專利名稱：白菜花粉壁發(fā)育相關基因PGBc2及其分離方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體涉及一種白菜花粉壁發(fā)育相關基因PG5c2及其分離方法。
背景技術：
花粉發(fā)育與植物雄性不育密切相關，同時是研究細胞生長、分裂、細胞分 化和細胞間信息傳遞等過程的理想模型。因此，花粉發(fā)育研究一直是生命科學 研究領域中的熱點?；ǚ郯l(fā)育過程復雜，涉及眾多基因的表達調控。研究發(fā)現(xiàn) 花粉基因表達的一大特點就是表達大量與細胞壁合成、調控相關的基因。花粉 粒最具特色的一部分是花粉壁(Blackmore and Barnes, 1990; Owen andMakaroff, 1995)。由花粉外壁和花粉內壁兩層組成，在花粉發(fā)揮正常功能上起 著舉足輕重的作用，尤其是在花粉萌發(fā)和花粉管生長過程中，花粉壁的異常是 導致花粉不能完成其生物學功能的主要原因之一。關于作用于花粉壁發(fā)育的基因或蛋白質目前研究不多，在模式生物擬南芥 中，只發(fā)現(xiàn)了數(shù)個花粉外壁發(fā)育的異常的突變體，例如邁s么/7p入"e/7和^;^， 以及2個花粉外壁和內壁同時異常的突變體邁s3灘/^7。這些突變體對應的基因 所編碼的蛋白質功能均未完全明確(Aarts eta7, 1997; Paxson-Sowders "a7， 1997， 2001; Shukla et a7. ， 1998; Fei and Sawhney， 2001; Ariizumi et a7， 2003， 2005)。在白菜中尚未有作用于花粉壁發(fā)育的基因或突變體被分離的報 導。花粉萌發(fā)時的水合花粉會釋放很多存在于花粉壁中的蛋白質，或者從花粉 內部分泌一些蛋白質，這些蛋白質被認為是花粉壁或花粉管壁發(fā)育所必需的 (Cosgrove eta7， 1997, 2000; Allen eta7， 1993)，多聚半乳糖醛酸酶(PG)就是其中之一。它是一種細胞壁水解和疏松酶，參與果膠的降解，使細胞壁結 構解體。盡管目前的研究推測花粉管中的PG可能通過降解花柱細胞壁而允許花 粉管通過花柱，或者可能作用于本身的細胞壁而加速自身的生長(Brown1990; Allen " a7， 1993; Hadfield " <a7, 1998; Honys " a二 2003)。但 是，確切證據(jù)卻少之又少。因此，花粉壁發(fā)育相關的基因的克隆和功能鑒定仍 然是一項重要的工作。發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術中存在的不足，提供了一種白菜花粉壁發(fā) 育相關的基因/^^^及其分離方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的-一種白菜花粉壁發(fā)育相關基因尸6及么它包含SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列。進一步地，還包括在SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列中添加、取代、插入 或缺失一個或多個核苷酸生成的突變體、等位基因和衍生物。一種權利要求1所述的白菜花粉壁發(fā)育相關基因/^^2的分離方法，包括以下步驟(1) 、用A8/T18引物對 <矮腳黃'白菜核雄性不育兩用系的不育株系與可育 株系花蕾基因表達差異進行cDNA-AFLP分析，獲得在可育株系花蕾中特異表 達的基因片段Bc-A8T18，該片段包含SEQ ID No. 1所述的核苷酸序列和在SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸生成 的衍生物；(2) 、利用RACE技術擴增Bc-A8T18片段相關的基因的cDNA的3'末端和5' 末端，其中，正向特異引物S1序列為5' -CTCCTCTCCAGGTTCTGACATTACT-3，； 反向特異引物A1序列為5， -CTGCTCGGTGTTGGAGATTGG-3，；分別與3' RACE和 5' RACE錨定引物擴增3'末端和5'末端；(3) 、用常規(guī)PCR擴增Bc-A8T18片段相關基因的cDNA序列及其DNA序列，該 DNA序列即為SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列。