專利名稱：通過分子解構(gòu)的拉曼監(jiān)測實(shí)施的核酸測序的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本方法、組合物和裝置涉及分子生物學(xué)和基因組學(xué)領(lǐng)域。更具體地，該方法、組合物和裝置涉及核酸測序。
背景技術(shù)：
人類基因組計(jì)劃的出現(xiàn)要求開發(fā)出用于核酸，例如DNA(脫氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)測序的改善的方法。遺傳信息以組織為染色體的非常長的DNA分子的形式儲存。人類基因組的23對染色體含有大約30億個堿基組成的DNA序列。該DNA序列信息決定了每個個體的多種特征，例如身高、眼睛顏色和種族。許多常見的疾病，例如癌癥、纖維囊泡癥、鐮狀細(xì)胞性貧血和肌肉萎縮癥都至少部分地基于DNA序列中的變異。
人類基因組整個序列的測定已經(jīng)為判定這些疾病的遺傳基礎(chǔ)提供了一個基礎(chǔ)。然而，為了確定與每一種疾病相聯(lián)系的遺傳變異，仍有大量的工作需要去做。為了確定在DNA序列中促發(fā)疾病的特定變化，就要求對表現(xiàn)有每一種這樣的疾病的個體或家族的染色體相應(yīng)部分進(jìn)行DNA測序。RNA是一種加工遺傳信息時所需要的中間分子，在一些情況下RNA也能被測序以確定各種疾病的遺傳基礎(chǔ)。
核酸測序的已有方法基于按大小分離開的熒光標(biāo)記核酸的檢測，它受到了所能測定的核酸長度的限制。一般來說，一次只能測定500到1000個堿基的核酸序列。這比DNA的功能單位，即基因的長度短得多，后者可能有上萬個，甚至十萬個堿基長。使用目前的方法來測定一個完整基因的序列，就需要制得該基因的若干拷貝，把它們切為相互重疊的片段然后再測序，之后再把相互重疊的DNA序列組合為完整的基因序列。這個過程費(fèi)力、昂貴、低效而且耗時。
附圖簡述下面的附圖構(gòu)成了本說明書的一部分，它們被引入是為了進(jìn)一步說明公開的實(shí)施方案的某些方面。通過參考這些附圖中的一個或者多個，并結(jié)合在這里提出的特定實(shí)施方案的詳細(xì)描述，可以更好的理解這些實(shí)施方案。


圖1顯示了用于DNA測序的一個典型的設(shè)備(未按比例作圖)和方法，其中，被釋放的核苷酸與將被測序的核酸分子在空間上是分離的。
圖2顯示了用于DNA測序的一個典型的設(shè)備(未按比例作圖)和方法，其中，被釋放的核苷酸與核酸分子在空間上不是分離的。檢測器對溶液中的核苷酸進(jìn)行定量。
示例性的實(shí)施方案的描述被公開的方法、組合物和裝置用于核酸的快速、自動的測序。在特定的實(shí)施方案中，本方法、組合物和裝置適用于獲得非常長的核酸13分子的序列，大于1000、大于2000、大于5000、大于10000、大于20000、大于50000、大于100000或者甚至有更多堿基的也可以。在各種實(shí)施方案中，這樣的序列信息在一次單獨(dú)的測序操作過程中使用模板核酸13，102的一個分子便可以獲得。在其他實(shí)施方案中，該模板核酸分子13，102的多個拷貝可以平行或順序地被測序，從而確證核酸的序列或獲得完整的序列數(shù)據(jù)。在可選擇的實(shí)施方案中，核酸分子13，102和它的互補(bǔ)鏈可以被測序以確證序列信息的精確性。與核酸測序的已有方法相比，優(yōu)點(diǎn)包括在一次單獨(dú)的測序操作中讀出長核酸的序列，獲得序列數(shù)據(jù)的速度更快，并且，就產(chǎn)生每單位的序列數(shù)據(jù)所需要的操作時間而言，測序的花費(fèi)降低，效率提高。
在某些實(shí)施方案中，待測序的核酸13，102是DNA，盡管其他核酸13，102，包括RNA或合成的核酸同型物也被認(rèn)為可以被測序。下面的詳細(xì)描述包含了大量特定細(xì)節(jié)以提供對公開的實(shí)施方案的更全面的理解。然而，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，沒有這些特定的細(xì)節(jié)，也能夠?qū)嵤┻@些實(shí)施方案。在其他方面，那些在本領(lǐng)域廣為人知的裝置、方法、步驟和個別的組分沒有在這里詳細(xì)描述。
一些實(shí)施方案如圖1和圖2所示，這些方法涉及單個單鏈核酸分子13，102的測序，這些核酸分子連接到一個反應(yīng)室11，101中的一個固定化表面14，103，并且在解構(gòu)(deconstruction)反應(yīng)中分解。在這些實(shí)施方案中，反應(yīng)室11，101含有一種或多種解構(gòu)試劑15，106，它們能次序地每一次從核酸分子13，102的未連接端17，105移去一個核苷酸16，104。這些解構(gòu)試劑15，106的非限定性的例子包括本領(lǐng)域已知的任何外切核酸酶。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)核苷酸16，104被釋放進(jìn)入溶液時，通過拉曼光譜被確定。
圖1顯示了某些實(shí)施方案。圖1顯示了一個用于核酸測序的裝置10，該裝置包含連接著一個流動通路12的一個反應(yīng)室11。該反應(yīng)室11包括連接到一個固定化表面14的一個核酸分子13和一種解構(gòu)試劑15，如外切核酸酶。該外切核酸酶15催化各個核苷酸16從核酸分子13的自由末端17按次序地釋放。當(dāng)各個核苷酸16通過解構(gòu)反應(yīng)被釋放并進(jìn)入溶液時，它們沿流動通路12流動并通過一個檢測單元18。該檢測單元18含有一個激發(fā)源19如一個激光器，它發(fā)出激發(fā)光束20。該激發(fā)光束20和釋放的核苷酸16反應(yīng)，致使電子被激發(fā)到更高能態(tài)。電子返回低能態(tài)時產(chǎn)生的拉曼發(fā)射光譜由一個拉曼光譜檢測器21如一個光度計(jì)或一個單色儀檢測。
在圖1顯示的實(shí)施方案中，被釋放的核苷酸16在接受檢測單元18的檢測之前與核酸分子13在空間上是分離的?？臻g上的分離可以通過隔離各個核苷酸16來提高拉曼檢測器21的信噪比。
在圖1顯示的實(shí)施方案中，一個反應(yīng)室11里含有一個核酸分子13。在可選擇的實(shí)施例中，將每一個核酸分子13分別置于一個獨(dú)立的反應(yīng)室11里，可以對多個核酸分子13同時測序。在這種情況里，各個反應(yīng)室11中的核酸模板13可能是相同的或者不同的。在其他可以選擇的實(shí)施方案中，兩個或者更多的模板核酸分子13可以放在同一個反應(yīng)室11里。在這樣的實(shí)施方案中，核酸分子13的序列相同。當(dāng)多于一個的核酸分子13存在于反應(yīng)室11中時，拉曼發(fā)射信號將代表反應(yīng)室11中由所有核酸分子13同時釋放的核苷酸16的平均值。熟練的技術(shù)人員能夠使用已知的數(shù)據(jù)分析技術(shù)，校正在解構(gòu)反應(yīng)的任何給定時間獲得的信號，這些信號或者落后于反應(yīng)的主體(majority)，或者先于反應(yīng)的主體。在某些實(shí)施方案中，技術(shù)人員可以通過一些步驟使單個反應(yīng)室11中的多個核酸分子13的解構(gòu)同步化，如在加入一團(tuán)解構(gòu)試劑15時作快速混合。
在某些可選擇的實(shí)施方案中，可以將一個標(biāo)記分子加入到檢測單元18上游的反應(yīng)室11或流動通路12。當(dāng)自由核苷酸16從核酸分子13上釋放時，標(biāo)記分子連接到它們上面，并對其加以標(biāo)記。這種釋放后標(biāo)記避免了在核酸分子13的核苷酸16進(jìn)入溶液前被標(biāo)記時會出現(xiàn)的問題。例如，如果摻入核酸分子13的每一個核苷酸16是在解構(gòu)之前被標(biāo)記，那么使用大體積熒光探針分子會產(chǎn)生明顯的空間位阻，這將會降低測序反應(yīng)的效率并增加測序用的時間。
