一種基于納米粒子信號探針的拉曼放大檢測凝血酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明為一種基于納米粒子信號探針的拉曼放大檢測凝血酶的方法，結(jié)合DNA滾 環(huán)復(fù)制和核-殼結(jié)構(gòu)的納米粒子拉曼信號探針來實現(xiàn)雙重信號放大。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003] 表面增強拉曼檢測技術(shù)具有制樣過程比較簡單、非入侵和無損等獨特的優(yōu)點。表 面增強拉曼檢測手段作為高靈敏的檢測技術(shù)，越來越受到了科學(xué)界的關(guān)注，廣泛應(yīng)用于特 定序列DNA、檢測蛋白質(zhì)、體內(nèi)原位檢測、單堿基錯配等生物分析中。由于其光學(xué)透明性，使 用二氧化硅殼在表面增強拉曼散射（SERS)為基礎(chǔ)的生物傳感應(yīng)用提供了許多優(yōu)勢，能夠穩(wěn) 定存在于環(huán)境介質(zhì)中，并改善生物相容性。
[0004] 我們報告了一種新的層層組裝法，由二氧化硅、金納米粒子（AuNP)和SERS信號分 子組成。金納米粒子因為它們通過粒子結(jié)構(gòu)的針孔的表面電磁場定位能力從單個顆粒強增 強效果，這種層層組裝方法的提出，使得硅膠封裝AuNP標(biāo)簽表現(xiàn)出較強的表面增強拉曼光 譜信號以及出色的多路復(fù)用功能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是：結(jié)合DNA滾環(huán)復(fù)制和核-殼結(jié)構(gòu)的納米粒子拉曼信號探針來實 現(xiàn)雙重信號放大檢測凝血酶。在磁珠表面結(jié)合把氨基修飾的DNA，凝血酶適體與其雜交形成 雙鏈DNA探針。在凝血酶存在下，與固定在磁珠表面的雙鏈DNA探針結(jié)合，釋放其中的一條 鏈。留在磁珠上的探針作為引物發(fā)生滾環(huán)復(fù)制反應(yīng)，生成長鏈DNA，與所制備的核-殼結(jié)構(gòu) 納米探針上的DNA雜交，捕獲拉曼信號探針，通過檢測拉曼信號實現(xiàn)凝血酶的檢測。
[0006] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案為： 制備了金納米粒子（AuNP)，通過層層組裝的方法將羅丹明異硫氰酸酯封裝在AuNP和Si02殼之間。由于一個納米粒子可封裝大量的拉曼信號分子，增大了拉曼信號。制備的核 殼結(jié)構(gòu)的納米粒子表面修飾兩種DNA鏈，形成生物條碼探針，減少交叉反應(yīng)。
[0007] 用磁珠作為載體，在磁珠表面結(jié)合把氨基修飾的DNA，凝血酶適體與其雜交形成雙 鏈DNA探針。凝血酶與其適體結(jié)合釋放到溶液中，磁珠表面留下單鏈DNA探針作為引物。加 入鎖扣式DNA，在T4DNA連接酶和Phi29DNA聚合酶作用下，留下的DNA鏈發(fā)生滾環(huán)復(fù)制 反應(yīng)，生成長鏈DNA。與所制備的核-殼結(jié)構(gòu)納米探針上的DNA雜交，捕獲拉曼信號探針，從 而檢測拉曼信號（附圖1)。
[0008] 其具體步驟如下： 1)通過檸檬酸鈉還原HAuC14的方法制備了納米金，通過層層組裝的方法將羅丹明異 硫氰酸酯封裝在AuNP和Si02殼之間。再與比例為10:1的DNA鏈結(jié)合形成生物條碼探針。
[0009] 2)通過羧基與氨基的共價鍵將一端帶有氨基的探針信標(biāo)固定在羧基功能化的磁 性納米顆粒上，再與凝血酶適體雜交，獲得識別探針。
[0010] 3)將目標(biāo)凝血酶分子與識別探針混合，在磁珠表面進行雜交后，釋放其中的一條 鏈。留在磁珠上的探針作為引物發(fā)生滾環(huán)復(fù)制反應(yīng)，生成長鏈DNA，與所制備的核-殼結(jié)構(gòu) 納米探針上的DNA雜交，捕獲拉曼信號探針。
[0011] 4)在外加磁場的作用下將多余的信號納米粒子探針清洗干凈，檢測拉曼信號。利 用凝血酶的標(biāo)準(zhǔn)溶液獲得檢測的工作曲線，從工作曲線進行凝血酶實際樣品的分析。
