專利名稱：單分子實(shí)時測序裝置、核酸分析裝置和單分子實(shí)時測序方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸序列解析方法和核酸序列解析裝置。更具體而言，涉及用于解讀 例如DNA或RNA等核酸的堿基序列的方法和裝置。
背景技術(shù)：
1990年至2005年間，投入30億美元預(yù)算的人類基因組計(jì)劃已經(jīng)比預(yù)定提前2 3年讀取出最容易解讀的部分(全體的93% )，正如非專利文獻(xiàn)1所述，解讀所必需的技術(shù) 和方法已經(jīng)作為一種遺產(chǎn)保留下來。這一技術(shù)在之后不斷進(jìn)行改進(jìn)，時至今日，用約2000 萬美元($2X107)左右已經(jīng)能夠以實(shí)用的精度解讀基因組。即便如此，能用該金額實(shí)現(xiàn)大 規(guī)模堿基序列解讀的仍僅限于專門解讀中心或獲得巨額預(yù)算的大型研究計(jì)劃。但是，若能 夠降低序列測定成本，則大多能夠處理更大量的基因組。例如使患者和健康人群的基因組 的比較成為可能，從而能期待基因組信息價值的提高。如非專利文獻(xiàn)2所示，預(yù)計(jì)這類基礎(chǔ) 數(shù)據(jù)的取得將大大有助于未來向定制(tailor made)醫(yī)療的發(fā)展。上述現(xiàn)狀下，美國國立衛(wèi)生研究所(NIH)出資援助的用于“革新的基因組序列 測定技術(shù)”的2個計(jì)劃的目標(biāo)是，至2009年解讀1個人的人類基因組降至10萬美元 ($1 XlO5)，并且使其在2014年前降至1000美元($1X103)。正在開發(fā)“ 1000美元基因組” 解讀技術(shù)。如非專利文獻(xiàn)3所述，目前幾種新一代序列分析儀已經(jīng)商品化。這些技術(shù)已能實(shí) 現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)的1/10 1/100的成本。此外，通過1次解析能測定的堿基數(shù)也達(dá)到IO9級。 然而，這些序列分析儀在成本方面的改善基本上達(dá)到極限，預(yù)計(jì)很難利用已商品化的裝置、 方式實(shí)現(xiàn)$1000基因組。此外，目前銷售的新一代序列分析儀雖能解讀直至IO9左右的堿基序列，但是，僅 是對IO9左右的大量數(shù)據(jù)進(jìn)行序列解讀的運(yùn)行時間(rim time)就需要2、3天以上的時間。 為了在醫(yī)療現(xiàn)場使個人水平的基因組序列解讀成為日常工作，則不僅是成本方面的改良， 還需要序列解讀的高速化。這種狀況下，備受期待的最有希望的測序技術(shù)之一是單分子實(shí)時測序法。其為對 酶反應(yīng)的現(xiàn)場直接以單分子水平進(jìn)行實(shí)時測定的方法。單分子實(shí)時測序法中，在堿基進(jìn)行 延伸時實(shí)時進(jìn)行熒光檢測。因此，能夠飛速進(jìn)行堿基序列解讀。此外，單分子實(shí)時測序法中， 無需利用PCR對試樣進(jìn)行擴(kuò)增，能大幅降低成本。因此，單分子實(shí)時測序法被視為最有希望 實(shí)現(xiàn)1000美元基因組的技術(shù)之一。非專利文獻(xiàn)4中公開了一種單分子實(shí)時測序法。該文獻(xiàn)中采用的方法為將用供 體熒光體修飾過的聚合酶固定在基板上，隨著核酸的延伸反應(yīng)，熒光能量向受體-核苷酸 轉(zhuǎn)移，對該熒光能量轉(zhuǎn)移進(jìn)行測量。此外，作為控制在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的各種生化過程、進(jìn)行實(shí)時解析的技術(shù)，可列舉出籠 鎖化合物?；\鎖化合物是將生理活性分子用光分解性保護(hù)基修飾使其暫時失去活性的物質(zhì)的總稱。按照使生理活性進(jìn)入籠(cage)中并休眠的分子這一意思而命名為籠鎖化合物 (caged compounds)。當(dāng)對籠鎖化合物照射最適合該化合物的波長的光時，在被光照的瞬 間、僅在被照射的地方保護(hù)基脫除，從而表現(xiàn)原有的生理活性。即，能通過光照控制化學(xué)反 應(yīng)的時間、空間動力學(xué)。專利文獻(xiàn)1、2中為制備寡核苷酸池而使用了籠鎖化合物。但該方 法是使用逐次反應(yīng)、使末端所結(jié)合的籠鎖化合物隨著反應(yīng)而依次分解的方法。因此，該方法 無法用于實(shí)時解析。此外，該方法的對象是多分子而非單分子。