富集赭曲霉毒素a的免疫親和吸附劑及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了富集赭曲霉毒素A的免疫親和吸附劑及其制備方法與應(yīng)用。該富集赭曲霉毒素A的免疫親和吸附劑，是將赭曲霉毒素A多克隆抗體和含氨基的固相載體偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物；所述赭曲霉毒素A多克隆抗體按照包括如下步驟的方法制備：以赭曲霉毒素A-NHS活性酯與載體蛋白的偶聯(lián)物為免疫原免疫非人哺乳動物得到抗血清，從所述抗血清中純化得到所述富集赭曲霉毒素A多克隆抗體。本發(fā)明富集赭曲霉毒素A的免疫親和吸附劑及其親和色譜柱具有濃縮待測樣品中赭曲霉毒素A濃度，提高檢測下限、排除雜質(zhì)干擾、提高檢測準(zhǔn)確性和可靠性、減少樣品過柱時間達(dá)到快速檢測的作用。
【專利說明】富集赭曲霉毒素A的免疫親和吸附劑及其制備方法與應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及富集赭曲霉毒素A的免疫親和吸附劑及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]赭曲霉毒素是赭曲霉及青霉菌中某些產(chǎn)毒菌株侵染糧食、食品、飼料及其他農(nóng)副產(chǎn)品后所產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物。赭曲霉毒素A是赭曲霉毒素中毒性最強(qiáng)、產(chǎn)量最高的一種，對人和動物有強(qiáng)烈的毒害作用，可以導(dǎo)致動物的腎萎縮、胎兒畸形、流產(chǎn)、死亡，并且具有高度的致癌性。赭曲霉毒素A在大麥、小麥、燕麥、玉米等大多數(shù)谷物中存在。用受赭曲霉毒素A污染的谷物飼養(yǎng)的家禽也會受到污染，赭曲霉毒素A直接或間接危及人體健康。因此，赭曲霉毒素是繼黃曲霉毒素后又一個引起世界關(guān)注的毒素。1993年，國際癌癥研究院(TheInternational Agency for Researchon Cancer)將赫曲霉毒素定為213組致癌物質(zhì)(可能是人類致癌物)。各國紛紛制定了谷物中赭曲霉毒素A的限量標(biāo)準(zhǔn)，第56次FA0/WH0食品添加劑聯(lián)合專家委員會會議對赭曲霉毒素A進(jìn)行了危險性評價并制定了谷物食品中赭曲霉毒素A最大殘留量標(biāo)準(zhǔn)為5 u g/kg，我國和歐盟及其成員國也規(guī)定在谷物中最大殘留量為 5 ii g/kg。
[0003]目前赭曲霉毒素A的測定方法有多種，如:薄層層析法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)和液相色譜-質(zhì)譜法(LC/MS)、免疫學(xué)檢測等方法。由于生物樣本成分復(fù)雜，待測物濃度低，大多數(shù)取樣量少。這就對分析方法的靈敏度、準(zhǔn)確度有更高的要求。免疫親和層析技術(shù)是一種集免疫反應(yīng)和層析技術(shù)相結(jié)合的分析方法，在提純物質(zhì)上是一項效率高、純度高、快速的技術(shù)，可以使免疫檢測技術(shù)(如ELISA等)和層析技術(shù)在特異性、分離能力、速度和靈敏度方面得到互補(bǔ)，避免了免疫分析法直接測定樣品的不足。使用免疫親和色譜純化富集樣品中的赭曲霉毒素A，可以很大程度的提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性和分析的極限。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種高柱容量(高富集率)的赭曲霉毒素A的免疫親和吸附劑及其制備方法。
[0005]本發(fā)明所提供的富集赭曲霉毒素A的免疫親和吸附劑，是將赭曲霉毒素A多克隆抗體和含氨基的固相載體偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物(吸附劑)；
[0006]所述赭曲霉毒素A多克隆抗體可按照包括如下步驟的方法制備:以赭曲霉毒素A-NHS活性酯與載體蛋白的偶聯(lián)物為免疫原免疫非人哺乳動物得到抗血清，從所述抗血清中純化得到所述富集赭曲霉毒素A多克隆抗體。