根據(jù)兩端拼接的cDNA全長序 列設計特異引物Tl和T2，從花蕾cDNA中擴增Be-A8T18片段相關基因的cDNA 序列，從基因組DNA中擴增其DNA序列。Tl和T2的序列分別為Tl, 5， -TGGGATTTTCAGCCAATG-3' ; T2， 5' -AGAGCATACATCATAGAC-3，。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明采用cDNA-AFLP技術對'矮腳黃'白菜核不 育兩用系的不育株系與可育株系花蕾基因表達差異進行分析，同時配合RACE技術分離獲得與花粉壁發(fā)育相關基因為進一步弄清不育株系花粉敗育的原因，以及闡明植物花粉壁發(fā)育和雄性不育發(fā)生的分子機制提供研究基 礎，進而為人工創(chuàng)建不育材料、培育優(yōu)良品種提供物質條件。


圖1是白菜尸6^W cDNA和DNA全長序列的擴增圖； 圖2為推測的白菜尸6^^氨基酸序列圖； 圖3為白菜尸6^^的時空表達特點示意圖； 圖4為白菜尸6^^表達的原位雜交分析圖；圖5為反義/^^2基因表達載體示意圖；圖6為Northern雜交檢測戶6^^在轉基因菜心中的表達示意圖; 圖7轉反義/^^^基因菜心的花粉離體萌發(fā)觀察圖；圖8轉反義/^ft^基因菜心花粉掃描電鏡觀察圖；圖9轉反義/^A^基因菜心花粉發(fā)育透射電鏡觀察圖。
具體實施方式
本發(fā)明通過基因表達差異分析從白菜^力^5" Wca^^7-W力S'的可育株 系花蕾中分離得到一個可育花蕾特異表達的基因尸"萬c么序列分析表明該基因 具有植物PG基因家族的4個保守結構域，并與已知的PG基因具有較高的相似 性，但不同于已知的PG基因家族成員，因此為一個新的PG基因。RT-PCR、 Northern雜交及原位雜交表明，凡Wc2的轉錄本最早在白菜花藥四分體時期的 絨氈層和四分小孢子中出現(xiàn)，且在絨氈層中的表達量要比在四分小孢子中的表 達量高。隨后在絨氈層中一直維持很強的表達信號，直到絨氈層的降解退化， 在小孢子中的表達水平從單核小孢子時期開始增強， 一直持續(xù)到花粉成熟期。 通過反義RNA技術，將尸6^^的反義基因導入正?？捎陌撞思毎炞C了該基因的功能。發(fā)現(xiàn)/^&^表達受抑制或沉默的轉基因植株花粉因花粉壁發(fā)育的 受阻導致花粉不能正常萌發(fā)，植株雄性育性降低，表明/^ft^為一個重要的花 粉壁發(fā)育相關基因。該基因的分離克隆，有助于闡明花粉發(fā)育和植物雄性不育 分子機理，對生產上人為控制植物育性，培育優(yōu)良品種具有重要的實踐意義。 實現(xiàn)本發(fā)明的具體技術步驟如下1. 白菜/^5ci"基因的分離和序列分析利用cDNA-AFLP技術分析白菜'Aa力W-^M/W的不育株系與可 育株系花蕾基因表達差異，篩選到A8/T18引物擴增得到的在可育株系花蕾中 特異表達的基因片段Bc-A8T18，長250 bp，具體序列見SEQ ID No. 1。通過 RACE技術擴增得到該片段相關基因的cDNA的3'末端，2次擴增結果均顯示 目的片段大小約為1 400bp，如圖1A泳道1、2所示；3' RAGE產物克隆至pGEM-T Easy載體，轉化DH 5d感受態(tài)細胞，藍白斑篩選陽性克隆，堿裂解法抽提質 粒，酶切鑒定'(圖1B)后測序。類似地，通過RACE技術擴增得到該片段相關 基因的cDNA的5'末端(圖1C泳道1、 2)，經(jīng)克隆后酶切鑒定(圖1C泳道3、 4)再測序。