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn) 專利文獻(xiàn)1 日本特表2006-503586專利文獻(xiàn)2 :US 2007/0059692非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1 =Nature Reviews (自然評論)，vol5, pp335,2004非專利文獻(xiàn)2 :《t卜y 7 Λ完全解読力、^「t卜」理解 》(從人類基因組完全解 讀到理解“人類”)、pp253，服部正平、東洋書店、2005非專利文獻(xiàn)3 :Nature(自然)，voll. 449，pp627，2007非專利文獻(xiàn) 4 《Next-Generateion Sequencing :Scientific and Commercial Implications of the $1,000 Genome》(新一代測序技術(shù)$1, 000基因組的科學(xué)和商業(yè)上 的關(guān)聯(lián))，Kevin Davies, pp41, Insight Pharma Reports非專利文獻(xiàn)5 :Anal. Chem. vol. 78,6238-6245非專利文獻(xiàn)6 :Nanotechnology (納米科技)，2007，vol. 18，pp 44017-44021.非專利文獻(xiàn)7 =Nano Letters (納米快報(bào))· 2004，vol. 4，957-96
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題作為單分子實(shí)時測序法的課題，可舉出延伸反應(yīng)開始的控制。通常，在延伸反應(yīng) 中，通過物鏡以CCD相機(jī)檢測來自固定在基板上的單分子發(fā)出的熒光。然而，物鏡能觀察的 視野有限，因而無法一次性觀察基板整面。另一方面，實(shí)時反應(yīng)中，在注入反應(yīng)液的同時，延 伸反應(yīng)即開始。因此，需要構(gòu)建僅在物鏡能觀察的基板區(qū)域內(nèi)使延伸反應(yīng)開始、在其它區(qū)域 內(nèi)不進(jìn)行反應(yīng)的反應(yīng)體系。為實(shí)現(xiàn)該目的，考慮了如下方法將流動池(flow cell)分成多 個反應(yīng)場，對這些反應(yīng)場獨(dú)立或依次輸送反應(yīng)液。但是，為解讀人類基因組，需要數(shù)百以上 的反應(yīng)場，必須制作復(fù)雜的流路。此外，為準(zhǔn)確地對多個反應(yīng)場獨(dú)立或依次輸送液體，需要 多臺高性能泵。并且，由于發(fā)生壓力損失、產(chǎn)生氣泡、產(chǎn)生作為測定噪音的雜質(zhì)等問題，可以 預(yù)想，對多個反應(yīng)場獨(dú)立或依次穩(wěn)定地輸送液體是極其困難的。進(jìn)而，還存在復(fù)雜的流路和 多個泵使成本變高的缺點(diǎn)。因此，尋求不制作復(fù)雜的流路、僅在基板內(nèi)的目標(biāo)區(qū)域內(nèi)開始延 伸反應(yīng)的方法論。本發(fā)明的目的涉及在基板內(nèi)的目標(biāo)區(qū)域內(nèi)選擇性控制延伸反應(yīng)。解決問題的手段本發(fā)明將在其末端配置有籠鎖化合物的寡探針固定在基板內(nèi)的反應(yīng)場區(qū)域。在包 含反應(yīng)場區(qū)域的流動池內(nèi)注入反應(yīng)液后，僅對反應(yīng)場區(qū)域照射光，使固定在該反應(yīng)場區(qū)域內(nèi)的寡探針末端的光分解活性保護(hù)基解離，選擇性控制聚合酶的延伸反應(yīng)的開始。在流動 池內(nèi)，在基板上以一定間隔配置有多個反應(yīng)場區(qū)域。使固定在可動載臺(migration stage) 上的流動池移動相鄰的反應(yīng)場區(qū)域的距離的量，照射光，連續(xù)進(jìn)行延伸反應(yīng)的測定。通過重 復(fù)該動作，在流動池內(nèi)既不使用復(fù)雜的流路、也不進(jìn)行反應(yīng)液的更換而穩(wěn)定地測定堿基延 伸反應(yīng)。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，能夠?qū)崟r測定堿基延伸反應(yīng)而不必使用由復(fù)雜的流路構(gòu)成的流動池 和輸送液體機(jī)構(gòu)。此外，由于采用簡單的流路體系，因而能夠預(yù)先防止隨著輸送液體而在流 路內(nèi)產(chǎn)生氣泡、產(chǎn)生雜質(zhì)、和漏液等問題；此外，還能夠降低流動池制作成本。


圖1是表示流動池結(jié)構(gòu)的基本構(gòu)成的示意圖；圖2是關(guān)于實(shí)時堿基延伸反應(yīng)的控制法的說明圖；圖3是關(guān)于寡探針的化學(xué)結(jié)構(gòu)的說明圖；圖4是關(guān)于使用利用照射光的延伸反應(yīng)控制法的裝置構(gòu)成的說明圖；圖5是實(shí)時延伸反應(yīng)的流程圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例公開了一種單分子實(shí)時測序裝置，其具有具有阻礙核酸延伸反應(yīng)的光分 解性物質(zhì)的核酸探針；配置有多個該核酸探針的反應(yīng)場區(qū)域；設(shè)有多個該反應(yīng)場區(qū)域的流 路；對前述流路供給用于核酸延伸反應(yīng)的試劑的試劑供給機(jī)構(gòu)；對目標(biāo)的反應(yīng)場區(qū)域照射 瞬逝光(Evanescent light)并檢測產(chǎn)生的熒光的激發(fā)光學(xué)系統(tǒng)；對目標(biāo)的反應(yīng)場區(qū)域照 射使前述光分解性物質(zhì)分解的光的反應(yīng)控制光學(xué)系統(tǒng)。