[0007]其中，所述非人哺乳動物可為兔、羊、鼠、豚鼠或馬等。
[0008]上述富集赭曲霉毒素A的免疫親和吸附劑中，所述赭曲霉毒素A-NHS活性酯是赭曲霉毒素A通過N，N-二環(huán)己基碳化二亞胺(N，N’ -dieyelohexylcarbodiimide, DCC)與N-羥基琥拍酰亞胺(N-Hydroxysuccinimide, NHS)反應(yīng)生成的活性酯。[0009]上述富集赭曲霉毒素A的免疫親和吸附劑中，所述赭曲霉毒素A-NHS活性酯可按照包括如下步驟的方法制備:
[0010]I)將碘乙酸通過 N，N- 二環(huán)己基碳化二亞胺(N，N，-di eye lohexy lcarbodiimide,DCC)與N-輕基琥拍酰亞胺(N-Hydroxysuccinimide, NHS)反應(yīng)生成活性酯,所述活性酯為NHS-碘乙?；钚怎ィ?br> [0011]2)將所述NHS-碘乙?；钚怎ヅc赭曲霉毒素A進(jìn)行取代反應(yīng)，得到赭曲霉毒素A-NHS活性酯。
[0012]上述富集赭曲霉毒素A的免疫親和吸附劑中，所述I)可為將碘乙酸、N-羥基琥珀酰亞胺和N，N-二環(huán)己基碳化二亞胺在黑暗中進(jìn)行縮合反應(yīng)，得到NHS-碘乙酰活性酯。進(jìn)一步，所述I)可為將碘乙酸、N-羥基琥珀酰亞胺和N，N-二環(huán)己基碳化二亞胺以269:695:582的摩爾比，在四氫呋喃中，20°C _25°C在黑暗中進(jìn)行縮合反應(yīng)，反應(yīng)完畢后，以IOOOOg離心，取上清液得到NHS-碘乙?；钚怎?；
[0013]所述2)可為將赭曲霉毒素A的四氫呋喃溶液與所述上清液(所述NHS-碘乙酰活性酯)混勻，在20-25°C進(jìn)行取代反應(yīng)，得到所述赭曲霉毒素A-NHS活性酯。
[0014]上述富集赭曲霉毒素A的免疫親和吸附劑中，從所述抗血清中純化得到所述富集赭曲霉毒素A多克隆抗體的方法包括:將所述赭曲霉毒素A-NHS活性酯與所述含氨基的固相載體偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物作為純化所述赭曲霉毒素A多克隆抗體的親和層析介質(zhì)，從所述抗血清中通過親和層析純化得到所述赭曲霉毒素A多克隆抗體；和/或
[0015]所述親和層析中用體積百分濃度為3%的乙酸水溶液洗脫所述赭曲霉毒素A多克隆抗。
[0016]上述富集赭曲霉毒素A的免疫親和吸附劑中，所述含氨基的固相載體可為含氨基的瓊脂糖凝膠或為含氨基的葡聚糖凝膠；和/或，
[0017]所述載體蛋白為血蘭蛋白或牛血清白蛋白。
[0018]制備上述富集赭曲霉毒素A的免疫親和吸附劑的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0019]以上述免疫親和吸附劑為填料的富集赭曲霉毒素A的免疫親和色譜柱、含有上述免疫親和吸附劑或上述免疫親和色譜柱的富集赭曲霉毒素A的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0020]所述試劑盒還包括上樣緩沖液、漂洗液及洗脫液。所述的上樣緩沖液可為PBS，所述漂洗液可為PBSt，所述的洗脫液可為乙酸和甲醇水溶液，所述乙酸和甲醇水溶液的溶劑為水，溶質(zhì)為乙酸和甲醇，乙酸的體積百分濃度為3%，甲醇的體積百分濃度為80%。
[0021]每升所述PBS 由 NaCl 8.0g, KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，Na2HPO4.12H20 2.9g，加蒸水定容至lOOOmL，調(diào)pH值到7.4制成。
[0022]每升所述PBSt 由 NaCl 8.0g, KCl 0.2g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4.12H20 2.9g,吐溫-20 500uL，加蒸水定容至IOOOmL, il pH值到7.4制成。
[0023]上述免疫親和吸附劑、上述免疫親和色譜柱、或上述試劑盒在富集赭曲霉毒素A中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0024]所述富集赭曲霉毒素A具體可為富集谷物或飼料中的赭曲霉毒素A。
[0025]上述應(yīng)用中，包括如下得到用于上柱的樣品溶液的步驟:
