分子診斷平臺的制作方法
【專利摘要】一種混合微滴的方法，所述方法包括：在表面上提供微滴，使所述微滴形成具有底部區(qū)域和兩個端部的第一“U”形狀，且同時合并所述端部并使所述微滴在所述底部區(qū)域處分離，以形成與所述第一“U”形狀實質(zhì)上相反的第二“U”形狀。
【專利說明】分子診斷平臺
[0001]I資助信息
[0002]本發(fā)明在國家衛(wèi)生研究院授予的A1065169下以政府支持完成。美國政府具有本發(fā)明的某些權利。
[0003]2相關申請
[0004]本專利申請涉及且要求2011年5月2日提交的標題為“Molecular DiagnosticsPlatform that uses Digital Microfluidics and Multiplexed Bead Detection，，的美國臨時專利申請?zhí)?1/481，508的優(yōu)先權，所述臨時專利申請的整個公開內(nèi)容通過引用并入本文。
[0005]3 背景
[0006]微滴執(zhí)行機構通常包括配置為形成用于進行微滴操作的表面或間隙的一個或多個基板。一個或多個基板建立用于進行微滴操作的微滴操作表面或間隙，且還可以包括布置成進行微滴操作的電極。微滴操作基板或在基板之間的間隙可以被涂覆或填充有不與形成微滴的液體混合的填充流體。
[0007]微滴執(zhí)行機構被用在各種應用中，包括分子診斷分析比如基于核酸的分析和免疫分析。在一個實例中，使用基于核酸的測試比如逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)分析來識別呼吸道病毒。由于單個樣品可包括待評估的多種分析物，存在對在微滴執(zhí)行機構上用于使分子診斷分析多重化的改進方法的需要。
[0008]4 定義
[0009]如本文所使用的，以下術語具有所指示的意義。
[0010]關于一個或多個電極的“激活”意指影響在有微滴的情況下導致微滴操作的一個或多個電極的電氣狀態(tài)的變化。
[0011]關于微滴執(zhí)行機構上的珠子(bead)，“珠子”意指能夠與微滴執(zhí)行機構上或在微滴執(zhí)行機構附近的微滴相互作用的任何珠子或顆粒。珠子可以具有各種形狀中的任一種，比如球形、大體球形、蛋形、圓盤形、立方體及其它三維形狀。珠子可能例如能夠在微滴執(zhí)行機構上的微滴中被運輸，或否則以允許微滴執(zhí)行機構上的微滴接觸微滴執(zhí)行機構上的珠子和/或接觸脫離微滴執(zhí)行機構的珠子的方式關于微滴執(zhí)行機構被配置。珠子可以使用各種材料——包括例如樹脂和聚合物——制成。珠子可以是任何合適的尺寸，包括例如微珠、微粒、納米珠和毫微粒。在一些情況下，珠子是磁性響應的；在其它情況下，珠子不是顯著磁性響應的。對于磁性響應的珠子，磁性響應材料可以構成實質(zhì)上整個珠子或僅構成珠子的一種組分。除了別的以外，珠子的剩余部分還可以包括聚合材料、涂層和允許分析試劑的附著的部分。合適的磁性響應珠子的實例包括流式細胞儀微珠、聚苯乙烯微粒和毫微粒、官能化的聚苯乙烯微粒和毫微粒、涂覆的聚苯乙烯微粒和毫微粒、二氧化硅微珠、熒光微球和納米球、官能化的熒光微球和納米球、涂覆的熒光微球和納米球、染色的微粒和毫微粒、磁性微粒和毫微粒、超順磁性微粒和毫微粒(例如，可從加利福尼亞州Carlsbad的Invitrogen公司得到的DYNABEADS?顆粒)、突光微粒和毫微粒、涂覆的磁性微粒和毫微粒、鐵磁性的微粒和毫微粒、涂覆的鐵磁性微粒和毫微粒及在2005 年 11 月 24 日公布的標題為 “Multiplex flow assays preferably with magneticparticles as solid phase”的美國專利公布號20050260686、2003年7月17日公布的標題為 “Encapsulation of discrete quanta of fluorescent particles，，的美國專利公布號 20030132538、2005 年 6 月 2 日公布的標題為 “Multiplexed Analysis of ClinicalSpecimens Apparatus and Method” 的美國專利公布號 20050118574、2005 年 12 月 15 日公布的標題為“Microparticles with Multiple Fluorescent Signals and Methods ofUsing Same”的美國專利公布號20050277197、2006年7月20日公布的標題為“MagneticMicrospheres for use in Fluorescence-based Applications，，的美國專利公布號20060159962中所描述的那些；所述專利公布的全部公開內(nèi)容通過引用并入本文，為了它們的涉及珠子及磁性響應材料和珠子的教導。珠子可以與生物分子(配體)預先連接。配體可以為例如抗體、蛋白質(zhì)或抗原、DNA/RNA探針或具有對期望目標的親和力的任何其它分子。