一種dc細(xì)胞培養(yǎng)方法及培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其涉及一種DC細(xì)胞培養(yǎng)方法及培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002] DC細(xì)胞是一類與粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞形態(tài)和功都不同的白細(xì)胞，因其細(xì) 胞膜向外伸出，形成與神經(jīng)細(xì)胞軸突相似的膜性樹狀突起，故而命名為樹突狀細(xì)胞 (dendritic cells，DCs)。它是機(jī)體功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞(Antigen presenting cells，APC)，能高效地?cái)z取、加工處理和遞呈抗原。未成熟DC細(xì)胞具有較強(qiáng)的迀移能力，成 熟DC細(xì)胞能有效激活初始型T細(xì)胞，處于啟動(dòng)、調(diào)控、并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。在已知的 APC中，DC細(xì)胞的抗原提呈功能最強(qiáng)，大部分的殺傷性T細(xì)胞都需要靠 DC細(xì)胞去識(shí)別抗原，并 加工處理后呈遞上去。
[0003] 成熟的DC細(xì)胞可用于治療癌癥以及其他疾病。但是DC細(xì)胞難于擴(kuò)增，數(shù)量不足成 為應(yīng)用的一大限制。如何獲得足夠數(shù)量的DC細(xì)胞是現(xiàn)在研究領(lǐng)域的熱門?，F(xiàn)有技術(shù)最好的 方案是采用life公司的AMV培養(yǎng)基添加50ng/ml IL-4(白細(xì)胞介素-4)和50ng/ml GM-CSF (粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞集落刺激因子)培養(yǎng)獲得DC細(xì)胞。但該種方法獲得的DC細(xì)胞并不理想， DC細(xì)胞幾乎不擴(kuò)增。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，有必要針對(duì)上述的問題，提供一種提高DC細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)的DC細(xì)胞培養(yǎng) 方法和培養(yǎng)基。
[0005] 一種DC細(xì)胞培養(yǎng)基，含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基、重組人胰島素、GM-CSF、IL-4、IL-15(白細(xì)胞 介素 -15)、黃體酮、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白和人血白蛋白。
[0006] 優(yōu)選地，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基。
[0007] 優(yōu)選地，所述DC細(xì)胞培養(yǎng)基各組分含量如下： DMEM 培養(yǎng)基 80-90v/v%, 重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白 10-25pg/ml， GM-CSF 35-70ng/ml, IL-4 10-50ng./ml，
[0008] IL-15 10-40ng/ml, 黃體麵 0.5-3mg/ml, 重組人胰島素 l-4mg/ml， 人血白蛋白 .30-80mg/ml， 余量為無(wú)菌注射用水。
[0009] 優(yōu)選地，所述DC細(xì)胞培養(yǎng)基各組分含量如下： DMEM 培養(yǎng)基 86v/v%,. 重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白 15gg/ml， GM-CSF 50ng/ml, IL-4 20ng/ml,
[0010] IL-15 20ng/ml, 黃體酮 _1.5mg/ml， 重組人胰島素 2mg/mi， 人血.白蛋白 5:0mg/ml， 余量為無(wú)菌注射用水。
[0011] 一種DC細(xì)胞培養(yǎng)方法，使用本發(fā)明DC細(xì)胞培養(yǎng)基和包被有CD28單抗的培養(yǎng)容器培 養(yǎng)PBMCXD28單抗可以促進(jìn)DC細(xì)胞的分化和增殖，而采用包被的方式不僅可以減少CD28的 用量，還可以使得細(xì)胞和CD28以及其他細(xì)胞因子的接觸更加充分。
[0012]優(yōu)選地，所述DC細(xì)胞的培養(yǎng)方法包括以下步驟：
[0013] S1、自10ml血液中提取PBMC，按照PBMC密度1 X 106cells/ml添加含有10%FBS的 DMEM/F12培養(yǎng)基將細(xì)胞混勻，然后將其加入到包被有⑶28單抗的培養(yǎng)瓶中，在37°C、5%C02 條件中培養(yǎng)3小時(shí)；
[0014] S2、棄去未貼壁細(xì)胞，用roS沖洗一次，然后加入10ml本發(fā)明DC細(xì)胞培養(yǎng)基;兩天后 加入10ml本發(fā)明DC細(xì)胞培養(yǎng)基;之后每隔2-3天換液一次；
[0015] S3、培養(yǎng)到第10天時(shí)加入50ng/ml TNF-α刺激DC細(xì)胞成熟，第13天時(shí)收集成熟DC細(xì) 胞。
[0016] 優(yōu)選地，⑶28單抗包被培養(yǎng)瓶的方法為：用含有0. lμg/mlCD28單抗的PBS包被培養(yǎng) 瓶1小時(shí)，棄去包被液，用PBS清洗2遍。
[0017] 優(yōu)選地，所述血液為外周血或臍血。
[0018] 優(yōu)選地，步驟S2中每次換液體積不超過30ml。
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0020] (1)本發(fā)明DC細(xì)胞培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基顯著提高了DC細(xì)胞的增殖倍數(shù)，使用本發(fā)明 DC細(xì)胞培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基所得的DC細(xì)胞數(shù)量為104.1-112.5百萬(wàn)個(gè)，是對(duì)比例1-3所得DC細(xì) 胞數(shù)的30倍左右。
