用于全血樣品檢測的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光雙層微流控芯片的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)和微流控心片技術(shù)實現(xiàn)分析物高靈敏定量檢測的芯片，特別公開了一種用于全血樣品檢測的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光雙層微流控芯片，可應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究、臨床診斷、生化檢測、司法鑒定，屬于微流控芯片化學(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，體外診斷(IVD)主要有兩種發(fā)展趨勢:一種是自動化、一體集成化，即利用大型醫(yī)院配套的中心實驗室的全自動化、高靈敏的大型儀器設(shè)備，實現(xiàn)高精度的疾病分析診斷；另一種小型化、床旁化，即通過掌上小型簡易設(shè)備，實現(xiàn)現(xiàn)場快速分析診斷。小型醫(yī)院資金不足、樣本量少，并不適合購買價格昂貴的大型設(shè)備?，F(xiàn)階段小型快速檢測設(shè)備主要是試紙條及其配套設(shè)備，但試紙條只能實現(xiàn)定性或半定量檢測，檢測靈敏度低、特異性差、重復(fù)性差、受干擾明顯。由于中國人口眾多，老齡化加劇，發(fā)病率劇增，單純依靠大型醫(yī)院已不堪重負。因此研制操作簡便、靈敏度高、重復(fù)性好和定量準確的快速檢測方法和設(shè)備變得極為迫切。
[0003]化學(xué)發(fā)光是指化學(xué)反應(yīng)過程中的反應(yīng)中間體、反應(yīng)產(chǎn)物或外加發(fā)光試劑將化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)楣饽艿默F(xiàn)象。與熒光和吸收光相比，化學(xué)發(fā)光沒有外來激發(fā)光源背景信號干擾，交叉干擾小，具有靈敏度高、線性范圍寬等優(yōu)點。由此建立的化學(xué)發(fā)光分析已廣泛應(yīng)用于臨床診斷等領(lǐng)域。化學(xué)發(fā)光儀是IVD主要的大型分析檢測設(shè)備。
[0004]微流控芯片技術(shù)是把生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)分析過程的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測等基本操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上，自動完成分析全過程。由于它在生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的巨大潛力，已經(jīng)發(fā)展成為一個生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、流體、材料、機械等多學(xué)科交叉的研究領(lǐng)域，被應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究、生化檢測、司法鑒定等領(lǐng)域。如中國專利201110006837.3描述了一種可定位的微流控芯片，該微流控芯片由圍欄陣列層、底片和蓋層組成，可用于體外受精、檢測神經(jīng)膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元作用、構(gòu)建神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和檢測細胞生長狀態(tài)等。
[0005]但將化學(xué)發(fā)光和微流控芯片結(jié)合起來的資料及文獻并不多，實用及可產(chǎn)業(yè)化的更少，如中國專利200910114403.8描述了一種微流控芯片化學(xué)發(fā)光測定人單個血紅細胞內(nèi)物質(zhì)的方法，其需依賴顯微鏡平臺或透鏡和濾光片組成的復(fù)雜光路；中國專利200910154432.7公開了毛細管電泳分離和化學(xué)發(fā)光檢測的微流控芯片，其流路結(jié)構(gòu)單一，進樣未經(jīng)充分混合從而導(dǎo)致反應(yīng)效率較低，無法達到最大發(fā)光強度。