此外，實(shí)施例公開了一種核酸分析裝置，其具有核酸分析器件，該器件具有與靶 核酸雜交但不照射UV光則不進(jìn)行核酸延伸反應(yīng)的核酸探針、配置有多個與不同的靶核酸 雜交的前述核酸探針的反應(yīng)場區(qū)域、設(shè)有多個該反應(yīng)場區(qū)域且能夠保持用于核酸反應(yīng)的試 劑的流路；激發(fā)光學(xué)系統(tǒng)，其對目標(biāo)的反應(yīng)場區(qū)域照射瞬逝光并檢測產(chǎn)生的熒光；反應(yīng)控 制光學(xué)系統(tǒng)，其對前述目標(biāo)的反應(yīng)場區(qū)域照射使前述光分解性物質(zhì)分解的UV光；載臺驅(qū)動 機(jī)構(gòu)，其使核酸分析器件相對于前述激發(fā)光光學(xué)系統(tǒng)和前述反應(yīng)控制光學(xué)系統(tǒng)相對移動而 使得能夠?qū)δ繕?biāo)的反應(yīng)場區(qū)域照射瞬逝光和UV光。此外，實(shí)施例公開了一種單分子實(shí)時測序方法，準(zhǔn)備具有阻礙核酸延伸反應(yīng)的光 分解性物質(zhì)的核酸探針和設(shè)有多個配置有多個該核酸探針的反應(yīng)場區(qū)域的流路，對前述流 路供給靶核酸和用于核酸延伸反應(yīng)的試劑，對目標(biāo)的反應(yīng)場區(qū)域照射使前述光分解性物質(zhì) 分解的UV光，對前述目標(biāo)的反應(yīng)場區(qū)域照射瞬逝光，檢測產(chǎn)生的熒光，使前述流路相對于 照射前述UV光的反應(yīng)控制光學(xué)系統(tǒng)和產(chǎn)生前述瞬逝光的激發(fā)光光學(xué)系統(tǒng)進(jìn)行相對移動， 對不同的反應(yīng)場區(qū)域照射使前述光分解性物質(zhì)分解的UV光，對前述不同的反應(yīng)場區(qū)域照 射瞬逝光，檢測產(chǎn)生的熒光。此外，實(shí)施例公開了 其中，光分解性物質(zhì)為在核酸探針的末端進(jìn)行修飾的光分解 性保護(hù)基。
此外，實(shí)施例公開了 其中，光分解性保護(hù)基為2-硝基芐基型、癸基苯甲酰甲基 型、或香豆?；谆?Coumarinyl Methyl)型物質(zhì)。此外，實(shí)施例公開了 其中，產(chǎn)生熒光增強(qiáng)場的金屬結(jié)構(gòu)體對應(yīng)于各核酸探針配置 在反應(yīng)區(qū)域場。此外，實(shí)施例公開了一種試劑，其含有用通過瞬逝光而產(chǎn)生各自不同的熒光的4 色熒光染料標(biāo)記的四種脫氧核糖核苷酸dATP、dCTP、dTTP、dGTP、和進(jìn)行核酸延伸反應(yīng)的酶。此外，實(shí)施例公開了 其中，激發(fā)光學(xué)系統(tǒng)為全反射照射波長420nm SOOnm的范 圍的可見光而產(chǎn)生瞬逝光的系統(tǒng)。此外，實(shí)施例公開了 其中，反應(yīng)控制光學(xué)系統(tǒng)為照射波長250 400nm的范圍的 UV光的系統(tǒng)。此外，實(shí)施例公開了 其中，反應(yīng)控制光學(xué)系統(tǒng)對目標(biāo)的反應(yīng)區(qū)域場照射光后，移 動流路，使不同的反應(yīng)區(qū)域場進(jìn)入反應(yīng)控制光學(xué)系統(tǒng)的視野。此外，實(shí)施例公開了一種反應(yīng)控制裝置，其具有作為測定對象的單一的分子；保 持前述單一分子的金屬結(jié)構(gòu)體；規(guī)則地配置有前述金屬結(jié)構(gòu)體的區(qū)域；規(guī)則地配置有前述 區(qū)域的流路；配置有一條以上前述流路的基板；含有與前述單一分子相互作用的化學(xué)物質(zhì) 的反應(yīng)溶液；阻礙前述單一分子和前述反應(yīng)溶液內(nèi)的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)的光分解性物 質(zhì)；解除前述光分解性物質(zhì)的阻礙而在局部使前述單一分子和前述反應(yīng)溶液開始相互作用 的手段；使前述基板移動的手段；對前述流路供給前述反應(yīng)溶液的手段。此外，實(shí)施例公開了 其中，前述單一分子是作為DNA或RNA的核酸，前述單一分子 的保持是利用與固定在前述金屬結(jié)構(gòu)體的前述單一分子的互補(bǔ)鏈的雜交而進(jìn)行的，前述光 分解性物質(zhì)是在前述互補(bǔ)鏈的末端進(jìn)行修飾的光分解性保護(hù)基，解除前述光分解性保護(hù)基 的阻礙而使反應(yīng)開始的手段為照射光，前述反應(yīng)溶液所含的化學(xué)物質(zhì)為用各自發(fā)出不同熒 光的4色熒光染料標(biāo)記的四種脫氧核糖核苷酸dATP、dCTP、dTTP、dGTP和進(jìn)行核酸的延伸 反應(yīng)的酶即聚合酶。