材料選擇性的遞送至細胞的制作方法
【專利摘要】根據(jù)所述細胞的物理性質(zhì)分離或鑒別一種細胞能夠包括提供一種細胞懸浮液；使懸浮液通過一種含有收縮部分的微流體通道；使細胞懸浮液通過收縮部分；并且，使所述細胞懸浮溶液與一種化合物進行接觸。所述收縮部分被調(diào)節(jié)尺寸從而與相對較小的細胞相比優(yōu)先使一種相對較大的細胞變形。
【專利說明】材料選擇性的遞送至細胞
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求享有2013年8月16日提交的美國臨時專利申請?zhí)枮?1/866,972的權益，該申請的全部內(nèi)容已經(jīng)通過引用并入本文。
[0003]政府支持
[0004]本發(fā)明獲得由美國國立衛(wèi)生研究院授予的R01GM101420-01A1，美國國立衛(wèi)生研究院授予的RC1EB011187-02，國立癌癥研究所授予的P30-CA-14051，以及國家科學基金會授予的GRFP主要基金號為#1122374的政府支持。該政府部門在本發(fā)明中享有某些權利。
技術領域
[0005]本發(fā)明領域涉及材料的尺寸選擇性遞送至細胞。
[0006]發(fā)明背景
[0007]材料的細胞內(nèi)遞送是一種挑戰(zhàn)。依賴于納米顆粒、電場、成孔化學等的現(xiàn)有技術能夠遞送一些材料到某些細胞類型中，但是通常針對目標細胞的物理特性是以完全無差別方式進行。通過發(fā)展依賴于目標細胞的生物特性的選擇性遞送方法，人們能夠在研究、診斷或者治療應用的遞送活性中運用多種更為有效的控制。舉例來說，循環(huán)腫瘤細胞(CTC)是在血液中發(fā)現(xiàn)的認為是介導轉(zhuǎn)移、或者癌癥的擴散的腫瘤細胞，到身體中的較遠位點。大約90%的由于癌癥導致人類死亡是由于轉(zhuǎn)移。CTC的識別與特征是用于理解、治療或者預防轉(zhuǎn)移癌癥的關鍵。此外，本領域眾所周知相對于周圍血細胞而言這些細胞具有不同的物理特性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明主題提供了基于物理特性用于選擇性為一種或多種細胞遞送材料的裝置、系統(tǒng)和方法，所述物理特性例如是尺寸、體積、直徑、胞液粘度或膜硬度。舉例來說，材料可以以細胞尺寸依賴的方式進行遞送。含有不同尺寸細胞的細胞懸浮液可穿過有目標遞送材料(例如，染料，蛋白質(zhì)，核苷酸等等)存在的裝置，并且這些材料能夠選擇性地遞送到在種群中的較大細胞。通過較大細胞的細胞膜的選擇性破壞的數(shù)據(jù)中的遞送機制是因為其是在通道收縮部分中變形，而較小的細胞不會變形從而足以引起膜破壞。
[0009]在一些示例性應用中，能夠得到相對于非腫瘤細胞而言標記的細胞。細胞通過一種裝置用于使用熒光染料或者其他檢測的標記物進行尺寸選擇性標記。所述細胞任選用抗體進行染色，例如腫瘤細胞選擇性抗體比方說抗CD45抗體，從而提供在癌癥細胞和血細胞(大部分血細胞是⑶45+)之間的進一步對比。樣品通過一種細胞分選器，例如一種標準熒光活化細胞分選器(FACS)。
[0010]在一些示例性應用中，能夠得到依據(jù)它們的細胞周期的細胞的標記，因為在的種群中接近分裂的細胞比那些剛剛經(jīng)歷過分裂的細胞更大。向在種群中的較大細胞的染料的遞送能夠用于鑒定在細胞周期較后面的階段過程中的單個細胞。
[0011]在一些示例性應用中，用于血癌(例如淋巴瘤)的治療可以實現(xiàn)，因為淋巴瘤細胞通常比周圍血液細胞大，因此一種細胞內(nèi)毒素能夠遞送到淋巴瘤細胞中而不是健康的周圍血細胞中。從而，這可以誘導患病細胞的選擇性地死亡。
[0012]標記的細胞可以通過熒光或者磁性純化技術進行分離。使用機器人操縱的流式細胞儀或者微陣列能夠被用于根據(jù)熒光性選擇細胞，同時能夠使用磁鐵柱、微流分離系統(tǒng)、或磁力清掃器來分離磁標記的顆粒。