[0026]將谷物或飼料研碎并通過Imm的試驗篩，不要研成粉末。稱取5g (精確到0.0lg)研碎的樣品于15mL離心管中，加入Ig氯化鈉和IOmL提取液(80%甲醇水溶液)，擰好蓋子，高速震蕩，萃取5min ;然后4000rpm離心5min，準(zhǔn)確移取4mL上清液于50mL的離心管中，加 PBS (每升 PBS 由 NaCl 8.0g, KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，Na2HPO4.12H202.9g，加蒸水定容至lOOOmL，調(diào)pH值到7.4制成)稀釋至刻度，混合均勻，經(jīng)玻璃纖維濾紙過濾，得到用于上柱的樣品溶液。
[0027]上述應(yīng)用中，還包括將上述用于上柱的樣品溶液按照如下步驟進(jìn)行富集的步驟:將上述用于上柱的樣品溶液過上述富集赭曲霉毒素A的免疫親和色譜柱，然后用所述漂洗液洗滌，再用所述洗脫液洗脫，得到富集的赭曲霉毒素A溶液。
[0028]實驗證明，本發(fā)明富集赭曲霉毒素A的免疫親和吸附劑對赭曲霉毒素A就有很高的富集率、靈敏度和回收率。對赭曲霉毒素A的富集率為52ii g/mL富集赭曲霉毒素A的免疫親和吸附劑，對赭曲霉毒素A靈敏度可以達(dá)到100ng/L，對赭曲霉毒素A的回收率達(dá)到80%以上。本發(fā)明富集赭曲霉毒素A的免疫親和吸附劑可以高效、準(zhǔn)確、可靠、快速簡便的富集赭曲霉毒素A。裝柱體積25 y L的本發(fā)明富集赭曲霉毒素A的免疫親和吸附劑能達(dá)到現(xiàn)有純化富集柱裝柱體積1000 u L的容量和更敏感的富集效率。本發(fā)明富集赭曲霉毒素A的免疫親和吸附劑可以把待檢樣品中赭曲霉毒素A富集起來，以便進(jìn)一步應(yīng)用于化學(xué)分析儀器檢測(HPLC，高效液相色譜法)和膠體金測試條的快速測試。本發(fā)明富集赭曲霉毒素A的免疫親和吸附劑及其親和色譜柱具有濃縮待測樣品中赭曲霉毒素A濃度，提高檢測下限、排除雜質(zhì)干擾、提高檢測準(zhǔn)確性和可靠性、減少樣品過柱時間達(dá)到快速檢測的優(yōu)點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為用本發(fā)明的富集赭曲霉毒素A的免疫親和色譜柱提純的赭曲霉毒素A，經(jīng)膠體金試紙條測試得到的效果圖。
[0030]圖中，A =PBS經(jīng)膠體金試紙條檢測結(jié)果為C、T均顯色，為陰性；B:0.1ng/mL的赭曲霉毒素A溶液經(jīng)膠體金試紙條檢測結(jié)果為C、T均顯色,為陰性；C:0.1ng/mL的赭曲霉毒素A溶液作為樣品進(jìn)行親和層析收集的流出液(濾過液)經(jīng)膠體金試紙條檢測結(jié)果為C、T均顯色，為陰性；D:0.1ng/mL的赭曲霉毒素A溶液作為樣品進(jìn)行親和層析洗脫出的液體經(jīng)膠體金試紙條檢測結(jié)果為C顯色、T不顯色，為陽性。
【具體實施方式】
[0031]下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0032]下述實施例中所用的緩沖液PBS和PBSt的配制方法如下:
[0033]每升PBS 由 NaCl 8.0g, KCl 0.2g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4.12H20 2.9g，加蒸水定容至lOOOmL, il pH值到7.4制成。
[0034]每升PBSt 由 NaCl 8.0g, KCl 0.2g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4.12H20 2.9g,吐溫-20500uL，加蒸水定容至lOOOmL，調(diào)pH值到7.4制成。
[0035]實施例1、制備富集赭曲霉毒素A的免疫親和吸附劑
[0036]本實施例給出了由赭曲霉毒素A多克隆抗體和含氨基的固相載體偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物作為富集赭曲霉毒素A的免疫親和吸附劑的制備方法。該方法包括:
[0037]一、赭曲霉毒素A特異性多克隆抗體的制備
[0038]1、赭曲霉毒素A全抗原以及包被抗原的制備:
[0039]( I)赭曲霉毒素A-NHS活性酯(半抗原)的制備 [0040]I)取 50mg 碘乙酸(0.269mmol)和 80mg N-羥基玻拍酸亞胺(NHS) (0.695mmol)溶解于500uL四氫呋喃(THF)，得到溶液I ;將120mg N，N-二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)(0.582mmol)溶解于500uL THF，得到溶液2。將溶液I與溶液2混合，在轉(zhuǎn)速為IOOrpm旋轉(zhuǎn)半徑為200mm的搖床在室溫(25°C )黑暗中進(jìn)行縮合反應(yīng)30min，然后1000Og離心2min，取上清液制得NHS-碘乙?；钚怎?，備用。
[0041]2).將50mg (0.124mmol)赭曲霉毒素A徹底溶解于500 y LTHF中得到赭曲霉毒素A溶液，把步驟I)的上清液(NHS-碘乙?；钚怎?加入到赭曲霉毒素A溶液中，混勻，在20°C轉(zhuǎn)速為IOOrpm旋轉(zhuǎn)半徑為200mm的搖床上進(jìn)行取代反應(yīng)I小時，即得到赭曲霉毒素A-NHS活性酯。
[0042](2)赭曲霉毒素A全抗原以及包被抗原的制備
[0043]取50mg載體蛋白一鑰孔血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin) (KLH)或牛血清白蛋白(BSA)，溶解于5mL0.lmol/L碳酸鈉溶液，使pH為8.3，加入步驟(1)的赭曲霉毒素A-NHS活性酯，混勻，室溫(20-250C )于轉(zhuǎn)速為IOOrpm旋轉(zhuǎn)半徑為200mm的搖床進(jìn)行取代反應(yīng)I小時。產(chǎn)物過脫鹽柱G25S印hadex (脫鹽步驟:用10倍體積蒸餾水洗滌脫鹽柱，加入樣品，待樣品完全加入填料后，補(bǔ)加蒸餾水，棄掉空量體積(填料顆粒間和顆粒內(nèi)的體積)，收集的流出液就是脫鹽后的樣品，即得到赭曲霉毒素A與載體蛋白的偶聯(lián)物，作為赭曲霉毒素A全抗原,作為制備赭曲霉毒素A多克隆抗體的免疫原。將載體蛋白為KLH的赭曲霉毒素A-NHS活性酯與載體蛋白的偶聯(lián)物命名為赭曲霉毒素A-KLH，將載體蛋白為BSA的赭曲霉毒素A-NHS活性酯與載體蛋白的偶聯(lián)物命名為赭曲霉毒素A-BSA。分裝保存，用于動物免疫。
[0044]2、赭曲霉毒素A多克隆抗體的制備:
[0045]I)動物免疫程序:
[0046]用步驟I制備的赭曲霉毒素A-BSA溶液(用蒸懼水溶解步驟I制備的赭曲霉毒素A-BSA得到的溶液)作為疫苗免疫新西蘭大白兔，疫苗中赭曲霉毒素A-BSA的濃度為lmg/mL,首次免疫每只兔用0.5mL疫苗加ImL完全佐劑混勻多點注射，加強(qiáng)免疫每只兔用
0.25mL疫苗加0.75mL PBS加ImL不完全佐劑混勻，分2點注射，首次免疫后，每間隔2周加強(qiáng)免疫一次，35-40天采集血清用ELISA方法(將步驟I的赭曲霉毒素A-BSA稀釋成Iug/mL，按IOOul/孔加到96孔板上，37°C靜置包被Ih ;取出，用PBSt洗3次，每次都拍干。加A l%BSA100ul/孔，37°C靜置封閉lh，取出，用PBSt洗3次，每次都拍干。按IOOul/孔加入PBS，用含0.1%BSA的PBS乳液按1:500稀釋抗血清，加入50ull:500的稀釋血清，混勻，取50ul加到第二孔，……依次類推，最后一孔不加抗體，作為空白對照，抗體加入后，37°C靜置反應(yīng)lh，取出，用PBSt洗3次，每次都拍干。按IOOul/孔加入二抗，37°C靜置反應(yīng)0.5h，取出，用PBSt洗3次，每次都拍干。按IOOul/孔加入顯色劑TMB，37°C靜置反應(yīng)15min，取出，按IOOul/孔加入終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀上0D450波長讀數(shù)，以最大0D450值的1/20D值對應(yīng)的稀釋度作為抗體滴度)檢測滴度，血清滴度達(dá)到1:6400后進(jìn)行生產(chǎn)性血清制備。[0047]2)抗血清制備
[0048]從耳部靜脈采集抗血清，20mL/只兔，血清采集后于4°C靜置I小時。然后再5000g離心lOmin，收集上清液，得到抗血清(免疫血清)。
[0049]3)抗原親和色譜填料的制備:
