專利名稱：由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法。
另外，為將寡核苷酸、DNA、RNA等核酸送達(dá)靶細(xì)胞，經(jīng)常利用由含有陽(yáng)離子脂質(zhì)的脂質(zhì)構(gòu)成的脂質(zhì)體(以下稱為陽(yáng)離子脂質(zhì)脂質(zhì)體)或聚L-賴氨酸、聚酰胺胺等堿性聚合物與核酸的復(fù)合體。但是，已知陽(yáng)離子脂質(zhì)脂質(zhì)體與核酸的復(fù)合體經(jīng)脈給藥后迅速?gòu)难邢蚋闻K或肺轉(zhuǎn)移[Biochim.Biophys.Acta，1281，139-149(1996)；J.Controlled Release，41，121-130(1996)]。另一方面，S.Li等人公開(kāi)了使小鼠血清與陽(yáng)離子脂質(zhì)脂質(zhì)體/DNA復(fù)合體接觸會(huì)引起復(fù)合體增大、凝集、脂質(zhì)體的崩解、DNA釋放和分解[Gene Therapy，5，930-937(1998)；Gene Therapy，6，585-594(1999)]。為解決上述問(wèn)題，研究開(kāi)發(fā)了陽(yáng)離子脂質(zhì)脂質(zhì)體的聚乙二醇修飾法，O.Meyer等人制備了含有聚乙二醇磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的陽(yáng)離子脂質(zhì)脂質(zhì)體和低聚脫氧核苷酸(ODN)的復(fù)合體[J.Biol.Chem.，273，15621-15627(1998)]。但是，使其與50％人血漿水溶液接觸4小時(shí)后有35％的ODN解離。為進(jìn)行改良，D.Stuart和T.Allen將陽(yáng)離子脂質(zhì)脂質(zhì)體預(yù)先溶解在氯仿中，然后加入ODN的水溶液和甲醇，混合后，通過(guò)進(jìn)行離心分離，使陽(yáng)離子脂質(zhì)脂質(zhì)體/ODN的復(fù)合體轉(zhuǎn)移到氯仿層中。再取出氯仿層，向其中加入PEG脂質(zhì)和中性脂質(zhì)及水，形成W/O型乳夜，之后與F.Szoka等人的反相蒸發(fā)法同樣進(jìn)行處理，試著使ODN完全內(nèi)含在脂質(zhì)體內(nèi)部[Biochim.Biophys.Acta，1463，219-229(2000)]。但是，從安全性方面考慮，使用氯仿是不理想的。進(jìn)而，D.Mc Phail等人將十六烷酰殼聚糖與膽固醇的囊懸浮液(殼聚糖囊)添加到蛋黃磷脂酰膽堿與膽固醇的薄膜上，調(diào)制成脂質(zhì)體中加入了殼聚糖的囊中囊(vesicle invesicle)[Int.J.Pharmaceutics，200，73-86(2000)]。但是沒(méi)有有關(guān)內(nèi)包效率的記載，由制備方法推測(cè)，只有百分之幾的內(nèi)包率，估計(jì)在實(shí)用方面會(huì)有問(wèn)題。由上述觀點(diǎn)可知，利用簡(jiǎn)便且高效的微粒封閉囊進(jìn)行的內(nèi)包化在醫(yī)療應(yīng)用方面非常有用。
另外，醫(yī)療上有用的許多肽、蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)被酶等迅速分解，有時(shí)因多次給藥而生成抗體，被從體內(nèi)除去，從而無(wú)法發(fā)揮效力。因此，為提高這些肽、蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)的穩(wěn)定性，而試驗(yàn)了脂質(zhì)體化。作為脂質(zhì)體化的方法，例如有Bangham等人的脂質(zhì)體制備法[J.Mol.Biol.13，238(1965)]、乙醇注入法[J.Cell.Biol.66，621(1975)]、弗氏壓碎法[FEBS Lett99，210(1979)]、凍結(jié)溶解法[Arch.Biochem.Biophys.212，186(1981)]、反相蒸發(fā)法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA75，4194(1978)]、pH梯度法(日本專利第2572554號(hào)公報(bào)、第2659136號(hào)公報(bào)等)。另外還制定出了針對(duì)低分子化合物的pH梯度法的改良方法。但是，肽、蛋白質(zhì)未必會(huì)實(shí)現(xiàn)高效的內(nèi)包化，通過(guò)熒光標(biāo)記胰島素測(cè)定發(fā)現(xiàn)5-40％左右被內(nèi)包，但胰島素完全未被內(nèi)包[Int.J.Pharmaceutics，179，85-95(1999)]。為提高肽、蛋白質(zhì)的治療效果，開(kāi)發(fā)將肽、蛋白質(zhì)高效地內(nèi)包在封閉小囊內(nèi)的方法是當(dāng)前的課題。
本發(fā)明的目的在于提供一種被覆方法，該被覆方法為使含有在微粒中的藥物等在生物體內(nèi)保持穩(wěn)定，而利用脂質(zhì)膜將所述的微粒安全、簡(jiǎn)便且有效地被覆。在該被覆方法中，將微粒包含在由脂質(zhì)雙層膜活多層膜構(gòu)成的封閉小囊內(nèi)，由此使之免受生物體內(nèi)特別是血液內(nèi)或消化道內(nèi)成分和細(xì)網(wǎng)內(nèi)皮系統(tǒng)等的影響，以及保存過(guò)程中微粒之間或用于分散微粒的分散介質(zhì)的影響。
本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)，由水溶性藥物和陽(yáng)離子脂質(zhì)組成的因靜電相互作用而形成的復(fù)合體不溶于乙醇水溶液，脂質(zhì)溶于乙醇含量高的乙醇水溶液，在乙醇含量低的乙醇水溶液中形成脂質(zhì)膜，從而成為脂質(zhì)體。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，預(yù)先在水溶性藥物和脂質(zhì)的復(fù)合體中加入聚乙二醇化脂質(zhì)等水溶性高分子衍生物，再使其分散在乙醇含量高的乙醇水溶液中，然后在該溶液中溶解聚乙二醇化脂質(zhì)和磷脂，之后逐步降低乙醇含量，由此可以使之前的藥物與脂質(zhì)的復(fù)合體被聚乙二醇化脂質(zhì)和磷脂形成的脂質(zhì)膜所被覆。
即，本發(fā)明涉及以下的(1)～(19)。
(1)由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法，特征在于，通過(guò)減少含有極性有機(jī)溶劑的水溶液中的極性有機(jī)溶劑的比例而在微粒表面被覆脂質(zhì)膜，所說(shuō)的微粒分散于所說(shuō)的極性有機(jī)溶劑中且在所說(shuō)的極性有機(jī)溶劑中溶解有脂質(zhì)。
(2)由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法，特征在于，使微粒分散于含有極性有機(jī)溶劑的水溶液中(A液)，在與該含有極性有機(jī)溶劑的水溶液相同或不同的含有極性有機(jī)溶劑的水溶液或極性有機(jī)溶劑中溶解脂質(zhì)(B液)，混合A液和B液(C液)，然后減少C液中的極性有機(jī)溶劑的比例(D液)，由此在該微粒上被覆脂質(zhì)膜。
(3)上述(2)中記載的由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法，其中B液是與脂質(zhì)一起使水溶性高分子衍生物(I)溶解得到的溶液。
(4)上述(2)或(3)中記載的由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法，其中A液和B液中極性有機(jī)溶劑的濃度為30％以上。
(5)上述(2)或(3)中記載的由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法，其中A液和B液中的極性有機(jī)溶劑的濃度為60～90％。
(6)上述(5)中記載的由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法，其中D液中的極性有機(jī)溶劑的濃度為50％以下。
(7)上述(1)～(6)中任一項(xiàng)記載的由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法，其中微粒是含有與上述(3)中記載的水溶性高分子衍生物(I)相同或不同的水溶性高分子衍生物的微粒。
(8)上述(1)～(7)中任一項(xiàng)記載的由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法，其中微粒是含有從藥物、脂質(zhì)聚集體、脂質(zhì)體、乳液中的微粒、天然高分子、合成高分子、金屬膠體、陽(yáng)離子脂質(zhì)、陰離子脂質(zhì)和微粒制劑中選擇的一種以上的微粒。
(9)上述(1)～(7)中任一項(xiàng)記載的由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法，其中微粒是含有藥物的微粒。
(10)上述(1)～(7)中任一項(xiàng)記載的由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法，其中微粒是藥物與選自下列物質(zhì)中一種以上物質(zhì)形成的復(fù)合體脂質(zhì)聚集體、脂質(zhì)體、乳液中的微粒、天然高分子、合成高分子、金屬膠體、陽(yáng)離子脂質(zhì)、陰離子脂質(zhì)和微粒制劑。