根據(jù)兩端拼接的cDNA全長序列設計引物，常規(guī)PCR方法擴增Bc-A8T18 片段相關基因的cDNA序列(圖1D泳道1)及其DNA序列(圖1D泳道2)，經(jīng) 克隆后酶切鑒定(圖lD泳道l為cDNA單克隆的酶切鑒定，圖1D泳道2為DNA 單克隆的酶切鑒定)再測序。DNA序列全長1 594 bp，具體序列見SEQ ID No. 2。利用生物信息學相關 軟件分析該基因序列，發(fā)現(xiàn)其含有3個外顯子和2個內含子，最大開放閱讀框 長l 188 bp，編碼395個氨基酸。在假定的蛋白質序列的N端具有一段疏水信 號肽。在數(shù)據(jù)庫中進行同源搜索發(fā)現(xiàn)推測的氨基酸序列與擬南芥花粉表達的假 定的多聚半乳糖醛酸酶PGA3序列具有86%的一致性和94%的相似性。在蛋白質 結構數(shù)據(jù)庫中搜索發(fā)現(xiàn)推測的氨基酸序列中具有一個典型的PG活性位點。與其 他發(fā)表的植物PG的氨基酸序列比較，其氨基酸序列中包含植物PG所特有的4 個保守結構域(圖2下劃線部分即為植物PG特有的功能結構域)。這些結果說 明，該基因是一個典型的PG基因，命名為/^&7么2. /^9c^的時空表達特點分析(1 )RT-PCR和Northern雜交分析尸Cft^在白菜aJ/ fifc5" ' ^c^^;7-^^/^ 可育植株5級不同大小的花蕾(花蕾縱徑的大小從I級到V級分別為:小于1 mm、 1.2 ~ 1.6 mm、 1. 8 2. 2 mm、 2. 4 2. 8 mm、 3. 0 3. 4 mm，這些大小不同 的花蕾分別對應于小孢子母細胞形成及形成前時期、四分體時期、單核花粉粒 時期及成熟花粉時期)以及開放的花、嫩角果、花莖和花莖葉片中的表達情況。 結果發(fā)現(xiàn)，RT-PCR分析(如圖3A所示)和Northern雜交分析(如圖3B所示) H^^的表達模式均顯示相同的結果，其轉錄本最早在III級花蕾中也就是四分 體時期開始出現(xiàn)，并且表達量較高，隨后在單核花粉粒時期的花蕾、包含成熟花粉粒的v級花蕾、開放的花及嫩角果中持續(xù)表達。而在減數(shù)分裂以前的II、 I 級花蕾以及花莖和花莖葉片中均未檢測到/^^^的表達(圖3中，B1 B5表示 Wcsj力W-OW的1 V級花蕾；F、 Si、 S、 L依次表示"ca^W;7-OW開放的 花、嫩角果、花莖和葉片；遍在表達的A7^'/7-7作為對照。)。(2)利用原位雜交技術進一步分析了 /^ft^在不同發(fā)育階段的花蕾中的表 達情況。發(fā)現(xiàn)，雜交信號首先在四分體時期的絨氈層和四分小孢子中出現(xiàn)，且 在絨氈層中的信號要比在四分小孢子中的信號強(圖4B);在單核小孢子后期， 絨氈層開始降解，但仍能看到很強的雜交信號，而在此時的單核小孢子中，雜 交信號要強于四分體時期(圖4C);到成熟花粉期，絨氈層己經(jīng)完全降解，這時，表達信號僅在花粉粒中檢測到，信號強弱類似于單核小孢子時期(圖4D);而在四分體時期之前的花藥(圖4A)、所有被檢測花蕾的萼片、花瓣、中柱、雌蕊中， 以及用正義探針進行雜交的對照中(圖4 E、 F)均沒有檢測到/^^2的表達信號。3.利用反義RNA技術驗證A^c^的功能分別構建含CaMV35S組成型啟動子和BcA9組織特異型啟動子的反義/^5c2 基因表達載體(圖5)，通過農桿菌介導法轉入菜心(白菜的一個變種)植株， 通過菜心無菌苗的培養(yǎng)、菜心子葉-子葉柄外植體的預培養(yǎng)、共培養(yǎng)、分化培養(yǎng) 誘導KanB苗的產生、在無菌瓶中生長擴繁Kar^苗、生根培養(yǎng)、移栽轉化植株等 一系列過程，分別獲得/^5c2的轉基因植株J55"-;^^i"(含CaM35S組成型啟動 子的轉化植株)和^^-p^bc^ (含BcA9絨氈層特異表達型啟動子的轉化植株)。 選取轉基因直至進行Northern雜交，以白菜Wcaj力^7-^M/5'植株花蕾(圖6 中的B)、花(圖6中的F)及非轉基因菜心植株(圖6中的non-tra)花蕾和花 為對照，用尸fift^的cDNA作為模板標記探針。