在涉及核苷酸16的釋放后標(biāo)記的實(shí)施方案中，可以期望使用別的檢測方法，例如熒光光譜法或發(fā)光(luminescene)光譜法。許多可以選擇的溶液中自由核苷酸16的檢測方法是已知的并可加以利用。對于這些方法，拉曼光譜檢測單元18可以用被設(shè)計(jì)成用于檢測熒光、發(fā)光或其他類型信號的檢測單元18替代。
標(biāo)記分子具有獨(dú)特且明顯可見的光學(xué)信號，這些信號能夠區(qū)分每種常用核苷酸16。在某些實(shí)施方案中，該標(biāo)記能夠增加拉曼發(fā)射信號的強(qiáng)度，或者以其他方式提高拉曼檢測器21檢測核苷酸16的靈敏度或特異性。對于涉及拉曼光譜的實(shí)施例來說，能夠使用的標(biāo)記分子的非限制性例子包括TRIT(四甲基若丹明異硫醇)、NBD(7-硝基苯-2-噁-1，3-二唑)、德克薩斯紅染料、鄰苯二甲酸、對苯二甲酸、間苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚藍(lán)紫、亮甲酚藍(lán)、對氨基苯甲酸、赤蘚紅和氨基吖啶。用于特定實(shí)施方案的其他標(biāo)記部分可以包括氰化物、硫醇、氯、溴、甲基、磷和硫。在某些實(shí)施方案中，碳納米管也可作為拉曼標(biāo)記被使用。在拉曼光譜中標(biāo)記的使用在本領(lǐng)域是已知的(例如，美國專利號5,306,403和6,174,677)。熟練的技術(shù)人員明白，當(dāng)拉曼標(biāo)記結(jié)合到不同的核苷酸16時，應(yīng)該能夠產(chǎn)生可區(qū)分的拉曼光譜，或者對于每一種核苷酸16，設(shè)計(jì)不同的標(biāo)記與之相連。
在某些實(shí)施方案中，核酸分子通過與一個固定化表面14相連而被固定在原位，并浸在沿一個流體通路12流動的微流體中，該流體能運(yùn)送從核酸分子13上釋放的核苷酸16，并使其通過一個檢測單元18。在一個非限制性的實(shí)例中，微流體流動可以由經(jīng)過核酸分子13并沿著一個流動通路12的溶劑體流動形成，流動通路12如一個硅、玻璃或其他芯片中的一個微毛細(xì)管或一個蝕刻通道。在作為選擇的實(shí)施方案中，體介質(zhì)移動很慢或者根本不移動，但是溶液中帶電荷的物質(zhì)(如帶負(fù)電荷的核苷酸16)在外加電場作用下沿著含有一個通道或細(xì)管的一個流動通路12運(yùn)動。
在其他作為選擇的實(shí)施方案中，通過移動與核酸分子13相連的固定化表面14，可以使核酸分子13離開釋放的核苷酸16。通過利用一個隨著核酸分子13移動的檢測單元18來掃描和確定釋放的核苷酸16。
在上面所討論的實(shí)施方案中，檢測單元18必須能夠區(qū)別從核酸分子13釋放的普通核苷酸16。至少，為了測定DNA分子13序列，檢測單元18必須能夠區(qū)分含有腺苷(A)、鳥苷(G)、胞苷(C)和胸苷(T)的核苷酸16。如果對RNA 13測序，檢測單元18必須能夠區(qū)分含有A、G、C和尿苷(U)的核苷酸。對于每個反應(yīng)室11只有一個核酸分子13的情況，沒有必要要求檢測單元18能夠?qū)θ芤褐械拿糠N核苷酸16進(jìn)行定量，因?yàn)槊恳淮沃挥幸粋€核苷酸16通過檢測單元18。
在其他實(shí)施方案中，如圖2所示，檢測單元107有足夠的靈敏度，能夠確定存在于溶液中的自由核苷酸104的數(shù)目。因此，不需要將釋放的核苷酸104與核酸分子102分離開。如圖2所示，該裝置100包含一個反應(yīng)室101，該反應(yīng)室101含有一個一端連接到一個固定化表面103的核酸分子102。通過一種解構(gòu)試劑106如外切核酸酶的作用，從核酸分子102的未連接端105次序地移去自由核苷酸104。
如圖2所示，在這些實(shí)施方案中自由核苷酸104與核酸分子102在空間上不是分開的。檢測單元107含有一個能發(fā)出激發(fā)光束110的激發(fā)源108和一個檢測器109。檢測單元107對含有核酸分子102和自由核苷酸104的反應(yīng)室101作出分析。因?yàn)闄z測器109能對溶液中每個核苷酸104進(jìn)行定量，所以可以通過核苷酸104釋放進(jìn)入溶液的時間順序確定核酸102序列。因?yàn)楸粧呙璧捏w積更大，所以可能有必要使用覆蓋范圍更廣、強(qiáng)度更大的激發(fā)光束110。
在這些實(shí)施方案中，由于每個核苷酸104是連續(xù)地從核酸分子102的未連接端105釋放，所以可以通過溶液中該核苷酸104信號的增強(qiáng)來確定該核苷酸104。拉曼檢測器109能獨(dú)立地確定溶液中每種核苷酸104——腺苷一磷酸(AMP)、鳥苷一磷酸(GMP)、胞苷一磷酸(CMP)和尿苷一磷酸(UMP)或胸苷一磷酸(TMP)——的分子數(shù)目，并從由核酸分子102產(chǎn)生的基準(zhǔn)拉曼信號中分離出那些信號。
技術(shù)人員會明白，對DNA 13，102的分析將導(dǎo)致脫氧核糖核苷或脫氧核糖核苷酸16，104(包括胸苷)的釋放，而對RNA 13，102的分析將導(dǎo)致核糖核苷或核糖核苷酸16，104(包括尿苷)的釋放。盡管由外切核酸酶15，106活性造成的釋放形式通常是核苷一磷酸16，104，但實(shí)施方案并不局限于檢測自由核苷酸或核苷16，104的某一特定形式，而是包含了利用一種解構(gòu)試劑15，106的活性從一個核酸13，102上釋放出的任何單體16，104。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，圖1和圖2顯示的方法和裝置10，100的一些組合可以被使用。圖1的方法可以使用一個低靈敏度的檢測器21，但要求更復(fù)雜的分子運(yùn)送程序。圖2顯示的方法簡化了分子運(yùn)送，但要求一個高靈敏度的檢測器109。各種中間方法可以被使用。例如，可以使用沿著一個流體通路12的微流體流動將已檢測到的核苷酸16從激發(fā)光束20照射的區(qū)域移走，而拉曼檢測器21的定量功能允許在被釋放的核苷酸16之間沒有時間或空間分離的情況下進(jìn)行檢測。
在某些實(shí)施方案中，來自一個檢測器21，109如分光計(jì)或單色儀陣列的數(shù)據(jù)可以傳入一個信息處理系統(tǒng)，該系統(tǒng)含有一個將特定拉曼信號與特定核苷酸16，104聯(lián)系起來的數(shù)據(jù)庫。該信息處理系統(tǒng)記錄下由檢測器21，109檢測到的信號，用數(shù)據(jù)庫中已知核苷酸16，104的信號校正那些信號，并保存關(guān)于核苷酸16，104顯現(xiàn)的一份記錄，該記錄表示了核酸分子13，102的序列。該信息處理系統(tǒng)也可實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)的程序，如背景信號的扣除，并且，當(dāng)檢測到的是來自多個核苷酸16，104的有重疊的時間或空間信號時，可以使用“堿基調(diào)用(base-calling)”測定。
在一些實(shí)施方案中，核酸分子13，102可以連接到一個表面14，103，例如功能化玻璃、硅、PDMS(聚二甲基硅氧烷)、銀或其他金屬涂蓋的表面、石英、塑料、PTFE(聚四氟乙烯)、PVP(聚乙烯基吡咯烷酮)、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、橡膠、尼龍、硝酸纖維素、玻璃珠、磁珠或者本領(lǐng)域已知的能在其表面整合上氨基、羧基、硫醇、羥基或第爾斯-阿爾德(Diels-Alder)反應(yīng)劑等功能性基團(tuán)的其他任何材料。
