專利名稱：一種高效疏水介質(zhì)的制備方法及其在純化蛇毒降纖酶中的應(yīng)用的制作方法
一種高效疏水介質(zhì)的制備方法及其在純化蛇毒降纖酶中的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生化領(lǐng)域，具體涉及一種高效疏水介質(zhì)的制備方法及其在純化蛇毒降纖酶中的應(yīng)用。技術(shù)背景
傳統(tǒng)疏水介質(zhì)的基質(zhì)通常為瓊脂糖、纖維素等軟基質(zhì)，這些基質(zhì)具有生物相容性好、化學(xué)穩(wěn)定性好、通透性好、非特異性吸附少等優(yōu)點(diǎn)。但較差的機(jī)械性使它們無(wú)法運(yùn)用于現(xiàn)代聞效制備液相系統(tǒng)。近年發(fā)展起來(lái)的娃I父基質(zhì)屬于硬基質(zhì)，以其為基礎(chǔ)合成的疏水介質(zhì)配合現(xiàn)代高效制備液相色譜儀使用，使疏水層析柱效獲得了空前的提升，純化效能大幅的提高。但由于硅膠自身較差的化學(xué)穩(wěn)定性使其只能在低于PH8的條件下使用，當(dāng)溶液pH值大于8時(shí)，硅膠容易發(fā)生溶解。當(dāng)pH值大于10.7時(shí)，硅膠則完全溶解。此外硅膠表面未封閉的硅醇基容易產(chǎn)生非特異性吸附，這些都限制了硅膠成為一個(gè)合適的高效疏水層析基質(zhì)。目前以硅膠為基質(zhì)的疏水介質(zhì)主要運(yùn)用于化學(xué)合成小分子多肽的純化。一個(gè)優(yōu)秀的基質(zhì)它必須具備以下性能: 1、不溶性:基質(zhì)在操作條件下不溶解于流動(dòng)相。
2、通透性:具有優(yōu)良的水力學(xué)性能，流動(dòng)相可以在適當(dāng)?shù)牧魉傧峦ㄟ^(guò)。
3、機(jī)械穩(wěn)定性好:有合適的顆粒形狀，不會(huì)發(fā)生壓力形變，并有較長(zhǎng)的使用壽命O
4、無(wú)非特異吸附性:基質(zhì)本身在層析操作條件下不會(huì)吸附蛋白質(zhì)。
5、化學(xué)穩(wěn)定性好:在吸附、洗脫、再生的操作的條件下，分離介質(zhì)的大分子鏈具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。
聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯(PGMA)微球是一種富含環(huán)氧基的功能高分子材料，既具備特定的物理結(jié)構(gòu)。又有良好的化學(xué)反應(yīng)性能，所以聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯(PGMA)微球的應(yīng)用與研究已越來(lái)越受到人們的關(guān)注。中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所的趙瑩歆等以聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球(PGMA)為基質(zhì)，利用還原氨化方法將肝素鍵合在其表面上，得到一種以肝素為配基的高效親和色 譜填料，填料耐壓可達(dá)20MPa以上。該填料對(duì)抗凝血酶III的親和容量為1.2 mg/g,對(duì)抗凝血酶III和人血清白蛋白的回收率分別為96.9%和94.4%。余曉等人以聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球(PGMA)為基質(zhì)，以胰蛋白酶抑制劑為配基合成了高效親和色譜填料，該填料于20MPa下裝填于制備色譜柱中，用于人血清白蛋白的純化收率大于99%。楊春霞等聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球?yàn)榛|(zhì)，合成一種新型弱酸性陽(yáng)離子色譜填料。選用甲烷磺酸作淋洗液，在流速為1.0mL/min時(shí)，對(duì)6種無(wú)機(jī)陽(yáng)離子(Li+)、(Na+)、(ΝΗ；)、(K+) > (Mg2+)、(Ca2+)和有機(jī)胺進(jìn)行了良好分離，此色譜柱的分離效果與Dionex1nPac CS12A商品柱接近，但分析時(shí)間縮短了 44min。因此聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球(PGMA)作為高效色譜填料基質(zhì)應(yīng)用前景廣闊，效果良好。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種高效疏水介質(zhì)的制備方法，該方法制得的產(chǎn)品純度高、收率高、操作簡(jiǎn)便。本發(fā)明的另一目的在于提供該高效疏水介質(zhì)在純化蛇毒降纖酶中的應(yīng)用，使其能夠快速、高效的純化高純度蛇毒降纖酶。本發(fā)明的目的是這樣來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其制備方法的步驟為:
O 制備聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯(PGMA)微球