(11)上述(1)～(7)中任一項(xiàng)記載的由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法，其中微粒是藥物與陽(yáng)離子脂質(zhì)的復(fù)合體。
(12)上述(1)～(7)中任一項(xiàng)記載的由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法，其中微粒是藥物與陽(yáng)離子脂質(zhì)的復(fù)合體。
(13)上述(1)～(7)中任一項(xiàng)記載的由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法，其中微粒是藥物與含有磷脂的脂質(zhì)體和葡聚糖硫酸鈉的復(fù)合體。
(14)上述(8)～(13)中任一項(xiàng)記載的由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法，其中藥物是選自肽、蛋白質(zhì)、核酸、低分子化合物、糖類、高分子化合物中的藥物。
(15)上述(1)～(14)中任一項(xiàng)記載的由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法，其中極性有機(jī)溶劑是從醇類、二醇類和聚亞烷基二醇類中選擇的一種以上。
(16)上述(15)中記載的由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法，其中醇類是乙醇。
(17)上述(15)或(16)中記載的由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法，其中二醇類是丙二醇。
(18)上述(15)～(17)中任一項(xiàng)記載的由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法，其中聚亞烷基二醇類是聚乙二醇。
(19)上述(3)～(18)中任一項(xiàng)記載的由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法，其中水溶性高分子衍生物是選自聚乙二醇化脂質(zhì)、聚乙二醇烷基醚、聚乙二醇蓖麻油衍生物、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯類、聚乙二醇硬脂酸酯類、乙二醇丙二醇共聚物和甘油酯類中的一種以上。
作為用于本發(fā)明的含有極性有機(jī)溶劑的水溶液中的極性有機(jī)溶劑，例如有甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、叔丁醇等醇類，甘油、乙二醇、丙二醇等二醇類，聚乙二醇等聚亞烷基二醇類等。
對(duì)構(gòu)成用于本發(fā)明的微粒的物質(zhì)無(wú)特別限定，例如由藥物、脂質(zhì)聚集體、脂質(zhì)體、乳液中的微粒、天然高分子、合成高分子、金屬膠體、陽(yáng)離子脂質(zhì)、陰離子脂質(zhì)、微粒制劑、水溶性高分子衍生物等。這些物質(zhì)可單獨(dú)使用，也可2種以上形成復(fù)合體，或與其他化合物組成復(fù)合體。
上述的復(fù)合體具體可以舉出，藥物與選自脂質(zhì)聚集體、脂質(zhì)體、乳液中的微粒、天然高分子、合成高分子、金屬膠體、陽(yáng)離子脂質(zhì)、陰離子脂質(zhì)和微粒制劑中的一種以上的物質(zhì)形成的復(fù)合體等，更具體的有利用靜電相互作用形成的核酸與陽(yáng)離子脂質(zhì)的復(fù)合體；核酸與聚-L-賴氨酸等正電荷聚合物形成的復(fù)合體；等點(diǎn)點(diǎn)高的堿性蛋白質(zhì)與磷脂酸等陰離子脂質(zhì)或苯乙烯馬來(lái)酸等負(fù)電荷聚合物的復(fù)合體；酸性蛋白質(zhì)與陽(yáng)離子脂質(zhì)或聚-L-賴氨酸等正電荷聚合物形成的復(fù)合體等。
藥物例如可以舉出含氧的蛋白質(zhì)、肽、含有基因的核酸、低分子化合物、糖類、高分子化合物等具有藥理學(xué)活性的物質(zhì)，作為含氧的蛋白質(zhì)或肽，例如有舒緩激肽、血管緊張素、催產(chǎn)素、抗利尿激素、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、降血鈣素、胰島素、胰高血糖素、縮膽囊肽、β-內(nèi)啡呔、黑素細(xì)胞阻礙因子、黑素細(xì)胞刺激激素、催胃液激素拮抗劑、神經(jīng)降壓肽、促生長(zhǎng)素抑制素、番木鱉堿、環(huán)孢菌素、腦啡呔、鐵傳遞蛋白、RGD(Arg Gly Asp)肽、甲狀腺激素、生長(zhǎng)激素、性腺刺激激素、黃體生成激素(LHRH)、天冬酰胺酶、精氨酸酶、尿酸酶、羧肽酶、谷氨酰胺酶、超氧化物歧化酶(SOD)、組織前纖維蛋白溶酶活化劑(t-PA)、鏈激酶、白介素、干擾素、胞壁酰二肽、熱生成素(thermopoietin)、顆粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、顆粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、胰蛋白酶抑制劑、溶菌酶、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、血小板源生長(zhǎng)因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(ECGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(GGF)、熱桿菌素、特異抗體(如抗EGF受體抗體等)。作為含基因的核酸例如有反義寡核苷酸、有意寡核苷酸、DNA、RNA等核酸類，低分子化合物例如有ε-氨基己酸、鹽酸精氨酸、L-天冬氨酸鉀、凝血酸、硫酸爭(zhēng)光霉素、硫酸長(zhǎng)春新堿、唑啉頭孢菌素鈉、噻孢霉素鈉、胞磷膽堿、阿糖胞苷、硫酸慶大霉素、鹽酸萬(wàn)古霉素、硫酸卡那霉素、硫酸丁胺卡那霉素等，作為糖類例如有軟骨素硫酸鈉、肝素鈉、右旋糖苷熒光素等，高分子化合物例如有聚乙烯磺酸鈉、DIVEMA(二乙烯基醚馬來(lái)酸酐共聚物)、SMANCS(苯乙烯馬來(lái)酸酐共聚物-新制癌菌素結(jié)合體)等。
作為脂質(zhì)聚集體，例如有球狀膠束、球狀反膠束、香腸狀膠束、香腸狀反膠束、板狀膠束、板狀反膠束、hexagonal I、hexagonal II和2分子以上脂質(zhì)組成的聚集體。
構(gòu)成脂質(zhì)體的脂質(zhì)，例如有磷脂、甘油糖脂質(zhì)、神經(jīng)鞘糖脂、膽固醇、陽(yáng)離子脂質(zhì)等，優(yōu)選使用磷脂。這些脂質(zhì)例如也可以用以下物質(zhì)改性聚山梨酸80、普朗尼克F68、山梨糖醇酐單月桂酸酯(如Span20)等非離子性表面活性劑、烷基二甲基芐基氯化銨等陽(yáng)離子性表面活性劑、月桂基硫酸鈉等陰離子性表面活性劑、葡聚糖等多糖類或其衍生物、聚氧乙烯月桂醇、聚乙二醇(PEG)等聚氧乙烯衍生物等。
磷脂例如有磷脂酰膽堿(大豆磷脂酰膽堿、蛋黃磷脂酰膽堿二硬脂?；字Ｄ憠A、二棕櫚酰基磷脂酰膽堿等)、磷脂酰乙醇胺(二硬脂?；字Ｒ掖及贰⒍貦磅；字Ｒ掖及返?、磷脂酰絲氨酸、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰膽堿、神經(jīng)鞘髓磷脂、聚乙二醇化磷脂、蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂、氫化磷脂等天然或合成磷脂等。
甘油糖脂質(zhì)例如有次硫酸核糖基甘油酯(Sulphoxy ribosylglyceride)、二糖基二甘油酯、二半乳糖基二甘油酯、半乳糖基二甘油酯、糖基二甘油酯等。
鞘糖脂例如有半乳糖基糖脂、乳糖基糖脂、神經(jīng)節(jié)苷脂等。
陽(yáng)離子脂質(zhì)例如有1，2-二油烯基-3-三甲基胺丙烷(DOTAP)、N-(2，3-二油烯氧基丙烷-基)-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)、2，3-二油烯氧基-N-[2-(精胺羧基酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-丙烷三氟乙酸銨(DOSPA)、1，2-二(十四烷基)氧基丙基-3-二甲基羥基乙基溴化銨(DMRIE)、1，2-二油烯氧基丙基-3-二乙基羥基乙基溴化銨(DORIE)、3β-[N-(N’N’-二甲基氨基乙基)氨基甲酰基]膽固醇(DC-Chol)等。
脂質(zhì)體中，這些脂質(zhì)可單獨(dú)使用，也可組合使用。組合使用時(shí)，例如可以使用下列脂質(zhì)由氫化大豆磷脂酰膽堿、聚乙二醇化磷脂和膽固醇中選擇的至少二種成分以上組成的脂質(zhì)，由二硬脂酰基磷脂酰膽堿、聚乙二醇化磷脂和膽固醇中選擇的至少二種成分以上組成的脂質(zhì)，蛋黃磷脂酰膽堿與DOTAP組成的脂質(zhì)，由蛋黃磷脂酰膽堿、DOTAP和聚乙二醇化磷脂組成的脂質(zhì)，由蛋黃磷脂酰膽堿、DOTAP、膽固醇和聚乙二醇化磷脂組成的脂質(zhì)等。