此外，實(shí)施例公開了 其中，特征為測定前述核酸的延伸反應(yīng)的手段為利用使用了 波長420nm SOOnm的范圍的可見光的全反射照射進(jìn)行的熒光測定，前述金屬結(jié)構(gòu)體的尺 寸小于前述可見光的波長；前述金屬結(jié)構(gòu)體通過可見光的照射產(chǎn)生表面等離子體共振從而 使前述金屬結(jié)構(gòu)體附近的電場強(qiáng)度增強(qiáng)，來自前述熒光染料的熒光被增強(qiáng)。此外，實(shí)施例公開了 其中，解除前述光分解性保護(hù)基的手段具有使用波長250 400nm的范圍的紫外光、僅對規(guī)則地配置有前述結(jié)構(gòu)體的區(qū)域的區(qū)域選擇性照射前述紫外 光的手段。此外，實(shí)施例公開了 其中，由僅對規(guī)則地配置有前述結(jié)構(gòu)體的區(qū)域選擇性照射紫 外光所引起的延伸反應(yīng)完成后，使前述基板移動相鄰的區(qū)域的間隔的量的手段是利用XY 載臺的手段，其具有連續(xù)測定前述區(qū)域內(nèi)的延伸反應(yīng)的手段和對前述基板的熒光分子自動 對焦的手段。此外，實(shí)施例公開了 其中，前述光分解性物質(zhì)為光分解性保護(hù)基，其保護(hù)基為 2-硝基芐基型，癸基苯甲酰甲基(phenacyl)型，香豆?；谆?。此外，實(shí)施例公開了 其中，固定在前述金屬結(jié)構(gòu)體的前述互補(bǔ)鏈的序列為用于捕 捉mRNA的po IyT序列。
此外，實(shí)施例公開了 其中，進(jìn)行前述熒光檢測的手段是由物鏡、陷波濾波器 (notch filter)、分色鏡、帶通濾波器、聚光透鏡、CXD相機(jī)構(gòu)成的。此外，實(shí)施例公開了 其中，前述全反射照射是由多個激光器、反射鏡、中性濾光片 (neutral-density filter)、λ/4波長板、快門、聚光透鏡、棱鏡、聯(lián)軸節(jié)油(coupling oil) 構(gòu)成的。此外，實(shí)施例公開了 其中，對前述流路供給前述反應(yīng)溶液的手段由分注單元、廢 液罐和前述基板的間隔物(septa)構(gòu)成。此外，實(shí)施例公開了 其中，前述脫氧核糖核苷酸為AleXa488-dCTP、Cy3_dATP、 Cy5-dCTP 和 Cy5. 5-dCTP。下面，參照附圖對發(fā)明的上述以及其它新特征和效果進(jìn)行說明。另外，附圖是為理 解發(fā)明而使用的，對保護(hù)范圍并不構(gòu)成限定。〔實(shí)施例〕作為本發(fā)明的實(shí)施例，下面使用圖1對在1個流路配置有多個反應(yīng)場的流 動池進(jìn)行說明。在具有透光性的基板105、103間夾入形成有長方形空間部的PDMS 104(polydimethylsilozane 聚二甲基硅氧烷)，從而形成流動池。PDMS是一種硅樹脂，可 通過在流路模具中注入PDMS的未聚合溶液并使其聚合而形成流路。此外，PDMS在可見光 區(qū)域的光吸收極少，因此適合于顯微鏡下的熒光測定。此外，PDMS由于僅通過范德華力密 合在平滑的基板103表面，因此，僅通過擠壓到基板103表面，PDMS即密合到基板上?；?103中設(shè)置有用于注入反應(yīng)液、洗滌液等試劑的橡膠性的間隔物(septa) 101、102。用注射 針等刺穿該間隔物，可通過手動或自動將目標(biāo)的液體注入流路內(nèi)。進(jìn)而，基板105上直線狀 地配置有200個反應(yīng)場106。相鄰的反應(yīng)場106間的間隔為0. 5mm。此外，反應(yīng)場106的大 小為Φ0. 5mm，被制成與使用的物鏡的最大視野幾乎相等的大小。圖1的基板107為反應(yīng)場106放大后的結(jié)果，在基板107內(nèi)，金結(jié)構(gòu)體108以Iym 的間距規(guī)則地配置成格子狀。此外，在各金結(jié)構(gòu)體108上分別固定有一條寡探針109。尤 其在進(jìn)行mRNA表達(dá)解析的情況下，寡探針109具有dT重復(fù)序列。金結(jié)構(gòu)體108為比激發(fā) 光的波長小的結(jié)構(gòu)體，本實(shí)施例中采用直徑80nm的金微粒。金結(jié)構(gòu)體108配置在基板107 上。對金結(jié)構(gòu)體108照射激發(fā)光時，通過等離子激元現(xiàn)象，金結(jié)構(gòu)體108附近的電場發(fā)生增 強(qiáng)，測得的熒光會增強(qiáng)。等離子激元現(xiàn)象是指光的約束所致的自由電子的集體激發(fā)。用于熒光增強(qiáng)的金結(jié)構(gòu)體108包括金字塔狀、2個金結(jié)構(gòu)體間夾有絕緣膜的形狀 (層疊形狀)、類似于領(lǐng)結(jié)那樣配置有2個三棱柱的形狀等。其為金字塔形狀時，在其前端 部等配置寡探針。