[0050]將步驟I的赭曲霉毒素A-NHS活性酯在pH8-9條件下直接與含氨基瓊脂糖凝膠(G Bios，786-066)在50% (體積百分濃度)的丙酮水溶液中反應(yīng)，室溫(20-25°C )于轉(zhuǎn)速為IOOrpm旋轉(zhuǎn)半徑為200mm的搖床進(jìn)行取代反應(yīng)過夜，生成赭曲霉毒素A-瓊脂糖。次日用PBS將填料雜質(zhì)洗去。即得到赭曲霉毒素A抗原特異性親和色譜填料，用于分離提純赭曲霉毒素A多克隆抗體。
[0051]4)多克隆抗體提純
[0052]將500mL步驟2)的免疫血清流過步驟3)所制的親和色譜填料柱。經(jīng)PBSt清洗去掉雜質(zhì)后，柱上的特異性抗赭曲霉毒素A抗體用體積百分濃度為3%的乙酸水溶液洗脫。洗脫的抗體用透析袋透析去掉乙酸，凍干，得到赭曲霉毒素A多克隆抗體。
[0053]二、富集赭曲霉毒素A的免疫親和吸附劑制備
[0054]用50mL濃度為0.lmol/L碳酸鈉溶液溶解Ig步驟一純化的赭曲霉毒素A多克隆抗體，與40mL的含氨基瓊脂糖凝膠(G Bios，786-066)在體積為90mL的玻璃層析柱室溫下流式循環(huán)反應(yīng)30分鐘。加入50mg硼氫化鈉溶解混勻后，轉(zhuǎn)4°C冰箱靜置30分鐘，用500mLPBSt清洗后，再用IOOmL PBS清洗，自然滴干，加入等體積甘油，混勻，富集赭曲霉毒素A的免疫親和吸附_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0055]取40ml上述富集赭曲霉毒素A的免疫親和吸附作為填料裝入親和層析塑料柱中，填料兩頭分別加上I個孔徑為50 y m的篩板，篩板剛好與填料接觸(不要緊壓填料)后得到40ml富集赭曲霉毒素A的免疫親和吸附的免疫親和色譜柱。用PBS平衡柱子，然后加入用PBS配制的50ml步驟一純化的赭曲霉毒素A多克隆抗體溶液(含有IOOOmg赭曲霉毒素A多克隆抗體)，自然重力下流出，使柱子達(dá)到飽和狀態(tài)。用PBSt清洗柱子，將未結(jié)合的抗體洗掉。應(yīng)用BCA法檢測過柱前后的赭曲霉毒素A多克隆抗體的含量變化，實驗重復(fù)三次，計算出結(jié)合在瓊脂糖上的抗體的量。
[0056]結(jié)果表明未結(jié)合的步驟一純化的赭曲霉毒素A多克隆抗體為150mg，實際偶聯(lián)的步驟一純化的赭曲霉毒素A多克隆抗體為850mg,該富集赭曲霉毒素A的免疫親和吸附劑的抗體吸附量(抗體密度)平均為21.25mg/mL。
[0057]實施例2、富集赭曲霉毒素A的免疫親和色譜柱及其特性檢測
[0058]一、制備富集赭曲霉毒素A的免疫親和色譜柱
[0059]取25 ii L實施例1制備的富集赭曲霉毒素A的免疫親和吸附劑作為填料裝入容量為200 y L的親和層析塑料柱中，填料兩頭分別加上I個孔徑為50 的篩板，壓緊后得到25 u L的富集赭曲霉毒素A的免疫親和色譜柱。
[0060]該富集赭曲霉毒素A的免疫親和色譜柱的貯藏條件:用含有0.01%疊氮鈉和
0.1%BSA的磷酸緩沖液，3_8°C下保存，不能冷凍。該產(chǎn)品的有效期為12個月。
[0061]二、富集赭曲霉毒素A的免疫親和色譜柱的特性檢測
[0062]該步驟所用的上樣緩沖液為PBS。
[0063]該步驟所用的漂洗液為PBSt。[0064]該步驟所用的洗脫液為乙酸和甲醇水溶液，所述乙酸和甲醇水溶液的溶劑為水，溶質(zhì)為乙酸和甲醇，乙酸的體積百分濃度為3%，甲醇的體積百分濃度為80%。
[0065]1、富集赭曲霉毒素A的免疫親和色譜柱的容量測試
[0066]取按照步驟一的條件貯藏12個月的步驟一制備的25 ii L的富集赭曲霉毒素A的免疫親和色譜柱按照如下方法測定柱容量:將親和色譜柱取出，室溫平衡IOmin ;用5mLPBS平衡柱子，然后加入5mL用PBS配制的濃度為2ug/mL的赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma,01877)，自然重力下流出，使柱子達(dá)到飽和狀態(tài)(判斷標(biāo)準(zhǔn)為:流出液中赭曲霉毒素A和加樣液濃度相同)。再用IOmL PBS清洗親和色譜柱，除去干擾雜質(zhì)。最后加入ImL洗脫液洗脫，收集洗脫液，用HPLC法按照GB/T25220-2010檢測，計算出動態(tài)柱容量(指每毫升免疫吸附劑(或柱床體積)對待測物的最大吸收值)。
