品中的所需化合物純度至少為90％。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的方法，其中樣品為源自血液的樣品。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中源自血液的樣品為血漿。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所獲得的化合物選自因子VIII、因子IX、因子II、因子X、蛋白質(zhì)C、白蛋白、免疫球蛋白、纖維蛋白原、α1抗胰蛋白酶(AAT)以及抗凝血酶III(ATIII)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中化合物為從Cohn血漿組分中獲得的免疫球蛋白G(IgG)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項所述的方法，其中步驟(a)為冷沉。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項所述的方法，其中步驟(a)為硫酸銨沉淀和聚乙二醇沉淀。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項所述的方法，其中樣品為含有重組蛋白的牛奶。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項所述的方法，其中樣品含有單克隆抗體。
15.一種大規(guī)模從含有多種化合物的混合物的樣品中移出至少一種所需化合物的方法，該方法包括(a)將含有所需化合物的樣品置于電泳裝置的第一空隙體積中，所述電泳裝置包括陽極區(qū)的陽極；陰極區(qū)的陰極，所述陰極相對于陽極放置以便適合在陽極和陰極之間施加電壓后在其電場區(qū)間產(chǎn)生電場；分離膜，其置于電場區(qū)中；第一限制性膜，其置于第一電極區(qū)和分離膜之間以限定其中的第一空隙體積；第二限制性膜，其置于第二電極區(qū)和分離膜之間以限定其中的第二空隙體積；(b)給第一空隙體積提供溶劑，其中溶劑具有選擇的pH；(c)在第一和第二空隙體積之間施加電壓，其中施加電壓導(dǎo)致第一空隙體積中所選擇化合物的選擇一部分和其他成分通過分離膜遷移到第二空隙體積中，而第一空隙體積中所選擇化合物的其他部分和其他成分則被阻止進(jìn)入第二空隙體積；(d)維持步驟(c)直到其中一種空隙體積含有所需量的選擇化合物以形成樣品組分；以及(e)通過一種或多種分離方法回收樣品組分并處理至少一部分的樣品組分以在分離樣品中獲得所需量的所需化合物，所述分離方法選自親和層析、大小排阻層析、離子交換層析、疏水作用層析、假親和層析、基于膜的離子交換系統(tǒng)、制備性等電聚焦(IEF)、緩沖液交換/透析處理、沉淀、過濾、巴士德殺菌、鹽/去垢劑處理、離心和超濾及其組合。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中步驟(b)導(dǎo)致樣品組分中的一種或多種化合物具有凈電荷或基本上是中性的。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的方法，其導(dǎo)致分離樣品中的所需化合物純度至少為70％。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其導(dǎo)致分離樣品中的所需化合物純度至少為80％。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其導(dǎo)致分離樣品中的所需化合物純度至少為90％。
20.根據(jù)權(quán)利要求15-19任一項所述的方法，其中樣品為源自血液的樣品。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中源自血液的樣品為血漿。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所獲得的化合物選自因子VIII、因子IX、因子II、因子X、蛋白質(zhì)C、白蛋白、免疫球蛋白、纖維蛋白原、α 1抗胰蛋白酶(AAT)以及抗凝血酶III(ATIII)。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中化合物為從Cohn血漿組分中獲得的免疫球蛋白G(IgG)。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中化合物為從硫酸銨沉淀和聚乙二醇沉淀中獲得的免疫球蛋白G(IgG)。
25.根據(jù)權(quán)利要求15-24任一項所述的方法，其中步驟(e)為離子交換層析。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中離子交換層析是陰離子交換層析。
27.根據(jù)權(quán)利要求15-24任一項所述的方法，其中步驟(e)為親和層析。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中親和層析為蛋白A親和層析或蛋白G親和層析。
全文摘要
本發(fā)明提供基于膜的電泳與一種或多種常規(guī)分離技術(shù)組合使用以便從多種化合物的混合物中獲得所需化合物。采用一步或多步基于膜的電泳導(dǎo)致更快和更有效地產(chǎn)生所需化合物。
文檔編號G01N30/88GK1473067SQ01818304
公開日2004年2月4日 申請日期2001年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月30日
發(fā)明者舍米謝里·哈里哈蘭·奈爾, 安德魯·馬克·吉爾伯特, 馬克 吉爾伯特, 舍米謝里 哈里哈蘭 奈爾 申請人:格拉迪普有限公司