制備脂質(zhì)體時(shí)，可以根據(jù)需要與脂質(zhì)同時(shí)添加下列物質(zhì)作為膜穩(wěn)定化劑的膽固醇等甾醇類，作為抗氧化劑的生育酚等，作為荷電物質(zhì)的硬脂酰胺、二(十六烷基)磷酸酯、神經(jīng)節(jié)苷脂或DOTMA[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413-7417(1987)]、二(十八烷基)酰胺甘氨酰精胺(DOGS)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，6982-6986(1989)]、DMRIE或DORIE[Methods，5，67-75(1993)]、DC-Chol[Biochem.Biophys.Res.Commun.，179，280-285(1991)]等陽(yáng)離子脂質(zhì)等。
對(duì)乳液中的微粒無(wú)特別限定，具體可以舉出由脂肪乳劑、非離子表面活性劑和豆油組成的乳液、脂質(zhì)乳液、含有脂質(zhì)微球等的所有O/W乳液或W/O/W乳液中的微粒等。對(duì)于天然高分子無(wú)特別限定，具體有白蛋白、葡聚糖、殼聚糖、脫氧核糖核酸等。
對(duì)合成高分子無(wú)特別限定，例如有聚-L-賴氨酸、聚乙烯亞胺、聚天冬氨酸、苯乙烯馬來(lái)酸共聚物、異丙基丙烯酰胺-丙烯酸吡咯烷酮共聚物、PEG修飾dendorimer、聚乳酸、聚乳酸聚乙二醇酸、PEG化聚乳酸、葡聚糖硫酸或其鹽等。
鹽包括金屬鹽、銨鹽、有機(jī)胺加成鹽、氨基酸加成鹽等。金屬鹽有鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽等堿金屬鹽，鎂鹽、鈣鹽等堿土金屬鹽，鋁鹽、鋅鹽等。銨鹽有銨、四甲基銨等鹽，有機(jī)胺加成鹽有嗎啉、哌啶等鹽，氨基酸加成鹽有甘氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸等的加成鹽等。
金屬膠體例如含有金、銀、鉑、銅、銠、二氧化硅、鈣、鋁、鐵、銦、鎘、鋇、鉛等的金屬膠體。
陽(yáng)離子脂質(zhì)與上述相同。
陰離子脂質(zhì)有磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇等。
微粒制劑例如有微球、微囊、超微晶、脂質(zhì)超微粒子聚合物膠束等。
優(yōu)選的微粒是在脂質(zhì)體內(nèi)內(nèi)包藥物的微粒。
微粒大小優(yōu)選為平均粒徑數(shù)nm～數(shù)十μm，特別優(yōu)選10nm～1000nm。
本發(fā)明中使用的水溶性高分子衍生物無(wú)特別限定，例如有PEG-PE、1，2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-(聚乙二醇2000)(PEG-DSPE)等聚乙二醇化脂質(zhì)、聚乙二醇烷基醚、聚氧乙烯硬化蓖麻油60、CREMOPHOR EL等聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯(Tween 80)等聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯類、聚乙二醇硬脂酸酯類、乙二醇丙二醇共聚物、甘油酯類、聚乙烯亞胺衍生物、聚乙烯醇衍生物、聚丙烯酸衍生物、聚丙烯酰胺衍生物、葡聚糖衍生物、聚甘油衍生物、殼聚糖衍生物、聚乙烯吡咯烷酮衍生物、聚天冬氨酰胺衍生物、聚-L-賴氨酸衍生物、甘露聚糖衍生物、茁酶多糖衍生物等。
本發(fā)明中用于脂質(zhì)膜的脂質(zhì)例如有磷脂、甘油糖脂、鞘糖脂、膽固醇、合成脂質(zhì)等，特別優(yōu)選磷脂。磷脂、甘油糖脂、鞘糖脂可以使用與上述同樣的物質(zhì)，合成脂質(zhì)例如有氟化磷脂酰膽堿、含氟表面活性劑、溴化二烷基銨等。
作為本發(fā)明中使用的分散微粒且溶解有脂質(zhì)的含極性有機(jī)溶劑的水溶液的制備方法，例如有以下方法。在含有極性有機(jī)溶劑的水溶液中分散微粒(A液)，在與該含有極性有機(jī)溶劑的水溶液相同或不同的含極性有機(jī)溶劑的水溶液或極性有機(jī)溶劑中溶解脂質(zhì)(B液)，然后混合A液和B液。
本發(fā)明的利用脂質(zhì)膜被覆微粒的方法，具體例如可以舉出以下方法。
步驟1將微粒分散于含有極性有機(jī)溶劑的水溶液優(yōu)選含有乙醇等醇類的水溶液(懸浮)中。
步驟2將溶于與所述含極性有機(jī)溶劑的水溶液相同或不同的含極性有機(jī)溶劑的水溶液(優(yōu)選相同的含極性有機(jī)溶劑的水溶液或極性有機(jī)溶劑)中的脂質(zhì)添加到步驟1得到的懸浮液中，混合。此時(shí)，也可添加水溶性高分子衍生物，對(duì)于添加的水溶性高分子衍生物的量無(wú)特別限定。
步驟3在步驟2得到的混合液中加入少量水，進(jìn)行透析或蒸餾除去有機(jī)溶劑，減少混合液中極性有機(jī)溶劑的比例，溶解的脂質(zhì)在步驟2中添加水溶性高分子衍生物時(shí)脂質(zhì)和水溶性高分子衍生物聚集在微粒表面，在微粒表面形成脂質(zhì)膜，得到內(nèi)包微粒的封閉小囊。
本發(fā)明方法中使用的含極性有機(jī)溶劑的水溶液中極性有機(jī)溶劑的比例，無(wú)特別限定，只要能滿足微粒不溶解而存在、構(gòu)成被覆微粒的脂質(zhì)膜的成分溶解的條件即可，但因所用的溶劑、微粒、脂質(zhì)的種類而異，優(yōu)選為30％以上，更優(yōu)選為60-90％。另外，在上述步驟3中，減少后的混合液中極性有機(jī)溶劑的比例也無(wú)特別限定，只要能使溶解的脂質(zhì)在步驟2中添加水溶性高分子衍生物時(shí)脂質(zhì)與水溶性高分子衍生物一起聚集在微粒表面上從而在微粒表面形成脂質(zhì)膜即可，但水溶液中的極性有機(jī)溶劑的濃度優(yōu)選為50％以下。
本發(fā)明方法中使用的微粒相對(duì)于含有極性有機(jī)溶劑的水溶液或本發(fā)明方法得到的制劑的比例，無(wú)特別限定，只要該微粒能被脂質(zhì)膜被覆即可，但優(yōu)選為1μg/ml～1g/ml，更優(yōu)選為0.1～500mg/ml。
本發(fā)明方法中使用的脂質(zhì)相對(duì)于含有極性有機(jī)溶劑的水溶液或本發(fā)明方法得到的制劑的比例，無(wú)特別限定，只要微粒能被即可，但優(yōu)選1μg/ml～1g/ml，更優(yōu)選為0.1～400mg/ml。
與所用微粒種類無(wú)關(guān)，基本上能按與上述同樣的方法用脂質(zhì)膜被覆微粒。
本發(fā)明中使用的極性有機(jī)溶劑和脂質(zhì)，例如可以市售品。
本發(fā)明中使用的微?？梢宰鳛槭惺燮返玫剑部捎晒椒ㄖ苽?。
例如，在制備構(gòu)成微粒的脂質(zhì)體時(shí)，可以適用的脂質(zhì)體制備方法。公知的脂質(zhì)體制備方法有，Bangham等人的脂質(zhì)體制備法[J.Mol.Biol.，13，238(1965)]、乙醇注入法[J.Cell.Biol.，66，621(1975)]、弗氏壓碎法[FEBS Lett.，99，210(1979)]、凍結(jié)溶解法[Arch.Biochem.Biophys.，212，186(1981)]、反相蒸發(fā)法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，4194(1978)]、pH梯度法(日本專利第2572554號(hào)公報(bào)、日本專利第2659136號(hào)公報(bào)等)等。
另外，還可以任意地用非離子性表面活性劑、陽(yáng)離子性表面活性劑、陰離子性表面活性劑、多糖類或其衍生物、聚氧乙烯衍生物等對(duì)脂質(zhì)體表面進(jìn)行改性，這些經(jīng)過(guò)表面改性的脂質(zhì)體也可以作為本發(fā)明的微粒使用[Stealth Liposome，ed.By D.D.Lasic and F.Martin，CRCPress Inc.，F(xiàn)lorida，93-102(1995)]。
制備構(gòu)成微粒的脂質(zhì)體時(shí)，作為使脂質(zhì)體懸浮的溶液，除水之外，還可以利用酸、堿、各種緩沖液、生理鹽水、氨基酸輸液等。另外，還可在脂質(zhì)體懸浮液中添加檸檬酸、抗壞血酸、半胱氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)等抗氧劑。另外，作為等張化劑，例如可以添加甘油、葡萄糖、氯化鈉等。
將藥物和脂質(zhì)溶于乙醇等有機(jī)溶劑中，蒸餾除去溶劑后，添加生理，振蕩攪拌，形成脂質(zhì)體。
脂質(zhì)體內(nèi)包藥物，或藥物和脂質(zhì)體形成復(fù)合體之時(shí)或之后，可以添加水溶性高分子衍生物。
對(duì)脂質(zhì)體的平均粒徑無(wú)特別限定，可以根據(jù)需要自由選擇。作為調(diào)節(jié)平均粒徑的方法，例如有擠壓法、或?qū)⒋蟮亩鄬幽ぶ|(zhì)體(MLV)以機(jī)械粉碎(使用蒙托壓碎器、微流化器)的方法[R.H.Muller，S.Bentia，B.Bohm編著，“Emulsion and Nanosuspensions for theFormulation of Poorly Soluble Drugs”，High-Pressure HomogenizationTechniques for the Production of Liposome DispersionsPotential andLimitations，M.Brandl，267-294(1998)(Scientific Publishers Stuttgart，Germany)]等。