[0013]細胞可以基于相對尺寸或者直徑從而進行識別。因此，相對較大的細胞選擇性地或者優(yōu)先地選取標記，這是由于在較大的細胞中細胞膜的破壞程度相對較大，即，相對于較小的細胞，較大的細胞以一種較大程度進行變形。由于較大細胞的較大程度的細胞膜破壞，相對于較小細胞而言，至少10 %、25 %、50 %、2-倍、5-倍、10-倍、100-倍或者更多的有效負載分子獲取進入到較大細胞的內(nèi)部(細胞質(zhì))。作為根據(jù)上述的方式的可檢測的標記的攝取的結果以及按照標記的攝取進行的后續(xù)分類，與在外周血中的純度水平相比，多種腫瘤細胞可被增強100倍、I，000倍、或者高達10，000倍或者更多。純度的評估是通過靶向/連接到已知標記上的抗體進行的，其中所述標記通過腫瘤細胞被表達/過表達?？蛇x擇地，針對標記的抗體，沒有被腫瘤細胞所表達，但是會被血細胞所表達/過表達(CD45是一個示例)。兩種方式都有助于提供增加的對比度從而分類所感興趣的細胞。
[0014]具有高尺寸-標記熒光和低⑶45熒光的樣品被捕獲作為候選/潛在的CTC13FACS輸出在本質(zhì)上是相對的。一種“高”信號在基線控制信號至少的熒光強度的最小的十進位(十倍較高的水平)，并且一種“低”信號是在陽性控制種群之下的十進位。
[0015]本發(fā)明所述的裝置和方法提供了一種解決方案，用于解決用于怎樣從來源于患者的血液樣本中的1-10百萬的白血球中識別和/或分離大約I或者更多(2、5、10、100、1,000或者更多)的CTC的這一長期存在的問題。例如，每毫升血液ICTC是與癌癥患者臨床相關的。綜上所述，用于分離或者識別一種循環(huán)腫瘤細胞的方法包括提供一種細胞懸浮液的步驟;使溶液通過微流體通道，所述微粒體通道包括收縮部分，所述收縮部分調(diào)節(jié)尺寸用于優(yōu)選地使循環(huán)的腫瘤細胞變形，而不是白細胞變形;使細胞懸浮液通過收縮部分;并且是細胞懸浮溶液與可檢測標記進行接觸。所述溶液可通過一種微流體通道，所述微流體通道包括一種收縮部分，所述收縮部分被調(diào)節(jié)尺寸從而優(yōu)選地將一種化合物遞送到具有與其他細胞組相比相對不同的物理特性的細胞組中。所述物理特性可以包括細胞尺寸、直徑、胞液濃度和/或細胞膜硬度(例如通過傳送時間測定法進行測定，較硬的細胞通過給定的微通道與較為不硬的細胞相比更慢，如在Sharei et al.,2012,Anal.Chem.84(15):6438-6443;Cross etal.,2007,Nature Nanotechnology2:780-783中所描述的那樣)。所述接觸可以發(fā)生在變形治療之后。或者所述材料可以在變形治療之前與細胞進行預混合。CTC和白血球都會變形；但是，較大的細胞變形至一種較大程度并且因此，分子可選擇性地遞送到這些細胞中，從而治療或者標記它們。
[0016]舉例來說，所述標記包括一種可檢測標記的，例如，熒光性或者磁性示蹤的材料，例如一種染料或者顆粒。所述染料或者顆粒不需要是腫瘤特異性的?？蛇x擇地，它們差異地連接到腫瘤細胞上(例如，與非腫瘤細胞相比，至少20 %、50 %、2倍、5倍或者更多)。但是，所述方法的特異性是依據(jù)一種發(fā)現(xiàn)，其中腫瘤細胞比白血球稍大，并且所述裝置具有高度尺寸選擇性。這種尺寸差異依賴于腫瘤類型。例如，腫瘤細胞通常比白血球大50%-400%。因此，所遞送的材料優(yōu)選地進入到細胞中，所述細胞是足夠大的從而能夠通過細胞的尺寸特異性變形而被標記。然后所遞送的標記再依次被檢測從而識別CTC。
[0017]在一個實施例中，所述懸浮液包括全血。作為選擇地，所述細胞懸浮液是一種細胞的混合物，其在生理鹽水溶液中而不是全血中。典型地，所述細胞懸浮液包括具有患有腫瘤細胞風險或者具備被診斷為具有腫瘤的受試者的全血。例如，患者懷疑具有、被診斷具有、或者懷疑或診斷患有黑色素瘤、結腸癌、前列腺癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、腦或血液的轉(zhuǎn)移性疾病。因此，CTC的早期檢測在臨床上是重要的，因為這種檢測表示一種可能向轉(zhuǎn)移性疾病反向發(fā)展的患者的早期識別。