[0067]三次重復(fù)實驗的結(jié)果表明該25 ii L的富集赭曲霉毒素A的免疫親和色譜柱的柱容量平均為52y g/mL填料。說明該富集赭曲霉毒素A的免疫親和色譜柱的富集能力很強(qiáng)，平均ImL的填料吸附52 U g的赭曲霉毒素A，本發(fā)明富集赭曲霉毒素A的免疫親和吸附劑的富集率為52ug/mL。
[0068]2、富集赭曲霉毒素A的免疫親和色譜柱的回收率測試
[0069]將赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品(sigma，01877)用上樣緩沖液分別制成濃度為2ng/mL、20ng/mL、100ng/mL的赭曲霉毒素A溶液作為待測樣品，并以上樣緩沖液作為空白待測樣品。按照步驟I的方法，用按照步驟一的條件貯藏12個月的步驟一制備的25 y L的富集赭曲霉毒素A的免疫親和色譜柱檢測待測樣品中的赭曲霉毒素A的質(zhì)量。
[0070]兩次重復(fù)實驗的結(jié)果表明:①50mL濃度為2ng/mL的赭曲霉毒素A溶液作為待測樣品，用洗脫液洗脫出的赭曲霉毒素A分別為80.5ng、80.3ng,平均回收率為80.4% ；
[0071]②5mL濃度為20ng/mL的赭曲霉毒素A溶液作為待測樣品,用洗脫液洗脫出的赭曲霉毒素A分別為90.2ng、89.6ng;平均回收率為89.9% ；
[0072]③ImL濃度為100ng/mL的赭曲霉毒素A溶液作為待測樣品,用洗脫液洗脫出的赭曲霉毒素A分別為83ng、85ng，平均回收率為84%;
[0073]④空白待測樣品用洗脫液洗脫，未檢出赭曲霉毒素A。
[0074]說明富集赭曲霉毒素A的免疫親和色譜柱對赭曲霉毒素A的回收率達(dá)到了 80%以上。
[0075]3、極限試驗
[0076]將赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品(sigma，01877)用上樣緩沖液分別制成濃度為100ng/L、1000ng/L的赭曲霉毒素A溶液作為待測樣品，并以上樣緩沖液作為空白待測樣品。按照步驟I的方法，用按照步驟一的條件貯藏12個月的步驟一制備的25 y L的富集赭曲霉毒素A的免疫親和色譜柱檢測待測樣品中的赭曲霉毒素A的質(zhì)量。
[0077]三次重復(fù)實驗的結(jié)果為:①IOmL濃度為100ng/L的赭曲霉毒素A溶液作為待測樣品，用洗脫液洗脫出的赭曲霉毒素A分別為1.3ng、0.9ng、1.0ng，平均為1.07ng ;@2mL濃度為1000ng/L的赭曲霉毒素A溶液作為待測樣品，用洗脫液洗脫出的赭曲霉毒素A分別為
2.6ng, 2.lng、2.4，平均為2.4ng;③空白待測樣品用洗脫液洗脫，未檢出赭曲霉毒素A。說明該富集赭曲霉毒素A的免疫親和色譜柱的靈敏度可以達(dá)到100ng/L，經(jīng)富集濃縮后樣品達(dá)到檢測儀器的要求。[0078]實施例3、富集赭曲霉毒素A的免疫親和色譜柱與膠體金測試條聯(lián)用對待測樣品進(jìn)行定性測試
[0079]制備10只25 y L的富集赭曲霉毒素A的免疫親和色譜柱，每只的制備方法如下:取25 ii L實施例1制備的富集赭曲霉毒素A的免疫親和吸附劑作為填料裝入容量為ImL的親和層析塑料柱中，填料兩頭分別加上I個孔徑為50 y m的篩板，壓緊后得到25 y L的富集赭曲霉毒素A的免疫親和色譜柱。
[0080]隨機(jī)抽樣5只25ii L富集赭曲霉毒素A的免疫親和色譜柱，室溫平衡IOmin ;用5mL PBS平衡柱子，備用。將赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品(sigma，01877)用PBS分別制成濃度為
0.0Ing/mL,0.1ng/mL、1.0ng/mLU0.0ng/mL的赭曲霉毒素A溶液作為待測樣品，并以PBS作為空白待測樣品，按照下述方法進(jìn)行親和層析。將ImL上述待測樣品分別上柱，控制流速為
0.05mL/s，收集流出液(濾過液)。上樣完畢，用PBS平衡，然后以100 y L體積百分濃度為3%的乙酸水溶液(用飽和tris-base溶液中和到pH=7.0-7.5)作為洗脫液進(jìn)行洗脫收集洗脫出的液體IOOuL0