構(gòu)成微粒的藥物、脂質(zhì)聚集體、脂質(zhì)體、乳液中的微粒、天然高分子、合成高分子、金屬膠體、陽(yáng)離子脂質(zhì)、陰離子脂質(zhì)、微粒制劑和水溶性高分子衍生物中選出的2種以上的組合而成的復(fù)合體的形成方法，不只限于在水中混合藥物和脂質(zhì)或高分子等的方法，此時(shí)，如有必要還可以增加整粒步驟或無(wú)菌化步驟。復(fù)合體的形成可以在丙酮、乙醚等各種溶劑中進(jìn)行。
對(duì)于被覆本發(fā)明中使用的微粒和/或得到的微粒的脂質(zhì)膜，可以在其表面用抗體等蛋白質(zhì)、糖類、糖脂類、氨基酸、核酸、各種低分子化合物、高分子化合物等進(jìn)行修飾，也可以簡(jiǎn)單地在微粒和/或脂質(zhì)膜中添加使用這些物質(zhì)。
例如，為應(yīng)用于靶向定位，對(duì)于被覆的膜還可以進(jìn)一步用蛋白質(zhì)(包括抗體)、肽、脂肪酸類等修飾脂質(zhì)膜的表面[Stealth liposomes，ed.By D.D.Lasic and F.Martin，CRC Press Inc.，F(xiàn)lorida，93-102，(1995)]。
用本發(fā)明方法得到的脂質(zhì)膜被覆的微粒，可以直接使用，但根據(jù)使用目的、保存條件等，也可以加入甘露糖醇、乳糖、海藻糖、麥芽糖、甘氨酸等賦形劑進(jìn)行冷凍干燥。另外，也可加入甘油等冷凍保存劑進(jìn)行冷凍保存。也可以與適當(dāng)?shù)馁x形劑一起進(jìn)行造粒、干燥等操作，加工成膠囊劑、片劑、顆粒劑等口服制劑。
用本發(fā)明方法得到的脂質(zhì)膜被覆的微粒，除用水之外，還可以用酸、堿、各種緩沖液、生理鹽水、氨基酸輸液等懸浮。另外，還可在脂質(zhì)體懸浮液中加入檸檬酸、抗壞血酸、半胱氨酸、EDTAdeng抗氧劑。另外，作為等張化劑，例如可以添加甘油、葡萄糖、氯化鈉等。
用本發(fā)明方法得到的制劑，一般作為注射劑使用，但也可加工成口服制劑、滴鼻劑、滴眼劑、栓劑、吸入劑等。
本發(fā)明得到的制劑，例如可以用于改善血液成分等生物體成分中如血液中或消化道中的藥物穩(wěn)定性、降低副作用、增加向腫瘤等目標(biāo)臟器的聚集性、改善口服或經(jīng)粘膜的吸收等。
以下給出本發(fā)明的實(shí)施例和比較例。
實(shí)施例1在10mg的陰離子型葡聚糖熒光素(FD)(Molecular Probes制)、60mg的DOTAP(Avanti制)和24mg的PEG-DSPE(Avanti制)中加入3ml蒸餾水，用螺旋混合器震蕩攪拌。將該懸浮液在室溫下用0.4μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，加入4ml的乙醇。然后在該懸浮液中加入240mg的蛋黃磷脂酰膽堿(EggPC)和50mg的PEG-DSPE溶于1ml乙醇的溶液。在該懸浮液中緩慢加入92ml蒸餾水，調(diào)節(jié)至乙醇濃度達(dá)到5％以下。對(duì)得到的脂質(zhì)體懸浮液進(jìn)行超速離心分離(1小時(shí)、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加磷酸緩沖食鹽水溶液(PBS)，再次懸浮使總脂質(zhì)濃度達(dá)到30mg/ml，得到脂質(zhì)體懸浮液(制劑1)。
以動(dòng)態(tài)光散射法(DLS)[A model ELS-800，Otsuka Electronics Ltd.(ELS-800，大電子)，下同]測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑，為134nm。
實(shí)施例2在10mg FD、60mg的DOTAP和24mg的PEG-DSPE中加入3ml蒸餾水，用螺旋混合器震蕩攪拌。將該懸浮液在室溫下用0.4μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，加入4ml的乙醇。然后在該懸浮液中加入120mg的EggPC和25mg的PEG-DSPE溶于1ml乙醇的溶液。在該懸浮液中緩慢加入92ml蒸餾水，調(diào)節(jié)至乙醇濃度達(dá)到5％以下。對(duì)得到的脂質(zhì)體懸浮液進(jìn)行超速離心分離(1小時(shí)、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加PBS，再次懸浮使總脂質(zhì)濃度達(dá)到30mg/ml，得到脂質(zhì)體懸浮液(制劑2)。
以DLS測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑，為179nm。
實(shí)施例3在10mg的FD、60mg的DOTAP和24mg的PEG-DSPE中加入3ml蒸餾水，用螺旋混合器震蕩攪拌。將該懸浮液在室溫下用0.4μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，加入4ml的乙醇。然后在該懸浮液中加入60mg的EggPC和12.5mg的PEG-DSPE溶于1ml乙醇的溶液。在該懸浮液中緩慢加入92ml蒸餾水，調(diào)節(jié)至乙醇濃度達(dá)到5％以下。對(duì)得到的脂質(zhì)體懸浮液進(jìn)行超速離心分離(1小時(shí)、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加PBS，再次懸浮使總脂質(zhì)濃度達(dá)到30mg/ml，得到脂質(zhì)體懸浮液(制劑3)。
以DLS測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑，為184nm。
實(shí)施例4在10mg FD、60mg的DOTAP中加入3ml蒸餾水，用螺旋混合器震蕩攪拌。將該懸浮液在室溫下用0.4μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，加入4ml的乙醇。然后在該懸浮液中加入240mg的EggPC和74mg的PEG-DSPE溶于1ml乙醇的溶液。在該懸浮液中緩慢加入92ml蒸餾水，調(diào)節(jié)至乙醇濃度達(dá)到5％以下。對(duì)得到的脂質(zhì)體懸浮液進(jìn)行超速離心分離(1小時(shí)、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加PBS，再次懸浮使總脂質(zhì)濃度達(dá)到30mg/ml，得到脂質(zhì)體懸浮液(制劑4)。
以DLS測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑，為131nm。
實(shí)施例5在10mg FD和60mg的DOTAP中加入3ml蒸餾水，用螺旋混合器震蕩攪拌。將該懸浮液在室溫下用0.4μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，加入4ml的乙醇。然后在該懸浮液中加入240mg的EggPC溶于1ml乙醇的溶液。在該懸浮液中緩慢加入92ml蒸餾水，調(diào)節(jié)至乙醇濃度達(dá)到5％以下。對(duì)得到的脂質(zhì)體懸浮液進(jìn)行超速離心分離(1小時(shí)、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加PBS，再次懸浮使總脂質(zhì)濃度達(dá)到30mg/ml，得到脂質(zhì)體懸浮液(制劑5)。
以DLS測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑，為458nm。
實(shí)施例6在2.5mg胰島素-熒光素異硫氰酸酯(FITC)標(biāo)記體(F-Ins)(Sigma制)、30mg的DOTAP和12mg的PEG-DSPE中加入1.49ml蒸餾水和0.01ml的1mol/L氫氧化鈉水溶液，用螺旋混合器震蕩攪拌。將該懸浮液在室溫下用0.4μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，加入2ml的乙醇。然后在該懸浮液中加入120mg的EggPC和25mg的PEG-DSPE溶于0.5ml乙醇的溶液。在該懸浮液中緩慢加入46ml蒸餾水，調(diào)節(jié)至乙醇濃度達(dá)到5％以下。對(duì)得到的脂質(zhì)體懸浮液進(jìn)行超速離心分離(1小時(shí)、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加PBS，再次懸浮使總脂質(zhì)濃度達(dá)到30mg/ml，得到脂質(zhì)體懸浮液(制劑6)。
以DLS測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑，為132nm。
實(shí)施例7
按30mg/12mg/ml的比例混合DOTAP/PEG-DSPE/蒸餾水，用螺旋混合器震蕩攪拌。將該懸浮液在室溫下用0.4μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，再用0.05μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次。在該懸浮液0.5ml中加入以15mg/ml的濃度溶有熒光素異硫氰酸酯結(jié)合硫代磷酸酯(F-PS)(Cymedia制)的蒸餾水溶液0.25ml，加入1ml的乙醇。再在該懸浮液中加入以120mg/25mg/ml溶解的EggPC/PEG-DSPE/乙醇溶液0.25ml。在該懸浮液中緩慢加入23ml蒸餾水，調(diào)節(jié)至乙醇濃度達(dá)到5％以下。對(duì)得到的脂質(zhì)體懸浮液進(jìn)行超速離心分離(1小時(shí)、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加PBS，再次懸浮使總脂質(zhì)濃度達(dá)到30mg/ml，得到脂質(zhì)體懸浮液。相對(duì)于120重量份的EggPC，將50重量份的PEG-DSPE溶于少量的乙醇(脂質(zhì)體懸浮液4容量％)后，與脂質(zhì)體懸浮液混合，在70℃下加熱2分鐘。添加PBS調(diào)節(jié)總脂質(zhì)濃度為30mg/ml，得到脂質(zhì)體懸浮液(制劑7)。