結果顯示，選取的其中一株轉基 因植株J5S-;^^^的花蕾和花中均沒有檢測到/^^^的表達信號，在另一株的 花蕾和花中檢測到了很弱的雜交信號；在4株選取的^^-;^k^植株中，有l(wèi)株 的花蕾和1株的花中仍有較弱的表達信號，在另外2株的花蕾和花中均沒有檢 測到明顯的雜交信號。相反在可育株^&a^W7-^^'(圖6中的B strain即 為'萬ca力W-W萬'，A strain為Wcaj7^7-。W )及非轉基因菜心植株的花 蕾和花中都檢測到很高的/^^2表達水平。這些結果說明凡Wc^的表達在轉基 因植株中受到較明顯的抑制，經(jīng)過Northern印跡雜交，得到尸^ft^的表達受到 明顯抑制的轉基因植株。對S55-;^bc^和力9-;^力c2轉基因植株進行形態(tài)學性狀觀察，發(fā)現(xiàn); ^;c^和^9-;^&^營養(yǎng)生長正常，并且能正常開花，花器官的發(fā)育也與非轉基因植株 的沒有明顯區(qū)別。經(jīng)蕾期授粉自交，轉基因植株能結出果莢，但與非轉基因的 野生型植株自交產生的果莢相比，其果莢不飽滿，每個果莢只產生1 5粒種 子。而正常非轉基因植株果莢飽滿，能產生約15粒種子。將非轉基因植株正常 的花粉分別授到轉基因植株J必-p^^和必-/^7^的柱頭上，結出的果莢大小 及產籽數(shù)和野生型植株沒有差異。轉基因植株自交^產生的種子播種能正常生長 發(fā)育，得到Ti代植株各50株。這些說明轉基因植株雌性育性和胚珠發(fā)育正常， 其育性降低應該歸咎于花粉功能的異常。后期檢測發(fā)現(xiàn)1 5^-/^^^和^^-/7^^2 植株所呈現(xiàn)的性狀沒有明顯區(qū)別，因此合稱pg力c么/^力ci"植株花粉離體正常萌 發(fā)率明顯降低(圖71)，與非轉基因植株(圖7中的WT)正常的花粉離體萌發(fā)(圖7A)和花粉萌發(fā)時核和內含物在花粉管內的正常移動(圖7 B D)相比， /^&^植株約81%的花粉萌發(fā)時花粉管爆裂(圖7E)，同時，核能進入爆裂的花 粉管(圖7F H)。掃描電鏡觀察顯示，與非轉基因對照植株(WT)的正?；ǚ?圖8E、 F)相比，"^^表達受抑制的轉基因植株<^5""7^力^和^-/7^7^產 生外壁網(wǎng)紋淺的畸形花粉(圖8A D)。透射電鏡觀察顯示，轉基因植株/^^2在 三核花粉的花粉萌發(fā)溝處外壁開始脫落，內壁異常增厚(圖9F、 H),范圍比非 轉基因植株(圖犯、G)的萌發(fā)溝廣，增厚程度大；成熟花粉期，因為外壁破壞， /^bd花粉外壁含油層外溢(圖9J、 L)。圖9左欄為非轉基因對照植株的花粉 發(fā)育過程，右欄為轉基因植株P^bc2的花粉發(fā)育過程，Ba表示基粒棒；exine 表示花粉外壁；Fm表示游離小孢子；Gf表示萌發(fā)溝；In表示內壁；Ne表示外 壁內層；Np表示單核花粉；Tc表示覆蓋層；Tp表示三核花粉。這些結果說明 尸6^^基因參與了花粉壁的發(fā)育。結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明范圍。 實施例l /^^^基因的分離和克隆(1) Be-A8T18片段的分離用A8/T18引物對白菜aj力^5" WcajM7-WJ/F的不育株系與可育株系花蕾基因表達差異進行cDNA-AFLP分析，檢測 到在可育株系花蕾中特異表達的基因條帶Be-A8T18,用手術刀片割下聚丙烯 酰胺凝膠上的差異片段，溶于100 PLTE (10mmol'l^Tris， pH 7. 5, 1畫1'L/1 EDTA， pH8.0)，并作為模板進行PCR擴增，條件與cDNA-AFLP中的預擴增相 同。PCR產物1.5%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)凝膠回收試劑盒純化?