一種cd40胞外區(qū)的表達(dá)純化及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明設(shè)及一種CD40胞外區(qū)的表達(dá)純化及 其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] CD40-CD4化信號通路是免疫系統(tǒng)激活的輔助信號之一，抗原遞呈細(xì)胞激活T細(xì)胞 免疫不僅需要TCR M肥抗原膚信號，還需要、CD28-B7等共刺激信號，CD40-CD4化信號增加 B7. 1、B7. 2分子表達(dá)。CD40不僅在B細(xì)胞、DC細(xì)胞、巨隧細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞中表達(dá)，還廣 泛表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞、肥大細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞表面。運(yùn)也提示著CD40 具有廣泛的功能，除了前續(xù)提到的抗原遞呈作用，它還參與輔助性T細(xì)胞啟動和細(xì)胞毒性T 細(xì)胞功能，在B細(xì)胞發(fā)育和抗體類型轉(zhuǎn)換時(shí)也發(fā)揮重要作用等等。
[0003] CD40-CD40L信號通路在1型糖尿病、多發(fā)性硬化癥、炎癥性腸炎（I抓）、牛皮癖、關(guān) 節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫病中是過度激活的，阻斷該信號通路已經(jīng)在相應(yīng)小鼠模 型中（NOD小鼠、EAE小鼠、I抓小鼠、CIA、SLE小鼠）被證明可W減輕病理作用。 W04]目前阻斷該信號通路的主要策略是應(yīng)用針對CD40L的抗體，其中包括 Ruplizum油度G9588)和Toralizumab (IDEC-131)，它們早在21世紀(jì)初就進(jìn)入臨床研究， Ruplizum油在二期臨床治療SLE和腎臟移植中顯現(xiàn)出療效。但是它們都因?yàn)椴l(fā)血管栓 塞而沒能實(shí)現(xiàn)應(yīng)用。治療思路相應(yīng)轉(zhuǎn)移到針對CD40的單抗研究上，ch5D12正在進(jìn)行克羅 恩?。ɑ痮hn' S disease) -期和二期臨床試驗(yàn)，另一個(gè)CD40單抗HCD122也在進(jìn)行治療MM 和化L的一期臨床研究。 陽0化]綜上，鑒于CD40-CD4化信號通路與多種疾病存在相關(guān)性，本領(lǐng)域迫切需要進(jìn)一步 針對CD40-CD4化信號通路加 W研究，開發(fā)W該信號通路為突破口的新型治療手段或治療 藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種CD40胞外區(qū)的表達(dá)純化及其用途。
[0007] 在本發(fā)明的第一方面，提供CD40蛋白氨基端胞外區(qū)的用途，用于制備抑制腫瘤或 抑制炎癥的藥物組合物。
[0008] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的CD40蛋白氨基端胞外區(qū)是CD40蛋白第21-193位氨基酸 序列的蛋白。
[0009] 在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤是淋己瘤。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，所述的炎癥是腸炎。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述的淋己瘤是彌漫型大B細(xì)胞淋己瘤。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述的CD40蛋白氨基端胞外區(qū)是不包含CD40蛋白第20位脯氨 酸的蛋白。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物還用于：阻斷CD40-CD4化信號通路；阻斷 CD40介導(dǎo)的非經(jīng)典NF- K B信號通路的激活訊/或降低細(xì)胞內(nèi)原癌基因 cMYC的表達(dá)。
[0014] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種CD40蛋白氨基端胞外區(qū)，其是CD40蛋白第21-193 位氨基酸序列的蛋白；較佳地，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0015] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種多核巧酸，其編碼所述的CD40蛋白氨基端胞外 區(qū)；較佳地，其核巧酸序列如SEQ ID NO:2中第16-537位所示。
[0016] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于抑制腫瘤或抑制炎癥的藥物組合物，其含有 所述的CD40蛋白氨基端胞外區(qū)。
[0017] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種重組表達(dá)載體，其中包含有所述的多核巧酸。
[0018] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種重組酵母細(xì)胞，其中包含有所述的多核巧酸或含 有所述多核巧酸的重組表達(dá)載體。
[0019] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種重組表達(dá)CD40蛋白氨基端胞外區(qū)的方法，所述方 法包括：
[0020] (1)提供一重組表達(dá)載體，其包含CD40蛋白氨基端胞外區(qū)的編碼序列，所述的 CD40蛋白氨基端胞外區(qū)是CD40蛋白第21-193位氨基酸序列的蛋白；
[0021] (2)將（1)的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，獲得重組酵母細(xì)胞；