[0018]可選擇地，在這些細胞通過所述裝置之前，完成紅細胞溶解作為一種預處理步驟。
[0019]所述裝置的特征在于使腫瘤細胞區(qū)別于非腫瘤細胞(例如，正常的紅細胞或者白細胞)的物理參數(shù)。舉例來說，收縮部分包括從4μπ?-10μπ?的寬度，Ιμ??-ΙΟΟμπ?的長度以及串聯(lián)的1-10個收縮部分。細胞的估算速度可以是在10mm/s至10m/s的范圍內(nèi)。為了推進或者推動所述細胞懸浮液通過裝置，所述方法進一步包括將一種壓力施加至細胞。壓力被用于趨勢細胞懸浮液通過裝置，并且通過收縮點的傳輸是使細胞變形并且導致細胞膜破壞，并且進而遞送。
[0020]所述方法包括將一種可檢測的化合物誘導至腫瘤細胞中。因此，所述細胞懸浮液包括一種有效負載，或者所述方法進一步包括，在其通過收縮部分之后，在一種含有有效負載的溶液中培養(yǎng)所述細胞懸浮液一段預設的時間。舉例來說，所述有效負載包括磁性顆粒例如納米顆粒、熒光顆粒例如一種量子點或者碳納米管、或者熒光染料或者蛋白質(zhì)、或者針對熒光蛋白編碼的基因材料(DNA或者RNA)或者其他能夠檢測的化合物(例如熒光素酶)ο可替代的，可以遞送上述材料的組合，從而完成檢測以及細胞的同時操作。舉例來說，能夠遞送一種熒光顆粒從而完成排序和共遞送DNA、RNA或者蛋白質(zhì)，從而方便隨后的腫瘤細胞的生存并且刺激它們的生長和增殖分選后，從而使得能夠進一步的對培養(yǎng)的轉(zhuǎn)移細胞的研究。
[0021]在本發(fā)明中，還涉及以一種用于從非腫瘤細胞區(qū)分腫瘤細胞的系統(tǒng)，包括定義了內(nèi)腔的微流體通道，并且被配置從而使懸浮在緩沖液中的腫瘤細胞能夠經(jīng)此通過，并且與非腫瘤細胞相比對腫瘤細胞進行收縮。非腫瘤細胞可以被變形到某些程度;但是，關鍵在于對腫瘤細胞進行變形從而足以致使細胞膜破裂，反之非腫瘤細胞由于其較小的相對尺寸從而不會進行足以致使細胞膜破裂的變形。較小細胞的細胞膜不會被破壞或者相比于較大的細胞的細胞膜而言破壞較少。例如，在某些情況下，較大和較小細胞都會被破壞但是較小的細胞相對于較大的細胞會吸收較少的材料。微流體通道包括細胞變形收縮部分，其中所述收縮部分的直徑是細胞直徑的函數(shù)。所述收縮部分進行尺寸化從而相比于非腫瘤細胞會優(yōu)先地使腫瘤細胞變形。這種優(yōu)選變形被設計為選擇性地促進目標材料遞送的腫瘤細胞，與非腫瘤細胞相比。選擇性的遞送使得一種物質(zhì)富集在期望的腫瘤種群中，通過分揀/富集方法，例如流式細胞儀(FACS)、顯微操縱、磁力分離、細胞培養(yǎng)。
[0022]該方法是在生理學溫度下完成，例如37°C，室溫下，例如20°C，或者任選的在0_4°C溫度下。在某些情況中，后者是優(yōu)選的，因為其能夠產(chǎn)生較好的遞送性能，由于延遲細胞膜修復并且通過降低細胞的內(nèi)吞活性從而最大程度減小內(nèi)吞作用的背景。根據(jù)上文所述，細胞懸浮液是全血或者在作為遞送緩沖液的生理緩沖溶液(例如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)或組織培養(yǎng)基)中的任何哺乳動物細胞懸浮液。在某些實施例中，PBS是優(yōu)選的，因為降低了在組織培養(yǎng)基上的Ca或者Mg的作用。
[0023]在一個方面，根據(jù)細胞的物理性質(zhì)分離或者識別一種細胞可以包括提供一種細胞懸浮液;是懸浮液通過包括收縮部分的微流體通道;使細胞懸浮液通過收縮部分;并且使細胞懸浮溶液與化合物接觸。收縮部分能夠被尺寸化從而優(yōu)選地使與相對較小的細胞相比相對較大的細胞進行變形。
[0024]在另一個方面，用于從非腫瘤細胞中區(qū)分腫瘤細胞的微流體系統(tǒng)可以包括一種微流體通道，所述微流體通道定義一種內(nèi)腔并且被配置從而與非腫瘤細胞相比使懸浮在緩沖液中的腫瘤細胞通過并且被收縮。所述微流體通道可以包括一種細胞變形收縮部分。收縮部分的直徑可以是細胞直徑的函數(shù)。