[0012] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下特點： 本發(fā)明用制備的核殼結(jié)構(gòu)納米探針包含大量拉曼信號分子，結(jié)合DNA滾環(huán)復(fù)制形成利 用雙重信號放大，通過拉曼光譜檢測，建立了一種高靈敏的拉曼光譜檢測凝血酶的方法。相 對于現(xiàn)有的檢測方法，有以下特點： (1)通過表面增強拉曼光譜檢測，操作簡單，靈敏度高。
[0013] (2)設(shè)計了一種核殼結(jié)構(gòu)納米探針，包含大量拉曼信號分子，可通過金增強作用進 行拉曼信號放大。制備的核殼結(jié)構(gòu)的納米粒子表面修飾兩種DNA鏈，形成生物條碼探針，減 少交叉反應(yīng)。
[0014] (3)DNA滾環(huán)復(fù)制可形成具有重復(fù)堿基序列的DNA長鏈，一個靶分子可以結(jié)合大量 納米粒子探針。
[0015] (4)雙重信號放大提高了檢測靈敏度。
[0016] 四、【附圖說明】 圖1.拉曼光譜檢測凝血酶方法的示意圖 五、【具體實施方式】 實施例1 :核-殼結(jié)構(gòu)的拉曼信號標(biāo)記納米粒子制備 在快速攪拌下，將混合拉曼標(biāo)簽（羅丹明異硫氰酸酯）6yL(1.0XKT4M)加入到3mL的金膠溶液，使該混合物平衡反應(yīng)20分鐘。接下來，加入3mLPAA溶液Ug.L4)，用0. 1M 的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0,在劇烈攪拌下逐滴加入，并攪拌3小時。聚合物包封的納米 球的溶液，進行離心分離兩次，以除去過量的聚合物分子，并再分散到水中。加偶聯(lián)劑3 -氨基丙基三甲氧基硅烷加入到該溶液中至終濃度為3XKT7M，平衡反應(yīng)20分鐘。然后二 氧化硅殼長大使用改進的St€ober's方法，即通過使用氨作為催化劑在醇溶液中的正硅 酸乙酯（TE0S)的水解和縮合。簡單地說，依次加入17mL異丙醇和200yL氨水（25%)。在 溫和攪拌下，加入8yL正硅酸乙酯，把它分成四個部分平均每個部分1小時。正硅酸乙 酯添加完成后，使該混合物進行反應(yīng)12小時，在4500rpm的轉(zhuǎn)速下，將混合物離心分離 15分鐘，清洗三次。最后，析出的染料編碼拉曼標(biāo)簽再分散到水中。
[0017] 實施例2 :核-殼結(jié)構(gòu)的拉曼信號標(biāo)記納米粒子的DNA功能化 把200yL3-三乙氧基甲硅烷基丙基琥珀酸酐（TEPSA，200mM)加入到400yL上 述核-殼結(jié)構(gòu)水溶液中，反應(yīng)過夜。羧基修飾的核-殼結(jié)構(gòu)離心洗滌三次，分散到200yL PBS(0? 1M，pH7.4)中以供以后使用。把 100yL含有 50mMNHSand200mMEDC溶液 加入到核-殼結(jié)構(gòu)的溶液中來激活-C00H基團。孵育2小時后，加入50yL的氨基修飾的 生物條碼探針溶液，靜置過夜后，將溶液離心，并用PBS洗滌三次，得到洗滌適配體官能化 的顆粒，將其分散在800yL的PBS溶液，放在4°C下以備將來使用。
[0018] 實施例2 :磁珠表面探針的固定 用0. 1M，咪唑-HC1緩沖溶液（pH6. 8, 3X100yL)將50yL羧基修飾的磁珠的懸浮液 (10mg?mL-1)洗滌三次。然后把0. 1M的EDC溶液（100yL)加入到該MB溶液中，將混合 物在室溫下震蕩反應(yīng)20分鐘，以激活磁性納米顆粒的羧酸酯基團。然后加入將氨基修飾的 捕獲探針和凝血酶適體鏈（1.0X10-10mol?L，溶液，將所得混合物于37 °C下震蕩反應(yīng) 12小時。磁性分離后，用0.1MPBS緩沖液把磁性納米顆粒洗滌三次。洗滌后的MNP/Si 再分散到200yL的PBS溶液。