以DLS測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑，為111nm。
實(shí)施例8按30mg/12mg/ml的比例混合DOTAP/PEG-DSPE/蒸餾水，用螺旋混合器震蕩攪拌。將該懸浮液在室溫下用0.4μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，再用0.05μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次。在該懸浮液0.4ml中加入以10mg/ml的濃度溶有F-PS的蒸餾水溶液0.2ml，加入0.8ml的乙醇。再在該懸浮液中加入以240mg/50mg/ml溶解的EggPC/PEG-DSPE/乙醇溶液0.2ml。在該懸浮液中緩慢加入18.4ml蒸餾水，調(diào)節(jié)至乙醇濃度達(dá)到5％以下。對(duì)得到的脂質(zhì)體懸浮液進(jìn)行超速離心分離(1小時(shí)、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加PBS，再次懸浮使總脂質(zhì)濃度達(dá)到30mg/ml，得到脂質(zhì)體懸浮液(制劑8)。
以DLS測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑，為112nm。
實(shí)施例9按30mg/12mg/ml的比例混合DOTAP/PEG-DSPE/蒸餾水，用螺旋混合器震蕩攪拌。將該懸浮液在室溫下用0.4μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，再用0.05μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次。在該懸浮液0.4ml中加入以15mg/ml的濃度溶有F-PS的蒸餾水溶液0.2ml，加入0.8ml的乙醇。再在該懸浮液中加入以240mg/50mg/ml溶解的EggPC/PEG-DSPE/乙醇溶液0.2ml。在該懸浮液中緩慢加入18.4ml蒸餾水，調(diào)節(jié)至乙醇濃度達(dá)到5％以下。對(duì)得到的脂質(zhì)體懸浮液進(jìn)行超速離心分離(1小時(shí)、110，000×g、25℃)，除去上清液。添加PBS，再次懸浮使總脂質(zhì)濃度達(dá)到30mg/ml，得到脂質(zhì)體懸浮液(制劑9)。
以DLS測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑，為137nm。
實(shí)施例10按30mg/12mg/ml的比例混合DOTAP/PEG-DSPE/蒸餾水，用螺旋混合器震蕩攪拌。將該懸浮液在室溫下用0.4μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，再用0.05μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次。在該懸浮液0.4ml中加入以17.5mg/ml的濃度溶有F-PS的蒸餾水溶液0.2ml，加入0.8ml的乙醇。再在該懸浮液中加入以240mg/50mg/ml溶解的EggPC/PEG-DSPE/乙醇溶液0.2ml。在該懸浮液中緩慢加入18.4ml蒸餾水，調(diào)節(jié)至乙醇濃度達(dá)到5％以下。對(duì)得到的脂質(zhì)體懸浮液進(jìn)行超速離心分離(1小時(shí)、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加PBS，再次懸浮使總脂質(zhì)濃度達(dá)到30mg/ml，得到脂質(zhì)體懸浮液(制劑10)。
以DLS測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑，為132nm。
實(shí)施例11按30mg/12mg/ml的比例混合DOTAP/PEG-DSPE/蒸餾水，用螺旋混合器震蕩攪拌。將該懸浮液在室溫下用0.4μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，再用0.05μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次。在該懸浮液0.4ml中加入以20mg/ml的濃度溶有F-PS的蒸餾水溶液0.2ml，加入0.8ml的乙醇。再在該懸浮液中加入以240mg/50mg/ml溶解的EggPC/PEG-DSPE/乙醇溶液0.2ml。在該懸浮液中緩慢加入18.4ml蒸餾水，調(diào)節(jié)至乙醇濃度達(dá)到5％以下。對(duì)得到的脂質(zhì)體懸浮液進(jìn)行超速離心分離(1小時(shí)、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加PBS，再次懸浮使總脂質(zhì)濃度達(dá)到30mg/ml，得到脂質(zhì)體懸浮液(制劑11)。
以DLS測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑，為164nm。
實(shí)施例12按30mg/12mg/ml的比例混合DOTAP/PEG-DSPE/蒸餾水，用螺旋混合器震蕩攪拌。將該懸浮液在室溫下用0.4μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，再用0.05μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次。在該懸浮液0.25ml中加入以15mg/ml的濃度溶有F-PS的蒸餾水溶液0.125ml，加入0.5ml的乙醇。再在該懸浮液中加入以240mg/100mg/ml溶解的EggPC/PEG-DSPE/乙醇溶液0.125ml。在該懸浮液中緩慢加入11.5ml蒸餾水，調(diào)節(jié)至乙醇濃度達(dá)到5％以下。對(duì)得到的脂質(zhì)體懸浮液進(jìn)行超速離心分離(1小時(shí)、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加PBS，再次懸浮使總脂質(zhì)濃度達(dá)到30mg/ml，得到脂質(zhì)體懸浮液(制劑12)。
以DLS測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑，為122nm。
實(shí)施例13按30mg/12mg/ml的比例混合DOTAP/PEG-DSPE/蒸餾水，用螺旋混合器震蕩攪拌。將該懸浮液在室溫下用0.4μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，再用0.05μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次。在該懸浮液0.25ml中加入以15mg/ml的濃度溶有F-PS的蒸餾水溶液0.125ml，加入0.5ml的乙醇。再在該懸浮液中加入以360mg/150mg/ml溶解的EggPC/PEG-DSPE/乙醇溶液0.125ml。在該懸浮液中緩慢加入11.5ml蒸餾水，調(diào)節(jié)至乙醇濃度達(dá)到5％以下。對(duì)得到的脂質(zhì)體懸浮液進(jìn)行超速離心分離(1小時(shí)、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加PBS，再次懸浮使總脂質(zhì)濃度達(dá)到30mg/ml，得到脂質(zhì)體懸浮液(制劑13)。
以DLS測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑，為165nm。
實(shí)施例14將30mg/ml的DOTAP和12mg/ml的PEG-DSPE懸浮液用螺旋混合器震蕩攪拌。將該懸浮液在室溫下用0.4μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，再用0.05μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，得到粒徑80nm左右的脂質(zhì)體懸浮液。用攪拌器攪拌下，在該懸浮液250μl中加入125μl的15mg/ml的F-PS水溶液，加入0.5ml的乙醇。再在該懸浮液中加入120mg的EggPC和25mg的聚氧乙烯硬化蓖麻油60(日本油脂制)溶于1ml乙醇的溶液125μl。在該懸浮液中緩慢加入11.5ml蒸餾水，調(diào)節(jié)至乙醇濃度達(dá)到5％以下。對(duì)得到的脂質(zhì)體懸浮液進(jìn)行超速離心分離(1小時(shí)、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加40μl的PBS再次懸浮，再用PBS稀釋，得到F-PS 3mg/ml的脂質(zhì)體懸浮液。相對(duì)于120重量份的EggPC，用少量乙醇溶解50重量份的PEG-DSPE(約脂質(zhì)體懸浮液的1/25容量)。將脂質(zhì)體懸浮液與PEG-DSPE乙醇溶液分別在70℃下加熱2分鐘。然后在PEG-DSPE乙醇溶液中添加脂質(zhì)體懸浮液，混合后在70℃下加熱2分鐘后，水冷。在得到的脂質(zhì)體懸浮液中加入PBS，稀釋至總脂質(zhì)濃度達(dá)到30mg/ml，得到脂質(zhì)體懸浮液(制劑14)。