[0081]用敏感度5ng/mL的赭曲霉毒素A膠體金測試條(無錫安迪生物工程有限公司，AN-OO3)按照試劑盒的說明書檢測上述0.01ng/mL、0.1ng/mL、1.0ng/mL和10.0ng/mL的赭曲霉毒素A溶液和PBS、各個待測樣品的流出液、各個待測樣品洗脫出的液體。測試結(jié)果表明，膠體金測試條對0.01ng/mL、0.1ng/mL和1.0ng/mL的赭曲霉毒素A溶液和PBS檢測結(jié)果為陰性，對10.0ng/mL的赭曲霉毒素A溶液的檢測結(jié)果為陽性，說明膠體金測試條合乎產(chǎn)品特性。膠體金測試條對所有5種樣品過柱后的濾過液皆呈陰性。說明該富集赭曲霉毒素A的免疫親和色譜柱能有效俘獲赭曲霉毒素A分子。
[0082]膠體金測試條對上樣緩沖液PBS和0.0lng/mL赭曲霉毒素A溶液作為樣品進(jìn)行上述親和層析洗脫出的液體的檢測結(jié)果為陰性，對0.lng/mL、l.0ng/mL、10.0ng/mL的赭曲霉毒素A溶液作為樣品進(jìn)行上述親和層析洗脫出的液體的檢測結(jié)果為陽性，結(jié)果見圖1，說明:1)該富集赭曲霉毒素A的免疫親和色譜柱上的抗體穩(wěn)定，沒有脫落，不造成因抗體不穩(wěn)定脫落的假陽性。2)該富集赭曲霉毒素A的免疫親和色譜柱能起富集作用，ImL的0.1ng/mL的樣品原液陰性(低于膠體金測試條的檢出限)，經(jīng)過該富集赭曲霉毒素A的免疫親和色譜柱純化富集到IOOy L后，可以被撿膠體金測試條檢測出來。說明經(jīng)過本發(fā)明的富集赭曲霉毒素A的免疫親和色譜柱富集后，檢測下限可達(dá)0.1ng/mL。
[0083]實施例4、富集赭曲霉毒素A的免疫親和色譜柱的使用方法
[0084]該實施例中的漂洗液為PBSt，所述洗脫液為乙酸和甲醇水溶液，所述乙酸和甲醇水溶液的溶劑為水，溶質(zhì)為乙酸和甲醇，乙酸的體積百分濃度為3%，甲醇的體積百分濃度為80%。
[0085]a)樣品的前處理:
[0086]谷物/飼料樣品:將樣品研碎并通過Imm的試驗篩，不要研成粉末。稱取5g(精確到0.0lg)研碎的樣品于15mL離心管中，加入Ig氯化鈉和IOmL提取液(80%甲醇水溶液)，擰好蓋子，高速震蕩，萃取5min ;然后4000rpm離心5min，準(zhǔn)確移取4mL上清液于50mL的離心管中，加PBSdf PH值到7.4制成稀釋至刻度，混合均勻，經(jīng)玻璃纖維濾紙過濾，得到用于上柱的樣品溶液共計10mL。
[0087]b).將實施例2制備的g集赫曲霉毒素A的免疫未和色譜柱從4 C冰箱移到室溫(22-25°C)，平衡IOmin后，取出上方塞子，并拔掉下方堵頭，用2mL PBS洗滌2次。
[0088]c).用0.2mL的洗脫液洗滌經(jīng)過步驟b)處理的富集赭曲霉毒素A的免疫親和色譜柱，洗掉填料上殘留的赭曲霉毒素A抗體，待洗脫液流干后用PBS洗至中性。
[0089]d).將步驟a)所得的樣品溶液過柱，流速控制在0.05mL/s。
[0090]e).待液體完全排干后，用漂洗液洗滌2次，每次2mL。
[0091]f).待液體完全排干后，用洗脫液進(jìn)行洗脫，洗脫出的液體可直接用于HPLC檢測分析，或者將洗脫出的液體用氮氣吹干后用復(fù)溶液(10%甲醇-0.5%BSA-PBSt)將殘渣溶解，該溶解物可以用于ELISA測試盒和膠體金試紙條測試。其中，復(fù)溶液的成分為在PBSt溶液中加入甲醇和BSA至甲醇體積含量為10%，BSA含量為0.5%得到的液體。
[0092]實施例5、實施例2的富集赭曲霉毒素A的免疫親和色譜柱檢測含赭曲霉毒素A的玉米
[0093]a)取不含赭曲霉毒素A的玉米籽粒研碎并通過Imm的試驗篩，不要研成粉末。稱取5g(精確到0.0lg)研碎的樣品于15mL離心管中，添加赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品(sigma, 01877),使樣品中赭曲霉毒素A的含量為0.lng/g，加入Ig氯化鈉和IOmL提取液(80%甲醇水溶液)，擰好蓋子，高速震蕩，萃取5min ;然后4000rpm離心5min，準(zhǔn)確移取4mL上清液于50mL的離心管中，加PBS稀釋至刻度，混合均勻，經(jīng)玻璃纖維濾紙過濾，得到用于上柱的樣品溶液。
[0094]b).將實施例2制備的g集赫曲霉毒素A的免疫未和色譜柱從4 C冰箱移到室溫(22-25°C)，平衡IOmin后，取出上方塞子，并拔掉下方堵頭，用2mL PBS洗滌2次。