用于固定磁性響應珠子和/或非磁性響應珠子和/或使用珠子進行微滴操作試驗的微滴執(zhí)行機構技術的實例在下列專利申請中被描述:2006年12月15日提交的標題為“Droplet-Based Particle Sorting”的美國專利申請?zhí)?11/639，566 ；2008 年 3 月 25 日提交的標題為 “Multiplexing Bead Detection in a Single Droplet” 的美國專利申請?zhí)?1/039，183 ;2008 年 4 月 25 日提交的標題為 “Droplet Actuator Devices and DropletOperations Using Beads”的美國專利申請?zhí)?1/047，789 ;2008年8月5日提交的標題為“Droplet Actuator Devices and Methods for Manipulating Beads” 的美國專利申請?zhí)?1/086，183 ;2008 年 2 月 11 日提交的標題為 “Droplet Actuator Devices and MethodsEmploying Magnetic Beads”的國際專利申請?zhí)?PCT/US2008/053545 ;2008 年 3 月 24 日提交的標題為“Bead-based Multiplexed Analytical Methods and Instrumentation，，的國際專利申請?zhí)朠CT/US2008/058018 ;2008年3月23日提交的標題為“Bead Sorting on aDroplet Actuator”的國際專利申請?zhí)朠CT/US2008/058047 ;及2006年12月11日提交的標題為“Droplet-based Biochemistry”的國際專利申請?zhí)朠CT/US2006/047486,所述專利申請全部個公開內(nèi)容通過引用并入本文。在使本發(fā)明的多重化方面中可以采用珠子的特征。具有適合于多重化的特征的珠子以及檢測并分析從此類珠子發(fā)射的信號的方法的實例可以在以下專利申請中找到:2008年12月11日公布的標題為“Systems and Methodsfor Multiplex Analysis of PCR in Real Time” 的美國專利申請?zhí)?20080305481 ;2008年 6 月 26 日公布的標題為 “Methods and Systems for Dynamic Range Expansion，，的美國專利公布號20080151240 ;2007年9月6日公布的標題為“Methods, Products, andKits for Identifying an Analyte in a Sample” 的美國專利公布號 20070207513 ；2007年 3 月 22 日公布的標題為 “Methods and Systems for Image Data Processing” 的美國專利公布號 20070064990 ；2006 年 7 月 20 日公布的標題為 “Magnetic Microspheres foruse in Fluorescence-based Applications” 的美國專利公布號 20060159962 ;2005 年
12月 15 日公布的標題為 “Microparticles with Multiple Fluorescent Signals andMethods of Using Same”的美國專利公布號20050277197 ;及2005年6月2日公布的標題為“Multiplexed Analysis of Clinical Specimens Apparatus and Method”的美國專利公布號 20050118574。
[0012]“微滴”意指在微滴執(zhí)行機構上的液體的體積。通常，微滴至少部分地被填充流體限制。例如，微滴可以被填充流體完全包圍或可以被填充流體和微滴執(zhí)行機構的一個或多個表面限制。作為另一實例，微滴可以被填充流體、微滴執(zhí)行機構的一個或多個表面及大氣限制。作為又一實例，微滴可以被填充流體和大氣限制。例如，微滴可以是含水的或非水的，或可以是包括含水組分和非水組分的混合物或乳液。微滴可以采用各種形狀；非限制性實例包括大體圓盤形、蛞蝓形、切去頂端的球體、橢圓體、球形、部分壓縮的球體、半球形、卵形、圓柱形、此類形狀的組合及在微滴操作比如合并或分離期間形成的或作為此類形狀與微滴執(zhí)行機構的一個或多個表面接觸的結果而形成的各種形狀。對于可能受到使用本發(fā)明的方法的微滴操作的微滴流體的實例，參見2006年12月11日提交的標題為“Droplet-Based Biochemistry”的國際專利申請?zhí)朠CT/US06/47486。在各種實施方式中，微滴可以包括生物樣品，比如全血、淋巴液、血清、血漿、汗、眼淚、唾液、痰、腦脊液、羊水、精液、陰道分泌物、漿液、滑液、心包液、腹膜液、胸膜液、滲出液、分泌液、膿囊液、膽汁、尿、胃液、腸液、排泄物樣品、包含單個或多個細胞的液體、包含細胞器的液體、流態(tài)化的組織、流態(tài)化的有機體、包含多細胞化有機體的液體、生物拭樣和生物廢液。而且，微滴可以包括試齊IJ，比如水、去離子水、鹽溶液、酸性溶液、堿性溶液、洗滌劑溶液和/或緩沖液。微滴內(nèi)容物的其它實例包括試劑，比如用于生化試驗比如核酸擴增試驗、基于親和力的分析試驗、酶分析試驗、定序試驗和/或用于分析生物流體的試驗的試劑。
[0013]“微滴執(zhí)行機構”意指用于操縱微滴的裝置。對于微滴執(zhí)行機構的實例，參見Pamula 等人于 2005 年 6 月 28 日發(fā)布的標題為 “Apparatus for Manipulating Dropletsby Electrowetting-Based Techniques” 的美國專利 6，911，132 ； Pamu I a 等人于 2006年 I 月 30 日發(fā)布的標題為 “Apparatuses and Methods for Manipulating Dropletson a Printed Circuit Board” 的美國專利申請?zhí)?11/343，284 ;Pollack 等人于 2006年12月11日提交的標題為“Droplet-Based Biochemistry”的國際專利申請?zhí)朠CT/US2006/047486 ;Shenderov 于 2004 年 8 月 10 日發(fā)布的標題為“Electrostatic Actuatorsfor Microfluidics and Methods for Using Same” 的美國專利 6，773，566 及于 2000 年
