切。雙酶切產(chǎn)物切膠，連接，獲 得pPIC9K-CD40-N-Flag (沒有優(yōu)化的，含信號膚）和pPIC9K-CD40-N-Flag (不含信號膚）。 陽1巧]連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH-5 a。質(zhì)粒抽提試劑盒（Axygen公司）進行質(zhì)粒抽提。抽提質(zhì)粒 用化oI/Notl進行雙酶切鑒定。將酶切后樣品進行瓊脂糖凝膠電泳1 %瓊脂糖，20分鐘到 30分鐘，出現(xiàn)9k+0.化條帶即為陽性克隆，測序進一步確定序列是否正確，同時陽性克隆菌 株菌液等體積加入50%無菌甘油-80°C保存。 陽1%] 將前述制備的pPIC9K-CD40-N-Flag(CD40-N為密碼子優(yōu)化的，不含信號膚）利用 Sail進行質(zhì)粒的線性化。電轉(zhuǎn)化己斯德畢赤酵母GS115,篩選G418抗性菌株。
[0127] (1)將篩選的菌株劃到平板上，劃線盡量長，出現(xiàn)單克隆。
[0128] (2)挑單克隆接種到5ml BMGY中30°C 25化pm過夜培養(yǎng)。 陽129] (3)菌液1:100接種到50ml BMGY中，30°C 250巧m培養(yǎng)。
[0130] (4)約1化后，菌液OD達(dá)到2-6之間，換BMMY (甲醇1 % )培養(yǎng)基開始誘導(dǎo)，同時 留樣200ul，留樣樣品離屯、12000,1分鐘，取上清160ul，-30°C存放。 陽131] 巧)2地后，加50 %甲醇1ml，留樣200ul，留樣樣品離屯、12000，！分鐘，取上清 160ul，-30°C 存放。 陽132] (6)48小時、72小時后，同操作5。 陽133] (7) 96小時時，收集搖瓶培養(yǎng)液，離屯、3500巧m，5分鐘，收集上清。
[0134] (8)檢測表達(dá)將0小時、24小時、48小時、72小時、96小時樣品加5x上樣緩沖液 40ul，10(rC煮沸10分鐘，12%分離膠SDS-PAGE，150v，約70分鐘?？捡R斯亮藍(lán)染色液染色 過夜，脫色后查看結(jié)果。
[0135] 免疫蛋白印跡Western Blot 陽136] (1)上樣：2好的12% SDS-PAGE膠中；
[0137] (2)電泳：80V30分鐘120V10ug或者40ug樣品加入配置20分鐘；
[0138] (3)轉(zhuǎn)膜：將PVDF(4. 5cmX8cm)泡在甲醇中1分鐘，轉(zhuǎn)膜液冰上預(yù)冷；采用夾屯、法 轉(zhuǎn)膜，順序為：黑色塑料板（負(fù)極）-海綿-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-海綿-白色塑料板 (正極），再將轉(zhuǎn)膜夾按照正確電極順序放入轉(zhuǎn)膜槽中，加入轉(zhuǎn)膜液，冰塊，恒壓100V50分鐘 冰浴中進行；
[0139] (4)封閉：5%脫脂牛奶放在搖床上1個小時；
[0140] 妨一抗：按適宜一抗?jié)舛认♂尶贵w（根據(jù)抗體說明書），4°C解育過夜； 陽141] (6)洗膜：PBS-0. 05% Tween20洗膜S次，每次5分鐘；
[0142] (7)二抗：加入適當(dāng)濃度的HRP標(biāo)記二抗（根據(jù)抗體說明書），室溫解育1小時；
[0143] (8)洗膜：PBS-0. 05% Tween20 洗膜S次，每次 5 分鐘；
[0144] (9)顯影：用 Pierce West Pico 底物或者 millipore 顯影，F(xiàn)'ujiFilm LAS4000 掃 膜成像。
[0145] PPIC9K-CD40 (巧-N的高密度發(fā)酵（P指代密碼子優(yōu)化序列） 陽146] 接種：
[0147] (I)-SCTC低溫冰箱中取出菌株，劃YPD平板。
[0148] 似2至3天后，待平板長出單克隆，挑單克隆菌株于5ml YTO培養(yǎng)基中 30°C 250巧m過夜培養(yǎng)，此為一級種子液。
[0149] (3)將一級種子液全部倒入含200ml Yro搖瓶中，30°C 25化pm培養(yǎng)約12小時達(dá)到 0D6004,作為二級種子液。
[0150] 發(fā)酵： 陽151] (4)在化發(fā)酵罐中裝入化BSM無機鹽培養(yǎng)基，12rC高壓滅菌20分鐘分鐘，冷卻 至室溫，加入PTMi6ml，用氨水調(diào)節(jié)PH至4. 5。 陽152] (5)接入二級種子液200ml，溶氧控制為35%，攬拌速度為65化pm，溫度設(shè)置為 30°C，開始發(fā)酵，每隔4小時測定一次0D，當(dāng)甘油耗盡后，使用50%甘油進行補料，至0D600 達(dá)到110停止。待發(fā)酵罐中甘油被耗盡后，開始加入甲醇開始補料誘導(dǎo)，添加甲醇量在4小 時內(nèi)從0.8ml/分鐘到4ml/分鐘，W后一直維持此速度。每隔4小時測定發(fā)酵液0D。誘導(dǎo) 36小時后，收集發(fā)酵液上清。
[0153] 蛋白純化超濾-G50-Q-S巧harose-FF法純化