[0095]c).用0.2mL的洗脫液洗滌經(jīng)過步驟b)處理的富集赭曲霉毒素A的免疫親和色譜柱，洗掉填料上殘留的赭曲霉毒素A抗體，待洗脫液流干后用PBS洗至中性。
[0096]d).將步驟a)所得的樣品溶液過柱,流速控制在0.05mL/s。
[0097]e).待液體完全排干后，用漂洗液(同實施例4)洗滌2次，每次2mL。
[0098]f).待液體完全排干后，用洗脫液(同實施例4)進(jìn)行洗脫，得到富集的赭曲霉毒素A溶液。
[0099]g).應(yīng)用國標(biāo)檢測方法:GB/T25220-2010糧油檢驗糧食中赭曲霉毒素A的測定高效液相色譜法和熒光光度法對樣品中赭曲霉毒素A的含量進(jìn)行測定。
【權(quán)利要求】
1.制備富集赭曲霉毒素A的免疫親和吸附劑的方法,包括將赭曲霉毒素A多克隆抗體和含氨基的固相載體偶聯(lián)得到富集赭曲霉毒素A的免疫親和吸附劑的步驟； 所述赭曲霉毒素A多克隆抗體按照包括如下步驟的方法制備:以赭曲霉毒素A-NHS活性酯與載體蛋白的偶聯(lián)物為免疫原免疫非人哺乳動物得到抗血清，從所述抗血清中純化得到所述富集赭曲霉毒素A多克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述赭曲霉毒素A-NHS活性酯是赭曲霉毒素A通過N，N- 二環(huán)己基碳化二亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺形成的活性酯。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述赭曲霉毒素A-NHS活性酯按照包括如下步驟的方法制備: 1)將碘乙酸、N-羥基琥珀酰亞胺和N，N-二環(huán)己基碳化二亞胺在黑暗中進(jìn)行縮合反應(yīng)，得到NHS-碘乙酰活性酯； 2)將所述NHS-碘乙酰活性酯與赭曲霉毒素A進(jìn)行取代反應(yīng),得到赭曲霉毒素A-NHS活性酯。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述I)為將碘乙酸、N-羥基琥珀酰亞胺和N，N-二環(huán)己基碳化二亞胺以269:695:582的摩爾比，在四氫呋喃中，20°C_25°C在黑暗中進(jìn)行縮合反應(yīng)，反應(yīng)完畢后，以IOOOOg離心，取上清液得到NHS-碘乙?；钚怎?； 所述2)為將赭曲霉毒素A的四氫呋喃溶液與所述上清液混勻,在20-25°C進(jìn)行取代反應(yīng)，得到所述赭曲霉毒素A-NHS活性酯。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:從所述抗血清中純化得到所述富集赭曲霉毒素A多克隆抗體的方法包括:將所述赭曲霉毒素A-NHS活性酯與所述含氨基的固相載體偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物作為純化所述赭曲霉毒素A多克隆抗的親和層析介質(zhì)，從所述抗血清中通過親和層析純化得到所述赭曲霉毒素A多克隆抗體；和/或 所述親和層析中用體積百分濃度為3%的乙酸水溶液洗脫所述赭曲霉毒素A多克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:所述含氨基的固相載體為含氨基的瓊脂糖凝膠或為含氨基的葡聚糖凝膠；和/或， 所述載體蛋白為血蘭蛋白或牛血清白蛋白。
7.由權(quán)利要求1-6中任一所述的方法制備的富集赭曲霉毒素A的免疫親和吸附劑。
8.以權(quán)利要求7所述的免疫親和吸附劑為填料的富集赭曲霉毒素A的免疫親和色譜柱。
9.含有權(quán)利要求7所述的免疫親和吸附劑或權(quán)利要求8所述的免疫親和色譜柱的富集赭曲霉毒素A的試劑盒。
10.權(quán)利要求7所述的免疫親和吸附劑，權(quán)利要求8所述的免疫親和色譜柱、或權(quán)利要求9所述的試劑盒在富集赭曲霉毒素A中的應(yīng)用。
【文檔編號】B01J20/24GK103480340SQ201310411949
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月11日
【發(fā)明者】周曉, 李川山, 謝軍, 李煒, 韋素梅, 劉運龍, 謝體三, 蕭浩, 徐德林, 林豐, 林丹超 申請人:廣西壯族自治區(qū)糧油科學(xué)研究所