[0021] (2)本發(fā)明DC細(xì)胞培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基極大提高了培養(yǎng)出的DC細(xì)胞的純度。使用本 發(fā)明DC細(xì)胞培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基獲得細(xì)胞中CD86+CDllc+細(xì)胞的含量明顯高于對(duì)比例1-3獲得 細(xì)胞的⑶86+CD1 lc+細(xì)胞含量，約為對(duì)比例1-3獲得細(xì)胞中⑶86+⑶1 lc+細(xì)胞含量的2倍。
[0022] (3)本發(fā)明DC細(xì)胞培養(yǎng)基中DMEM培養(yǎng)基為細(xì)胞提供基本營(yíng)養(yǎng)成分，GM-CSF、IL-4和 IL-15刺激細(xì)胞向DC細(xì)胞分化、生長(zhǎng)，黃體酮促進(jìn)細(xì)胞增殖，重組人胰島素促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄 糖的代謝，重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞代謝廢物;人血白蛋白可以減少細(xì)胞損傷，圍成細(xì)胞滲 透壓，保護(hù)細(xì)胞。本發(fā)明DC細(xì)胞培養(yǎng)方法采用CD28包被的培養(yǎng)容器培養(yǎng)PBMC，不僅可以減少 CD28的用量，還可以使得細(xì)胞和CD28以及其他細(xì)胞因子的接觸更加充分。
【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1為本發(fā)明效果實(shí)施例1的細(xì)胞數(shù)量結(jié)果圖。
[0024] 圖2為本發(fā)明效果實(shí)施例1的細(xì)胞活率結(jié)果圖。
[0025] 圖3為本發(fā)明效果實(shí)施例2的⑶86+⑶llc+細(xì)胞的含量圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 為了更好的說(shuō)明本發(fā)明，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例做進(jìn)一步說(shuō)明。本發(fā)明中所 用試劑或儀器均可由市場(chǎng)購(gòu)得，使用的檢測(cè)方法等都是本領(lǐng)域所熟知的，在此不再贅述。 [0027] 實(shí)施例1
[0028] 一種DC細(xì)胞培養(yǎng)基，含有下述含量的下述組分:DMEM培養(yǎng)基(GIBC0)86v/v%，重組 人轉(zhuǎn)鐵蛋白（Sigma) 15μg/ml，GM-CSF(peprotech)50ng/ml，IL-4(peprotech)20ng/ml，IL-15(口6口1'〇丨6。11)2〇1^/1111，黃體酮（大連美侖生物）1.511^/1111，重組人胰島素（3丨81]^)211^/1111， 人血白蛋白（鄭州萊士)50mg/ml，余量為無(wú)菌注射用水。
[0029]使用上述DC細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)DC細(xì)胞的方法，包括以下步驟：
[0030] Sl、10ml外周血或臍血添加等體積的生理鹽水稀釋，添加稀釋液三分之一倍體積 的Ficoll分離液，700g離心20-30min，升降速降為零，吸取中間白膜層；白膜層細(xì)胞用生理 鹽水清洗兩遍，得到PBMC，進(jìn)行計(jì)數(shù)；
[0031]用含有0. lμg/mlCD28單抗的ros 4ml包被T75培養(yǎng)瓶1小時(shí)，棄去包被液，用PBS清 洗2遍得到⑶28單抗包被的T75培養(yǎng)瓶；向PBMC中加入含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，使PBMC 的密度為1 X 106cells/ml，然后將其加入⑶28單抗包被的T75培養(yǎng)瓶中，在37°C、5%二氧化 碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3小時(shí)，使DC細(xì)胞貼壁；
[0032] S2、取出培養(yǎng)瓶，棄去未貼壁細(xì)胞，用PBS沖洗培養(yǎng)瓶一次，然后加入10ml本發(fā)明DC 細(xì)胞培養(yǎng)基;兩天后換液，加入本發(fā)明DC細(xì)胞培養(yǎng)基10ml;之后每隔2-3天換液一次，每次換 液體積不超過30ml;
[0033] S3、培養(yǎng)到第10天時(shí)加入50ng/ml TNF-α刺激DC細(xì)胞成熟，第13天時(shí)收集成熟的DC 細(xì)胞。
[0034] 實(shí)施例2
[0035] 一種DC細(xì)胞培養(yǎng)基，含有下述含量的下述組分:DMEM培養(yǎng)基80v/v%，重組人轉(zhuǎn)鐵 蛋白 lOμg/ml，GM_CSF 35ng/ml，IL_410ng/ml，IL_1510ng/ml，黃體酬0 · 5mg/ml，重組人膜島 素 lmg/ml，人血白蛋白30mg/ml，余量為無(wú)菌注射用水。
[0036]使用上述DC細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)DC細(xì)胞的方法與實(shí)施例1相同。
[0037] 實(shí)施例3
[0038] 一種DC細(xì)胞培養(yǎng)基，含有下述含量的下述組分:DMEM培養(yǎng)基90v/v%，重組人轉(zhuǎn)鐵 蛋白 25μg/ml，GM_CSF 70ng/ml，IL_450ng/ml，IL_1540ng/ml，黃體酮3mg/ml，重組人胰島素 4mg/ml，人血白蛋白80mg/ml，余量為無(wú)菌注射用水。
[0039]使用上述DC細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)DC細(xì)胞的方法與實(shí)施例1相同。
[0040] 對(duì)比例1
[0041 ] 本對(duì)比例中使用的DC細(xì)胞培養(yǎng)基為含50ng/ml IL-4、50ng/ml GM-CSF的AM V培 養(yǎng)基。