[0006]故現(xiàn)有技術(shù)主要存在如下缺點:
[0007]1)現(xiàn)有快速診斷方法主要定性或半定量的試紙條，其靈敏度低、重復(fù)性差、受干擾明顯。
[0008]2)現(xiàn)有化學(xué)發(fā)光微流控芯片結(jié)構(gòu)設(shè)計簡單，檢測時操作復(fù)雜，檢測時間長，所需試劑多通過外部壓力注入芯片。
[0009]3)現(xiàn)有化學(xué)發(fā)光微流控芯片其檢測系統(tǒng)依賴大型設(shè)備，如顯微鏡平臺、生物芯片掃描儀等。
[0010]另外，基于微流控芯片實現(xiàn)的反應(yīng)和分析，其基本過程是在芯片內(nèi)預(yù)封裝或者從外部引入一種或多種反應(yīng)試劑，然后將液體樣本加入芯片，樣本按照預(yù)先設(shè)定的微通道流路與試劑接觸并進行反應(yīng)，通過儀器或者肉眼對結(jié)果進行讀取。目前微流控芯片主流的檢測手段包括激光誘導(dǎo)熒光、化學(xué)發(fā)光和紫外吸收等。要實現(xiàn)分析結(jié)果的準確性，最重要的微通道內(nèi)多種液體要準確定量的按照預(yù)先設(shè)定的通道在指定的時間內(nèi)到達指定位置。但是實際情況并不一定理想，由于芯片或者樣本的原因，微流控芯片內(nèi)的反應(yīng)可能并沒有按照設(shè)定的過程進行，如產(chǎn)生氣泡導(dǎo)致芯片內(nèi)液體流動停止，或者芯片發(fā)生滲漏導(dǎo)致液體無法填充各預(yù)定通道等，這些都會使預(yù)定反應(yīng)的試劑或底物之間反應(yīng)不完全，使得分析結(jié)果產(chǎn)生錯誤。但是由于芯片內(nèi)的反應(yīng)是自動完成，實驗者或檢測者看到的只是最終結(jié)果，缺少對中間過程的監(jiān)控，這樣必然會導(dǎo)致對結(jié)果的錯誤分析，從而影響了分析的準確性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題為針對現(xiàn)有快速診斷方法靈敏度低、重復(fù)性差、受干擾明顯，以及現(xiàn)有化學(xué)發(fā)光微流控芯片配套儀器昂貴、檢測時間長的問題，提供一種微流控磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫檢測的集成化芯片(把除測試樣本外所有組分均集成到芯片內(nèi))并配套小型便攜設(shè)備，從而實現(xiàn)現(xiàn)場樣本中分析物的快速、準確、高靈敏定量檢測。
[0012]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:
[0013]一種用于全血樣本檢測的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光雙層微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括頂板(1)和底板(2)，其中頂板包含加樣口(4)、樣本填充區(qū)(12)、標記配體存儲池(5)和樣本混合區(qū)(13);底板包含過濾區(qū)￠)、磁顆粒包被區(qū)(7)、清洗區(qū)(14)、檢測區(qū)
(8)、清洗液存儲池(9)、發(fā)光基底液存儲池(10)、液體釋放通道(16);
[0014]所述加樣口(4)和標記配體存儲池(5)由樣本填充區(qū)(12)連接，標記配體存儲池
(5)與樣本混合區(qū)(13)連接；所述底板的檢測區(qū)(8)與清洗液存儲池(9)和發(fā)光基底液存儲池(10)通過液體釋放通道(16)連接；所述過濾區(qū)￠)、磁顆粒包被區(qū)(7)、清洗區(qū)(14)、檢測區(qū)(8)依次連接；所述樣本混合區(qū)(13)末端與過濾區(qū)(6)連通；
[0015]所述標記配體存儲池(5)、清洗液存儲池(9)、發(fā)光基底液存儲池(10)為液體密封池，可通過外力擠壓而局部破裂，釋放液體；
[0016]所述標記配體存儲池(5)、清洗液存儲池(9)、發(fā)光基底液存儲池(10)和磁顆粒包被區(qū)(7)中存儲預(yù)封裝試劑；所述過濾區(qū)(6)包含濾血膜，其中濾血膜可通過物理孔徑或生物/化學(xué)試劑使液體與細胞分離，所述生物/化學(xué)試劑包含凝血劑等；