[0025]可以包括下述特征中的一個或多個。例如，物理特性可以是尺寸和直徑中的一個或多個。細胞懸浮液能夠包括下一種或多種:外周血細胞；以及具有不同物理特性的至少兩種不同細胞尺寸。細胞懸浮液可以包括外周血細胞的紅細胞耗盡的群。較大的細胞可以包括循環(huán)腫瘤細胞，并且較小的細胞可以包括白血球O化合物可以包括0.5kDa至5Mda的分子量?；衔锟梢园?kDa至I OkDa的分子量?；衔锟梢园ㄒ环N可檢測的標記物(例如，量子點、青色素、熒光素、若丹明、以及它們的衍生物，比方說異硫氰酸熒光素(FITC)或者四甲基羅丹明異硫氰酸酯(TRITC)或者NHS-羅丹明，馬來酰亞胺活化的熒光素比如說熒光素-5-馬來酰亞胺，以及Alexa熒光劑)，活性生物分子、和/或毒素(例如，假單胞菌外毒素、白喉毒素、和蓖麻毒素，caspase蛋白質(zhì)，干擾基本細胞功能的抗體(例如，抗微管蛋白抗體))，用于選擇性地殺死目標細胞。所述化合物能夠影響細胞功能(例如，轉(zhuǎn)錄因子、s iRNA、DNA、mRNA、抗體、小分子藥物)和/或能夠誘導細胞死亡。所述化合物能夠在細胞通過收縮部分之后進入到細胞中。所述懸浮液可以包括全血。所述懸浮液可以包括患有包括腫瘤風險的受試者或者診斷具有腫瘤的受試者的全血。所述腫瘤可以包括黑色素瘤、結腸癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、腦癌、或血液癌癥。所述收縮部分可以包括的寬度為4μπι-1 Ομπι，長度為1μπι-100μπι，以及串聯(lián)的1-10個收縮部分。細胞通過收縮部分的速度可以是在lOmm/s至lOm/s的范圍內(nèi)。能夠?qū)毫糜诩毎麘腋∫簭亩?qū)使細胞通過微流體通道的收縮部分。
[0026]所述細胞懸浮液可以包括一種有效載荷，或者所述細胞懸浮液可以在其通過收縮部分之后在預定的時間內(nèi)在含有有效載荷的溶液中進行溫育。所述有效載荷可以包括磁性顆粒、熒光顆粒、例如量子點或者碳納米管、或者熒光染料或蛋白質(zhì)、或者編碼熒光蛋白的遺傳物質(zhì)(DNA或者RNA)或者其他能夠檢測的化合物(例如，熒光素酶)。所述收縮部分可以進行尺寸化從而與非腫瘤細胞相比優(yōu)先使腫瘤細胞變形。
[0027]本發(fā)明的這些和其他能力連通本發(fā)明本身在重新仔細查看下列附圖、詳細描述和權利要求書得到全面的理解。
【附圖說明】
[0028]附圖1指的是用于通過快速機械變形的尺寸選擇標記CTC的系統(tǒng)的框圖。
[0029]附圖2是柱狀圖，其顯示了將尺寸選擇遞送微流體平臺與用于CD45染色的抗體進行結合會產(chǎn)生樣品富集因子，比獨立地其他技術好超過一個量級。
[°03°]附圖3A是一種細胞標記的示意圖。使用標準紅細胞裂解試劑例如eB1scienceRBC裂解緩沖液(Cat.N0.00-4333)使紅血細胞(RBCs)通過RBC細胞溶解從全血中被消耗。所得到的懸浮液流過收縮通道微流體裝置，用熒光染料(以及任選其他化合物)進行溫育。然后將所述懸浮液用⑶45進行標記，并且在熒光激活細胞分選儀(FACS)機器上進行處理從而收集具有用熒光染料標記的非-CD45+細胞。
[0031]附圖3B是一系列共軛3kDa右旋糖酐的cascade藍的流式細胞素計數(shù)點，通過CellSqueeze裝置遞送至PBMCs (在50psi下的30-6個芯片)、HT-29(在50psi下的30-6個芯片)、SK-MEL-5 (在50ps i下的10_7個芯片)以及PANC-1 (在50ps i下的10_7個芯片)。
[0032]附圖3C是在通過收縮通道之前和之后的一系列Panc-1腫瘤細胞和血細胞的透射光和熒光顯微圖。預遞送的細胞是在染料存在下進行溫育，用于矯正背景胞吞作用。所述后遞送圖像是在遞送后24個小時拍照從而證明染料的滯留和細胞在遞送后細胞的粘附和生長能力。雖然大的血細胞還可以在處理中得到標記，但是這些數(shù)據(jù)證明了腫瘤細胞的選擇性標記。