；厥债a物連接 到pGEM-T Easy Vector (Promega)并轉化到A coh' DH 5 a感受態(tài)細胞，經(jīng)藍白斑篩選重組質粒，測序，最后RT-PCR驗證得到該條帶的核苷酸序列。(2) Be-A8T18片段相關的基因的cDNA的3，末端和5，末端擴增根 據(jù)雙鏈cDNA合成試劑盒(SMART PCR cDNA Synthesis Kit)中接頭及引物的 特征設計了 3' RACE和5' RACE錨定引物P3和P5;根據(jù)差異片段Bc-A8T18 設計正向特異引物S1，與錨定引物P3擴增3'末端，反向引物Al與錨定引物 P5擴增5'末端。錨定引物P5的序列為5， -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3，； 錨定引物P3的序列為5， -GAGGCGGCCGACATGTTTTT-3，；正向特異引物Sl序 列為5， -CTCCTCTCCAGGTTCTGACATTACT-3，； 反向特異引物Al序列為 5， -CTGCTCGGTGTTGGAGATTGG-3， 。 PCR產物經(jīng)DNA凝膠回收試劑盒回收，插入 pGEM-T Easy載體，轉化DH 5 a感受態(tài)細胞，藍白斑篩選陽性克隆，堿裂解法 抽提質粒，酶切鑒定后，重組質粒送上海博亞生物技術有限公司測序，得到 Bc-A8T18片段相關的基因的cDNA的3'末端和5'末端。(3) /^^^基因的全長克隆根據(jù)兩端拼接的cDNA全長序列設計特異引 物Tl (序列為5， -TGGGATTTTCAGCCAATG-3，)和T2 (序列為 5， -AGAGCATACATCATAGAC-3，)。常規(guī)PCR方法再次從花蕾cDNA中擴增 Bc-A8T18片段相關基因的cDNA序列；用同一特異引物對在基因組DNA中擴增 得到其DNA序列。實施例2利用反義RNA技術驗證/^ft^的功能(1)反義表達載體的構建根據(jù)尸""cDNA全長序列，在尸MW序列內部 第85個堿基至第546個堿基之間設計引物，擴增462 bp序列作為反義基因片 段，見SEQ ID No:3。并根據(jù)植物雙元載體pBI121的多克隆酶切位點，設計分 別含有萬』I和Z力a I限制性內切酶位點以及三個保護堿基的兩條PCR擴增引 物，上游引物為5' -ACAGGATCCGAGCTTTTACCGTTTTTA-3，，下游引物為 5， -GCCTCTAGATGGCATCTATTGMGATA-3 ，(劃線部分為酶切位點)。以 Wca力W-。75，花蕾cDNA為模板進行PCR擴增。產物克隆至pGEM-T Easy載 體，陽性克隆質粒命名為pTPGBc2A。(2) CaMV35S組成型啟動子表達載體和BcA9組織特異型啟動子表達載體的 構建將反義尸^c^片段與經(jīng)飽/zH I和JZ^ I雙酶切的雙元載體pBI121混合 連接，產物轉化DH 5 a感受態(tài)細胞，在含Kan 50 mg'L—1的固體LB培養(yǎng)基平板 上培養(yǎng)過夜。挑取單菌落，在含Kan50mg'L—'的液體LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)過夜， 堿裂解法抽提其質粒DNA，采用PCR和限制性內切酶酶切等方法鑒定陽性克隆。 陽性克隆質粒命名為pBI35S-PGBc2A。 BcA9啟動子是從白菜中分離得到的、在花藥組織中特異表達的組織特異型啟動子。將反義戶G&^片段、BcA9啟動子和 經(jīng)歷y^III和A』I雙酶切的pBI121混合連接，如上方法轉化、鑒定獲得陽 性克隆質粒，命名為pBIBcA9-PGBc2A。(3) 反義表達載體對菜心的遺傳轉化將上述構建好的植物表達載體 pBI35S-PGBc2A及pBIBcA9-PGBc2A質粒轉入農桿菌LBA4404,菜心的遺傳轉化 通過組織培養(yǎng)途徑實現(xiàn)。