在一些實(shí)施方案中，功能性基團(tuán)可以共價連接到交聯(lián)劑上，以便核酸分子13，102與解構(gòu)試劑15，106之間的結(jié)合反應(yīng)能夠在沒有位阻的情況下發(fā)生。典型的交聯(lián)基團(tuán)包括乙二醇寡聚物和二胺。連接可以是共價或非共價的結(jié)合。將核酸分子13，102連接到表面14，103的各種方法在本領(lǐng)域是已知的，并且可以加以利用。
定義在這里所使用的“一個(‘a(chǎn)’或‘a(chǎn)n’)”可以表示某個物件(item)的一個或者多于一個。
“核酸”13，102可以是DNA或RNA，可以是單鏈的、雙鏈的或三鏈的，也可以是它們經(jīng)過化學(xué)修飾的形式，盡管單鏈核酸13，102是優(yōu)選的。事實(shí)上，可以考慮對核酸13，102作出任何修飾。在這里所使用的單鏈核酸13，102可以用前綴“ss”表示，雙鏈核酸13，102可以用前綴“ds”表示，三鏈核酸13，102可以用前綴“ts”表示。
“核酸”13，102幾乎可以是任何長度，它的堿基數(shù)可以是10、20、30、40、50、60、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、30000、40000、50000、75000、100000、150000、200000、500000、1000000、1500000、2000000、5000000或者甚至更多，直到全長染色體DNA分子13，102。
“核苷”16，104是含有一個堿基(A、T、G、C或U)的分子，這些堿基共價連接到戊糖如脫氧核糖、核糖、或者戊糖的衍生物或同型物(analogs)。
“核苷酸”16，104是指進(jìn)一步包括至少一個磷酸基團(tuán)共價連接到其戊糖上的核苷。在一些實(shí)施方案中，核苷酸16，104是核糖核苷一磷酸16，104或脫氧核糖核苷一磷酸16，104，盡管在一些實(shí)施方案中，可以預(yù)料得到的是核苷二磷酸或三磷酸16，104。在其他實(shí)施方案中，核苷16，104可從核酸分子13，102上釋放出來，并按下面討論的方法檢測?？梢钥紤]對核苷酸16，104的結(jié)構(gòu)作各種取代和修飾，只要它們?nèi)匀荒軌蛲ㄟ^解構(gòu)試劑15，106從核酸13，102上釋放出來。例如，在某些實(shí)施方案中，核糖或脫氧核糖部分可以用其他的戊糖或戊糖同型物(analog)取代。在其他的實(shí)施方案中，磷酸基團(tuán)可以用各種同型物取代。
核酸將被測序的核酸分子13，102可以用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)來制備。在一些實(shí)施方案中，核酸分子13，102是自然發(fā)生的DNA或RNA分子。事實(shí)上，可以使用已公開的方法來制備和序列測定任何自然發(fā)生的核酸13，102，包括但不限于染色體DNA、線粒體DNA和葉綠體DNA，和核糖體RNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA、不均一核RNA或信使RNA。
用于制備和分離各種形式的細(xì)胞內(nèi)核酸13，102的方法是已知的。(見，例如，Guide to Molecular Cloning Techniques，eds.Berger andKimmel，Academic Press，New York，NY，1987；Molecular CloningALaboratory Manual，2ndEd.，eds.Sambrook，F(xiàn)ritsch and Maniatis，ColdSpring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。一般地，含有待測序的核酸13，102的細(xì)胞、組織或其他源材料首先要被勻漿化，例如在液氮中冷凍，然后在研缽里用磨棒研磨。某些組織可以用韋林氏攪切器(Waring blender)、維爾第斯勻漿器(Virtis homogenizer)、杜恩斯勻漿器(Dounce homogenizer)或其他勻漿器勻漿化。粗制的勻漿可以用去污劑提取，如十二烷基磺酸鈉(SDS)、Triton X-100、CHAPS(3-[(3-膽胺丙基)二甲基氨]-1-丙烷磺酸酯)、辛基葡糖苷(octylglucoside)或本領(lǐng)域已知的其他去污劑?？蛇x擇或者可作為補(bǔ)充的是，可以使用促溶劑如異硫氰酸胍或有機(jī)溶劑如苯酚進(jìn)行提取。在一些實(shí)施例中，可以通過蛋白酶處理來降解細(xì)胞蛋白，例如使用蛋白酶K。顆粒污染物可以通過離心或超高速離心來去除(例如，大約5000到10000×g離心10到30分鐘，或者50000到100000×g離心30到60分鐘)。在低離子強(qiáng)度的含水緩沖液中進(jìn)行透析可以除去鹽或其他可溶性污染物。在-20℃加入乙醇，或者加入醋酸鈉(pH6.5，約0.3M)和0.8倍體積的2-丙醇，可以將核酸13沉淀。沉淀的核酸13，102可以通過離心被收集，或者，對于沉淀下來的染色體DNA，可以將其纏繞在玻璃吸管或其它探頭上。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會明白，上面所列的步驟僅僅是示例性的。取決于將被測序的核酸13，102的特定類型，可以作出許多變化。例如，線粒體DNA 13，102常常是通過采用不連續(xù)梯度的氯化銫密度梯度離心來制備，而mRNA 13，102則常常是用商業(yè)來源的制備柱來制備，這些商業(yè)來源例如Promega(Madison，WI)或Clontech(Palo Alto，CA)。這些變化在本領(lǐng)域是已知的。
技術(shù)人員會明白，取決于所制備的模板核酸13，102的類型，可以使用各種核酸酶抑制物。例如，通過用焦碳酸二乙酯(DEPC)進(jìn)行處理，可以去除儲液中的核糖核酸酶(RNase)污染。商業(yè)上可獲得的核酸酶抑制物可以有標(biāo)準(zhǔn)的來源，如Promega(Madison，WI)或BRL(Gaithersburg，MD)。純化的核酸13，102可以溶解在含水緩沖液中，如TE(Tris-EDTA)(乙二胺四乙酸)，然后在使用前貯存在-20℃或液氮中。
如果要被測序的是單鏈DNA(ssDNA)13，102，可以按標(biāo)準(zhǔn)方法由雙鏈DNA(dsDNA)制備ssDNA 13，102。最簡單的是，加熱dsDNA至它的退火溫度(在該溫度，dsDNA自發(fā)分離為ssDNA 13，102)以上。典型的條件可能涉及在92到95℃加熱5分鐘或更長時間。用于確定分離dsDNA的條件的公式，例如基于GC含量和分子長度的公式，在本領(lǐng)域是已知的。作為選擇，單鏈DNA 13，102可以用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增技術(shù)由雙鏈DNA制得，即使用僅結(jié)合雙鏈DNA的一條鏈的引物。制備單鏈DNA 13，102的其他方法在本領(lǐng)域是已知的，例如將待測序的雙鏈核酸插入復(fù)制態(tài)的噬菌體如M13中，然后讓噬菌體產(chǎn)生核酸13，102的單鏈拷貝。
盡管某些實(shí)施方案涉及自然發(fā)生的核酸13，102的制備，而事實(shí)上，能夠用作外切核酸酶或其他解構(gòu)試劑15，106的底物的任何類型核酸13，102都可以被測序。例如，用各種擴(kuò)增技術(shù)如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCRTM)擴(kuò)增制得的核酸13，102可以被測序。(見美國專利號4,683,195、4,683,202和4,800,159。)作為選擇，待測序的核酸13，102可以用標(biāo)準(zhǔn)載體克隆，標(biāo)準(zhǔn)載體如質(zhì)粒、粘粒、BACs(細(xì)菌人工染色體)或YACs(酵母人工染色體)。(見，例如，Berger and Kimmel，1987；Sambrook et al.，1989。)核酸插入物13，102可以從載體DNA中分離，例如，用合適的限制性內(nèi)切核酸酶切割，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并用溴化乙啶染色。將具有所需大小的核酸13，102片段從膠中取出，例如，使用低熔點(diǎn)瓊脂糖，或從膠塊中電洗脫。插入核酸13，102的分離方法在本領(lǐng)域是已知的。