I月 24 日發(fā)布的標題為 “Actuators for Microfluidics Without Moving Parts” 的美國專利6，565，727 ；Kim等人于2003年I月27日提交的標題為“Electrowetting-drivenMicropumping”的美國專利申請?zhí)?0/343, 261 ;2006年I月23日提交的標題為“Methodand Apparatus for Promoting the Complete Transfer of Liquid Drops from aNozzle”的美國專利申請?zhí)杔l/275，668、2009年5月14日提交的標題為“Method for UsingMagnetic Particles in Droplet Microfluidics” 的美國專利申請?zhí)?12/465, 935 ；2009年 4 月 30 日提交的標題為 “Method and apparatus for real-time feedback controlof electrical manipulation of droplets on chip，，的美國專利申請?zhí)?12/513，157 ;Velev 于 2009 年 6 月 16 日發(fā)布的標題為 “Droplet Transportation Devices andMethods Having a Fluid Surface” 的美國專利 7，547，380 ;Sterling 等人于 2007 年 I月 16 日發(fā)布的標題為 “Method，Apparatus and Article for Microfluidic Control viaElectrowetting, for Chemical, Biochemical and Biological Assays and the Like，，的美國專利7，163,612 ;Becker和Gascoyne等人于2010年I月5日發(fā)布的標題為“Methodand Apparatus for Programmable fluidic Processing” 的美國專利號 7，641，779 和于2005 年 12 月 20 日發(fā)布的標題為“Method and Apparatus for Programmable fluidicProcessing”的美國專利號6，977，033 ;Decre等人于2008年2月12日提出的標題為“System for Manipulation of a Body of Fluid” 的美國專利 7，328，979 ;Yamakawa等人于2006年2月23日公布的標題為“Chemical Analysis Apparatus”的美國專利公布號 20060039823 ;Wu 于 2008 年 12 月 31 日公布的標題為 “Digital MicrofluidicsBased Apparatus for Heat-exchanging Chemical Processes，，的國際專利公布號W0/2009/003184 ;Fouillet 等人于 2009 年 7 月 30 日公布的標題為“Electrode AddressingMethod”的美國專利公布號20090192044 ;Fouillet等人于2006年5月30日發(fā)布的標題為“Device for Displacement of Small Liquid Volumes Along a Micro-catenary Line byElectrostatic Forces”的美國專利 7, 052, 244 ；Marchand 等人于 2008 年 5 月 29 日公布的標題為“Droplet Microreactor”的美國專利公布號20080124252 ；Adachi等人于2009年12月31日公布的標題為“Liquid Transfer Device”的美國專利公布號0090321262 ；Roux等人于 2005 年 8 月 18 日公布的標題為 “Device for Controlling the Displacement ofa Drop Between two or Several Solid Substrates” 的美國專利公布號 20050179746 ；Dhindsa等人的“Virtual Electrowetting Channels:Electronic Liquid Transport withContinuous Channel Functionality，，(Lab Chip, 10:832 - 836 (2010));上述專利的公開內(nèi)容及其優(yōu)選權文件通過弓I用并入本文。某些微滴執(zhí)行機構將包括底部基板、與基板相關聯(lián)的微滴操作電極、在基板和/或形成微滴操作表面的電極頂上的一個或多個電介質(zhì)和/或疏水層，以及可選地，從微滴操作表面分隔開一間隙的頂部基板。在一些情況下，底部基板和頂部基板可以被形成為一個整體部件。