基于高通量dna甲基化組學(xué)信息的分子診斷檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于高通量DNA甲基化組學(xué)信息的分子診斷檢測方法，產(chǎn)生高通量組學(xué)原始數(shù)據(jù)的平臺主要有DNA甲基化450K高通量芯片及表觀亞硫酸氫鹽測序技術(shù)RRBS。所采用的方法涉及到多染色體鏈和多片段的拼接和重組定位等一系列先前步驟；其次是根據(jù)全局染色體片段定位信息并結(jié)合高通量組學(xué)的信息在全部細(xì)胞系中進(jìn)行全染色體組型篩查，對照多模態(tài)的參考組，最終實(shí)現(xiàn)染色體雙鏈中的高危及致癌關(guān)聯(lián)片段的檢測與診斷。該發(fā)明填補(bǔ)了國內(nèi)外分子檢測診斷領(lǐng)域中的單源性和可靠度低等多種缺點(diǎn)，在基礎(chǔ)研究和臨床醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域具有較好的市場開發(fā)前景。
【專利說明】
基于高通量DNA甲基化組學(xué)信息的分子診斷檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種基于高通量DNA甲基化組學(xué)信息的分子診斷檢測方法，屬于高通量組學(xué)技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)無創(chuàng)檢測技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]DNA甲基化是一類重要的表觀遺傳學(xué)過程。其在維持正常細(xì)胞功能、遺傳印記、胚胎發(fā)育以及人類腫瘤發(fā)生中起著重要作用。隨著對甲基化研究水平的提升，其檢測與分析技術(shù)越來越受到學(xué)術(shù)和工程應(yīng)用領(lǐng)域的重視。根據(jù)不同的研究和應(yīng)用目的，目前已有基于限制性內(nèi)切酶、甲基化敏感性單核苷酸藥物延伸、甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性和免疫化學(xué)法等多種甲基化檢測分析方法，但大部分在技術(shù)上還存在一定缺陷或是實(shí)現(xiàn)需要精密且成本更為昂貴的檢測儀器，由此在相當(dāng)大的程度上限制了該類技術(shù)在學(xué)術(shù)研究和工程領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。我們前期的工作已經(jīng)圍繞全基因組DNA甲基化的檢測和分析開展了一定程度研究，并鑒于目前DNA甲基化檢測與分析技術(shù)所存在問題，提出了新的思路和途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]目的:為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提供一種基于高通量DNA甲基化組學(xué)信息的分子診斷檢測方法，提供一類基于多路互驗(yàn)的檢測技術(shù)與分析途徑。
[0004]技術(shù)方案:為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
一種基于高通量DNA甲基化組學(xué)信息的分子診斷檢測方法，包括以下步驟:
步驟(I):基于基因微陣列SAGE的全基因組DNA甲基化水平檢測與分析；
步驟(2):基于染色質(zhì)免疫共沉淀ChIP的全基因組DNA甲基化水平檢測與分析； 步驟(3):基于重亞硫酸鹽加克隆測序RRBS的DNA甲基化水平檢測與分析。
[0005]所述步驟(I)具體是指:
IA)利用基因微陣列SAGE技術(shù)構(gòu)建樣本文庫，并進(jìn)行測序和定位分析，從而獲得相關(guān)蛋白在全基因組內(nèi)的分布特征及狀態(tài)水平信息；
IB)基于細(xì)胞系或組織樣本進(jìn)行基因微陣列SAGE技術(shù)的全基因組DNA甲基化水平圖譜的構(gòu)建；
IC)基于多樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行批次效益預(yù)處理后，進(jìn)行相關(guān)位點(diǎn)的全基因組定位和差異化位點(diǎn)鑒定。
[0006]所述步驟(2)具體是指:
2A)利用染色質(zhì)免疫共沉淀ChIP技術(shù)，結(jié)合基因芯片技術(shù)，完善相關(guān)細(xì)胞系或組織樣本中目標(biāo)蛋白與基因組中DNA關(guān)鍵研究對象的全基因組定位；
2B)利用基因組位點(diǎn)以及前期測序豐度關(guān)鍵信息，確定目標(biāo)蛋白與基因組中DNA相互作用位點(diǎn);并在RT-PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步驗(yàn)證本步驟結(jié)論的可重復(fù)性和可信度；2C)結(jié)合二代測序技術(shù)，確定轉(zhuǎn)錄因子綁定位點(diǎn)信息，并以此考查和驗(yàn)證本步驟結(jié)論的可靠性。
[0007]所述步驟(3)具體是指:
3A)利用重亞硫酸氫鈉在堿性條件和氫醌的催化下處理DNA，使非甲基化的胞嘧啶發(fā)生脫氧基反應(yīng)，從而轉(zhuǎn)變成尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶不發(fā)生反應(yīng)；
3B)并在此基礎(chǔ)上，通過DNA直接測序、限制性內(nèi)切酶分析以及設(shè)計不同引物的PCTR擴(kuò)增方法測出相應(yīng)序列的甲基化水平；
3C)在此結(jié)合RT-PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證本步驟所得結(jié)論的可重復(fù)性和可信度。
[0008]步驟(4):基于上述實(shí)驗(yàn)步驟和相關(guān)結(jié)論，結(jié)合多源信息融合的途徑，對DNA甲基化水平進(jìn)行定性和定量化的評價與鑒定。
[0009]該部分計算分析需要結(jié)合適當(dāng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證環(huán)節(jié)來開展，從而使得實(shí)驗(yàn)與計算部分的結(jié)論具有較高的可信度和可重復(fù)性，同時能夠在試驗(yàn)和計算可控范圍內(nèi)，大大提高DNA甲基化的檢測和分析精度，縮小檢測和鑒定的時間。
[0010]本發(fā)明基于現(xiàn)有DNA分子表達(dá)水平檢測與實(shí)驗(yàn)設(shè)備，提出了多源組學(xué)信息融合互驗(yàn)的檢測和分析途徑。相關(guān)的檢測和分析對象可以采用實(shí)驗(yàn)室常用的細(xì)胞系和組織樣本，因此具有較大的適用范圍和市場前景。
[0011]有益效果:本發(fā)明提供的基于高通量DNA甲基化組學(xué)信息的分子診斷檢測方法，利用基因微陣列SAGE技術(shù)、染色質(zhì)免疫共沉淀ChIP技術(shù)、重亞硫酸鹽加克隆測序RRBS技術(shù)，開創(chuàng)性提出了多源基因組學(xué)資源融合的DNA甲基化檢測與分析技術(shù)，填補(bǔ)了國內(nèi)外在此項研究上的空白；能夠?qū)崿F(xiàn)多源實(shí)驗(yàn)平臺組學(xué)信息的快速整合、DNA甲基化水平的高精度檢測與分析等用途，并且具有軟硬件實(shí)現(xiàn)成本較低，適用范圍較廣的優(yōu)點(diǎn)。另外該技術(shù)方法相對工藝簡單，不需要使用專用設(shè)備，不需要特殊環(huán)境資源，對環(huán)境無污染等特點(diǎn)。
【附圖說明】
[0012]圖1是本發(fā)明的流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作更進(jìn)一步的說明。
[0014]如圖1所示，一種基于高通量DNA甲基化組學(xué)信息的分子診斷檢測方法，其特征在于:包括以下步驟:
步驟(I):基于基因微陣列SAGE的全基因組DNA甲基化水平檢測與分析;具體是指:
IA)利用基因微陣列SAGE技術(shù)構(gòu)建樣本文庫，并進(jìn)行測序和定位分析，從而獲得相關(guān)蛋白在全基因組內(nèi)的分布特征及狀態(tài)水平信息；
IB)基于細(xì)胞系或組織樣本進(jìn)行基因微陣列SAGE技術(shù)的全基因組DNA甲基化水平圖譜的構(gòu)建；
IC)基于多樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行批次效益等預(yù)處理后，進(jìn)行相關(guān)位點(diǎn)的全基因組定位和差異化位點(diǎn)鑒定。