其為層疊形狀時，在絕緣膜等配置寡探針。為配置有2個三棱柱的形狀 時，在其所夾的空間配置寡探針。此外，作為能夠產(chǎn)生定域型表面等離子激元的金屬體，已 知有金、銀、鉬、鋁和銅等，作為金結(jié)構(gòu)體108的材質(zhì)，除金外還可以使用上述金屬。此外，表面等離子激元所致的熒光增強(qiáng)現(xiàn)象已知是使用Anal. Chem. to 1. 78， 6238-6M5(非專利文獻(xiàn)5)報(bào)道的納米級的銀島結(jié)構(gòu)、Nanotechnology (納米科技)，2007， vol. 18, pp 44017-44021.(非專利文獻(xiàn)6)報(bào)道的直徑數(shù)十納米的球狀金微粒。Nano Letters (納米快報(bào))· 2004，vol. 4，951-961 (非專利文獻(xiàn)7)中公開了 接近三棱柱時，其間 的空間內(nèi)產(chǎn)生強(qiáng)的定域型表面等離子激元。本說明書中，將這些文獻(xiàn)作為說明書的一部分 而并入。
接著，使用圖2，對使用UV光209的實(shí)時堿基延伸反應(yīng)的控制進(jìn)行說明。在基 板213內(nèi)的流路205內(nèi)，反應(yīng)液通過間隔物211、212被注入。反應(yīng)液含有用各不相同的熒 光染料標(biāo)記的4種核苷酸和聚合酶。各核苷酸分別為AleXa488-dCTP214、Cy3_dATP215、 y5-dCTP216、Cy5. 5-dCTP217。各核苷酸的濃度為200nM。此外，反應(yīng)液的鹽濃度、鎂濃度和 PH進(jìn)行了優(yōu)化，以使得延伸反應(yīng)能高效進(jìn)行。如圖1中說明那樣，在反應(yīng)場201、202、203、204內(nèi)，金結(jié)構(gòu)體207以Iym的間距 規(guī)則地配置成格子狀。一條寡探針205共價結(jié)合在1個金結(jié)構(gòu)體207上。此外，反應(yīng)開始 前、待解讀序列的mRNA206和寡探針205處于雜交的狀態(tài)。寡探針205的3'末端的核苷酸 中的3' OH標(biāo)記有作為光分解活性保護(hù)基的籠鎖化合物220。由于該籠鎖化合物220阻礙 靶核酸即mRNA206的互補(bǔ)鏈的延伸反應(yīng)，因此即使流動池內(nèi)充滿反應(yīng)溶液，延伸反應(yīng)也不 會進(jìn)行。但是，通過僅對反應(yīng)場201照射波長260nm的UV光209，使反應(yīng)場201上的寡探針 205末端的籠鎖化合物220解離，能夠在任意時間使延伸反應(yīng)開始。用圖3對上述寡探針的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行說明。本實(shí)施例的寡探針301的5'末端用 生物素進(jìn)行修飾。這是為了利用親和素-生物素的結(jié)合而將寡探針301固定在金結(jié)構(gòu)體 上。此外，5'末端的修飾并不限于生物素，還可以使用利用氨基和馬來酰亞胺基、硫醇基和 金的共價鍵的方法。本實(shí)施例中以mRNA的序列解析為例進(jìn)行了說明，為了與mRNA的3 ‘末端的poly A部選擇性雜交，本實(shí)施例的寡探針301的堿基序列為poly T序列。此外，寡探針301的3'末端用光分解性保護(hù)基進(jìn)行了修飾。迄今為止已報(bào)道了各 種光分解性保護(hù)基，但本實(shí)施例使用了光分解性保護(hù)基中的代表性基團(tuán)即2-硝基芐基型。 活化本實(shí)施例的2-硝基芐基型籠鎖化合物的最佳波長為260nm。照射UV光后，光分解性 保護(hù)基脫保護(hù)，寡探針301變成寡探針303的分子結(jié)構(gòu)。光分解性保護(hù)基解離后的寡探針 303中，由于阻礙延伸反應(yīng)的物質(zhì)已經(jīng)解離，因此通過聚合酶而攝入溶液中懸浮的熒光標(biāo)記 過的核苷酸，從而發(fā)生延伸反應(yīng)。通過該機(jī)理，能利用光照射進(jìn)行延伸反應(yīng)的控制。用圖4對適合上述延伸反應(yīng)技術(shù)的核酸分析裝置進(jìn)行說明。為了激發(fā)四種不同的 熒光染料，本實(shí)施例的裝置具備波長514nm的氬激光器401、波長633nm的HeNe激光器402 這兩種激光器。使用2種激光器而非使用4種是為了降低成本，也可以具備四種激光器。 氬激光器401用于激發(fā)熒光標(biāo)記過的核苷酸即AleXa488-dCTP214和Cy3_dATP215，此外， HeNe激光器402用于激發(fā)Cy5_dCTP216和Cy5. 5_dCTP217。由氬激光器401和HeNe激光 器402發(fā)出的激發(fā)光分別被分色鏡(dichroic mirror) 405、分色鏡406反射，經(jīng)由中性濾光 片407、4/λ波長板、反射鏡408、聚光透鏡410、棱鏡411射入基板432底面。入射角度為臨 界角以上，流動池基板上的熒光染料因全反射照射而被激發(fā)。