一個或多個參考電極可以被設置在頂部基板和/或底部基板上和/或在間隙中。在各種實施方式中，微滴通過微滴執(zhí)行機構的操縱可以是電極介導的，例如，電濕潤介導的或雙向電泳介導的或庫倫力介導的?？刂瓶捎迷诒景l(fā)明的微滴執(zhí)行機構中的流體流的其它方法的實例包括引起流體動力射流壓力的裝置，比如基于下列原理的裝置:機械原理(例如，外部注射器泵、氣動膜泵、振動膜泵、真空裝置、離心力、壓電/超聲波泵及聲力);電氣或磁性原理(例如，電滲流、電動泵、鐵磁流體塞、電流體動力泵、使用磁力的吸引或排斥及磁流體動力泵)；熱力學原理(例如，氣泡產(chǎn)生/相變引起的體積膨脹)；其它類型的表面濕潤原理(例如，電濕潤和光電濕潤以及以化學方法、用熱的方法、在結構上和放射性地引起的表面張力梯度);重力；表面張力(例如，毛細管作用);靜電力(例如，電滲流)；離心流(基板被布置在緊湊的圓盤上且旋轉(zhuǎn))；磁力(例如，振蕩離子引起流動);磁流體動力；及真空或壓力差。在某些實施方式中，在本發(fā)明的微滴執(zhí)行機構中可以采用前述技術中的兩種或更多種的組合。
[0014]“微滴操作”意指在微滴執(zhí)行機構上的微滴的任何操縱。例如，微滴操作可以包括:將微滴裝入到微滴執(zhí)行機構中；分配來自源微滴的一個或多個微滴；使微滴分離、分開或分成兩個或更多個微滴；將微滴從一個位置運輸?shù)饺魏畏较蛏系牧硪晃恢?；將兩個或更多個微滴合并或組合成單個微滴；稀釋微滴；混合微滴；攪動微滴；使微滴變形；將微滴保持在合適的位置；培養(yǎng)微滴；加熱微滴；蒸發(fā)微滴；冷卻微滴；處理掉微滴；將微滴運送出微滴執(zhí)行機構；本文所描述的其它微滴操作；和/或前述操作的任何組合。術語“合并(merge)”、“合并(merging)”、“組合(combine)”、“組合(combining)”及類似詞語用于描述從兩個或更多個微滴產(chǎn)生一個微滴。應理解，當關于兩個或更多個微滴使用這樣的術語時，可以使用足以導致兩個或更多個微滴組合成一個微滴的微滴操作的任何組合。例如，“合并微滴A和微滴B”可以通過運送微滴A以接觸靜止的微滴B、運送微滴B以接觸靜止的微滴A或運送微滴A和B以彼此接觸來實現(xiàn)。術語“分離”、“分開”和“分成”并非用來暗示關于因而得到的微滴的體積(即，因而得到的微滴的體積可以是相同的或不同的)或因而得到的微滴的數(shù)目(因而得到的微滴的數(shù)目可以為2個、3個、4個、5個或更多個)的任何特定結果。術語“混合”是指導致微滴內(nèi)的一種或多種組分的較均勻的分布的微滴操作?！把b入”微滴操作的實例包括微量透析裝入、壓力輔助裝入、機器人裝入、被動裝入及移液管裝入。微滴操作可以是電極介導的。在一些情況下，通過使用表面上的親水和/或疏水區(qū)域和/或通過物理障礙物來進一步便于微滴操作。對于微滴操作的實例，參見上文在“微滴執(zhí)行機構”的定義下引用的專利和專利申請。
[0015]“填充流體”意指與微滴執(zhí)行機構的微滴操作基板相關的流體，所述流體與微滴不能充分混合，以使微滴相受到電極介導的微滴操作。例如，填充流體可以為低粘度的油比如硅油。填充流體的其它實例在下列申請中被提供:2006年12月11日提交的標題為“Droplet-Based Biochemistry” 的國際專利申請?zhí)?PCT/US2006/047486、2008 年 8 月 8 日提交的標題為 “Use of additives for enhancing droplet actuation” 的國際專利申請PCT/US2008/072604、2007 年 5 月 17 日提交的標題為“Electrowetting Devices”的美國專利公布號20080283414，所述專利的全部公開內(nèi)容通過引用并入本文。填充流體可以填充微滴執(zhí)行機構的整個間隙或可以涂覆微滴執(zhí)行機構的一個或多個表面。填充流體可以是導電的或不導電的。
[0016]關于磁性響應珠子的“固定”意指珠子實質(zhì)上被限制在微滴執(zhí)行機構上的微滴中或填充流體中的實質(zhì)上的合適位置中。例如，在一個實施方式中，固定的珠子可以被充分限制在合適的位置中，以允許在微滴上致執(zhí)行分離操作，產(chǎn)生具有實質(zhì)上所有珠子的一個微滴和實質(zhì)上沒有珠子的一個微滴。
[0017]“磁性響應”意指響應于磁場?！按判皂憫樽印卑ù判皂憫牧匣蛴纱判皂憫牧辖M成。磁性響應材料的實例包括順磁性材料、鐵磁性材料、亞鐵磁性材料及變磁性材料。合適的順磁性材料的實例包括鐵、鎳和鈷以及金屬氧化物，比如Fe304、BaFe12O19^ CoO, NiO,Mn2O3、Cr2O3 和 CoMnP。`
[0018]如在本文用于指微滴和/或微滴內(nèi)的磁性響應珠子的“運送到磁體的磁場中”、“朝著磁體運送”及類似短語用來指運送到實質(zhì)上能夠吸引微滴中的磁性響應珠子的磁場的區(qū)域中。類似地,如在本文用于指微滴和/或微滴內(nèi)的磁性響應珠子的“遠離磁體或磁場運送”、“運送出磁體的磁場”及類似短語用來指遠離實質(zhì)上能夠吸引微滴中的磁性響應珠子的磁場的區(qū)域運送，不管微滴或磁性響應珠子是否完全從磁場中移除。將認識到，在本文所描述的此類情況中的任一種情況下，微滴可以朝著或遠離磁場的期望區(qū)域被運送，和/或磁場的期望區(qū)域可以朝著或遠離微滴被移動。對電極、微滴或磁性響應珠子在磁場或類似物“內(nèi)”或“中”的提及用來描述以下情況:其中電極以允許電極將微滴運送到磁場的期望區(qū)域中和/或遠離磁場的期望區(qū)域運送微滴的方式被定位，或微滴或磁性響應珠子被定位在磁場的期望區(qū)域中，在每一種情況下，其中在期望區(qū)域中的磁場能夠?qū)嵸|(zhì)上吸引微滴中的任何磁性響應珠子。類似地，對電極、微滴或磁性響應珠子在磁場或類似物的“外部”或“遠離”磁場或類似物的提及用來描述以下的情況:其中電極以允許電極遠離磁場的某一區(qū)域運送微滴的方式被定位，或微滴或磁性響應珠子被定位成遠離磁場的某一區(qū)域，在每一種情況下，其中在這樣的區(qū)域中的磁場實質(zhì)上不能吸弓I微滴中的任何磁性響應珠子。