各培養(yǎng)基的成分如下預培養(yǎng)和共培養(yǎng)培養(yǎng)基1/2倍濃度肌+的MS培養(yǎng)基的鹽類+ 2%蔗糖+ 0.8%瓊脂+ 3 mg'l/1 BAP + 1 mg'l/1 NAA + 7.5 mg,L—1 AgN03 (pH值5. 8)。分化培養(yǎng)基1/2倍濃度NH/的MS培養(yǎng)基的鹽類+ 2%蔗糖+ 0. 8%瓊脂+ 3 mg丄-1 BAP + 1 mg丄—1 NAA + 7. 5 mg'L—1 AgN03 + 7. 5 mg丄-1 Kan + 300 mg'l/1 Amp (pH值5.8)。生根培養(yǎng)基1/2MS培養(yǎng)基的鹽類及維生素+0.8%瓊脂+5mg'L_1Kan (PH 值5.8)。植物生長調節(jié)劑在高壓滅菌前加入，AgN03和抗生素在高壓滅菌后加入，高 壓滅菌的條件為121。C保持20 min， 50。C保溫。本實驗以子葉-子葉柄為外植體，把子葉柄插入預培養(yǎng)培養(yǎng)基中2 ~ 3 ram 深，培養(yǎng)3 d，農桿菌侵染后平放入共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2 d。將共培養(yǎng)2 d 后的菜心子葉-子葉柄外植體轉入分化培養(yǎng)基上，大約20 d左右，待分化出的 抗性芽長到一定大小，小心從基部將其切下轉入到新的分化培養(yǎng)基上繼續(xù)生長。 得到的抗性芽在分化培養(yǎng)基上繼代并篩選，每20d左右轉瓶一次，去除其中的 假陽性植株。待抗性植株長到2 ~ 3 cm時，將其從愈傷組織切下，轉到生根培 養(yǎng)基上。待抗性植株在生根培養(yǎng)基上長出大量白色的須狀根時，打開瓶口煉苗2 3d，小心去除根上的培養(yǎng)基，移入含水量為60%的培養(yǎng)土中，保濕培養(yǎng)5~7 天后，再轉到室外培養(yǎng)。轉基因植株經(jīng)PCR檢測、Southern及Northern印跡雜交檢測，篩選獲得 /^5c2基因表達沉默和受抑制的轉基因植株J55"-; ^7C^和力9-j^6c么(4) 轉基因植株的形態(tài)和細胞學觀察檢測體外和體內花粉萌發(fā)情況,用于 花粉離體萌發(fā)的半固體培養(yǎng)基組成為15%蔗糖+ 0.4 mmol L-l硼酸+ 0. 4 mmol *L-1 CaN03 + 0.1%瓊脂。采集花朵的時間均為上午9:00左右，每株采5朵 花藥剛裂開的花，采后先將花粉抖落到硫酸紙上，充分混勻，將其點涂在載玻 片上的培養(yǎng)基中，不加蓋玻片，將載玻片置于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，置于 黑暗、20 25t:恒溫條件下培養(yǎng)，4 ~ 6 h后在顯微鏡下觀察萌發(fā)率。掃描電鏡觀察花粉形態(tài)，采剛開放的花朵，用鑷子夾持花藥將花粉輕輕地涂在貼有雙面膠的金屬載物臺上，噴金后在Philips XL-40型掃描電鏡下觀察花粉形狀、飽滿 程度及表面網(wǎng)紋，拍照。透射電鏡觀察花粉發(fā)育過程，取不同大小花蕾中的花藥， 制備超薄切片觀察花粉花藥發(fā)育過程。最后，還需注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的一個具體實施例。顯然， 本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本 發(fā)明公開的內容直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。