以DLS測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑，為116nm。
實(shí)施例15將30mg/ml的DOTAP和12mg/ml的PEG-DSPE懸浮液用螺旋混合器震蕩攪拌。將該懸浮液在室溫下用0.4μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，再用0.05μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，得到粒徑80nm左右的脂質(zhì)體懸浮液。用攪拌器攪拌下，在該懸浮液500μl中加入250μl的15mg/ml的F-PS水溶液，加入1ml的乙醇。再在該懸浮液中加入120mg的EggPC和25mg的CREMOPHOREL(Sigma制)溶于1ml乙醇的溶液250μl。在該懸浮液中緩慢加入23ml蒸餾水，調(diào)節(jié)至乙醇濃度達(dá)到5％以下。對(duì)得到的脂質(zhì)體懸浮液進(jìn)行超速離心分離(1小時(shí)、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加40μl的PBS再次懸浮，再用PBS稀釋，得到F-PS 3mg/ml的脂質(zhì)體懸浮液。相對(duì)于120重量份的EggPC，用少量乙醇溶解50重量份的PEG-DSPE(約脂質(zhì)體懸浮液的1/25容量)。將脂質(zhì)體懸浮液與PEG-DSPE乙醇溶液分別在70℃下加熱2分鐘。然后在PEG-DSPE乙醇溶液中添加脂質(zhì)體懸浮液，混合后在70℃下加熱2分鐘后，水冷。在得到的脂質(zhì)體懸浮液中加入PBS，稀釋至總脂質(zhì)濃度達(dá)到30mg/ml，得到脂質(zhì)體懸浮液(制劑15)。
以DLS測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑，為140nm。
實(shí)施例16將30mg/ml的DOTAP和12mg/ml的PEG-DSPE懸浮液用螺旋混合器震蕩攪拌。將該懸浮液在室溫下用0.4μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，再用0.05μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，得到粒徑80nm左右的脂質(zhì)體懸浮液。用攪拌器攪拌下，在該懸浮液250μl中加入120μl的15mg/ml的F-PS水溶液，加入0.5ml的乙醇。再在該懸浮液中加入25mg的Tween80溶于120mg/ml EggPC乙醇溶液1ml后得到的溶液125μl。在該懸浮液中緩慢加入11.5ml蒸餾水，調(diào)節(jié)至乙醇濃度達(dá)到5％以下。對(duì)得到的脂質(zhì)體懸浮液進(jìn)行超速離心分離(1小時(shí)、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加40μl的PBS再次懸浮，再用PBS稀釋，得到F-PS 3mg/ml的脂質(zhì)體懸浮液。相對(duì)于120重量份的EggPC，用少量乙醇溶解50重量份的PEG-DSPE(約脂質(zhì)體懸浮液的1/25容量)。將脂質(zhì)體懸浮液與PEG-DSPE乙醇溶液分別在70℃下加熱2分鐘。然后在PEG-DSPE乙醇溶液中添加脂質(zhì)體懸浮液，混合后在70℃下加熱2分鐘后，水冷。在得到的脂質(zhì)體懸浮液中加入PBS，稀釋至總脂質(zhì)濃度達(dá)到30mg/ml，得到脂質(zhì)體懸浮液(制劑16)。
以DLS測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑，為151nm。
實(shí)施例17將30mg/ml的DOTAP和12mg/ml的PEG-DSPE懸浮液用螺旋混合器震蕩攪拌。將該懸浮液在室溫下用0.4μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，再用0.05μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，得到粒徑80nm左右的脂質(zhì)體懸浮液。用攪拌器攪拌下，在該懸浮液250μl中加入125μl的15mg/ml的F-PS水溶液，加入0.5ml的乙醇。再在該懸浮液中加入120mg的EggPC、120mg的Span20(關(guān)東化學(xué)制)、50mg的PEG-DSPE溶于2ml乙醇的溶液125μl。在該懸浮液中緩慢加入11.5ml蒸餾水，調(diào)節(jié)至乙醇濃度達(dá)到5％以下。對(duì)得到的脂質(zhì)體懸浮液進(jìn)行超速離心分離(1小時(shí)、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加40μl的PBS再次懸浮，再用PBS稀釋，得到F-PS 3mg/ml的脂質(zhì)體懸浮液。相對(duì)于120重量份的EggPC，用少量乙醇溶解50重量份的PEG-DSPE(約脂質(zhì)體懸浮液的1/25容量)。將脂質(zhì)體懸浮液與PEG-DSPE乙醇溶液分別在70℃下加熱2分鐘。然后在PEG-DSPE乙醇溶液中添加脂質(zhì)體懸浮液，混合后在70℃下加熱2分鐘后，水冷。在得到的脂質(zhì)體懸浮液中加入PBS，稀釋至總脂質(zhì)濃度達(dá)到30mg/ml，得到脂質(zhì)體懸浮液(制劑17)。
以DLS測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑，為131nm。
實(shí)施例18將30mg/ml的DOTAP和12mg/ml的PEG-DSPE懸浮液用螺旋混合器震蕩攪拌。將該懸浮液在室溫下用0.4μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，再用0.05μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，得到粒徑80nm左右的脂質(zhì)體懸浮液。用攪拌器攪拌下，在該懸浮液500μl中加入250μl的15mg/ml的F-PS水溶液，加入1ml的乙醇。再在該懸浮液中加入120mg的EggPC和25mg的CREMOPHOREL(Sigma制)溶于1ml乙醇的溶液250μl。在該懸浮液中緩慢加入23ml蒸餾水，調(diào)節(jié)至乙醇濃度達(dá)到5％以下。對(duì)得到的脂質(zhì)體懸浮液進(jìn)行超速離心分離(1小時(shí)、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加40μl的PBS再次懸浮，再用PBS稀釋，得到F-PS 3mg/ml的脂質(zhì)體懸浮液。相對(duì)于120重量份的EggPC，用少量乙醇溶解50重量份的PEG-DSPE(約脂質(zhì)體懸浮液的1/25容量)。將脂質(zhì)體懸浮液與PEG-DSPE乙醇溶液分別在70℃下加熱2分鐘。然后在PEG-DSPE乙醇溶液中添加脂質(zhì)體懸浮液，混合后在70℃下加熱2分鐘后，水冷。在得到的脂質(zhì)體中加入PBS，稀釋至總脂質(zhì)濃度達(dá)到30mg/ml，得到脂質(zhì)體懸浮液(制劑18)。
以DLS測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑，為133nm。
實(shí)施例19在589mg的蛋黃卵磷脂(KUPPY制)中加入50mmol/L的磷酸二氫鉀水溶液11.8ml，用螺旋混合器震蕩攪拌。將該懸浮液在室溫下用0.1μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾30次。將該懸浮液40μl與1mg/ml的G-CSF(協(xié)和發(fā)酵制，narthoglasstym，基因重組人G-CSF變異型)水溶液1ml和2mg/ml葡聚糖硫酸鈉(默克制)水溶液1ml的混合液混合，用1mol/L和0.1mol/L的鹽酸水溶液(關(guān)東化學(xué)制)將混合液調(diào)節(jié)為pH4。在該混合液500μl中加入753μl的乙醇，加入50mg/ml的蛋黃卵磷脂乙醇溶液80μl。在該懸浮液中緩慢加入7ml蒸餾水，調(diào)節(jié)至乙醇濃度達(dá)到10％以下。對(duì)得到的脂質(zhì)體懸浮液進(jìn)行超速離心分離(1小時(shí)、146,000×g、25℃)，除去上清液。加水使總量達(dá)到500μl再次懸浮，得到脂質(zhì)體懸浮液(制劑19)。
以DLS測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑，為316nm。