這里，利用全反射照射的優(yōu)點(diǎn) 在于，反應(yīng)溶液中游離的熒光染料并非被全部激發(fā)，而是僅從基板起延Z方向深度約150nm 附近區(qū)域能夠被局部照射到。因此，與通常的落射激發(fā)法相比，能顯著減少會成為噪音的背 景光。進(jìn)而，照射于金結(jié)構(gòu)體的激發(fā)光產(chǎn)生表面等離子激元共振，在金結(jié)構(gòu)體大小附近的區(qū) 域內(nèi)能夠獲得數(shù)十倍的熒光增強(qiáng)效果。發(fā)出的熒光經(jīng)由物鏡412、陷波濾波器413、帶通濾 波器440而到達(dá)分色鏡414。直線傳播的熒光進(jìn)一步被分色鏡416分光，分別通過帶通濾 波器417、441，通過聚光透鏡415、419而會聚于C⑶相機(jī)418、420的成像面。同樣地，被分 色鏡414反射的熒光被分色鏡421分光，分別通過帶通濾波器442、443，通過聚光透鏡424、422而會聚于CXD相機(jī)425、423的成像面。通過這種操作，能夠同時取得四種不同的熒光染 料的熒光圖像。通過控制PC似6處理各CXD相機(jī)418、420、423、425中取得的信號而使其轉(zhuǎn) 換為mRNA的堿基序列。另外，上述實(shí)施例中使用全反射照射激發(fā)熒光染料，但也可以在流動池基板上設(shè) 置開口小于激發(fā)光波長的納米開口，通過對該開口照射激發(fā)光而產(chǎn)生的瞬逝光來激發(fā)熒光 染料。延伸反應(yīng)的控制通過控制PC似6來進(jìn)行?？刂芇C似6使UV激光器444的快門445 開放。UV光經(jīng)由帶通濾波器446、經(jīng)過與前述瞬逝光照明相同的光路照射基板432的底面。 本實(shí)施例中，UV激光器444的照射和熒光染料的激發(fā)使用了同一光學(xué)系統(tǒng)。但是，UV激光 器的照射法本身并不限定于瞬逝光照明，既可以是通常使用的落射法，也可以是斜光照明法。如前面所說明那樣，隨著UV激光的照射，光保護(hù)基解離，核酸的延伸反應(yīng)自動進(jìn) 行。在某些反應(yīng)場中延伸反應(yīng)完成后，控制PC驅(qū)動XY載臺驅(qū)動用伺服電動機(jī)433，使下一 個反應(yīng)場移動至物鏡412的視野內(nèi)。進(jìn)而，控制PC在金結(jié)構(gòu)體的散射光存在下驅(qū)動自動對 焦裝置427而將焦距對準(zhǔn)流動池壁面的熒光分子。通過重復(fù)該動作，能夠?qū)ε渲迷诹鲃映?內(nèi)的200個反應(yīng)場依次重復(fù)實(shí)時測定堿基延伸反應(yīng)。此外，基板432內(nèi)可制作多個流路，可 通過分注單元4 對各個流路獨(dú)立分注反應(yīng)液。此外，廢液通過間隔物431而儲存在廢液 罐429中。此外，為了使實(shí)時堿基延伸反應(yīng)穩(wěn)定而附加了溫度調(diào)整單元450。圖5表示實(shí)時反應(yīng)的流程。在流動池中注入含有4種熒光脫氧核苷酸和聚合酶的 反應(yīng)溶液。接著，驅(qū)動XY載臺進(jìn)行測定的反應(yīng)場的定位。接著，基于金結(jié)構(gòu)體的散射圖像對 流動池壁面進(jìn)行自動對焦。將焦距對準(zhǔn)流動池壁面后，開始由CCD相機(jī)獲取連續(xù)圖像。通過 UV激光的照射，光分解活性保護(hù)基解離，實(shí)時延伸反應(yīng)開始。60秒左右的實(shí)時反應(yīng)結(jié)束后， 停止照射UV激光，停止獲取圖像。進(jìn)而，停止氬激光器、He-Ne激光器的照射，使XY載臺移 動反應(yīng)場的間隔的量，將同一流動池內(nèi)尚未發(fā)生延伸反應(yīng)的反應(yīng)場定位于物鏡正下方。對 1個流動池重復(fù)200次該動作，從而通過對200個反應(yīng)場依次照射UV而能夠簡便地實(shí)現(xiàn)實(shí) 時堿基延伸反應(yīng)且無需更換反應(yīng)液。此外，流動池內(nèi)的反應(yīng)場數(shù)量不必限定于本實(shí)施例中 所述的200個。此外，基板上所形成的流動池的數(shù)量也沒有特別限定。另外，上述實(shí)施例中通過驅(qū)動載臺而將目標(biāo)的反應(yīng)場配置到激發(fā)光照射區(qū)域、UV 光照射區(qū)域，但也可以不移動載臺而是通過控制光學(xué)系統(tǒng)而僅對目標(biāo)的反應(yīng)場照射激發(fā) 光、UV光。符號說明101，102，211，212，430，431 間隔物103，105，107，213，432 基板104 PDMS106，201，202，203，204 反應(yīng)場108,207 金結(jié)構(gòu)體109,301,303 寡探針206 mRNA214 Alexa488-dCTP214