序列表〈110>浙江大學〈120〉白菜花粉壁發(fā)育相關基因尸6^C2及其分離方法〈160〉 2〈170> Patentln version 3.1〈210〉 1〈211〉 250〈212〉 DNA〈213> Brassica ra<400〉 1ttttattaaaggggtgcatattttggagctttttccgtttttatttt60ctgtttattgggattttcagccaatgctgtatacatcaccattggctcctctccaggctc120caggcacttctgagcattc3C3acagcatgccaatctccaacaccgag180cgtggtg3tCCCgg3g3gttCgcttgggtgagatccagatgggtccat240gcagctcc250〈210〉 2〈211〉 1594〈212〉 DNA〈213> Brassica ra〈400〉 2gaeigaaacaacaaataaaatagtaatattaaatttttt60gggtgcatatUtggagcttttaccgtttttattttctgtttattgggat120tttcagccaatgctgtatscatcaccattggctcctctccttctgacattactcagg180ttagttacattgctctcctttttcttgctatacaagcaatatattatcgg240ctacgttgttaaggttctattgcgcatgacatatgcaggcacttctgaaagC3ttC3C33300C￡lgC3tgCC￡lccgagcgtggtgatccc3aggagagttcaagcttg360gtgagatccagatgaggggtccatgcaaagctccagtcgagatcaccattcaaggcactg420tcaaaLgctg3tggtaacgcgatcc3gggaggscacatggattgtctttggcaac3tta480atggctttaagttgaacggaggtggagctttcgatggtga3cgcagcttggg540ttcaactgtcaccagactttcaactgcaagaaacttcccatcgtatgtgtgcttatat600atgtCCtC3LSLtttaattggcttttgtgaaaaataatageit.tagtgatgtt660attttgtcttttttttatag3gt3taaggtttgatttcgtggeLgaacgctgagatcaaag720acatatcttcaatagatgccaagaacttccgctcggtgcc780ccatggatcacatcaacatcattgccccaaaagaceLgtcccaacactgacggtatccatt840tggga卿3gtgacggagtc犯gstccttactccaccggagacgactgta900tatccgttgg卿tggg2Ltgaagaaccttc3Cgtgg卿3agtcacgtgcggtcc鄉(xiāng)ac960atggaatcagtgtcgg鄉(xiāng)ccttgg犯ggtacggaaacgaac3ggaitgtcagcggcatta1020g3gtc￡ita<aactgcactctcC6LaCELgactgacaacggactgaggatxaagacatggcctt1080ctgcagcttgCtCC3CC3CCgcctccgatattcatttcgagaatatcattctcaagaacg1140ttatgaacccaatcctcatcgaccaagagtactgcccttggaaccaatgtaac犯gcaga1200aaccat caacgattaagcttgccaacatcagcttcaagcagatc柳ggaacatcagggat1260acaaggatgceigtgeL8igcta>ttgtgCEigcaggggatacccatgccaaaacgttg鄉(xiāng)ttg1320g￡lga_C3ttg3cattaggtacagcggagcag3tggtccagcgactttccagtgctcaaacg1380tgagccccaaactcatgggaactcagagccctaaagcttgC3gtggtCC3gtgaccaact1440taccccaata3gt3g犯gCtcaaaaaatatt aaac t aaaacacccattcattatttgttt1500tgtttcctac8cccaattta3tttatatggtctatgatgtatgctctcattctttctaat1560tcaatataaatgcattcattatgcctttttgELCC159權利要求