實(shí)施例20在588mg的蛋黃卵磷脂和205mg的PEG-DSPE中室溫下加入適量乙醇，使之溶解后，蒸餾除去乙醇，減壓干燥。向其中加入50mmol/L的磷酸二氫鉀水溶液11.8ml，用螺旋混合器震蕩攪拌。將該懸浮液在室溫下用0.1μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾30次。將該懸浮液40μl與1mg/ml的G-CSF水溶液1ml和2mg/ml葡聚糖硫酸鈉水溶液1ml的混合液混合，用1mol/L和0.1mol/L的鹽酸水溶液將混合液調(diào)節(jié)為pH4。在該混合液500μl中加入753μl的乙醇，再加入含有50mg/ml的蛋黃卵磷脂、16.7mg/ml PEG-DSPE的乙醇溶液80μl。在該懸浮液中緩慢加入7ml蒸餾水，調(diào)節(jié)至乙醇濃度達(dá)到10％以下。對(duì)得到的脂質(zhì)體懸浮液進(jìn)行超速離心分離(1小時(shí)、146,000×g、25℃)，除去上清液。加水使總量達(dá)到500μl再次懸浮，得到脂質(zhì)體懸浮液(制劑20)。
以DLS測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑，為316nm。
實(shí)施例21在598mg的蛋黃卵磷脂和68.8mg的蔗糖脂肪酸酯(三菱化成制)中在室溫下加入適量乙醇溶解后，蒸餾除去乙醇，減壓干燥。向其中加入50mmol/L的磷酸二氫鉀水溶液12.0ml，用螺旋混合器震蕩攪拌。將該懸浮液在室溫下用0.1μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾30次。將該懸浮液40μl與1mg/ml的G-CSF水溶液1ml和2mg/ml葡聚糖硫酸鈉水溶液1ml的混合液混合，用1mol/L和0.1mol/L的鹽酸水溶液將混合液調(diào)節(jié)為pH4。在該混合液500μl中加入753μl的乙醇，加入含有50mg/ml的蛋黃卵磷脂和4.5mg/ml蔗糖脂肪酸酯的乙醇溶液80μl。在該懸浮液中緩慢加入7ml蒸餾水，調(diào)節(jié)至乙醇濃度達(dá)到10％以下。對(duì)得到的脂質(zhì)體懸浮液進(jìn)行超速離心分離(1小時(shí)、146,000×g、25℃)，除去上清液。加水使總量達(dá)到500μl，得到脂質(zhì)體懸浮液(制劑21)。
以DLS測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑，為242nm。
實(shí)施例22在150mg的蛋黃卵磷脂和60mg的PEG-DSPE中加入5ml蒸餾水，用螺旋混合器震蕩攪拌。將該懸浮液在室溫下用0.08μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次。將該懸浮液571μl與含有1.4mg/ml G-CSF的磷酸二氫鉀水溶液119μl和2mg/ml葡聚糖硫酸鈉水溶液167μl的混合液混合，用1mol/L和0.1mol/L的鹽酸水溶液將混合液調(diào)節(jié)為pH4。在該混合液0.5ml中加入666μl的乙醇，加入120mg蛋黃磷脂酰膽堿(EggPC、日本油脂制)和25mgPEG-DSPE溶于1ml乙醇的溶液167μl。在該懸浮液中緩慢加入47ml蒸餾水，調(diào)節(jié)至乙醇濃度達(dá)到5％以下。對(duì)得到的脂質(zhì)體懸浮液進(jìn)行超速離心分離(1小時(shí)、146,000×g、4℃)，除去上清液。加水使總量達(dá)到500μl，得到脂質(zhì)體懸浮液(制劑22)。
以DLS測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑，為126nm。
實(shí)施例23在150mg的蛋黃卵磷脂和60mg的PEG-DSPE中加入5ml蒸餾水，用螺旋混合器震蕩攪拌。將該懸浮液在室溫下用0.08μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，再用0.03μm聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾7次。將該懸浮液286μl與含有1.4mg/ml G-CSF的磷酸二氫鉀水溶液119μl和2mg/ml葡聚糖硫酸鈉水溶液119μl的混合液286μl混合，用1mol/L和0.1mol/L的鹽酸水溶液將混合液調(diào)節(jié)為pH4。在該混合液0.25ml中加入333μl的乙醇，再加入120mg蛋黃磷脂酰膽堿和25mgPEG-DSPE溶于1ml乙醇的溶液84μl。在該懸浮液中緩慢加入23.5ml蒸餾水，調(diào)節(jié)至乙醇濃度達(dá)到5％以下。對(duì)得到的脂質(zhì)體懸浮液進(jìn)行超速離心分離(1小時(shí)、146,000×g、4℃)，除去上清液。加入磷酸二氫鉀水溶液再懸浮，得到脂質(zhì)體懸浮液(制劑23)。
以DLS測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑，為146nm。
實(shí)施例24在150mg的蛋黃卵磷脂和60mg的PEG-DSPE中加入5ml蒸餾水，用螺旋混合器震蕩攪拌。將該懸浮液在室溫下用0.08μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，再用0.05μm聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次。將該懸浮液428μl與含有1.4mg/ml G-CSF的磷酸二氫鉀水溶液89μl和2mg/ml葡聚糖硫酸鈉水溶液125μl的混合液混合，用1mol/L和0.1mol/L的鹽酸水溶液將混合液調(diào)節(jié)為pH4。在該混合液0.5ml中加入666μl的乙醇，再加入120mg蛋黃磷脂酰膽堿和25mg PEG-DSPE溶于1ml乙醇的溶液167μl。在該懸浮液中緩慢加入47ml蒸餾水，調(diào)節(jié)至乙醇濃度達(dá)到5％以下。對(duì)得到的脂質(zhì)體懸浮液進(jìn)行超速離心分離(1小時(shí)、146,000×g、4℃)，除去上清液。加入磷酸二氫鉀水溶液再懸浮，得到脂質(zhì)體懸浮液(制劑24)。
以DLS測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑，為134nm。
實(shí)施例25在150mg的蛋黃卵磷脂和60mg的PEG-DSPE中加入5ml蒸餾水，用螺旋混合器震蕩攪拌。將該懸浮液在室溫下用0.08μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次，再用0.05μm聚碳酸酯膜過(guò)濾器過(guò)濾20次。將該懸浮液500μl與含有1,000,000units/ml干擾素α-2b(ResearchDiagnostics制)的PBS溶液20μl、2mg/ml葡聚糖硫酸鈉水溶液150μl和蒸餾水80μl的混合液混合，用1mol/L和0.1mol/L的鹽酸水溶液將混合液調(diào)節(jié)為pH4。在該混合液0.5ml中加入666μl的乙醇，再加入120mg蛋黃磷脂酰膽堿和25mg PEG-DSPE溶于1ml乙醇的溶液167μl。在該懸浮液中緩慢加入47ml蒸餾水，調(diào)節(jié)至乙醇濃度達(dá)到5％以下。對(duì)得到的脂質(zhì)體懸浮液進(jìn)行超速離心分離(1小時(shí)、146,000×g、4℃)，除去上清液。加入磷酸二氫鉀水溶液再懸浮，得到脂質(zhì)體懸浮液(制劑25)。
以DLS測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑，為164nm。
比較例1將215mgEggPC、61mg的DOTAP和54mg的膽固醇(chol)溶于氯仿中后，減壓下除去溶劑。在得到的薄膜上添加FD水溶液(2mg/ml)5ml。將該懸浮液在室溫下用0.4μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾20次。添加PBS，調(diào)節(jié)總脂質(zhì)濃度達(dá)到30mg/ml，得到脂質(zhì)體懸浮液(制劑a)。
以DLS測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑，為134nm。
比較例2將215mg EggPC、61mg的DOTAP和54mg的膽固醇溶于氯仿中后，減壓下除去溶劑。在得到的薄膜上添加FD水溶液(2mg/ml)5ml。將該懸浮液在室溫下用0.4μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾20次。添加濃度為1471mg/ml的PEG-DSPE的乙醇溶液0.05ml后，在70℃下加熱5分鐘，用PEG被覆脂質(zhì)體表面。添加PBS，調(diào)節(jié)總脂質(zhì)濃度達(dá)到30mg/ml，得到脂質(zhì)體懸浮液(制劑b)。
以DLS測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑，為143nm。
比較例3將300mg的氫化大豆磷脂酰膽堿(HSPC)、100mg的膽固醇和100mg的PEG-DSPE溶于氯仿中后，減壓下除去溶劑。在得到的薄膜上添加FD水溶液(18.8mg/ml)8ml。將該懸浮液在70℃下用0.4μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾4次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾10次。對(duì)得到的脂質(zhì)體懸浮液進(jìn)行超速離心分離(1小時(shí)、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加PBS，調(diào)節(jié)總脂質(zhì)濃度達(dá)到30mg/ml，得到脂質(zhì)體懸浮液(制劑c)。