[0019]關于沖洗珠子的“沖洗”意指減少與珠子接觸或暴露于珠子的一種或多種物質(zhì)的量和/或濃度，所述物質(zhì)來自與珠子接觸的微滴。物質(zhì)的量和/或濃度的減少可以是部分的，實質(zhì)上全部的或甚至全部的。物質(zhì)可以是各種物質(zhì)中的任一種；實例包括用于進一步分析的目標物質(zhì)和不想要的物質(zhì)，比如樣品的組分、污染物和/或過量的試劑。在一些實施方式中，沖洗操作以與磁性響應珠子接觸的起始微滴開始，其中微滴包括物質(zhì)的初始量和初始濃度。可以使用各種微滴操作來進行沖洗操作。沖洗操作可以產(chǎn)生包括磁性響應珠子的微滴，其中微滴具有物質(zhì)的總量和/或濃度，所述物質(zhì)的總量和/或濃度小于物質(zhì)的初始量和/或濃度。合適的沖洗技術的實例在Pamula等人的于2008年10月21日被授權的標題為 “Droplet-Based Surface Modification and Washing” 的美國專利 7，439，014 中被描述，所述專利的整個公開內(nèi)容通過弓I用并入本文。
[0020]在整個說明書中關于微滴執(zhí)行機構的部件的相對位置例如微滴執(zhí)行機構的頂部基板和底部基板的相對位置使用術語“上部”、“底部”、“上方”、“下方”和“在....上”。將認識到，微滴執(zhí)行機構是功能性的，而不管其在空間中的方向。
[0021]當以任何形式的液體(例如，微滴或連續(xù)主體，不管是移動的還是靜止的)被描述為在電極、陣列、基質(zhì)或表面“上”、“處”或“上方”時，這樣的液體可以直接接觸電極/陣列/基質(zhì)/表面，或可以接觸在液體和電極/陣列/基質(zhì)/表面之間插入的一個或多個層或膜。
[0022]當微滴被描述成在微滴執(zhí)行機構“上”或“裝在微滴執(zhí)行機構上”時，應理解，微滴以便于使用微滴執(zhí)行機構的方式布置在微滴執(zhí)行機構上，以在微滴上進行一個或多個微滴操作，微滴以便于感測微滴的屬性或來自微滴的信號的方式被布置在微滴執(zhí)行機構上，和/或微滴在微滴執(zhí)行機構上受到微滴操作。
[0023]5附圖簡述
[0024]圖1示出采樣-反饋數(shù)字微流體分子診斷平臺的實例的透視圖；
[0025]圖2示出適合于單個生物樣品中的一個或多個病原體的采樣-反饋多重檢測的微滴執(zhí)行機構的另一實例的透視圖；
[0026]圖3示出用于xTAG珠子的多重檢測的成像系統(tǒng)的透視圖；
[0027]圖4示出用于生物樣品中的呼吸道病毒的采樣-反饋檢測的試驗的實例的流程圖；
[0028]圖5示出圖1的微滴執(zhí)行機構的頂視圖且示出適合用于執(zhí)行圖4的呼吸道病毒檢測試驗的微滴執(zhí)行機構架構的實例；
[0029]圖6顯示在工作臺上和在微滴執(zhí)行機構上執(zhí)行的xTAG RVP分析的比較的條形圖；以及
[0030]圖7A和圖7B示出微滴執(zhí)行機構的實例的一部分的側(cè)視圖且示出使用在單個微滴中的多種類型的珠子使免疫分析多重化的過程。
[0031]6 描述
[0032]本發(fā)明提供使用數(shù)字微流體和用于多重分子測試的珠子技術的分子診斷平臺。更具體地，通過結合檢測系統(tǒng)使用微滴執(zhí)行機構，可使用在單個樣品微滴中的多種類型的珠子(編碼的珠子)來使采樣-反饋分子分析多重化。微滴執(zhí)行機構裝置使用大的輸入樣品體積(例如，約I毫升UL))且提供來自單個樣品的多種目標分析物(例如，核酸)的快速捕獲和濃縮，用于在同一微滴執(zhí)行機構上的隨后的分子診斷分析(例如，RT-PCR)。本發(fā)明的微滴執(zhí)行機構是便宜的和使用簡單的一次性裝置，其在各種臨床背景——包括醫(yī)院實驗室和在床邊監(jiān)護——提供高質(zhì)量的測試。
[0033]在一個實施方式中，本發(fā)明的分子診斷平臺和方法在小于約60分鐘或小于約30分鐘或小于約20分鐘內(nèi)提供在單個生物樣品(例如，鼻咽樣品)中的呼吸道病毒的多重檢測。
[0034]在另一實施方式中，本發(fā)明的分子診斷平臺和方法提供并行地執(zhí)行的高流通量分子診斷，即，多個不同測試(例如，xMAP珠子陣列面板)。
[0035]在又一實施方式中，本發(fā)明提供在微滴執(zhí)行機構中使用包含多種類型的珠子的單個微滴進行多重免疫分析的方法。
[0036]6.1多重分子診斷平臺
[0037]本發(fā)明的分子診斷平臺包括數(shù)字微流體液體處理技術和基于珠子的分析物捕獲技術，其用于多重分子分析(例如，核酸測試、免疫分析)。分子診斷平臺使用用于基于珠子的區(qū)別和在生物樣品中的一種或多種分析物的檢測的成像技術。
[0038]6.1.1數(shù)字微流體