215 Cy3-dATP216 Cy5-dCTP217 Cy5. 5-dCTP220 籠鎖化合物302光分解活性保護(hù)基401氬激光器402 He-Ne 激光器403，404，417，440，442，443，446 帶通濾波器405，406，414，416，221 分色鏡407 ND 濾光片408 反射鏡409 λ/4 波長板410,415,419,422,424 聚光透鏡413 陷波濾波器418，420，423，425 CCD 相機(jī)426 控制 PC428 分注單元429 廢液罐433 XY載臺驅(qū)動用伺服電動機(jī)445 快門450溫度調(diào)整單元
權(quán)利要求
1.一種單分子實(shí)時測序裝置，其特征在于，具有核酸探針，其具有阻礙核酸延伸反 應(yīng)的光分解性物質(zhì)；反應(yīng)場區(qū)域，其配置有多個該核酸探針；流路，其設(shè)有多個該反應(yīng)場區(qū) 域；試劑供給機(jī)構(gòu)，其對所述流路供給用于核酸延伸反應(yīng)的試劑；激發(fā)光學(xué)系統(tǒng)，其對目標(biāo) 的反應(yīng)場區(qū)域照射瞬逝光并檢測產(chǎn)生的熒光；反應(yīng)控制光學(xué)系統(tǒng)，其對目標(biāo)的反應(yīng)場區(qū)域 照射使所述光分解性物質(zhì)分解的光。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單分子實(shí)時測序裝置，其特征在于，所述光分解性物質(zhì)為在 所述核酸探針的末端進(jìn)行修飾的光分解性保護(hù)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的單分子實(shí)時測序裝置，其特征在于，所述光分解性保護(hù)基為 2-硝基芐基型、癸基苯甲酰甲基型、或香豆?；谆?。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單分子實(shí)時測序裝置，其特征在于，產(chǎn)生熒光增強(qiáng)場的金屬 結(jié)構(gòu)體對應(yīng)于各核酸探針被配置在所述反應(yīng)區(qū)域場。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單分子實(shí)時測序裝置，其特征在于，所述試劑含有用通過 所述瞬逝光而產(chǎn)生各自不同的熒光的4色熒光染料所標(biāo)記的四種脫氧核糖核苷酸dATP、 dCTP、dTTP、dGTP，和進(jìn)行核酸延伸反應(yīng)的酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單分子實(shí)時測序裝置，其特征在于，所述激發(fā)光學(xué)系統(tǒng)為全 反射照射波長420nm SOOnm的范圍的可見光而產(chǎn)生瞬逝光的系統(tǒng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單分子實(shí)時測序裝置，其特征在于，所述反應(yīng)控制光學(xué)系統(tǒng) 為照射波長250 400nm的范圍的UV光的系統(tǒng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單分子實(shí)時測序裝置，其特征在于，所述反應(yīng)控制光學(xué)系統(tǒng) 對目標(biāo)的反應(yīng)區(qū)域場照射光后，移動所述流路，使不同的反應(yīng)區(qū)域場進(jìn)入所述反應(yīng)控制光 學(xué)系統(tǒng)的視野。
9.一種核酸分析裝置，其特征在于，具有核酸分析器件，其具有與靶核酸雜交但不照 射UV光則不進(jìn)行核酸延伸反應(yīng)的核酸探針、配置有多個與不同的靶核酸雜交的所述核酸 探針的反應(yīng)場區(qū)域、設(shè)有多個該反應(yīng)場區(qū)域且能夠保持用于核酸反應(yīng)的試劑的流路；激發(fā)光學(xué)系統(tǒng)，其對目標(biāo)的反應(yīng)場區(qū)域照射瞬逝光并檢測產(chǎn)生的熒光；反應(yīng)控制光學(xué)系統(tǒng)，其對所述目標(biāo)的反應(yīng)場區(qū)域照射使所述光分解性物質(zhì)分解的UV光；載臺驅(qū)動機(jī)構(gòu)，其使核酸分析器件相對于所述激發(fā)光光學(xué)系統(tǒng)和所述反應(yīng)控制光學(xué)系 統(tǒng)相對移動而使得能夠?qū)δ繕?biāo)的反應(yīng)場區(qū)域照射瞬逝光和UV光。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的核酸分析裝置，其特征在于，所述核酸探針的末端用光分解 性保護(hù)基進(jìn)行了修飾。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的核酸分析裝置，其特征在于，所述光分解性保護(hù)基為2-硝 基芐基型、癸基苯甲酰甲基型、或香豆酰基甲基型。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的核酸分析裝置，其特征在于，產(chǎn)生熒光增強(qiáng)場的金屬結(jié)構(gòu)體 對應(yīng)于各核酸探針被配置在所述反應(yīng)區(qū)域場。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的核酸分析裝置，所述試劑含有用通過所述瞬逝光而產(chǎn)生各 自不同的熒光的4色熒光染料所標(biāo)記的四種脫氧核糖核苷酸dATP、dCTP、dTTP、dGTP，和進(jìn) 行核酸延伸反應(yīng)的酶。