[0015]步驟(2):基于染色質(zhì)免疫共沉淀ChIP的全基因組DNA甲基化水平檢測與分析;具體是指:
2A)利用染色質(zhì)免疫共沉淀ChIP技術(shù)，結(jié)合基因芯片技術(shù)，完善相關(guān)細(xì)胞系或組織樣本中目標(biāo)蛋白與基因組中DNA等關(guān)鍵研究對象的全基因組定位等步驟； 2B)利用基因組位點(diǎn)以及前期測序豐度等關(guān)鍵信息，確定目標(biāo)蛋白與基因組中DNA相互作用位點(diǎn);并在RT-PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)論的可重復(fù)性和可信度；
2C)結(jié)合二代測序技術(shù)，確定轉(zhuǎn)錄因子綁定位點(diǎn)等信息，并以此考查和驗(yàn)證上述結(jié)論的可靠性。
[0016]步驟(3):基于重亞硫酸鹽加克隆測序RRBS的DNA甲基化水平檢測與分析，具體是指:
3A)利用重亞硫酸氫鈉在堿性條件和氫醌的催化下處理DNA，可使非甲基化的胞嘧啶發(fā)生脫氧基反應(yīng)，從而轉(zhuǎn)變成尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶不發(fā)生反應(yīng)；
3B)并在此基礎(chǔ)上，通過DNA直接測序、限制性內(nèi)切酶分析以及設(shè)計不同引物的PCTR擴(kuò)增等方法測出相應(yīng)序列的甲基化水平；
3C)在此結(jié)合RT-PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證本步驟所得結(jié)論的可重復(fù)性和可信度。
[0017]步驟(4):基于上述實(shí)驗(yàn)步驟和相關(guān)結(jié)論，結(jié)合多源信息融合的途徑，對DNA甲基化水平進(jìn)行定性和定量化的評價與鑒定。
[0018]該部分計算分析需要結(jié)合適當(dāng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證環(huán)節(jié)來開展，從而使得實(shí)驗(yàn)與計算部分的結(jié)論具有較高的可信度和可重復(fù)性，同時能夠在試驗(yàn)和計算可控范圍內(nèi)，大大提高DNA甲基化的檢測和分析精度，縮小檢測和鑒定的時間。
[0019]本發(fā)明基于現(xiàn)有DNA分子表達(dá)水平檢測與實(shí)驗(yàn)設(shè)備，提出了多源組學(xué)信息融合互驗(yàn)的檢測和分析途徑。相關(guān)的檢測和分析對象可以采用實(shí)驗(yàn)室常用的細(xì)胞系和組織樣本，因此具有較大的適用范圍和市場前景。
[0020]本發(fā)明提供的基于高通量DNA甲基化組學(xué)信息的分子診斷檢測方法，產(chǎn)生高通量組學(xué)原始數(shù)據(jù)的平臺主要有DNA甲基化450K高通量芯片(
11lumina Human Methylat1n450 DNA BeadChip)及表觀亞硫酸氫鹽測序技術(shù) RRBS(Reduced Representat1n Bisulfite Sequencing)。所米用的方法涉及到多染色體鏈和多片段的拼接和重組定位等一系列先前步驟;其次是根據(jù)全局染色體片段定位信息并結(jié)合高通量組學(xué)的信息在全部細(xì)胞系中進(jìn)行全染色體組型篩查，對照多模態(tài)的參考組，最終實(shí)現(xiàn)染色體雙鏈中的高危及致癌關(guān)聯(lián)片段的檢測與診斷。該發(fā)明填補(bǔ)了國內(nèi)外分子檢測診斷領(lǐng)域中的單源性和可靠度低等多種缺點(diǎn)，在基礎(chǔ)研究和臨床醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域具有較好的市場開發(fā)前景。
[0021]利用基因微陣列SAGE技術(shù)、染色質(zhì)免疫共沉淀ChIP技術(shù)、重亞硫酸鹽加克隆測序RRBS技術(shù)，開創(chuàng)性提出了多源基因組學(xué)資源融合的DNA甲基化檢測與分析技術(shù)，填補(bǔ)了國內(nèi)外在此項研究上的空白；能夠?qū)崿F(xiàn)多源實(shí)驗(yàn)平臺組學(xué)信息的快速整合、DNA甲基化水平的高精度檢測與分析等用途，并且具有軟硬件實(shí)現(xiàn)成本較低，適用范圍較廣的優(yōu)點(diǎn)。另外該技術(shù)方法相對工藝簡單，不需要使用專用設(shè)備，不需要特殊環(huán)境資源，對環(huán)境無污染等特點(diǎn)。