單個核酸分子的分離在某些實(shí)施方案中，待測序的核酸分子13，102是ssDNA或ssRNA的單個分子。為了收集和操作單個ssDNA或ssRNA分子13，102，可以使用各種方法，如流體動力學(xué)聚焦(hydrodynamic focusing)、微操縱器偶聯(lián)(micro-manipulator coupling)、光捕獲、或這些方法的組合和類似的方法。(見，例如，Goodwin et al.，1996，Acc.Chem.Res.29607-619；美國專利號4,962,037；5,405,747；5,776,674；6,136,543；6,225,068。)在某些實(shí)施方案中，可以應(yīng)用微流體學(xué)或超微流體學(xué)來分選和分離模板核酸13，102?？梢赃\(yùn)用流體動力學(xué)來操縱核酸13，102的運(yùn)動，使其進(jìn)入一個微通道、微毛細(xì)管或微孔。在一個實(shí)施方案中，可以使用液體動力來移動核酸分子13，102通過一個梳狀結(jié)構(gòu)，從而分離出單個核酸分子13，102。一旦核酸分子13，102被分離開，就可以使用流力聚焦將這些分子13，102定位在反應(yīng)室11，101內(nèi)。熱學(xué)或電學(xué)上的勢差、一定的壓力或真空也都可用來提供操作核酸13，102所需的驅(qū)動力。在典型的實(shí)施方案中，為了測序而對模板核酸13，102進(jìn)行的操作可能涉及到使用一種砌塊(channel block)設(shè)計(jì)，它整合了微構(gòu)造的通道和一體化的膠質(zhì)材料。這個設(shè)計(jì)公開在美國專利號5,867,266和6,214,246。
在另一個實(shí)施方案中，含有核酸分子13，102的樣品可以在偶聯(lián)到一個固定化表面14，103之前被稀釋。在典型的實(shí)施方案中，固定化表面14，103可能是磁性或非磁性微珠(beads)的形式，或是其他離散的結(jié)構(gòu)單元。經(jīng)過適當(dāng)?shù)南♂?，每個微珠14，103具有結(jié)合零個或一個核酸分子13，102的統(tǒng)計(jì)概率。連接有一個核酸分子13，102的微珠14，103可以用例如熒光染料和流式細(xì)胞儀篩選或磁性篩選的方法來判定。取決于微珠14，103和核酸13，102的相對大小和均一性，可能使用一個磁過濾器和質(zhì)量分離法來分離含有一個結(jié)合核酸分子13，102的微珠14，103。在其他實(shí)施方案中，連接到單個微珠或其他固定化表面14，103的多個核酸13，102可以被測序。
在可選擇的實(shí)施方案中，可以使用一個有涂層的光纖末梢(coatedfiber tip)14，103來獲得用于測序的單個核酸分子13(例如，美國專利號6,225,068)。在其他可選擇的實(shí)施方案中，可以制備含有抗生物素蛋白或其他交聯(lián)劑的單個分子的固定化表面14，103。這樣的表面14，103能夠連接將被測序的生物素化核酸的單個分子13，102。這個實(shí)施方案不限于抗生物素蛋白-生物素結(jié)合體系，而適用于本領(lǐng)域已知的任何偶聯(lián)體系。
在其他可選擇的實(shí)施方案中，可以使用光捕獲來操縱用于測序的核酸的單個分子13，102。(例如，美國專利號5,776,674)。典型的光捕獲系統(tǒng)可以在商業(yè)上從Cell Robotics，Inc.(Albuquerque，NM)、S+LGmbH(Heidelberg，Germany)和P.A.L.M Gmbh(Wolfratshausen，Germany)獲得。
固定化的方法在各種實(shí)施方案中，待測序的核酸分子13，102可以連接(或固定)到一固體表面14，103。核酸分子13，102的固定化可以用各種方法來實(shí)現(xiàn)，這些方法涉及核酸分子13，102和表面14，103之間的非共價或共價連接。在一個典型的實(shí)施方案中，固定化可以通過這樣的方法完成，即用鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白包覆一個表面14，103，接著進(jìn)行生物素化核酸13，102的連接(Holmstrom et al.，Anal.Biochem.209278-283，1993)。固定化亦可這樣實(shí)現(xiàn)，即用聚L-Lys(賴氨酸)或聚L-Lys，Phe(苯丙氨酸)包覆硅、玻璃或其他表面14，103，接著用雙功能交聯(lián)劑共價連接氨基或巰基修飾的核酸13，102(Running et al.，Bio Techniques 8276-277，1990；Newton et al.，Nucleic Acids Res.211155-62，1993)?？梢酝ㄟ^使用氨基硅烷將胺基引入到表面14，103上以供交聯(lián)使用。
可以將5’-磷酸化核酸13，102直接共價連接到化學(xué)修飾的表面14，103，從而實(shí)現(xiàn)固定化(Rasmussen et al.，Anal.Biochem.198138-142，1991)。核酸13，102與表面14，103之間的共價鍵通過與水溶性碳二亞胺的縮合而形成。這種方法方便了核酸13，102通過其5’-磷酸基團(tuán)進(jìn)行有效的5’-連接。
要將DNA 13，102結(jié)合到玻璃上，通常要先對玻璃表面14，103進(jìn)行硅烷化，然后用碳二亞胺或戊二醛活化。在作為選擇的步驟中可以使用的試劑例如3-環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基硅烷(GOP)或氨丙基三甲氧基硅烷(APTS)，DNA 13，102通過整合到其3’或5’端的氨基接頭(linkers)來聯(lián)接。通過紫外輻射可以將DNA 13，102直接結(jié)合到膜表面14，103。核酸13，102固定化技術(shù)的其他非限制性實(shí)例公開在美國專利號5,610,287，5,776,674和6,225,068。
可用于核酸13，102的固定化的表面14，103類型是不受限的。在各種實(shí)施方案中，固定化表面14，103可以是磁性珠、非磁性珠、一個平表面、一個點(diǎn)狀表面，或其他包含幾乎任何材料的任何形狀的固體表面，只要該材料是足夠持久耐用的，并且是惰性的，能夠允許核酸13，102的測序反應(yīng)發(fā)生?？梢允褂玫谋砻?4，103的非限制性的例子包括玻璃、硅土、硅酸鹽、聚二甲基硅烷(PDMS)、銀或其他金屬包覆的表面、硝酸纖維素、尼龍、活化的石英、活化的玻璃、聚二氟偏二乙烯(PVDF)、聚苯乙烯、其他聚合物如聚氯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或聚二甲基硅氧烷和光敏聚合物，光敏聚合物含有光反應(yīng)物質(zhì)如氮賓、卡賓和能與核酸分子13，102形成共價連接的羰自由基(見美國專利號5,405,766和5,986,076)。
雙功能交聯(lián)劑可以在各種實(shí)施方案中被使用，例如連接核酸分子13，102到一個表面14，103?？梢愿鶕?jù)雙功能交聯(lián)劑的功能基團(tuán)的特異性將它們劃分，例如氨基、胍基、吲哚或羧基特異性基團(tuán)。其中，針對自由氨基的試劑更受歡迎，因?yàn)樗鼈冊谏虡I(yè)上可以獲得、合成簡便，而且能夠在溫和的反應(yīng)條件下應(yīng)用它們。用于交聯(lián)分子的典型方法公開在美國專利號5,603,872和5,401,511。交聯(lián)劑包括戊二醛(GAD)、雙功能環(huán)氧乙烷(OXR)、乙二醇二縮水甘油醚(EGDE)和碳二亞胺如1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)。