[0022] (3)培養(yǎng)（2)的重組酵母細(xì)胞，從而表達(dá)CD40蛋白氨基端胞外區(qū)。
[0023] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的酵母細(xì)胞是畢赤酵母細(xì)胞。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述的CD40蛋白氨基端胞外區(qū)的編碼序列的核巧酸序列如SEQ ID NO:2中第16-537位所示（即密碼子優(yōu)化后的序列）。
[0025] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。
【附圖說明】
[0026] 圖UCD40胞外端基因克隆和鑒定。人CD40胞外段基因 PCR擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠檢 :右側(cè)條帶為CD40-N基因條帶，左邊條帶為DNA marker :DL2000,每孔上樣均為5y 1。
[0027] 圖2、pPIC9K-CD40-N(巧構(gòu)建后化Ol NotI雙酶切鑒定：左邊泳道為基因大小分子 標(biāo)記（Marker)，剩下的8條泳道均為質(zhì)粒酶切后的樣品，Marker上樣5 y 1，其余上樣9 y 1/ 孔。
[0028] 圖3、酵母菌株表達(dá)CD40-N和Western blot鑒定（至少S次實(shí)驗(yàn)重復(fù)）。
[0029] (A)酵母菌株甲醇誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE電泳后考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果，泳道1為 Marker,左側(cè)為分子量大小對照，0,12......84小時(shí)分別為不同時(shí)間樣品，單位kD，樣品 20 y 1/孔，SDS-PAGE濃縮膠5 %，分離膠12 % ;
[0030] 度）各個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品Western blot, P為轉(zhuǎn)染CD40的肥K293T細(xì)胞樣品，作為陽 性對照。
[0031] 圖4、CD40-N表達(dá)菌株高密度發(fā)酵和表達(dá)分析（至少S次實(shí)驗(yàn)重復(fù)）。
[0032] (A)酵母發(fā)酵生長曲線，縱坐標(biāo)為吸光度0D600讀數(shù)，橫坐標(biāo)為時(shí)間；
[0033] 度）不同時(shí)間點(diǎn)發(fā)酵液上清蛋白SDS-PAGE電泳：左邊泳道為蛋白Marker,泳道 1-14 分別為 0、4、12、16、20、24、32、36、40、48、56、61 小時(shí)樣品，蛋白樣品用 SXloading 煮沸 10分鐘后每孔上樣14 y 1，Marker上樣5 y 1/孔，單位kD，SDS-PAGE膠：濃縮膠5 %，分離 膠 12%。
[0034] 圖5、蛋白純化和糖基化分析（至少=次實(shí)驗(yàn)重復(fù)）。
[0035] (A)凝膠過濾層析圖（S巧hadex G-50)，Y軸為0D280皿吸收值，X軸為流過層析柱 的體積（單位：ml)，藍(lán)色線為樣品0D280nm吸收值值，紅色為0D254nm吸收值；
[0036] (B)離子交換層析圖怕Se地arose Fast Flow)，XY軸與A圖相同，垂直線為標(biāo)記， 標(biāo)記線后開始0-1. OM化Cl線性洗脫，箭頭處為目標(biāo)蛋白洗脫下來位置；
[0037] (C) SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色圖，各泳道名稱見上面標(biāo)注，M表示Marker, 1-1、 1-2、1-3分別表示第一個(gè)吸收峰收集的=管，左側(cè)為分子量大小，單位kD ; W38] 值）糖膚酶F (PNGase巧處理樣品后SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果，M表示 Marker, CON為對照組，PNGaseF為糖膚酶F處理組，PNGaseF組中35kD處為糖膚酶F (細(xì)箭 頭標(biāo)識）。SDS-PAGE中樣品上樣量為Marke巧y 1/孔，樣品20 y 1/孔，單位kD，SDS-PAGE 濃縮膠5%，分離膠12%。
[0039] 圖6、CD40N阻斷CD40-CD4化信號通路（至少S次實(shí)驗(yàn)重復(fù)）。
[0040] (A) CD40-N可W阻斷G28-5對于BJAB細(xì)胞中非經(jīng)典NF- K B信號通路的激活， G28-5 為 lug/ml，CD40N 為 lOug/ml，* 為非特異性帶； 陽OW 度）不同濃度的CD40-N可W阻斷CD40-L激活的非經(jīng)典NF-KB信號通路，0.1、1、 10 分別表不 0. 1、1、lOug/ml，CD40-L 為 lug/ml。
[0042] 圖7、CD40N可W減少病人來源的DLB化細(xì)胞存活。左圖為病人來源的DLB化細(xì)胞 (PDC)體外不加入和加入骨髓來源的基質(zhì)細(xì)胞度MSC) W及加入和不加入CD40-N后培養(yǎng)后 進(jìn)行流式檢測結(jié)果（左上角圖為不加入BMSC和CD40-N，左下角圖加入BMSC，右上角圖加入 CD40-N，右下角圖加入BMSC和CD40-N);右圖左圖的量化結(jié)果，CD40-N為lOug/ml。至少S 次實(shí)驗(yàn)重復(fù)，**P<〇. 01。
[0043] 圖 8、CD40-N 抑制 DLB(X 值iffuse large B-cell lymphoma)腫瘤組織塊體內(nèi)生 長。 W44] (A)病人來源的淋己瘤組織移植到裸鼠腎囊膜下，經(jīng)過5次傳代穩(wěn)定。取一只裸鼠 體內(nèi)淋己瘤組織塊移植到10只裸鼠腎囊膜下，1周后將帶瘤老鼠分為兩組，一組腹腔注射 PBS，一組注射CD40-N，每周S次，20mg/kg，2個(gè)月腫瘤塊如圖；
[0045] 度）腫瘤重量比較（*p<0. 05, **p<0. 01);
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