[0033]附圖4是與在PBMC和淋巴瘤混合物中的百分I3BMC相比I3BMC遞送的圖，顯示了與健康的PBMC相比染料選擇性遞送至腫瘤細胞。即使當所述懸浮液是以數(shù)量級99.9%健康的PBCM時，在某些實施中能夠?qū)崿F(xiàn)高達8倍的遞送特異性。在另一些實施中，能夠?qū)崿F(xiàn)更高的特異性。
[0034]附圖5A是加入到全血(40細胞/ml)并且用⑶45復染法(APC)處理的四甲基若丹明右旋糖酐標記的Panc-1-GFP細胞的FACS圖。
[0035]附圖5B是GFP與CD45相比的FACS圖，證明根根據(jù)GFP熒光PANC-1GFP標記怎樣能夠單獨地被證實。P5的柵極將被作為用于排序候選CTC的基礎，P4被用于證實PANC-1GFP細胞的標識。綠色的點是精確命中(P4&P5)，紅色的點是假陽性(僅有P5 )，藍色的點是未命中(僅有 P4)0
[0036]附圖5C是HTB1760的原發(fā)腫瘤的組織病理學圖像，確定胰腺導管腺癌(PDAC)。具體實施方案
[0037]CTC是腫瘤細胞，其在血液中被發(fā)現(xiàn)，并且被認為是癌癥轉(zhuǎn)移至遠端器官的原因。CTC被認為是對于癌癥患者最小侵入性的、“液體活組織檢查”，并且是作為用于患者預后和治療功效的預后指標。這些單一細胞的全面表征提供了轉(zhuǎn)移性轉(zhuǎn)移、治療性抵抗和腫瘤生物學的更高的理解。
[0038]典型的人的紅細胞具有大約6.2-8.2μπι直徑的圓盤，以及在2_2.5μπι的最厚點的厚度;并且在0.8-1μπι中心的最小厚度，比大多數(shù)其他人類細胞小的多。白細胞(白血細胞)包括中心粒細胞(12-14μπι直徑)、嗜酸粒細胞(12-17μπι直徑)、嗜堿粒細胞(I4-16μπι直徑)、淋巴細胞(對于靜止的直徑為平均6_9μπι，并且對于激活的直徑為10-14μπι)、以及單核細胞，最大類型的白血細胞可以在直徑上高達20μπι。如附圖1所示，在CTC和血液細胞之間的尺寸差異通常允許從在循環(huán)血液(CTCs?9-20ym;RBC?8μπι盤形；白細胞?7-12μπι)中的其他細胞區(qū)分CTC。參見附圖1。隨后使用抗體(或者其細胞特異性片段)特異性標記的腫瘤細胞或者其他腫瘤細胞特異性配體提高了方法的選擇性。
[0039]由于CTC是作為一種在血流中的16-1O7單核細胞中存在，所以使用了高靈敏度富集技術其依賴于從血細胞中在CTC方面的免疫學或者形態(tài)學的差異。免疫學方法通常針對上皮細胞表面標記(例如EpCAM)以及腫瘤特異性蛋白(例如Her2-neu、MUC I/MUC2、癌胚抗原(CEA)、乳腺球蛋白、以及甲胎蛋白)或者用于消除CD45+細胞的目的。微過濾、密度梯度分離和微流體平臺是以形態(tài)學為基礎的方法的示例。CTC的所有這些方法可能下調(diào)表面抗原或者表現(xiàn)出不同的形態(tài)特征。這些偏見造成該領域的顯著挑戰(zhàn)，因為所述CTC的子集是對于新陳代謝負責或者是可靠地預后標記仍然很大程度上是未知的。因此，開發(fā)能夠確保所有候選CTC子類型的高靈敏度方案用于拍攝最為臨床相關的候選物是非常重要的。在這里所描述的裝置和方法允許感興趣的CTC子類型的分離和計數(shù)。
[0040]—種組合富集的方法結合了免疫學和形態(tài)學基礎的方法，用于標記和分離具有較少偏差的純的CTC，并且基于可調(diào)的參數(shù)。所屬方法結合了微流體細胞內(nèi)遞送(附圖1)和抗體染色，用于從全血中產(chǎn)生穩(wěn)定的、高靈敏度純化的循環(huán)腫瘤細胞(附圖2)，包括一種4μ-10ym寬，Ιμ??-ΙΟΟμπι長，以及1-10個串聯(lián)的收縮部分。細胞的估算速度可以為從10mm/s至10m/s的范圍內(nèi)。所選擇的具體的裝置參數(shù)是有目標腫瘤細胞類型所決定的，例如，不同的裝置設計被用來針對黑色素瘤患者或者是結腸癌患者進行CTC的選擇。腫瘤細胞尺寸/直徑的實施例包括:黑色素瘤?15um，結腸癌?11um，以及胰腺癌?15um。