解構(gòu)試劑測序反應(yīng)涉及到將解構(gòu)試劑15，106結(jié)合到核酸分子13，102的自由端17，105，每一次移去一個核苷酸16，104。在某些實(shí)施方案中，反應(yīng)可由酶來催化，如外切核酸酶15，106。實(shí)施方案并不限制可以使用的外切核酸酶15，106的類型。可能用到的外切核酸酶15，106的非限制性的例子包括E.coli外切核酸酶I、III、V或VII，Bal 31外切核酸酶、綠豆外切核酸酶、S1核酸酶、E.coli DNA聚合酶I全酶或Klenow片段酶、RecJ、外切核酸酶T、T4或T7 DNA聚合酶、Taq聚合酶、外切核酸酶T7基因6、蛇毒磷酸二酯酶、脾磷酸二酯酶、海濱熱球菌(Thermococcus litoralis)DNA聚合酶、熱球菌屬(Pyrococcus sp.)GB-D DNA聚合酶、λ(lambda)外切核酸酶、S.aureus微球(micrococcal)核酸酶、脫氧核糖核酸酶(DNase)I、核糖核酸酶A、T1微球核酸酶或本領(lǐng)域已知的其他外切核酸酶。外切核酸酶15，106可以由商業(yè)來源獲得，如New England Biolabs(Beverly，MA)、Amersham Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)、Promega(Madison，WI)、Sigma Chemicals(St.Louis，MO)或Boehringer Mannheim(Indianapolis，IN)。
技術(shù)人員會明白，具有外切核酸酶15，106活性的酶有各種各樣的性質(zhì)，例如，它們能從核酸分子13，102的5’端、3’端或任意一端移去核苷酸16，104。它們可能對RNA、DNA或兩者具有特異性。它們的活性可能依賴于單鏈或雙鏈核酸13，102的使用。它們會不同程度的受到反應(yīng)介質(zhì)的各種因素(如鹽、溫度、pH或二價陽離子)的影響。各種外切核酸酶和聚合酶15，106的這些及其他的性質(zhì)在本領(lǐng)域是已知的。
技術(shù)人員會明白，可以操縱外切核酸酶15，106的活力，以與檢測單元18，107對核苷酸16，104的最佳分析速率相吻合。用于調(diào)整外切核酸酶15，106的活力的各種方法是已知的，包括調(diào)整反應(yīng)室11，101中的溫度、壓力、pH、鹽濃度或二價陽離子濃度。優(yōu)化外切核酸酶15，106的活性的方法在本領(lǐng)域是已知的。
標(biāo)記某些實(shí)施方案可以涉及將一標(biāo)記整合進(jìn)入核苷酸前體17，以方便檢測單元12對它們的測定。可以使用許多的不同標(biāo)記，如拉曼標(biāo)記、熒光團(tuán)、生色團(tuán)、放射性同位素、酶標(biāo)記、抗體、化學(xué)發(fā)光劑、電發(fā)光劑、親和標(biāo)記，等等。本領(lǐng)域技術(shù)人員會承認(rèn)，這些標(biāo)記及其他這里未提到的標(biāo)記成分可以在該公開方法中使用。
在涉及拉曼光譜的實(shí)施方案中使用的標(biāo)記如上所述。在其他實(shí)施方案中，可以使用的標(biāo)記體可以是熒光團(tuán)，如Alexa 350、Alexa 430、AMCA(7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸)、BODIPY(5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮雜-s-indacene-3-丙酸)630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL(熒光素)、BODIPY-R6G(6-羧基若丹明)、BODIPY-TMR(四甲基若丹明)、BODIPY-TRX(德克薩斯紅-X)、瀑布藍(lán)(CascadeBlue)、Cy2(青色素)、Cy3、Cy5，6-FAM(5-羧基熒光素)、熒光素、6-JOE(2’7’-二甲氧基-4’5’-二氯-6-羧基熒光素)、俄勒岡綠(OregonGreen)488、俄勒岡綠500、俄勒岡綠514、太平洋藍(lán)(Pacific Blue)、若丹明綠、若丹明紅、ROX(6-羧基-X-若丹明)、TAMRA(N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基若丹明)、四甲基若丹明和德克薩斯紅。熒光或發(fā)光標(biāo)記可以由標(biāo)準(zhǔn)的商業(yè)來源獲得，例如Molecular Probes(Eugene，OR)。
反應(yīng)室反應(yīng)室11，101被設(shè)計(jì)用來盛放水溶液中的固定化表面14，103、核酸分子13，102、解構(gòu)試劑15，106和核苷酸16，104。在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)室11，101被設(shè)計(jì)成可控溫的，例如整合進(jìn)帕爾帖元件(Pelletierelements)或使用本領(lǐng)域已知的其他方法。用于控制小體積液體溫度的方法屬于已知技術(shù)。(見，例如，美國專利號5,038,853，5,919,622，6,054,263和6,180,372。)在某些實(shí)施方案中，反應(yīng)室11，101和任何與之聯(lián)系的液體通道都可以用批制造工藝來制造，如同在計(jì)算機(jī)芯片制造或微毛細(xì)管芯片制造領(lǐng)域中已知的情況。上述液體通道如流動通路12或通道，它們可提供與一個廢物口、一個核酸13，102加載口或一個解構(gòu)試劑15，106來源的連接。在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)室11，101和該裝置10，100的其他組分如流動通路12可以制造為一個集成芯片。這樣的芯片可以用本領(lǐng)域已知的方法制造，如使用光平板印刷和蝕刻。然而，制造方法是不受限的，本領(lǐng)域已知的其他方法可以被使用，如激光切割、注塑、澆鑄或印刷技術(shù)。對于某些實(shí)施方案，可以使用用于超微電機(jī)械系統(tǒng)制造的方法。(見，例如，Craighead，Science 2901532-36，2000.)微細(xì)加工芯片可以在商業(yè)上獲得，來源如Caliper Technologies Inc.(MountainView，CA)和ACLARA BioSciences Inc.(Mountain View，CA)。
在一個非限制性的實(shí)施方案中，可將Borofloat玻璃片(PrecisionGlass & Opitics，Santa Ana，CA)在濃HF(氫氟酸)中預(yù)蝕刻一小段時間，然后在等離子體增強(qiáng)化學(xué)氣相淀積(PECVD)系統(tǒng)(PEII-A，TechnicsWest，San Jose，CA)中一無定形硅犧牲層沉積之前清洗。晶片可以用六甲基二硅氮烷(HMDS)涂底，然后用感光性樹脂(Shipley 1818，Marlborough，MA)旋涂并烘烤軟化?？梢允褂媒佑|掩模對準(zhǔn)器(QuintelCorp.San Jose，CA)將感光性樹脂層曝光于一種或多種掩模圖案，然后將曝光的感光性樹脂用Microposit developer concentrate(Shipley)和水除去。開發(fā)出來的晶片可以被烘烤硬化，然后在PECVD反應(yīng)器中用CF4(四氟甲烷)除去曝光的無定形硅?？梢杂脻釮F對晶片進(jìn)行化學(xué)蝕刻以制造出反應(yīng)室11，101、流動通路12和任何通道。剩余的感光樹脂可被剝?nèi)?，無定形硅也可除去。