[0039]通過微滴的表面張力(電濕潤)的電控制，數(shù)字微流體技術在離散的微滴上進行微滴操作。微滴可以被夾在兩個基板一分隔開間隙的底部基板和頂部基板一之間。例如，底部基板可以是具有電力地可尋址的電極的布置的印刷電路板(PCB)。例如，頂部基板可以是具有由例如導電油墨或銦錫氧化物制成的參考電極平面的注射成型的塑料頂部基板。底部基板和頂部基板可以被涂覆有疏水材料。圍繞微滴的空間(例如，在底部基板和頂部基板之間的間隙)可以填充有不相混的惰性流體比如硅油，以防止微滴的揮發(fā)且便于它們在裝置內(nèi)的運輸。在電壓被施加到底部基板上的控制電極時形成的電場減小微滴和電極之間的界面張力。這個效應可用于使用通過激活沿著連續(xù)電極的任何路徑在底部基板上的控制電極的模式而建立的表面能量梯度來運輸微滴。通過改變電壓激活的模式，可以影響其它微滴操作；實例包括微滴的合并、分離、混合和分配。
[0040]圖1示出采樣-反饋數(shù)字微流體分子診斷平臺100的實例的透視圖。分子診斷平臺100可以包括與成像系統(tǒng)112組合的微滴執(zhí)行機構110。在一個實施方式中,微滴執(zhí)行機構110被配置為用于單個樣品的合并的樣品制備和核酸測試。微滴執(zhí)行機構110可以包括分隔開一間隙的底部基板114和頂部基板116。例如，底部基板114可以由PCB、塑料、硅或其它實質(zhì)上不導電的或絕緣的基板形成。例如，頂部基板116可以由模塑材料比如注射成型的塑料形成，或可以由PCB、塑料、硅形成，或甚至由導電基板形成。分配儲器可以被合并至IJ頂部基板116中。例如，儲器可以被配置為用于制備并分配樣品流體(例如，ImL鼻咽拭樣洗脫物)的樣品分配儲器118和一個或多個試劑分配儲器120，S卩，用于分配不同的試劑流體的試劑分配儲器120a至120f。樣品分配儲器118包括用于裝入樣品流體的樣品輸入口122和用于裝入樣品制備試劑(例如，溶解緩沖液、核酸捕獲珠子)的試劑輸入口 124。樣品分配儲器118可以具有足夠的尺寸，以包含大體積例如約1.5mL的流體。樣品分配儲器118和試劑分配儲器120與分配電極對齊，且通過微滴操作電極(例如，電濕潤電極)的布置例如路徑或陣列而相互連接。微滴操作是在間隙內(nèi)的這些電極頂部上進行的。參考圖5較詳細地描述分配電極和微滴操作電極的布置。檢測窗口 126被包括在頂部基板116中。檢測窗口 126可以被配置成將來自間隙內(nèi)的信號傳輸?shù)絺鞲衅骱?或?qū)碜酝獠吭吹碾姶拍芰總鬏數(shù)介g隙中。合適的透明度可以改變。窗口可以被形成為引導和/或過濾光，例如作為排除某些波長的透鏡或過濾器。在操作中，檢測窗口 126可以位于成像系統(tǒng)112附近。參考圖3描述成像系統(tǒng)112的實例。
[0041]圖2示出適合于單個生物樣品中的一個或多個病原體的采樣-反饋多重檢測的微滴執(zhí)行機構200的另一實例的透視圖。微滴執(zhí)行機構200可以包括在其至少一個或多個區(qū)域中分隔開一間隙的底部基板210和底部基板212。例如，底部基板210可以是PCB或其它合適的基板。底部基板210可以包括微滴操作電極241 (例如，電濕潤電極)的布置。微滴操作在微滴操作表面上在微滴操作電極214的頂部上進行。電接觸件216的布置被設置在底部基板210上，用于電氣地控制微滴執(zhí)行機構200的電極241或其它部件，比如傳感器、加熱器、電磁體、二極管等。例如，頂部基板212可以由模塑材料比如注射成型的塑料或其它合適的材料形成。分配儲器218可以被合并到頂部基板212中。例如，分配儲器218可以被配置為用于分配樣品流體(例如，ImL鼻咽拭樣洗脫物)的樣品分配儲器218和一個或多個試劑分配儲器220，即，用于分配不同的試劑流體的試劑分配儲器220a至220g。樣品分配儲器218和試劑分配儲器220與分配電極對齊，且通過微滴操作電極214的布置例如路徑或陣列而相互連接。
[0042]6.1.2基于珠子的分析物捕獲
[0043]使用在單個樣品微滴中的多種類型的分析物捕獲珠子(編碼的珠子)可使采樣反饋分子分析多重化。每一種類型的分析物捕獲珠子具有用于容易地區(qū)分開一種類型的珠子和另一種類型的珠子的識別特征。例如，各種類型的分析物捕獲珠子可以按照顏色、熒光、尺寸、密度、表面性質(zhì)、對磁場的響應性、放射性及其任何組合來區(qū)分。分析物捕獲珠子可以被涂覆有對特定生物分析(例如，核酸測試、免疫分析)特定的試劑(例如，寡核苷酸序列、抗體、多肽、受體)。在優(yōu)選的實施方式中，分析物捕獲珠子是磁性響應捕獲珠子。
[0044]參考圖7，較詳細地描述使在包含不同類型的珠子的單個微滴中的免疫分析多重化的實例。
[0045]6.1.2.1呼吸道病毒的檢測
[0046]急性的呼吸道感染是世界范圍內(nèi)急性疾病的主要起因且依然是嬰兒和幼兒死亡率的最重要起因。目前，存在幾種市場上可購買得到的基于PCR的多重呼吸道病毒面板分析，然而它們中的大多數(shù)被分類為CLIA高復雜性，僅在某些實驗室可利用，且可能花費多于一天來獲得結果。獲得結果的時間對于可治療的患者是關鍵的，因為抗病毒藥物僅在感染的前24小時內(nèi)有效。通過幫助控制流行病感染，這些病原體的快速且準確的識別不僅對于單獨患者的治療而且對于公共健康都是關鍵的。此外，由于不斷出現(xiàn)呼吸道病毒的新變體，現(xiàn)在，實驗室面臨著檢測多達20種可引起急性呼吸道疾病的不同病毒的挑戰(zhàn)。這些呼吸道病毒中的一些具有非常特定的治療物，比如用于流感的奧塞米韋或扎那米韋、用于鼻病毒的普來可那立和用于呼吸道合胞病毒(RSV)的預防藥帕利珠單抗。感染控制實踐在病毒之間也顯著不同，且一些是可向公共衛(wèi)生機構報告的。