[0041]在這種方法中，一種快速機械變形遞送系統(tǒng)利用在多種CTC和周圍血細胞之間固有的尺寸差異用于選擇性地將熒光、磁性和/或其他的區(qū)別材料遞送至腫瘤細胞。在進一步的過程中，基于抗體的熒光和/或磁性標記被用于增強候選CTC和周圍血細胞之間的對比。通過唯一地將基于尺寸和免疫學的方法與CTC分離結合，這種技術證明了用于分析的從患者樣本中無偏置分離候選腫瘤細胞的作用。在某些實施方案中，較大和較小的細胞都能夠進行變形，但是較小的細胞膜不會被變形至細胞膜受損的那一點。例如，為了選擇性地遞送至在全血細胞中的15μπι的腫瘤細胞，其中大部分健康的白細胞是?8μπι的尺寸時，可以使用一種6μπι寬的收縮部分。這種收縮部分將會同時時兩種類型的細胞變形，但是將更優(yōu)選地使15μηι的腫瘤細胞細胞膜擾亂，而不是8μηι的血細胞。
[0042]臨床/轉(zhuǎn)移相關性
[0043]目前正在探索將CTC作為用于腫瘤活檢的替代指標，用于了解抗性機制并且指導靶向療法的選擇。治療前和治療后的CTC的數(shù)量和組合物的測量表明治療效果和預后。所述方法利用了一種穩(wěn)定的、高通量的、一次性的裝置，用于根據(jù)細胞尺寸和表面抗原進行CTC的標記。此外，遞送各種大分子的能力還能夠使其遞送分子探針(例如，抗體、量子點、碳納米管、以及分子信標)，其對細胞內(nèi)環(huán)境進行應答，并且因此提供為目標細胞的細胞內(nèi)特性提供進一步的信息。這種組合方法提供了一種穩(wěn)定的平臺，能夠?qū)δ切﹥H僅依靠免疫學或形態(tài)學分離的替代方法已經(jīng)錯過的CTC種群進行富集。該技術有利于分離患者的CTC。
[0044]實施例1
[0045]全血或者其他的細胞懸浮液同時使用未標記的和/或抗體包覆的磁珠進行處理。然后使用一種作用于罕見的細胞的高保真、磁性富集系統(tǒng)對這些細胞進行分離。也可以使用一種納米孔技術用于通過從84，672亞納米級的孔的彈性陣列中對所需要的單個細胞進行成像和自動檢索從而實現(xiàn)高純度的分離。
[0046]得到不同表型的單一、活的、純凈、完整的CTC允許表征的宿主從基因組到具有立即臨床和轉(zhuǎn)移相關性的功能水平努力。該方法允許一種具有降低偏差的活的、不同的CTC的高度敏感性和特異性富集。
[0047]實施例2
[0048]磁性納米顆粒被遞送至腫瘤細胞系&PBMCS。納米顆粒遞送至EpCAM-表達的、上皮癌細胞系，例如HT-29、LNCaP、以及SK-BR-3，是與來源于人類血液的大量外周血單核細胞(PBMC)懸浮液進行比較的。
[0049]具有聚乙二醇(PEG)表面涂層的1nm氧化鐵納米顆粒被遞送至與全血混合的癌癥細胞中，并且所得到的目標細胞混合物通過使用上文所描述的細胞分離裝置進行處理。例如，微流體遞送系統(tǒng)被用于誘導細胞的快速機械變形從而生成在細胞膜中的瞬態(tài)空隙(附圖1)。所述方法已經(jīng)被證明了具有將一系列材料，包括蛋白質(zhì)、RNA、DNA以及納米顆粒遞送之多種細胞類型中的能力，并且適用于全血、通常會對微流體系統(tǒng)產(chǎn)生問題的介質(zhì)。
[0050]示例性的標記分子，例如3kDa和70kDa，熒光標記的、作為模型分子的葡聚糖聚合物，被用于單獨依據(jù)尺寸在PBMC與兩種不同的癌癥細胞系之間進行區(qū)分。所述結果還表明系統(tǒng)對于磁性顆粒選擇性遞送至血液中的腫瘤細胞的功效。PEG包覆的氧化鐵顆粒被用于磁性標記結腸癌(例如，根據(jù)細胞系HT-29所例證的)。進一步的富集是通過將FITC共軛至氧化鐵納米顆粒表面從而直接測量納米顆粒的攝取來實現(xiàn)的。
[0051 ] PEG包覆的1nm氧化鐵納米顆粒被遞送至細胞懸浮液中，所述細胞懸浮液被懷疑含有或者已知含有CTC，例如，一種來源于患者的血液樣本，或者細胞系HT-29、LNCaP、和SK-BR-3細胞，其分別于全血進行混合。然后對所得到的標記細胞混合物進行純化，例如，使用一種高保真磁分離器。所述分離器在具有高氧化鐵含量的模型CTC和效率較低標記的PBMC之間進行準確區(qū)分。任選地，在治療、納米顆粒濃度增加、它們的尺寸改變或者涉及多個處理步驟之前，紅血細胞被裂解。