[0154] (1)超濾發(fā)酵液上清通過Millipore超濾系統(tǒng)用截留3邸的膜濃縮到500ml W內(nèi)。 陽155] (2) Se地adexG-50凝膠過濾層析使用前先用0.1 M化OH清洗Se地adexG-50 1-2柱 體積（CV)，后用TriS-肥L (PH7. 4)平衡2個CV W上。接下來準(zhǔn)備上樣，將濃縮液500ml W 5ml/分鐘過柱，紫外280nm監(jiān)測收集各個吸收峰下蛋白。 陽156] (3)電泳檢測目的蛋白峰凝膠過濾層析后收集樣品進行電泳，考馬斯亮藍(lán)染色脫 色后，確定是否含有目的條帶的組分。
[0157] (4) Q-Se地arose-FF離子交換層析使用前用0.1 M化OH清洗Q-Se地arose-FFl個 柱體積，100 % B將B通道充滿洗脫緩沖液（1M化Cl Tris-HCL)過柱1個CV，平衡緩沖液 平衡柱子10個柱體積后開始上樣，3)中獲得到的目的蛋白組分樣品W5ml/分鐘過柱。樣 品上樣結(jié)束后，速度調(diào)為IOml/分鐘平衡緩沖液清洗柱子3個柱體積，接下來將B通道調(diào)為 20% 100分鐘速度還是IOml/分鐘開始洗脫，紫外280皿監(jiān)測各個蛋白吸收峰并收集各組 份蛋白，各組份蛋白使用考馬斯亮藍(lán)染色和免疫蛋白印跡確定含有目的蛋白的組份。 陽158] CD40-N功能驗證
[0159] (1)培養(yǎng)好的BJAB細(xì)胞（購自ATCC)鋪12孔板，1〇6細(xì)胞/孔，共12孔。
[0160] 似24小時后，在兩個孔分別加入G28-5 (購自ATCC) lug/ml和G28-5 Iug/ ml+CD40N10ug/ml〇 陽16U (3)8 小時后，在兩孔分別加入 G28-5 lug/ml 和 G28-5 lug/ml+CD40N10ug/ml。
[0162] (4)16小時后，在兩個孔分別加入628-5 111旨/1111和628-5 111旨/1111+〔040化0雌/1111。
[0163] (5)20小時后，在兩個孔分別加入628-5 111旨/1111和628-5 111旨/1111+〔040化0雌/1111。
[0164] (6)22小時后，在兩個孔分別加入628-5 111旨/1111和628-5 111旨/1111+〔040化0雌/1111。 陽1化](7)24小時后，收樣，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到EP管中，500g4分鐘離屯、去上清。
[0166] (8)用Iml PBS重懸細(xì)胞，500g4分鐘離屯、去上清。
[0167] (9)用SOullX上樣緩沖液重懸細(xì)胞，100°C 10分鐘，樣品凍存于-30°C冰箱。
[0168] (IO)Western blot 檢測。 陽169] 實施例1、克隆獲得CD40胞外段基因
[0170] 成熟CD40的胞外蛋白片段仰40-腳為全長蛋白的20-193aa，相應(yīng)mRNA長度為 52化P。利用服0細(xì)胞系CDNA作為模板，設(shè)計特異性引物，PCR可得單一 DNA條帶，瓊脂糖 凝膠電泳結(jié)果顯示此條帶略大于5(K)bp (見圖1)。PCR產(chǎn)物使用PCR產(chǎn)物回收試劑盒進行 產(chǎn)物回收?；厥债a(chǎn)物使用化Ol和NotI酶切，pPIC9k也使用相同酶切。酶切產(chǎn)物使用膠回 收試劑盒回收，使用T4連接酶連接1小時，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化D冊a細(xì)菌。搖菌小抽質(zhì)粒后，將 獲得的質(zhì)粒再次用化Ol和NotI進行酶切鑒定，雙酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果 呈現(xiàn)兩條帶巧〇(K)bp+5(K)bp)為陽性克隆，鑒定為陽性克隆的質(zhì)粒送公司測序。測序結(jié)果在 化bmed網(wǎng)站上的用blast進行比對。插入片段序列與Genbank網(wǎng)站中CD40序列完全一致。 使用該質(zhì)粒pPIC9k-CD40-N電轉(zhuǎn)化己斯德畢赤酵母GS115菌株，并篩選其中G418抗性的菌 株。最后篩選到兩株高性菌株，將運兩只菌株分別擴大培養(yǎng)后，用甲醇進行誘導(dǎo)表達(dá)，收集 誘導(dǎo)后0、24、48、72、96小時的酵母上清液，進行SDS-PAGE電泳考馬斯亮藍(lán)染色，在目的大 小位置沒有觀察到肉眼可見的條帶（結(jié)果未示）。蛋白沒有分泌或者表達(dá)過低。 陽171] 實施例2、CD40-N序列密碼子優(yōu)化及獲得CD40-N高表達(dá)畢赤酵母菌株 [0172] 為了促進CD40-N在畢赤酵母中的表達(dá)，本發(fā)明人將CD40-N序列進行畢赤酵母偏 好密碼子優(yōu)化，并去除了序列中的第一個氨基酸（脯氨酸）。將優(yōu)化后的序列使用全基因 合成，簡稱CD40N(巧，并構(gòu)建到PPIC9K上，命名為PPIC9K-CD40N任），酶切鑒定見圖2。將 PPIC9K-CD40N(巧電轉(zhuǎn)化己斯德畢赤酵母菌株GS115,篩選獲得G418抗性菌株。
[0173] 將篩選獲得的菌株進行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)：每隔12小時收集一次樣品并補加甲醇，保 持甲醇濃度為1 %。84小時后停止誘導(dǎo)，將收集的樣品進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染