[0047]本發(fā)明的裝置和方法以足夠的靈敏性和特異性提供多種臨床上相關的病毒的床邊監(jiān)護檢測，以指導治療和感染控制程序。[0048]在一個實施方式中，顏色編碼的珠子(例如，改變熒光染料的量)可以被涂覆有寡核苷酸序列，用于捕獲特定的目標DNA序列(核酸捕獲珠子)。在優(yōu)選的實施方式中，顏色編碼的珠子是磁性響應珠子?？梢越M合任何數(shù)目的不同核酸捕獲珠子，用于單個樣品微滴中的不同目標序列的多重核酸測試。適合于用在數(shù)字微流體核酸測試流體中的磁性響應核酸捕獲珠子的一個實例是xMAP珠子微陣列(Luminex)。xMAP珠子(例如，磁性響應的MagPlex?珠子)通過改變兩種熒光染料(例如，紅色和紅外的)的量被內(nèi)部地顏色編碼且被涂覆有對特定生物分析特定的試劑(例如，標記的寡核苷酸序列)。連接到報道分子的第三熒光團(例如，藻紅蛋白)用于量化在珠子表面處的生物分子相互作用。
[0049]在一個實例中，在磁性響應的MagPlex?珠子上的多重Luminex xTAG呼吸道病毒面板(RVP)可適合于用在微滴執(zhí)行機構上?？梢允褂脁TAG RVP分析來同時檢測19種呼吸道病毒類型或亞型，包括RSV A&B，4種冠狀病毒(NL63、229E、0C43、HKU1)、SARS、非特異性流感A和H1、H3、H5亞型、流感B、副流感病毒1/2/3/4、腺病毒偏肺病毒、鼻病毒/腸病毒。分析還包括兩個對照，MS-2卩遼菌體內(nèi)部對照和Lambdaphage陽性對照。
[0050]本發(fā)明的分子診斷平臺的兩個實例的規(guī)范顯示在表1中。在一個實例中，平臺I使用單樣品一次性微滴執(zhí)行機構，用于使用xTAG RVP分析來進行呼吸道病毒的合并的樣品制備和多重檢測。在另一實例中，平臺II使用隨機接近高流通量微滴執(zhí)行機構，用于在單個一次性微滴執(zhí)行機構上的高達12種不同的分子診斷面板(例如，xTAG面板)的完整的樣品制備(一個或多個樣品)和多重分析。
【權利要求】
1.一種混合微滴的方法，所述方法包括: (a)在表面上提供微滴； (b)使所述微滴形成為具有底部區(qū)域和兩個端部的第一“U”形狀； (c)同時合并所述端部并使所述微滴在所述底部區(qū)域處分離，以形成實質(zhì)上與所述第一 “U”形狀相反的第二 “U”形狀。
2.如權利要求1所述的方法，包括重復步驟(b)和(c)一次或多次。
3.如權利要求1及后面的權利要求中的任一項所述的方法，其中所述形成步驟包括使用通過電極介導的微滴操作來操縱所述微滴。
4.如權利要求3及后面的權利要求中的任一項所述的方法，其中所述微滴操作是電濕潤介導的。
5.如權利要求1及后面的權利要求中的任一項所述的方法，其中所述微滴包括珠子。
6.如權利要求1及后面的權利要求中的任一項所述的方法，其中所述微滴包括樣品。
7.如權利要求1及后面的權利要求中的任一項所述的方法，其中所述提供步驟包括合并樣品微滴和試劑微滴，以在所述表面上產(chǎn)生所述微滴。
8.如權利要求1及后面的權利要求中的任一項所述的方法，其中所述微滴位于所述表面上且被夾在兩個基板之間。
9.一種微滴執(zhí)行機構，包括: (a)第一基板，其具有平坦表面`； (b)第二基板，其與所述第一基板分開，以形成微滴操作間隙； (C)開口，其在所述第二基板中，形成從所述微滴執(zhí)行機構的外部位置到所述微滴操作間隙內(nèi)的流體路徑； (d)干燥的試劑小球，其具有平坦表面，位于所述第一基板上且與所述開口對齊，其中所述干燥的試劑小球的所述平坦表面鄰接所述第一基板的所述平坦表面。
10.如權利要求9及后面的權利要求中的任一項所述的微滴執(zhí)行機構，還包括在所述干燥的試劑小球下方的電極。
11.如權利要求10及后面的權利要求中的任一項所述的微滴執(zhí)行機構，其中所述電極具有實質(zhì)上類似于所述干燥的試劑小球的所述平坦表面的形狀的形狀。
12.如權利要求9及后面的權利要求中的任一項所述的微滴執(zhí)行機構，其中所述干燥的試劑小球具有選自由以下項組成的組的形狀:實質(zhì)上圓錐形；具有圓形點的實質(zhì)上圓錐形；實質(zhì)上圓柱形；具有圓形端部的實質(zhì)上圓柱形；實質(zhì)上半球形；實質(zhì)上卵形；前述形狀中的任一種的幾何部分。
13.如權利要求9及后面的權利要求中的任一項所述的微滴執(zhí)行機構，其中所述開口具有中心軸，所述干燥的試劑小球具有中心軸，且所述干燥的試劑小球的所述中心軸與所述開口的所述中心軸實質(zhì)上對齊。
14.如權利要求9及后面的權利要求中的任一項所述的微滴執(zhí)行機構，其中所述干燥的試劑小球具有大于所述微滴操作間隙的高度的高度。
15.—種在微滴執(zhí)行機構上提供試劑的方法,所述方法包括: (a)提供權利要求9及后面的權利要求中的任一項的微滴執(zhí)行機構；以及 (b)使液體通過所述開口流動而接觸所述干燥的試劑小球，從而將所述干燥的試劑小球溶解在所述液體中，以提供試劑微滴。
16.如權利要求15及后面的權利要求中的任一項所述的方法，其中所述液體包括樣品O
17.如權利要求15及后面的權利要求中的任一項所述的方法，其中所述液體包括緩沖液。
18.—種微滴執(zhí)行機構,包括: (a)一個或多個基板，其被布置成形成微滴操作間隙； (b)與一個或兩個基板相關聯(lián)的電極的布置，所述電極包括: (i)電極的中心路徑； (?)側(cè)電極，其被布置在電極的所述中心路徑的任一側(cè)上。
19.如權利要求18及后面的權利要求中的任一項所述的微滴執(zhí)行機構，其中每一個中心電極與一對側(cè)電極對齊。
20.如權利要求18及后面的權利要求中的任一項所述的微滴執(zhí)行機構，其中每組兩個中心電極與單對側(cè)電極對齊。
21.如權利要求18及 后面的權利要求中的任一項所述的微滴執(zhí)行機構，其中每組三個中心電極與單對側(cè)電極對齊。