[0019]實施例3 :拉曼檢測凝血酶 在10yL探針修飾的磁性納米顆粒分散液中滴入10yL不同濃度的凝血酶溶液反應(yīng) 40分鐘。加入10yL鎖扣式DNA(10nM)，然后加入T4DNA連接酶Buffer(400U/凡，10 禮！'1^8-11(：1，？117.4，含1〇11111%(：12、1〇111101'1'和11111六了？），室溫下孵育30分鐘，最后 加入T4DNA連接酶（10X)和去離子水混合，在22 °C條件下反應(yīng)1小時。鎖扣DNA連接成 環(huán)狀，并把修飾在磁珠上的DNA(Si)捕獲。磁性分離以除去未被捕獲的鎖扣DNA，加入Phi 29 0嫩聚合酶的緩沖溶液（40禮1'1^8 11(：1，？117.5，含5〇11111((：1、1〇11111%(：12和5 1111 (NH4)2S04)、Phi29DNA聚合酶（0.5A，10U/Z〇，dNTPs(5A，1 禮)，在 37。。下反應(yīng) 1 小時。反應(yīng)完成后將反應(yīng)液加熱到65°C10分鐘至Phi29聚合酶失活以此終止RCA反應(yīng)。 記錄不同濃度凝血酶溶液與樣品的拉曼信號，獲得凝血酶檢測的工作曲線，并求出樣品中 的凝血酶濃度。
【主權(quán)項】
1. 一種基于納米粒子信號探針的拉曼放大檢測凝血酶的方法，其特征在于：制備了一 種攜帶有大量拉曼信號分子的核-殼結(jié)構(gòu)的生物條碼作為拉曼信號探針；在凝血酶存在 下，與固定在磁珠表面的雙鏈脫氧核糖核酸（以下簡稱DNA)探針結(jié)合，釋放其中的一條鏈； 留在磁珠上的探針發(fā)生滾環(huán)復(fù)制反應(yīng)，生成長鏈DNA，與所制備的核-殼結(jié)構(gòu)納米探針上的 DNA雜交，捕獲拉曼信號探針，從而檢測拉曼信號。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述的方法在磁珠表面結(jié)合滾環(huán)復(fù)制 和核-殼結(jié)構(gòu)的納米粒子信號探針來實現(xiàn)雙重信號放大。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述的方法用磁珠作為載體，在磁珠 表面結(jié)合把氨基修飾的DNA，凝血酶適體與其雜交形成雙鏈DNA探針；凝血酶與其適體結(jié)合 釋放到溶液中，磁珠表面留下單鏈DNA探針作為引物；加入鎖扣式DNA，在T4 DNA連接酶和 Phi 29 DNA聚合酶作用下，留下的DNA鏈發(fā)生滾環(huán)復(fù)制反應(yīng)，生成長鏈DNA。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于制備了金納米粒子（AuNP)，通過層層 組裝的方法將羅丹明異硫氰酸酯封裝在AuNP和Si02殼之間；由于一個納米粒子可封裝大 量的拉曼信號分子，增大了拉曼信號。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于制備的核殼結(jié)構(gòu)的納米粒子表面修飾 兩種DNA鏈，形成生物條碼探針，減少交叉反應(yīng)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于檢測靶標(biāo)為凝血酶。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于納米粒子信號探針的拉曼放大檢測凝血酶的方法，結(jié)合DNA滾環(huán)復(fù)制和核-殼結(jié)構(gòu)的納米粒子拉曼信號探針來實現(xiàn)雙重信號放大。在磁珠表面結(jié)合把氨基修飾的DNA，凝血酶適體與其雜交形成雙鏈DNA探針。在凝血酶存在下，與固定在磁珠表面的雙鏈DNA探針結(jié)合，釋放其中的一條鏈。留在磁珠上的探針作為引物發(fā)生滾環(huán)復(fù)制反應(yīng)，生成長鏈DNA，與所制備的核-殼結(jié)構(gòu)納米探針上的DNA雜交，捕獲拉曼信號探針，通過檢測拉曼信號實現(xiàn)凝血酶的檢測。該方法具有廣泛的適用性，適體與靶蛋白質(zhì)結(jié)合引起的DNA分子機器過程相對比較簡單，因此經(jīng)過改變靶蛋白適體的序列的方法，來間接的檢測相應(yīng)的靶蛋白，此方法可以得到較為廣泛的應(yīng)用。
【IPC分類】G01N21-65
【公開號】CN104614358
【申請?zhí)枴緾N201410741458
【發(fā)明人】李雪梅, 王琳琳, 羅捷
【申請人】臨沂大學(xué)
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2014年12月9日