可以用金剛石打孔鉆頭(Crystalite，Westerville，OH)在蝕刻的晶片上鉆打出接入孔洞。在一個可編程的真空爐(Centurion VPM，J.M.Ney，Yucaipa，CA)中，將蝕刻和鉆孔的平板熱鍵到同樣尺寸的平晶片上，便可得到一個完成了的芯片。在某些實(shí)施方案中，芯片可以通過將兩塊蝕刻平板結(jié)合在一起而制得。整合有一個反應(yīng)室11，101和流動通路12的芯片的可以選擇的典型加工方法公開在美國專利號5,867,266和6,214,246。
為了便于檢測單元18，107對核苷酸16，104進(jìn)行檢測，反應(yīng)室11，101和/或流動通路12的材料對于檢測單元18，107使用的激發(fā)和發(fā)射頻率處的電磁輻射而言，可以是可透過的。玻璃、硅以及在被拉曼光譜、熒光光譜、發(fā)光光譜或其他形式的光譜使用的頻率范圍內(nèi)通常是具有可透性的其他任何材料都可以被使用。在一些實(shí)施方案中，與檢測單元18，107相背的反應(yīng)室11，101和/或流動通路12表面可以用銀、金、鉑、銅、鋁或?qū)τ跈z測單元18，107相對不透光的其他材料覆蓋。在那種情況下，不透光材料可以用來增強(qiáng)拉曼或其他信號，例如使用表面增強(qiáng)拉曼光譜，而且不會干擾檢測單元18，107的功能。可選擇的是，包含有銀、金、鉑、銅或鋁的網(wǎng)格可以放置在反應(yīng)室11，101和/或流動通路12內(nèi)。技術(shù)人員會意識到，在涉及流動通路12的實(shí)施方案中，核苷酸16通常是在它們處于流動通路12中時被檢測。在沒有流動通路12的實(shí)施方案中，核苷酸104是在反應(yīng)室101中被檢測。
在各種實(shí)施方案中，反應(yīng)室11，101的內(nèi)部體積可以是約1皮升、約2皮升、約5皮升、約10皮升、約20皮升、約50皮升、約100皮升、約250皮升、約500皮升、約1納升、約2納升、約5納升、約10納升、約20納升、約50納升、約100納升、約250納升、約500納升、約1微升、約2微升、約5微升、約10微升、約20微升、約50微升、約100微升、約250微升、約500微升或約1毫升。
流動通路在某些實(shí)施方案中，自由核苷酸16沿著一個流動通路12移動并通過檢測單元18。用于運(yùn)送自由核苷酸16的技術(shù)的非限制性實(shí)例包括微流體技術(shù)。流動通路12可包含一個微毛細(xì)管(例如，從ACLARABioSciences Inc.，Mountain View，CA獲得)或一個液相集成電路(例如，Caliper Technologies Inc.，Mountain View，CA)。這樣的微流體平臺只需要幾納升的樣品。
在某些實(shí)施方案中，將被檢測的自由核苷酸16通過溶劑的整體流動沿著流動通路12運(yùn)動。在其他實(shí)施方案中，可以使用微毛細(xì)管電泳運(yùn)送自由核苷酸16，使它們沿著流動通路12運(yùn)動并通過檢測單元18。微毛細(xì)管電泳通常涉及使用很細(xì)的毛細(xì)管或通道，其中可以充有或不充有特定的分離介質(zhì)。帶有適當(dāng)電荷的物質(zhì)可以在施加的電場作用下發(fā)生電泳，例如當(dāng)裝置的反應(yīng)室11一側(cè)和檢測單元18一側(cè)分別加上負(fù)電和正電時，帶負(fù)電的核苷酸16便會發(fā)生電泳。盡管電泳常常是用來對同時加到微毛細(xì)管中的混合組分進(jìn)行大小分離，但是它也可以用來運(yùn)送先后加入到流動通路12的大小類似的核苷酸16。因?yàn)猷堰屎塑账?A、G)16比嘧啶核苷酸(C、T、U)16大，所以前者遷移得更慢，這樣的話，流動通路12的長度和對應(yīng)的通過檢測單元18的時間應(yīng)該盡量小，以防止有差異的遷移將核酸13上核苷酸16的釋放次序混淆起來。作為選擇，可以對填充在微毛細(xì)管中的分離介質(zhì)進(jìn)行選擇，由此使嘌呤和嘧啶核苷酸16以相近或相同的遷移速率沿著流動通路12運(yùn)動。微毛細(xì)管電泳方法已經(jīng)被公開，例如Woolley and Mathies(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9111348-352，1994)。
包括微毛細(xì)管電泳器件在內(nèi)的微流體器件的微加工已經(jīng)被討論，例如，Jacobsen等(Anal.Biochem，209278-283，1994)；Effenhauser等(Anal.Chem.662949-2953，1994)；Harrison等(Science261895-897，1993)和美國專利號5,904,824。典型地，這些方法包括在石英、硅或其他晶體襯底或基片上用照相平版印刷法蝕刻出微米級通道，這些方法很具有適用性。在一些實(shí)施方案中，微毛細(xì)管可以用制造反應(yīng)室11，101時所用的同種聚合材料來加工，其中使用注塑或本領(lǐng)域已知的其他技術(shù)。
檢測單元涉及拉曼光譜的實(shí)施方案在一些實(shí)施方案中，檢測單元18，107被設(shè)計(jì)成利用拉曼光譜學(xué)對核苷酸16，104進(jìn)行檢測和定量。利用拉曼光譜學(xué)檢測核苷酸16，104的各種方法在本領(lǐng)域是已知的。(見，例如，美國專利號5,306,403；6,002,471；6,174,677)。關(guān)于表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)或表面增強(qiáng)共振拉曼光譜(SERRS)的變化已經(jīng)公開。在SERS和SERRS中，對于吸附在粗糙金屬表面如銀、金、鉑、銅或鋁表面上的分子，拉曼檢測的靈敏度可提高106或更多倍數(shù)。
拉曼檢測單元18，107的一個非限制性的實(shí)施方案公開在美國專利號6,002,471。在這個實(shí)施方案中，激發(fā)光束20，110由釹:釔鋁石榴石(Nd:YAG)激光器19，108產(chǎn)生，波長為532nm；或者由鈦:藍(lán)寶石(Ti:sapphire)激光器19，108產(chǎn)生，波長為365nm。可以使用脈沖激光束20，110或連續(xù)激光束20，110。激發(fā)光束20，110經(jīng)過共聚焦光學(xué)元件和顯微物鏡，然后聚焦在流動通路12或反應(yīng)室101上。來自核苷酸16，104的拉曼發(fā)射光由顯微物鏡和共聚焦光學(xué)元件收集，然后偶聯(lián)到單色儀上進(jìn)行光譜分離。共聚焦光學(xué)元件用作降低背景信號，包括雙色濾片、二次濾片、共聚焦孔、透鏡和平面鏡。標(biāo)準(zhǔn)的全視場光學(xué)元件可以同共聚焦光學(xué)元件一起使用。拉曼發(fā)射信號由拉曼檢測器21，109檢測。該檢測器21，109包括與一臺用于信號計(jì)數(shù)和數(shù)字化的計(jì)算機(jī)相連接的雪崩光電二極管。在某些實(shí)施方案中，在流動通路12或反應(yīng)室101中放置了包含有銀、金、鉑、銅或鋁的網(wǎng)格，這樣便會因表面增強(qiáng)拉曼或表面增強(qiáng)拉曼共振而得到增強(qiáng)的信號。
已公開的可供選擇的檢測單元18，107的實(shí)施方案如美國專利號5,306,403，其中包括了Spex Model 1403雙柵分光光度計(jì)21，109，并配有砷化鎵光電倍增管(RCA Model C31034或Burle Industries ModelC3103402)，它以單光子計(jì)數(shù)模式運(yùn)作。激發(fā)源19，108是來自SpectraPhysics的514.5nm線氬離子激光器19，108，Model 166，和氪離子激光器19，108(Innova 70，Coherent)的647.1nm線。