[0017]所述微流控芯片測試流程中，用磁鐵操控磁顆粒移動或聚集。
[0018]所述微流控芯片磁鐵操控磁顆粒移動或聚集分為頂部磁鐵操控磁顆粒移動或聚集和底部磁鐵操控磁顆粒移動或聚集兩種。
[0019]所述微流控芯片的測試流程包括:
[0020]步驟1)將全血樣本滴入加樣口(4)，樣本流入樣本填充區(qū)(12)，蓋上蓋子(11)，微流控芯片放入配套儀器中，酶或發(fā)光劑標配體從標記配體存儲池(5)釋放后，樣本和酶或發(fā)光劑標配體于樣本混合區(qū)(13)混合均勻，然后注入底板過濾區(qū)(6);
[0021]步驟2)樣本經(jīng)過濾區(qū)(6)后，到達磁顆粒包被區(qū)(7)，溶解磁標配體，磁鐵加速樣本中分析物與磁標配體反應(yīng)，然后磁鐵收集磁顆粒，清洗液存儲池(9)釋放清洗液，磁顆粒清洗后，磁鐵將磁顆粒移至檢測區(qū)(8)，發(fā)光基底液存儲池(9)釋放發(fā)光基底液，儀器檢測系統(tǒng)檢測發(fā)光信號強度，進而實現(xiàn)分析物的定量檢測。
[0022]所述微流控芯片的測試流程步驟1)所述樣本體積為10?500 μ 1，優(yōu)選20?100 μ Ιο作為優(yōu)選，在實施例中加樣體積為50 μ 1。
[0023]所述微流控芯片的測試流程步驟2)所述磁顆粒尺寸為0.1?10 μ m，優(yōu)選0.5?3 μ??。其中磁顆粒尺寸和磁鐵的磁感應(yīng)強度對檢測結(jié)果有明顯的影響，為與磁顆粒相匹配，磁鐵磁感應(yīng)強度為500?30000高斯，優(yōu)選1000?8000高斯。作為優(yōu)選，其中一個實施例中使用2 μπι的磁顆粒，磁感應(yīng)強度為6000高斯。另一個實施例中使用0.5 μπι的磁顆粒，磁感應(yīng)強度為2000高斯。
[0024]本發(fā)明所用磁顆粒超順磁性顆粒，包含鐵、鈷、鎳的化合物，主要包含但不限于三氧化二鐵和四氧化三鐵化合物。本發(fā)明實施例中所用磁顆粒為聚苯乙烯為殼，三氧化二鐵為核的顆粒。
[0025]所述微流控芯片的測試流程步驟1)所述配套儀器為小型便攜設(shè)備，包含擠壓氣栗和存儲池，磁鐵移動，發(fā)光檢測系統(tǒng)等功能，微流控芯片放入儀器后，點擊開始測試，儀器可自動完成所有操作；步驟1)所述氣栗包含微流控芯片自帶彈性膠帶(23)密封形成空氣空腔，以及配套儀器提供正負壓氣流兩種；步驟2)所述分析物與配體的反應(yīng)，包含分析物與酶標抗體和磁顆粒標記抗體形成三明治結(jié)構(gòu)，以及分析物與酶標抗體競爭，減少磁顆粒與酶標抗體的結(jié)合。
[0026]本發(fā)明微流控芯片的制備方法如下:
[0027]步驟1)發(fā)光劑標記可與分析物結(jié)合或競爭的一種配體，獲得發(fā)光劑標記配體，磁顆粒標記可與分析物結(jié)合或競爭的另一種配體，獲得磁顆粒標記配體，這兩種配體可相同或不同；
[0028]步驟2)將磁顆粒標記抗體溶液放入包被區(qū)中，干燥，然后將發(fā)光劑標記物溶液滴入包被區(qū)中，干燥，將清洗液和發(fā)光激發(fā)液分別注入清洗液存儲池和發(fā)光基底液存儲池中，密封，組裝微流控芯片。
[0029]本發(fā)明微流控芯片制備方法張所述的步驟2)所述標記配體溶液、磁顆粒標記配體溶液和清洗液均包含緩沖液、蛋白質(zhì)、表面活性劑及防腐劑，且磁顆粒標記抗體溶液還包含糖類；步驟2)所述發(fā)光基底液包含與酶對應(yīng)的底物及發(fā)光增強液；步驟2)所述發(fā)光基底液可拆分為底物液和發(fā)光增強液，分別注入發(fā)光基底液存儲池A (24)、發(fā)光基底液存儲池B (25)，釋放后通過發(fā)光基底液預(yù)混合通道(26)混合均勻。
[0030]本發(fā)明微流控芯片制備方法張所述的步驟1)所述酶包含過氧化氫酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP);所述發(fā)光劑包含但不限于吖啶酯和吖啶磺酰胺，本發(fā)明的實施例采用吖啶酯。吖啶酯與發(fā)光激發(fā)液作用后，不需酶的催化作用，直接參與發(fā)光反應(yīng)。所述磁顆粒包含三氧化二鐵和四氧化三鐵化合物。
[0031]本發(fā)明提供的用于全血樣品檢測的磁微粒直接化學(xué)