1、一種白菜花粉壁發(fā)育相關基因PGBc2，其特征在于它包含SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
2、 根據(jù)權利要求1所述的白菜花粉壁發(fā)育相關基因其特征在于 還包括在SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一個或 多個核苷酸生成的突變體、等位基因和衍生物。
3、 一種權利要求l所述的白菜花粉壁發(fā)育相關基因HWc^的分離方法，其特征在于，包括以下步驟(1) Bc-A8T18片段的分離用A8/T18引物對白菜的不育株系與可育株 系花蕾基因表達差異進行cDNA-AFLP分析，檢測到在可育株系花蕾中特異表 達的基因條帶Bc-A8T18，用手術刀片割下聚丙烯酰胺凝膠上的差異片段，溶 于100叱TE，并作為模板進行PCR擴增，條件與cDNA-AFLP中的預擴增相 同，PCR產物1.5%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)凝膠回收試劑盒純化，回收產物連接 到pGEM-T Easy Vector并轉化到f. DH 5 a感受態(tài)細胞。 經(jīng)藍白斑篩選重組質粒，測序，最后RT-PCR驗證得到該條帶的核苷酸序列。(2) Be-A8T18片段相關的基因的cDNA的3，末端和5，末端擴增根 據(jù)雙鏈cDNA合成試劑盒中接頭及引物的特征設計3' RACE和5' RACE錨定引 物P3和P5;根據(jù)差異片段Be-A8T18設計正向特異引物SI和反向特異引物Al, 正向特異引物SI與錨定引物P3擴增3'末端，反向特異引物Al與錨定引物 P5擴增5'末端。錨定引物P5的序列為5， -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3，； 錨定引物P3的序列為5， -GAGGCGGCCGACATGTTTTT-3，；正向特異引物Sl序 列為5' -CTCCTCTCCAGGTTCTGACATTACT-3';反向特異引物Al序列為 5， -CTGCTCGGTGTTGGAGATTGG-3' ; PCR產物經(jīng)DNA凝膠回收試劑盒回收，插入 pGEM-T Easy載體，轉化DH 5 a感受態(tài)細胞，藍白斑篩選陽性克隆，堿裂解法 抽提質粒，酶切鑒定后，測序，得到Bc-A8T18片段相關的基因的cDNA的3， 末端和5'末端。(3) /^&^基因的全長克隆根據(jù)兩端拼接的cDNA全長序列設計特異引 物Tl和T2， Tl的序列為5， -TGGGATTTTCAGCCAATG-3， ， T2的序列為 5， -AGAGCATACATCATAGAC-3，；常規(guī)PCR方法再次從花蕾cDNA中擴增Be-A8T18 片段相關基因的cDNA序列；用同一特異引物對在基因組DNA中擴增得到其DNA 序列SEQ ID No. 2。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種白菜花粉壁發(fā)育相關基因PGBc2及其分離方法，白菜花粉壁發(fā)育相關基因PGBc2包含SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，該基因的分離克隆及功能驗證，有助于闡明花粉發(fā)育和植物雄性不育產生的分子機理，對生產上人為控制植物育性，培育優(yōu)良品種具有重要的實踐意義。
文檔編號C12N15/10GK101255429SQ20081006058
公開日2008年9月3日 申請日期2008年3月28日 優(yōu)先權日2008年3月28日
發(fā)明者葉意群, 張愛紅, 張豫超, 曹家樹, 鸝 黃 申請人:浙江大學