作為選擇的激發(fā)源19，108包括337nm的氮激光器19，108(LaserScience Inc.)和325nm的氦-鎘激光器19，108(Liconox)(美國專利號6,174,677)。激發(fā)光束20，110經(jīng)過帶通濾波器(Corion)處理成為單色光，然后該光束可以用6×接物透鏡(Newport，Model L6×)聚焦到流動通路12或反應(yīng)室101上?？梢杂媒游锿哥R來激發(fā)核苷酸16，104和收集拉曼信號，其中使用到全息光束分離器(Kaiser Optical Systems，Inc.，Model HB 647-26N18)，以對激發(fā)光束20，110和發(fā)射的拉曼信號進(jìn)行直角解析。可以使用全息階式濾波器(Kaiser Optical Systems，Inc.)來減少瑞利散射。作為選擇的拉曼檢測器21，109包括ISA HR-320光譜攝制儀，配有紅增強(qiáng)放大電荷耦合器件(RE-ICCD)檢測系統(tǒng)(Princeton Instruments)?？梢允褂闷渌愋偷臋z測器21，109，如電荷注入元件、光電二極管陣列或光電晶體管陣列。
本領(lǐng)域已知的任何具有適當(dāng)形式或結(jié)構(gòu)的拉曼光譜或相關(guān)技術(shù)都可以用來檢測核苷酸16，104，包括但不限于常規(guī)拉曼散射、共振拉曼散射、表面增強(qiáng)拉曼散射、表面增強(qiáng)共振拉曼散射、相干反斯托克斯拉曼光譜(CARS)、受激拉曼散射、反拉曼光譜、受激獲得拉曼光譜、超拉曼散射、分子光學(xué)激光檢測器(MOLE)或拉曼顯微探針或拉曼顯微鏡或共聚焦拉曼微光譜測定法、三維或掃描拉曼、拉曼飽和光譜學(xué)、時間分辨共振拉曼、拉曼退耦光譜學(xué)或紫外-拉曼顯微鏡。
涉及FRET的實(shí)施方案在某些作為選擇的實(shí)施例中，核苷酸16，104可以用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)來確定和定量。FRET是一種可用來檢測檢測一個供體分子(donor molecule)和一個受體分子(acceptor molecule)之間距離的光譜學(xué)現(xiàn)象。所選擇的供體和受體對應(yīng)該滿足供體的熒光發(fā)射與受體的激發(fā)光譜有重疊。在兩個分子結(jié)合在一起時(距離少于100埃)，供體的激發(fā)態(tài)能量非輻射地轉(zhuǎn)移給受體，同時供體的發(fā)射淬滅。假如受體分子是一個熒光團(tuán)，那么它的發(fā)射會增強(qiáng)。用于關(guān)于寡聚核苷酸的FRET的組合物和方法在本領(lǐng)域是已知的(例如，美國專利號5,866,366)。
常被用作FRET的標(biāo)記的分子包括熒光素、5-羧基熒光素(FAM)、2’7’-二甲氧基-4’5’-二氯-6-羧基熒光素(JOE)、若丹明、6-羧基若丹明(R6G)、N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基若丹明(TAMRA)、6-羧基-X-若丹明(ROX)、4-(4’-二甲基氨基苯氮)安息香酸(DABCYL)和5-(2’-氨乙基)氨基萘-1-磺酰酸(EDANS)。其他可能的FRET供體和受體分子在本領(lǐng)域是已知的(見美國專利號5,866,336，表1)。技術(shù)人員能熟悉地選擇用于FRET的成對標(biāo)記分子(美國專利號5,866,336)。
在涉及FRET的實(shí)施方案中，供體和受體分子可以共價或非共價地連接到測序裝置10，100的各種組分上。在某些實(shí)施方案中，供體和受體分子可以連接到核苷酸16，104、外切核酸酶15，106或流動通路12。
在一些實(shí)施方案中，供體分子可以連接到外切核酸酶15，106或流動通路12的表面，而受體分子連接到核苷酸16，104上。在這種情況下，每種核苷酸16，104應(yīng)該連接到具有可區(qū)分的發(fā)射光譜的一種受體分子上，而選擇的供體分子應(yīng)該具有寬范圍的發(fā)射光譜，該光譜范圍能夠覆蓋所有四種受體分子的激發(fā)光譜。在外切核酸酶15，106或流動通路12上可以存在多個供體分子，盡管在其他實(shí)施例中可以只有一個供體分子。
一受到激發(fā)，供體分子將把它們的能量轉(zhuǎn)移給連接在核苷酸16，104上的受體標(biāo)記分子，并由此得到來自受體分子的增強(qiáng)的發(fā)射信號。因?yàn)樾盘栐鰪?qiáng)的程度會隨距離增大迅速降低，所以對于距離供體分子非常近的核苷酸16，204，會有最大的信號增強(qiáng)出現(xiàn)。如果一個供體分子連接到外切核酸酶15，106的催化位點(diǎn)，或靠近催化位點(diǎn)，那么具有最強(qiáng)發(fā)射信號的核苷酸16，104將是那些位于外切核酸酶15，106的催化位點(diǎn)的核苷酸16，104。供體分子的連接位置應(yīng)該靠近催化位點(diǎn)，但是在這個位置它不能干擾解構(gòu)試劑15，106的外切核酸酶活性。在某些實(shí)施方案中，供體分子連接到流動通路12的表面，并且連接位置是激發(fā)光束20的聚焦處，這樣，只有那些位于激發(fā)光束20的焦點(diǎn)內(nèi)的核苷酸16能夠給出可檢測的熒光信號?？梢赃x擇激發(fā)光束20，110的波長來最大程度的激發(fā)供體分子，而較弱地激發(fā)受體分子。當(dāng)每個核苷酸16，104從核酸分子13，102上移去時，就可檢測到來自供體標(biāo)記的信號。
在某些實(shí)施方案中，可以使用本領(lǐng)域已知的方法將待測序的核酸分子13，102放置在一個熒光顯微鏡的視場內(nèi)，例如通過使用光捕獲(例如，美國專利號6,136,543)?？梢允褂玫臒晒怙@微鏡的非限制性的例子是反式相襯和入射光熒光顯微鏡(IMT2-RFC，Olympus Co.，Ltd.)，其中使用了100倍油鏡(Plan.Multidot.Apochromat.Times.100，1.40 NA，Olympus Co.，Ltd.)。如上所述，激發(fā)光束20，110可由激光器19，108發(fā)出。熒光發(fā)射可以通過接物透鏡并使用合適的濾片來收集，然后由靈敏的熒光檢測器21，109檢測，例如CCD器件、光電二極管、光電倍增管或等效物。
信息處理和控制系統(tǒng)及數(shù)據(jù)分析在某些實(shí)施方案中，核酸測序裝置10，100可以包含一個信息處理系統(tǒng)。實(shí)施方案并不限制所使用的信息處理系統(tǒng)的類型。一個典型的信息處理系統(tǒng)可以整合一臺含有用于信息交流的總線的計(jì)算機(jī)和一個用于信息處理的處理器。在一個實(shí)施方案中，處理器可以選自Pentium系列處理器，包括但不局限于Pentium II系列、Pentium III系列和Pentium 4系列處理器，它們可以Intel Corp.(Santa Clara，CA)獲得。在作為選擇的實(shí)施方案中，處理器可以是Celeron、Itanium或Pentium Xeon 處理器(Santa Clara，CA)。在各種其他實(shí)施例中，處理器可以基于Intel 結(jié)構(gòu)，如Intel IA-32或Intel IA-64結(jié)構(gòu)。作為選擇，可以使用其他處理器。
該計(jì)算機(jī)可以進(jìn)一步包含一個隨機(jī)存儲器(RAM)或其他動態(tài)存儲器件、一個只讀存儲器(ROM)和/或其他靜態(tài)存儲器，以及一個數(shù)據(jù)存儲器件如磁盤或光盤和它們對應(yīng)的驅(qū)動。該信息處理和控制系統(tǒng)也可包含本領(lǐng)域已知的其他外圍設(shè)備，如一個顯示器(如陰極射線管或液晶顯示器)、一個文字輸入設(shè)備(如鍵盤)、一個光標(biāo)控制設(shè)備(如鼠標(biāo)、跟蹤球或光標(biāo)方向鍵)和一個通訊設(shè)備(如調(diào)制解調(diào)器、網(wǎng)絡(luò)接口卡或用于連接以太網(wǎng)、令牌網(wǎng)或其他類型網(wǎng)絡(luò)的接口設(shè)備)。