[0052]實施例3
[0053]—種基于結合的免疫學和形態(tài)學的方法如下所述實施。在基于細胞尺寸通過裝置進行處理之后，用一種抗體或其他腫瘤細胞特異性配體例如熒光標記的抗一 CD45抗體對細胞進行處理。對三種不同的分離方法的敏感度和特異性進行比較:1)僅裝置，2)僅抗一 CD45抗體，3)裝置+抗一⑶45抗體。形態(tài)標記(裝置)+免疫標記(例如抗一⑶45抗體)被發(fā)現(xiàn)相對于另外兩種單獨使用的技術而言可顯示出優(yōu)異的靈敏度(附圖2)。例如，能夠觀察到于單獨的抗一CD45抗體相比，其在靈敏度方面的2-5倍的增加和/或在特異性方面的2-5倍的增加。觀察到超過一個數(shù)量級的富集指數(shù)(附圖2)。
[0054]實施例4
[0055]在一個實施例中，所述裝置是由硅和玻璃制成。可替代的，所述裝置是使用一種聚合物，例如硅氧烷、PDMS、聚碳酸酯、丙烯酸、聚丙烯、聚苯乙烯制成。任何裝置都是被滅菌的(加熱或者γ輻射)并且是一次性的。針對多種細胞類型使用材料和參數(shù)對設備的性能進行驗證。例如，在一定范圍的流速下的用PEG包覆的量子點(尺寸在10-50nm范圍內(nèi))的性能被用于確定是否納米顆粒和細胞存活率的遞送效果。示例的裝置在PCT/US2012/060646中進行描述，所述申請已經(jīng)通過引用全部并入到本文中。
[0056]優(yōu)勢
[0057]當與現(xiàn)有的方法進行比較時，可以發(fā)現(xiàn)該方法具有下述優(yōu)勢。相對于基于抗體的方法時，該方法提供了一種非偏離隔離過程，其適用于大多數(shù)癌癥類型中并且時獨立于任何特定的細胞表面標記物的。所述裝置和方法實現(xiàn)了不能夠由現(xiàn)有的標記物分離的CTC的識別，并且因此具有顯著的診斷和預后意義。
[0058]相對于現(xiàn)有的基于尺寸的分離方法，在本發(fā)明中所描述的裝置和方法提供了高很多的通量，并且是通過改變“W”(附圖1)可調(diào)的從而捕獲特定的CTC尺寸范圍。例如，一種6μπι寬的收縮部分適用于結腸癌細胞的捕獲，而一種7μι和8μπι的寬度分別適用于胰腺癌細胞和黑色素瘤細胞的捕獲。此外，與現(xiàn)有技術不同，這種系統(tǒng)可以與基于抗體的技術相結合用于增強分離敏感性和/或是CTC的子級多參數(shù)分離(例如通過分離一定尺寸+表面標記物的CTC) ο
[0059]通過使獲自一定范圍的癌癥類型的CTC的有效的、穩(wěn)定的分離，這種技術將是對抗癌癥的一種有價值的平臺。這種技術的預后和診斷連理可以使新基因鑒別，所述新基因是癌癥發(fā)展的關鍵，并且因此使得新的治療技術的開發(fā)。它也能夠提供患者期望壽命和治療效果的更精確的預測。
[0060]在這里所描述的CTC分離方法結合了免疫學和以尺寸為基礎的分離，從而得到一種高富集因子/回收率以及可調(diào)的偏置(標記特異性vs尺寸特異性)。
[0061]雖然上文只詳細描述了少數(shù)的實施例，但是其他的修改也是可能的。上文描述的實施方案可以針對公開的特征的各種組合和子組合，和/或上文描述的幾種其他特征的組合或亞組合。此外，附圖中的邏輯流程圖和/或在此的描述并不要求完全按照所示的特征順序或步驟次序來實現(xiàn)所需結果。其他的實施方案可落在以下權利要求書的范圍內(nèi)。
【主權項】
1.一種基于細胞的物理特性用于分離、鑒別、或者操作細胞的方法，所述細胞包括: 提供一種細胞懸浮液； 使所述懸浮液通過一種含有收縮部分的微流體通道，所述收縮通道被調(diào)節(jié)尺寸從而將化合物遞送至具有相對不同的物理特性的細胞組中，而不是其他的細胞組； 使所述細胞懸浮溶液與一種化合物進行接觸。2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述物理特性是尺寸、直徑和膜硬度的其中一種或多種。