一種介孔二氧化硅復(fù)合材料結(jié)合質(zhì)譜鑒定肽段的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于先進(jìn)納米材料與生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種介孔二氧化硅復(fù)合材料結(jié)合質(zhì)譜鑒定肽段的方法，具體涉及一種磁性微球四氧化三鐵表面包覆聚全氟烷基修飾的介孔二氧化硅復(fù)合材料在全氟烷基衍生的磷酸化肽富集與MALD1-TOF MS分析中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]全氟烷基能夠在含氟環(huán)境中產(chǎn)生離域效應(yīng)，氟氟固相微萃取便是利用這一特性，通過(guò)全氟烷基修飾的介質(zhì)，將含有全氟烷基的物質(zhì)同不含氟的物質(zhì)分離開(kāi)來(lái)。氟氟固相微萃取技術(shù)通常被應(yīng)用于靶向合成、非均相催化和有機(jī)小分子化合物的分離提純等。近來(lái)，氟氟固相微萃取的應(yīng)用已拓展到生物化學(xué)領(lǐng)域，包括蛋白質(zhì)和肽段的分析鑒定、納米微陣列設(shè)計(jì)和熒光檢測(cè)等。
[0003]然而生物分子通常是不含氟的，所以必須用合適的含全氟烷基的親和試劑進(jìn)行衍生后，再利用氟氟相互作用將它們提取出來(lái)?；诜H和作用的蛋白質(zhì)組學(xué)便是將生物樣品中特定的蛋白/肽段標(biāo)記上全氟烷基基團(tuán)后，用氟氟固相微萃取技術(shù)進(jìn)行富集的新型分析平臺(tái)。傳統(tǒng)的基于親和作用的富集策略只適用于某一類(lèi)有著特定功能基團(tuán)的蛋白/肽段，比如金屬氧化物親和色譜用于磷酸化肽的富集，硼酸親和色譜用于糖肽的富集等。與上述基于親和作用的富集方法不同，對(duì)目標(biāo)蛋白/肽段進(jìn)行適當(dāng)?shù)难苌?，基于氟親和作用的富集方法能夠應(yīng)用于富集含有不同功能基團(tuán)或翻譯后修飾的蛋白/肽段，并展現(xiàn)了很高的選擇性。
[0004]另一方面，基于氟親和作用的富集方法還被同功能化磁性納米材料進(jìn)行了結(jié)合。全氟癸基功能化的磁性納米微球被成功合成并應(yīng)用于水樣中含氟物質(zhì)的萃取，為結(jié)合了磁性材料的氟氟固相微萃取技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了啟示。考慮到磁性分離的快速和簡(jiǎn)便性，融合了磁性材料的氟氟固相微萃取方法與質(zhì)譜鑒定技術(shù)相結(jié)合，是取代傳統(tǒng)親和方法鑒定肽段的理想手段。此外，這一新的富集策略具有從一個(gè)蛋白樣品中同時(shí)富集多種含有不同功基團(tuán)或翻譯后修飾肽段的潛力，而無(wú)須對(duì)富集的介質(zhì)做出改變。
[0005]本發(fā)明中設(shè)計(jì)與合成的磁性微球四氧化三鐵表面包覆全氟烷基修飾的介孔二氧化硅復(fù)合材料，被成功應(yīng)用于全氟烷基衍生的肽段的富集。首先通過(guò)傳統(tǒng)水熱合成方法制備四氧化三鐵磁性微球，接著通過(guò)表面活性劑輔助的一鍋法在四氧化三鐵表面包覆全氟烷基修飾的介孔二氧化硅，其中正硅酸乙酯作為硅源，十六烷基三甲基溴化銨作為介孔形成的模板劑，1H, 1H, 2H, 2H-全氟癸基三乙氧基硅烷作為全氟烷基的來(lái)源。由于材料表面富含硅羥基而介孔二氧化硅孔道中修飾有全氟烷基，合成所得復(fù)合材料具有良好的分散性、較高的富集容量和對(duì)于全氟烷基衍生肽段的特異性吸附作用，能夠應(yīng)用于氟相衍生的低濃度肽段的富集與質(zhì)譜檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明目的在于提供一種介孔二氧化硅復(fù)合材料結(jié)合質(zhì)譜鑒定肽段的方法。
[0007]該方法將介孔二氧化硅復(fù)合材料配成濃度為10 mg/mL的分散液，溶劑為50% (體積分?jǐn)?shù))乙醇；將該分散液加入全氟烷基衍生的肽段溶液稀釋液中，混合，在酶解儀中孵育30-60分鐘；通過(guò)外加磁場(chǎng)分離出介孔二氧化硅復(fù)合材料，用去離子水洗滌，用0.4 Μ氨水洗脫；取1 μ L洗脫液點(diǎn)在基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD1-TOF MS)靶板上，自然干燥后再滴加0.8 μ L濃度為20 mg/mL的2，5- 二羥基苯甲酸(DHB )溶液于被分析物液滴上，形成薄基質(zhì)層，干后進(jìn)行質(zhì)譜分析。