在特定的實(shí)施方案中，檢測單元18，107在操作上也可與信息處理系統(tǒng)連接。來自檢測單元18，107的數(shù)據(jù)可由處理器處理，然后數(shù)據(jù)儲存在主存儲器。關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)核苷酸16，104的發(fā)射剖圖的數(shù)據(jù)也可儲存在主存儲器或ROM中。處理器可以比較反應(yīng)室101或流動通路12中核苷酸16，104的發(fā)射光譜，以確定從核酸分子13，102上釋放的核苷酸16，104的類型。主存儲器也可以儲存從核酸分子13，102上釋放的核苷酸16，104的順序。處理器可以分析這些來自檢測單元18，107的數(shù)據(jù)，以確定核酸13，102的序列?？梢钥紤]在某些實(shí)施過程中使用一個不同配置的信息處理系統(tǒng)。所以，在不同的實(shí)施方案中系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)可以不同。
應(yīng)該注意到，在作為選擇的實(shí)施方案中，當(dāng)這里所述的處理過程在一個程序控制的處理器的控制下進(jìn)行時，該處理可以完全或部分的由可編程或硬編碼邏輯來實(shí)施，例如現(xiàn)場可編程門陣列(FPGAs)、TTL邏輯或?qū)Ｓ眉呻娐?ASICs)。另外，可以通過程序控制的通用計(jì)算機(jī)組分和/或客戶硬件組分的任意組合來實(shí)施被公開的方法。
在數(shù)據(jù)收集操作之后，數(shù)據(jù)通常會被報(bào)告給一個數(shù)據(jù)分析操作。為了方便分析操作，由檢測單元18，109獲得的數(shù)據(jù)通常是使用一臺數(shù)字計(jì)算機(jī)來分析，如上所述。典型地，計(jì)算機(jī)被恰當(dāng)?shù)鼐幊桃越邮芎痛鎯τ蓹z測單元18，109獲得的數(shù)據(jù)，以及分析和報(bào)告收集到的數(shù)據(jù)。
在某些實(shí)施方案中，可以使用客戶定制軟件包來分析由檢測單元18，109獲得的數(shù)據(jù)。在作為選擇的實(shí)施方案中，可以使用信息處理系統(tǒng)及可公開利用的軟件包來實(shí)施數(shù)據(jù)分析?？捎糜贒NA序列分析的軟件的非限制性的例子包括PRISMTMDNA測序分析軟件(AppliedBiosystems，F(xiàn)oster City，CA)、SequencherTM軟件包(Gene Codes，AnnArbor，MI)和通過國家生物技術(shù)信息機(jī)構(gòu)獲得的各種軟件包，網(wǎng)址為www.nbif.org/links/1.4.1.php。
權(quán)利要求
1.一種裝置，包括a)含有固定化表面的反應(yīng)室，該固定化表面連接著單個核酸分子；b)與反應(yīng)室相連的流動通路；和c)檢測單元，含括激發(fā)源和拉曼光譜檢測器。
2.權(quán)利要求1的裝置，其中激發(fā)源是激光器。
3.權(quán)利要求1的裝置，其中拉曼檢測器是分光計(jì)或單色儀。
4.權(quán)利要求1的裝置，進(jìn)一步包括(i)信息處理系統(tǒng)；和(ii)數(shù)據(jù)庫。
5.權(quán)利要求1的裝置，其中固定化表面是磁珠、非磁性珠、圓錐形表面、平表面或曲表面。
6.權(quán)利要求1的裝置，其中流動通路包括微毛細(xì)管或芯片中的一個或多個微通道。
7.權(quán)利要求1的裝置，其中流動通路的一部分被銀、金、鉑、銅或鋁包覆。
8.權(quán)利要求1的裝置，其中流動通路含有銀、金、鉑、銅或鋁網(wǎng)格。
9.權(quán)利要求1的裝置，進(jìn)一步包括解構(gòu)試劑。
10.一種裝置，包括a)含有固定化表面的反應(yīng)室，該固定化表面連接著單個核酸分子；和b)檢測單元，包括激發(fā)源和拉曼光譜檢測器。
11.權(quán)利要求10的裝置，進(jìn)一步包括(i)信息處理系統(tǒng)；和(ii)數(shù)據(jù)庫。
12.權(quán)利要求10的裝置，其中激發(fā)源是激光器。
13.權(quán)利要求10的裝置，其中拉曼檢測器是分光計(jì)或單色儀。
14.權(quán)利要求10的裝置，其中固定化表面是磁珠、非磁性珠、圓錐形表面、平表面或曲表面。
15.權(quán)利要求10的裝置，反應(yīng)室中進(jìn)一步含有銀、金、鉑、銅或鋁網(wǎng)格。
16.權(quán)利要求10的裝置，進(jìn)一步包括解構(gòu)試劑。
17.一種測定核酸序列的方法，包括a)制備單個模板分子，在反應(yīng)室中該核酸分子的一端連接到固定化表面；b)從核酸分子的未連接端按順序地移去核苷酸；c)將核苷酸與核酸分子分離開；和d)利用拉曼光譜學(xué)檢測核苷酸。
18.權(quán)利要求17的方法，其中利用外切核酸酶活性從核酸分子的未連接端移去核苷酸。
19.權(quán)利要求17的方法，其中在核苷酸從核酸分子上移走之后，每個核苷酸被連接上一個標(biāo)記分子。
20.權(quán)利要求17的方法，其中利用表面增強(qiáng)拉曼散射、表面增強(qiáng)共振拉曼散射、受激拉曼散射、反拉曼、受激獲得拉曼光譜學(xué)、超拉曼散射或相干反斯托克斯拉曼散射來檢測核苷酸。
21.一種測定核酸序列的方法，包括a)制備單個模板分子，在反應(yīng)室中該核酸分子的一端連接到固定化表面；b)從核酸分子的未連接端按順序地移去核苷酸；c)利用拉曼光譜學(xué)對反應(yīng)室中的核苷酸進(jìn)行定量。
22.權(quán)利要求21的方法，其中利用外切核酸酶活性從核酸分子的未連接端移去核苷酸。
23.權(quán)利要求21的方法，其中在核苷酸從核酸分子上移走之后，每個核苷酸被連接上一個標(biāo)記分子。
24.權(quán)利要求21的方法，其中利用表面增強(qiáng)拉曼散射、表面增強(qiáng)共振拉曼散射、受激拉曼散射、反拉曼、受激獲得拉曼光譜學(xué)、超拉曼散射或相干反斯托克斯拉曼散射來檢測核苷酸。
25.一種測定核酸序列的方法，包括a)制備單個模板分子，在反應(yīng)室中該核酸分子的一端連接到固定化表面；b)從核酸分子的未連接端按順序地移去核苷酸；和c)利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)光譜學(xué)檢測核苷酸。
26.權(quán)利要求25的方法，其中在核苷酸從核酸分子上移走之后，這些核苷酸被連接到受體分子上。
27.權(quán)利要求26的方法，其中利用外切核酸酶移去這些核苷酸。
28.權(quán)利要求27的方法，其中一個或多個供體分子連接到外切核酸酶上。
全文摘要
這里公開的方法、裝置和組合物是用于核酸序列測定。更具體地說，該方法和裝置涉及通過以下方法對單鏈DNA或RNA的單個分子進(jìn)行測序，即將該分子暴露于外切核酸酶活性，每一次從核酸的一端移去一個自由核苷酸，然后利用拉曼光譜學(xué)或熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)確定被釋放的核苷酸。
文檔編號B01L3/00GK1556861SQ02818650
公開日2004年12月22日 申請日期2002年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月24日
發(fā)明者V·拉奧, G·紐鮑爾, S·柯奇, M·山川, A·伯林, V 拉奧 申請人:英特爾公司