3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述細胞懸浮液包括外周血細胞；以及具有不同物理特性的至少兩種不同的細胞種類中的其中一種或多種。4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述細胞懸浮液包括一種外周血細胞的紅細胞去除的群。5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述較大的細胞包括循環(huán)的腫瘤細胞并且所述較小的細胞包括白細胞。6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述化合物包括0.5kDa至5MDa的分子質(zhì)量。7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述化合物包括3kDa至1MDa的分子質(zhì)量。8.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述化合物包括可檢測的標記物、活性分子和毒素的其中一種或多種。9.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中在所述細胞通過所述收縮部分之后，可檢測的標記物進入到所述細胞中。10.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述懸浮液包括全血。11.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述懸浮液包括患有腫瘤風險或者被診斷為包括腫瘤的受試者的全血。12.根據(jù)權利要求10所述的方法，其中所述腫瘤包括黑色素瘤、結腸癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、腦癌、或者血液癌。13.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述收縮部分包括的寬度為4μπ?-10μπ?，長度為1μm-ΙΟΟμπι，以及串聯(lián)的1-10個收縮部分。14.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中細胞通過收縮部分的速度是在10mm/s至10m/s的范圍內(nèi)。15.根據(jù)權利要求1所述的方法，進一步包括將壓力施用于所述細胞懸浮液用于驅(qū)使細胞通過微流體通道的收縮部分。16.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述細胞懸浮液包括一種有效載荷或者其中所述方法進一步包括在所述細胞懸浮液通過收縮部分之后將其在預定的時間內(nèi)在含有有效載荷的溶液中進行溫育的步驟。17.根據(jù)權利要求16所述的方法，其中所述有效載荷包括磁性顆粒、熒光顆粒、例如量子點或者碳納米管、熒光染料、熒光蛋白質(zhì)、編碼熒光蛋白質(zhì)的遺傳物質(zhì)(DNA或者RNA)、其他能夠檢測的化合物(例如，熒光素酶)、影響細胞功能的化合物以及誘導細胞死亡的化合物的一種或多種。18.—種用于從非腫瘤細胞中區(qū)分腫瘤細胞的微流體通道，包括: 一種定義了內(nèi)腔的微流體通道，并且被配置從而使懸浮在緩沖液中的腫瘤細胞能夠經(jīng)此通過，并且與非腫瘤細胞相比對腫瘤細胞進行收縮，其中所述微流體通道包括細胞變形的收縮部分，其中所述收縮部分的直徑是細胞直徑的函數(shù)。19.根據(jù)權利要求18所述的系統(tǒng)，其中所述收縮通道被調(diào)整尺寸從而與非腫瘤細胞相比優(yōu)先使腫瘤細胞變形。
【文檔編號】B07B1/00GK105848793SQ201480056295
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2014年8月15日
【發(fā)明人】A·R·沙瑞, V·A·阿達爾斯泰因松, N·曹, R·S·蘭格, J·C·洛夫, K·F·延森
【申請人】麻省理工學院