[0022]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出:對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項】
1.一種基于高通量DNA甲基化組學(xué)信息的分子診斷檢測方法，其特征在于:包括以下步驟: 步驟(I):基于基因微陣列SAGE的全基因組DNA甲基化水平放的檢測與分析過程； 步驟(2):基于染色質(zhì)免疫共沉淀ChIP的全基因組DNA甲基化水平的檢測與分析過程； 步驟(3):基于重亞硫酸鹽加克隆測序RRBS的DNA甲基化水平的檢測與分析過程。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于高通量DNA甲基化組學(xué)信息的分子診斷檢測方法，其特征在于:所述步驟(I)具體是指: IA)利用基因微陣列SAGE技術(shù)構(gòu)建樣本文庫，并進(jìn)行測序和定位分析，從而獲得相關(guān)蛋白在全基因組內(nèi)的分布特征及狀態(tài)水平信息； IB)基于細(xì)胞系或組織樣本進(jìn)行基因微陣列SAGE技術(shù)的全基因組DNA甲基化水平圖譜的構(gòu)建； IC)基于多樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行批次效益預(yù)處理后，進(jìn)行相關(guān)位點(diǎn)的全基因組定位和差異化位點(diǎn)鑒定。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于高通量DNA甲基化組學(xué)信息的分子診斷檢測方法，其特征在于:所述步驟(2)具體是指: 2A)利用染色質(zhì)免疫共沉淀ChIP技術(shù)，結(jié)合基因芯片技術(shù)，完善相關(guān)細(xì)胞系或組織樣本中目標(biāo)蛋白與基因組中DNA關(guān)鍵研究對象的全基因組定位； 2B)利用基因組位點(diǎn)以及前期測序豐度關(guān)鍵信息，確定目標(biāo)蛋白與基因組中DNA相互作用位點(diǎn);并在RT-PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步驗(yàn)證本步驟結(jié)論的可重復(fù)性和可信度；2C)結(jié)合二代測序技術(shù)，確定轉(zhuǎn)錄因子綁定位點(diǎn)信息，并以此考查和驗(yàn)證本步驟結(jié)論的可靠性。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于高通量DNA甲基化組學(xué)信息的分子診斷檢測方法，其特征在于:所述步驟(3)具體是指: 3A)利用重亞硫酸氫鈉在堿性條件和氫醌的催化下處理DNA，使非甲基化的胞嘧啶發(fā)生脫氧基反應(yīng)，從而轉(zhuǎn)變成尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶不發(fā)生反應(yīng)； 3B)并在此基礎(chǔ)上，通過DNA直接測序、限制性內(nèi)切酶分析以及設(shè)計不同引物的PCTR擴(kuò)增方法測出相應(yīng)序列的甲基化水平； 3C)在此結(jié)合RT-PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證本步驟所得結(jié)論的可重復(fù)性和可信度。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于高通量DNA甲基化組學(xué)信息的分子診斷檢測方法，其特征在于:還包括步驟(4):基于上述實(shí)驗(yàn)步驟和相關(guān)結(jié)論，結(jié)合多源信息融合的途徑，對DNA甲基化水平進(jìn)行定性和定量化的評價與鑒定。
【文檔編號】C12Q1/68GK105861693SQ201610302752
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月10日
【發(fā)明人】湯斌華
【申請人】河海大學(xué)常州校區(qū)