14.根據(jù)權(quán)利要求9所述的核酸分析裝置，其特征在于，所述激發(fā)光學(xué)系統(tǒng)為全反射照射波長420nm 800nm的范圍的可見光而產(chǎn)生瞬逝光的系統(tǒng)。
15.根據(jù)權(quán)利要求9所述的核酸分析裝置，其特征在于，所述反應(yīng)控制光學(xué)系統(tǒng)為照射 波長250 400nm的范圍的UV光的系統(tǒng)。
16.根據(jù)權(quán)利要求9所述的核酸分析裝置，其特征在于，所述反應(yīng)控制光學(xué)系統(tǒng)對目標(biāo) 的反應(yīng)區(qū)域場照射光后，移動所述流路，使不同的反應(yīng)區(qū)域場進(jìn)入所述反應(yīng)控制光學(xué)系統(tǒng) 的視野。
17.一種單分子實(shí)時測序方法，其特征在于，準(zhǔn)備核酸探針和設(shè)有多個反應(yīng)場區(qū)域的流 路，其中，所述核酸探針具有阻礙核酸延伸反應(yīng)的光分解性物質(zhì)，所述反應(yīng)場區(qū)域配置有多 個該核酸探針，對所述流路供給靶核酸和用于核酸延伸反應(yīng)的試劑，對目標(biāo)的反應(yīng)場區(qū)域照射使所述光分解性物質(zhì)分解的UV光，對所述目標(biāo)的反應(yīng)場區(qū)域照射瞬逝光，檢測產(chǎn)生的熒光，使所述流路相對于所述照射UV光的反應(yīng)控制光學(xué)系統(tǒng)和所述產(chǎn)生瞬逝光的激發(fā)光光 學(xué)系統(tǒng)相對移動，對不同的反應(yīng)場區(qū)域照射使所述光分解性物質(zhì)分解的UV光，對所述不同的反應(yīng)場區(qū)域照射瞬逝光，檢測產(chǎn)生的熒光。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的單分子實(shí)時測序方法，其特征在于，所述光分解性物質(zhì)為 在所述核酸探針的末端進(jìn)行修飾的光分解性保護(hù)基。
19.根據(jù)權(quán)利要求2所述的單分子實(shí)時測序方法，其特征在于，所述光分解性保護(hù)基為 2-硝基芐基型、癸基苯甲酰甲基型、或香豆?；谆?。
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的單分子實(shí)時測序方法，其特征在于，產(chǎn)生熒光增強(qiáng)場的金 屬結(jié)構(gòu)體對應(yīng)于各核酸探針被配置在所述反應(yīng)區(qū)域場。
21.根據(jù)權(quán)利要求17所述的單分子實(shí)時測序方法，其特征在于，所述試劑含有用通 過所述瞬逝光而產(chǎn)生各自不同的熒光的4色熒光染料所標(biāo)記的四種脫氧核糖核苷酸dATP、 dCTP、dTTP、dGTP，和進(jìn)行核酸延伸反應(yīng)的酶。
22.根據(jù)權(quán)利要求17所述的單分子實(shí)時測序方法，其特征在于，所述瞬逝光通過全反 射照射波長420nm 800nm的范圍的可見光而產(chǎn)生。
23.根據(jù)權(quán)利要求17所述的單分子實(shí)時測序方法，其特征在于，所述UV光是波長在 250 400nm的范圍的UV光。
全文摘要
本發(fā)明的目的涉及在基板內(nèi)的目標(biāo)區(qū)域內(nèi)選擇性控制延伸反應(yīng)。本發(fā)明將在其末端配置有籠鎖化合物的寡探針固定在基板內(nèi)的反應(yīng)場區(qū)域。在包含反應(yīng)場區(qū)域的流動池內(nèi)注入反應(yīng)液后，僅對反應(yīng)場區(qū)域照射光，使固定在該反應(yīng)場區(qū)域內(nèi)的寡探針末端的光分解活性保護(hù)基解離，選擇性控制聚合酶的延伸反應(yīng)的開始。在流動池內(nèi)，在基板上以一定間隔配置有多個反應(yīng)場區(qū)域。使固定在可動載臺上的流動池移動相鄰的反應(yīng)場區(qū)域的距離的量，照射光，連續(xù)進(jìn)行延伸反應(yīng)的測定。通過重復(fù)該動作，在流動池內(nèi)既不使用復(fù)雜的流路、也不進(jìn)行反應(yīng)液的交換而穩(wěn)定地測定堿基延伸反應(yīng)。
文檔編號G01N37/00GK102066548SQ20098012348
公開日2011年5月18日 申請日期2009年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月23日
發(fā)明者加藤宏一, 芳賀孝信, 隈崎修孝, 高橋智 申請人:株式會社日立高新技術(shù)