[0008]其中，所述介孔二氧化硅材料為磁性微球四氧化三鐵表面包覆全氟烷基修飾的介孔二氧化硅復(fù)合材料。
[0009]本發(fā)明中，介孔二氧化硅復(fù)合材料的具體制備步驟如下:
(1)將六水合三氯化鐵溶于乙二醇中，磁力攪拌至澄清后，加入醋酸鈉，充分?jǐn)嚢枞芙夂筠D(zhuǎn)移至水熱合成反應(yīng)釜中，超聲5分鐘后，放入烘箱中190-200°C下加熱10-18小時(shí)，取出反應(yīng)釜，冷卻10-12小時(shí)；從反應(yīng)釜中倒出反應(yīng)所得的磁球，并用去離子水和無(wú)水乙醇充分洗滌，40-60°C下真空干燥；
(2)將步驟(1)所得產(chǎn)物與十六烷基三甲基溴化銨按質(zhì)量比1:10分散在去離子水中，超聲30分鐘；將所得分散液與氫氧化鈉溶液混合，超聲5分鐘后得到均一穩(wěn)定的分散液；將該混合溶液在60°C水浴中加熱攪拌30分鐘后，向其中緩慢滴加正硅酸乙酯/乙醇溶液，滴加完畢后在60°C水浴中加熱攪拌30分鐘；
(3)將1H，1H,2H, 2H-全氟癸基三乙氧基硅烷/正硅酸乙酯溶液滴加到步驟(2)所得產(chǎn)物中，在60°C水浴中加熱攪拌12小時(shí)；
(4)用磁鐵將步驟(3)所得產(chǎn)物從反應(yīng)液中分離出來(lái)，在60°C乙醇溶液中加熱回流除去十六烷基三甲基溴化銨模板劑，在40-60 V下真空干燥。
[0010]本發(fā)明中，步驟(1)中六水合三氯化鐵和醋酸鈉的質(zhì)量比為:(1.0-1.5):(3.0-10.0)。
[0011]本發(fā)明中，步驟(2)中步驟(1)所得的產(chǎn)物和去離子水的質(zhì)量比為1.0:1.0 ;氫氧化鈉溶液的濃度范圍為1.0X 10 3摩爾/升-1.5X 10 3摩爾/升；氫氧化鈉溶液與去離子水的體積比為9.0:1.0 ;正硅酸乙酯與分散液的體積比為1.0:1000 ;正硅酸乙酯與乙醇的體積比為1.0:4.0。
[0012]本發(fā)明中，步驟(3)中1H，1H, 2H, 2H-全氟癸基三乙氧基硅烷與正硅酸乙酯的體積比為1.0:2.0 ；1H, 1H, 2H, 2H-全氟癸基三乙氧基硅烷/正硅酸乙酯混合溶液與步驟(2)中正硅酸乙酯/乙醇混合溶液的體積比為1.0:( 15.0-20.0)。
[0013]本發(fā)明中，全氟烷基衍生的肽段溶液稀釋液的具體制備步驟如下:
(1)向標(biāo)準(zhǔn)磷酸化肽、蛋白酶解液或人體血清中依次加入二甲亞砜/乙醇溶液、飽和氫氧化鋇溶液、濃度為500 mM的氫氧化鈉溶液和衍生試劑1H，2H, 2H, 2H-全氟-1-硫醇，在酶解儀中37°C下避光反應(yīng)1小時(shí)；
(2)加入體積分?jǐn)?shù)為5%的三氟乙酸溶液，將步驟(1)所得的溶液調(diào)節(jié)至酸性，終止衍生反應(yīng)，然后加入過(guò)氧化氫溶液在酶解儀中20°C下氧化30分鐘，磷酸化肽中的磷酸根將被全氟烷基所取代；用去離子水將衍生液稀釋100倍。
[0014]本發(fā)明中，步驟(1)中二甲亞砜/乙醇溶液與肽段溶液的體積比為1.0:1.0，二甲亞砜與乙醇的體積比為3.0:1.0，飽和氫氧化鋇溶液與二甲亞砜/乙醇溶液的體積比為23.Ο:25.0,500 mM氫氧化鈉溶液與二甲亞砜/乙醇溶液的體積比為1.0:5.0，1H, 2H, 2H, 2H-全氟-1-硫醇與二甲亞砜/乙醇溶液的體積比為7.0:50.0
本發(fā)明中，步驟(2)中5%三氟乙酸溶液與二甲亞砜/乙醇溶液的體積比為3.0:5.0，過(guò)氧化氫溶液的終濃度為體積分?jǐn)?shù)3%。
[0015]本發(fā)明的有益效果在于:所提供的介孔二氧化硅復(fù)合材料結(jié)合質(zhì)譜鑒定肽段的方法中，磁性微球包覆全氟烷基修飾的介孔二氧化硅復(fù)合材料用表面活性劑輔助的一鍋合成法合成，制備方法簡(jiǎn)便，合成所得材料具有良好的磁響應(yīng)性、大比表面積和在水溶液中的分散性，對(duì)全氟烷基衍生的磷酸化肽具有很強(qiáng)的親和作用，可作為富集分離全氟烷基修飾的磷酸化肽的固相微萃取吸附劑。該材料以全氟烷基修飾的介孔二氧化硅作為殼層，提供了對(duì)目標(biāo)含氟肽段的特異性吸附，并顯示出了很高的選擇性，取得了對(duì)于非磷酸化肽1:1000(物質(zhì)的量之比)的選擇性，并適用于復(fù)雜生物樣品中全氟烷基衍生的磷酸化肽的鑒定。
【附圖說(shuō)明】
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