制備聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯(PGMA)微球采用的是分散聚合方法，其單體為甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯(GMA)，引發(fā)劑為偶氮二異丁腈(AIBN)或過(guò)氧化苯甲酰(ΒΡ0)，穩(wěn)定劑為聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，反應(yīng)介質(zhì)為一元醇或這類醇與甲苯等其它溶劑組成的混合物。各原料組分為:甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯50-100 g、偶氮二異丁腈或過(guò)氧化苯甲酰1-2 g、聚乙烯吡咯烷酮 5-20 g、乙醇 600-800 ml、甲苯 70-200 ml。制備過(guò)程如下:將稱量好的原料加入到適當(dāng)?shù)牟ＡХ磻?yīng)瓶中，使其充分溶解并通氮?dú)獬?。然后置反?yīng)瓶于帶有旋轉(zhuǎn)和加熱裝置的設(shè)備上，于65-75攝氏度下聚合24-36h。反應(yīng)結(jié)束后，用沉降方法除去溶劑，并用乙醇充分洗滌，即可得到顆粒分布基本呈現(xiàn)單分散的PGMA微球。2) 以聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯(PGMA)微球?yàn)榛|(zhì)制備高效疏水介質(zhì)
聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球富含環(huán)氧基基團(tuán)，因此具有良好的化學(xué)反應(yīng)性能，在催化齊U(三氟化硼乙醚)作用下可以迅速的與醇、酚反應(yīng)。得到高效疏水介質(zhì)。根據(jù)配基的種類不同催化劑的加入量為0.01-0.03ml/g.PGMA,反應(yīng)時(shí)間為30_50min，反應(yīng)溫度控制在45-50°C。以下是反應(yīng)通式:
權(quán)利要求
1.一種高效疏水介質(zhì)的制備方法，其特征在于方法步驟為: 1)利用分散聚合法制備聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球: 各原料組分為:甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯50-100 g、偶氮二異丁腈或過(guò)氧化苯甲酰1-2 g、聚乙烯吡咯烷酮5-20 g、乙醇600-800 ml、甲苯70-200 ml ； 制備過(guò)程如下:將稱量好的原料加入到適當(dāng)?shù)牟ＡХ磻?yīng)瓶中，使其充分溶解并通氮?dú)獬?，然后置反?yīng)瓶于帶有旋轉(zhuǎn)和加熱裝置的設(shè)備上，于65-75攝氏度下聚合24-36h，反應(yīng)結(jié)束后，用沉降方法除去溶劑，并用乙醇充分洗滌，即可得到顆粒分布基本呈現(xiàn)單分散的聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球； 2)以聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球?yàn)榛|(zhì)，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)接入疏水配基制備高效疏水介質(zhì): 在催化劑三氟化硼乙醚的作用下，聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球與醇、酚反應(yīng)，得到高效疏水介質(zhì)，催化劑的加入量為0.01-0.03ml/g.PGMA,反應(yīng)時(shí)間為30_50min，反應(yīng)溫度控制在 45-50 °C。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效疏水介質(zhì)的制備方法，其特征是:步驟I)中所述聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球的粒徑為8-10微米。
3.—種權(quán)利要求1所述高效疏水介質(zhì)在純化蛇毒降纖酶中的應(yīng)用，其特征是:將權(quán)利要求I合成所得高效疏水介質(zhì)以20MPa壓力裝填于不銹鋼色譜柱中，然后將柱子連接于制備液相色譜系統(tǒng)，色譜柱平衡液為:20-50mmol/L磷酸鹽、PH值為7-8.5、內(nèi)含l-2mol/L硫酸銨；洗脫液為20-50mmol/L磷酸鹽緩沖液、PH值為7-8.5 ;首先以平衡液將色譜柱平衡至基線平直，然后將降纖酶樣品加入柱中，接著以平衡液洗滌至基線平直；最后以平衡液為A相、洗脫液為B相進(jìn)行梯度洗脫，得到高純度降纖酶，活性回收大于90%。
全文摘要
一種高效疏水介質(zhì)的制備方法及其在純化蛇毒降纖酶中的應(yīng)用。其制備方法包括如下步驟1)利用分散聚合法制備聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯(PGMA)微球；2)以聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯(PGMA)微球?yàn)榛|(zhì)制備高效疏水介質(zhì)；高效疏水介質(zhì)以20MPa壓力裝填于不銹鋼色譜柱中，然后將柱子連接液相色譜系統(tǒng)，用來(lái)純化蛇毒降纖酶。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于產(chǎn)品純度高、收率高、操作簡(jiǎn)便、達(dá)到產(chǎn)業(yè)化要求，利于推廣。
文檔編號(hào)B01J20/26GK103145899SQ201310083428
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月16日
發(fā)明者胡小光, 劉慶華, 張素芳 申請(qǐng)人:南昌佰泰生物科技有限公司