22.如權利要求18及后面的權利要求中的任一項所述的微滴執(zhí)行機構，其中所述電極包括電濕潤電極。
23.如權利要求18及后面的權利要求中的任一項所述的微滴執(zhí)行機構，還包括相鄰于一個或多個所述中心電極或插入到一個或多個所述中心電極中的分配電極的布置。
24.如權利要求23及后面的權利要求中的任一項所述的微滴執(zhí)行機構，其中所述分配電極的布置位于具有過渡和間隙高度的所述微滴操作間隙的區(qū)域中，其中所述間隙高度在遠離所述中心電極的方向上減少。
25.如權利要求23及后面的權利要求中的任一項所述的微滴執(zhí)行機構，其中所述分配電極的布置位于相鄰于微滴操作電極的路徑處，使得所述分配電極被布置成將微滴分配到微滴操作電極的所述路徑上。
26.如權利要求23及后面的權利要求中的任一項所述的微滴執(zhí)行機構，其中所述中心電極沿著X軸布置，且其中每一個中心電極沿著所述X軸的長度實質(zhì)上等于每一個中心電極的側(cè)電極沿著所述X軸的長度。
27.如權利要求26及后面的權利要求中的任一項所述的微滴執(zhí)行機構，其中每一個中心電極沿著Y軸的長度實質(zhì)上等于每一個中心電極的側(cè)電極沿著所述Y軸的長度。
28.如權利要求26及后面的權利要求中的任一項所述的微滴執(zhí)行機構，其中每一個中心電極沿著Y軸的長度至少是每一個中心電極的側(cè)電極沿著所述Y軸的長度的兩倍。
29.如權利要求26及后面的權利要求中的任一項所述的微滴執(zhí)行機構，其中每一個中心電極沿著Y軸的長度至少是每一個中心電極的側(cè)電極沿著所述Y軸的長度的三倍。
30.一種使成形為實現(xiàn)混合的微滴變形的方法，所述方法包括: (a)提供權利要求18及后面的權利要求中的任一項所述的微滴執(zhí)行機構； (b)激活中心電極和不在所激活的中心電極的側(cè)面的一個或多個側(cè)電極。
31.如權利要求30及后面的權利要求中的任一項所述的方法，包括激活兩個或更多個中心電極和不在所激活的中心電極的側(cè)面的一個或多個側(cè)電極。
32.—種微滴執(zhí)行機構,包括: (a)一個或多個基板，其被布置成形成微滴操作間隙，所述微滴操作間隙包括間隙高度過渡的區(qū)域，在該間隙高度過渡的區(qū)域中所述微滴操作間隙的間隙高度從第一間隙高度過渡到第二間隙高度； (b)電極，其與布置成進行微滴操作的所述一個或多個基板相關聯(lián)，所述電極包括橫穿所述間隙高度過渡的區(qū)域的過渡電極。
33.如權利要求32及后面的權利要求中的任一項所述的微滴執(zhí)行機構，其中所述電極包括電濕潤電極。
34.如權利要求32及后面的權利要求中的任一項所述的微滴執(zhí)行機構，其中: (a)所述過渡電極的側(cè)面是具有第一覆蓋區(qū)的第一組電極和具有第二覆蓋區(qū)的第二組電極； (b)所述第一覆蓋區(qū)大于所述第二覆蓋區(qū)； (c)所述第一組電極被布置在較大間隙高度的區(qū)域中； (d)所述第二組電極被布置在較小間隙高度的區(qū)域中。
35.如權利要求32及后面的權利要求中的任一項所述的微滴執(zhí)行機構，其中所述過渡電極具有在所述第一覆蓋區(qū)和所述第二覆蓋區(qū)中間的覆蓋區(qū)。
36.如權利要求32及后面的權利要求中的任一項所述的微滴執(zhí)行機構，其中所述過渡電極包括嵌入電極，其中所述嵌入電極被嵌入到所述過渡電極中。
37.如權利要求36及后面的權利要求中的任一項所述的微滴執(zhí)行機構，其中所述嵌入電極橫穿所述過渡區(qū)域的至少一部分。
38.如權利要求36及后面的權利要求中的任一項所述的微滴執(zhí)行機構，其中所述嵌入電極不過渡所述過渡區(qū)域的任何部分。
39.如權利要求32及后面的權利要求中的任一項所述的微滴執(zhí)行機構，包括與單個間隙高度過渡相關聯(lián)的多個過渡電極。
40.如權利要求32及后面的權利要求中的任一項所述的微滴執(zhí)行機構，包括與多個間隙高度過渡相關聯(lián)的多個過渡電極。
41.一種微滴執(zhí)行機構,包括: (a)微滴操作表面； (b)與所述微滴操作表面相關聯(lián)的電極的布置，所述電極包括: (i)分配電極，其具有第一覆蓋區(qū)； (?)具有第二覆蓋區(qū)的電極的路徑，所述第二覆蓋區(qū)小于所述第一覆蓋區(qū)，其中電極的所述路徑的至少一個電極被嵌入到所述分配電極中；以及 (iii) 一組側(cè)電極，其在電極的所述路徑的兩個或更多個電極的側(cè)面。
42.如權利要求41及后面的權利要求中的任一項所述的微滴執(zhí)行機構，其中所述側(cè)電極在電極的所述路徑的三個或更多個電極的側(cè)面。
43.如權利要求41及后面的權利要求中的任一項所述的微滴執(zhí)行機構，其中所述分配電極是兩個或更多個分配電極的布置之一。
44.如權利要求43中的任一項所述的微滴執(zhí)行機構，其中所述微滴操作表面被設置在微滴操作間隙中， 且兩個或更多個分配電極的所述布置與通過基板的開口相關聯(lián)，形成從所述微滴執(zhí)行機構的外部位置到所述微滴操作間隙內(nèi)的流體路徑。
【文檔編號】B01F3/08GK103562729SQ201280021808
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2012年5月1日 優(yōu)先權日:2011年5月2日
【發(fā)明者】多諾萬·博爾特, 卡麗·格雷厄姆, 瓦姆西·帕姆拉, 邁克爾·波來克, 拉瑪克里什那·西斯塔, 維吉·斯里尼瓦桑 申請人:先進流體邏輯公司