以DLS測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑，為149nm。
比較例4將215mg的EggPC、61mg的DOTAP和54mg的膽固醇溶于氯仿中后，減壓下除去溶劑。在得到的薄膜上添加FD水溶液(2mg/ml)8ml。將該懸浮液在室溫下用0.4μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾20次。對(duì)得到的脂質(zhì)體懸浮液進(jìn)行超速離心分離(1小時(shí)、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加PBS再次懸浮使總脂質(zhì)濃度達(dá)到30mg/ml，得到脂質(zhì)體懸浮液(制劑d)。
以DLS測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑，為141nm。
比較例5將215mg的EggPC、61mg的DOTAP和54mg的膽固醇溶于氯仿中后，減壓下除去溶劑。在得到的薄膜上添加FD水溶液(2mg/ml)5ml。將該懸浮液在室溫下用0.4μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾20次。添加濃度為1471mg/ml的PEG-DSPE的乙醇溶液0.05ml之后，在70℃下加熱5分鐘，用PEG被覆脂質(zhì)體表面。對(duì)得到的脂質(zhì)體懸浮液進(jìn)行超速離心分離(1小時(shí)、110,000×g、25℃)，除去上清液。添加PBS再次懸浮使總脂質(zhì)濃度達(dá)到30mg/ml，得到脂質(zhì)體懸浮液(制劑e)。
以DLS測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑，為139nm。
比較例6使F-PS溶于PBS中，得到F-PS溶液(制劑f)。
比較例7按30mg/12mg/ml的比例混合DOTAP/PEG-DSPE/蒸餾水，用螺旋混合器振蕩攪拌。將該懸浮液在室溫下用0.4μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾20次，再用0.1μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾20次，再用0.05μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾20次。在該懸浮液0.5ml中添加15mg/ml的F-PS蒸餾水溶液0.25ml，得到總脂質(zhì)濃度為28mg/ml的脂質(zhì)體懸浮液(制劑g)。
以DLS測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑，為108nm。
以下利用試驗(yàn)例說(shuō)明本發(fā)明的效果。
試驗(yàn)例1對(duì)實(shí)施例1～5中制備的制劑1～5和比較例1～5中制備的制劑a～e進(jìn)行超速離心分離(1小時(shí)，110,000×g，25℃)。為定量各制劑中的FD和超速離心分離后上清液中的FD，使用熒光微量培養(yǎng)板讀出器，以激發(fā)波長(zhǎng)485nm、熒光波長(zhǎng)530nm測(cè)定熒光強(qiáng)度。另外，利用磷脂CTESTWACO(和光純藥制)以酶法定量各制劑的脂質(zhì)體中磷脂酰膽堿(PC)。從PC濃度以加料比換算總脂質(zhì)濃度。按下式(1)計(jì)算出FD的單位脂質(zhì)封入效率和超速離心分離的內(nèi)包率。
單位脂質(zhì)的封入效率(mgFD/mg總脂質(zhì))＝(A1-C1)/B1(1)A1各制劑中的FD量(mg/ml)B1各制劑中的總脂質(zhì)量(mg/ml)C1上清液中的FD量(mg/ml)由超速離心分離得到的內(nèi)包率(％)＝[(A1-C1)÷B1]/(D1÷E1)×100(2)A1各制劑中的FD量(mg/ml)B1各制劑中的總脂質(zhì)量(mg/ml)C1上清液中的FD量(mg/ml)D1實(shí)施例1～5或比較例1～5中FD加入量(mg/ml)E1實(shí)施例1～5或比較例1～5中加入總脂質(zhì)量(mg/ml)結(jié)果在表1和表2中給出。
表1單位脂質(zhì)的封入效率

表2由超速離心分離得到的內(nèi)包率

由表1可知，制劑1～5的脂質(zhì)體中制劑a和c具有同樣的高封入效率，但未考慮加入的FD量/總脂質(zhì)量。制備制劑1～5和a～e時(shí)的加入量分別不同，特別是制劑c，相對(duì)于脂質(zhì)而言，使用了大量的FD進(jìn)行制備，如果考慮到加入量，制劑1～5和a的脂質(zhì)體相對(duì)于總脂質(zhì)量來(lái)說(shuō)是FD量高的脂質(zhì)體。
表2中給出的內(nèi)包率是將表1的結(jié)果除以加入時(shí)的FD量/總脂質(zhì)量后得到的值的百分率，反應(yīng)了加入時(shí)的FD量/總脂質(zhì)量。由表2可知，制劑1～5和a的脂質(zhì)體中FD內(nèi)包率較高，而制劑b～e的脂質(zhì)體中內(nèi)包率較低。這表明制劑b～e的脂質(zhì)體中大量存在未被內(nèi)包的FD(游離)，在制備過(guò)程或內(nèi)包率的分析過(guò)程中游離的FD被除去。由該結(jié)果可知，在制劑b～e中，加入的FD中被封入脂質(zhì)體中或牢固結(jié)合(靜電吸附)在脂質(zhì)體表面的FD少，被只有很少的FD被有效利用。
試驗(yàn)例2在實(shí)施例1～5中制備的制劑1～5和比較例1～5中制備的制劑a～e的各0.02ml中加入PBS1.98ml，混合，作為試樣溶液。混合之后立即將該試樣溶液0.5ml進(jìn)行凝膠過(guò)濾(Sepharose CL-4B，φ10mm×20cm，流動(dòng)相PBS，試樣添加量2ml，級(jí)分采集量約2ml)。分離脂質(zhì)體級(jí)分和未被內(nèi)包在脂質(zhì)體中的成分的級(jí)分，與試驗(yàn)例1同樣測(cè)定溶出液的熒光強(qiáng)度。由凝膠過(guò)濾得到的內(nèi)包率用式(3)算出。
由凝膠過(guò)濾得到的內(nèi)包率(％)＝[F1/(F1+G1)]×100 (3)F1脂質(zhì)體級(jí)分中的FD量(mg)G1未被內(nèi)包在脂質(zhì)體中的成分的級(jí)分中FD量(mg)結(jié)果在表3中給出。
表3由凝膠過(guò)濾得到的內(nèi)包率

在凝膠過(guò)濾中，不只是游離的FD，牢固地結(jié)合(靜電吸附)在脂質(zhì)體表面的FD也被除去。另外，制劑的穩(wěn)定性差的情況下，存在于內(nèi)水相中的FD部分漏出。由表3可知，制劑1～5、c和e的脂質(zhì)體內(nèi)包率高。這表明在脂質(zhì)體的內(nèi)水相中存在很多FD。但是，在表3中未考慮到加入時(shí)FD量/總脂質(zhì)量，因?yàn)橄鄬?duì)于脂質(zhì)而言在制劑c中使用了大量的FD進(jìn)行制備，內(nèi)包率當(dāng)然高。另一方面，制劑a、b和d的值較低，F(xiàn)D未被牢固地封入脂質(zhì)體內(nèi)，可以說(shuō)是穩(wěn)定性差的制劑。
表2中給出了制造效率，表3中給出了脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。由表2和表3可知，制劑a雖然制造效率好，但不是十分穩(wěn)定，而制劑c和e雖然穩(wěn)定，但制造效率差，進(jìn)而，制劑b和d的制造效率和穩(wěn)定性都差，另一方面，制劑1～5的制造效率、穩(wěn)定性都好。在制劑1～5中，F(xiàn)D被牢固地包封在脂質(zhì)體內(nèi)部。即，F(xiàn)D-陽(yáng)離子脂質(zhì)復(fù)合體被脂質(zhì)被覆。
試驗(yàn)例3將實(shí)施例6中制備的制劑6進(jìn)行超速離心分離(1小時(shí)，110,000×g，25℃)。為定量制劑6中的F-Ins和超速離心分離后的上清液中的F-Ins，使用熒光微量培養(yǎng)板讀出器，測(cè)定激發(fā)波長(zhǎng)485nm、熒光波長(zhǎng)530nm下的熒光強(qiáng)度。另外，對(duì)制劑脂質(zhì)體中的PC利用磷脂C TESTWACO(和光純藥制)以酶法進(jìn)行定量。由PC濃度按加入比換算總脂質(zhì)濃度。F-Ins對(duì)脂質(zhì)體的單位脂質(zhì)封入效率和超離心分離得到的內(nèi)包率由式(4)式(5)算出。
單位脂質(zhì)的封入效率(mgF-Ins/mg總脂質(zhì))＝(A2-C2)/B2(4)A2制劑6中的F-Ins量(mg/ml)B2制劑6中的總脂質(zhì)量(mg/ml)C2上清液中的F-Ins量(mg/ml)由超速離心分離得到的內(nèi)包率(％)＝[(A2-C2)÷B2]/(D2÷E2)×100(5)A2制劑6中的F-Ins量(mg/ml)B2制劑6中的總脂質(zhì)量(mg/ml)
C2上清液中的F-Ins量(mg/ml)D2實(shí)施例6中加入F-Ins量(mg/ml)E2實(shí)施例6中加入總脂質(zhì)量(mg/ml)結(jié)果在表4和表5中給出。
表4單位脂質(zhì)的封入效率

表5由超速離心分離得到的內(nèi)包率

由表4可知，制劑6中盡管單位脂質(zhì)的F-Ins加入量很少，但F-Ins的單位脂質(zhì)封入效率還是很高。
由超速離心分離得到的內(nèi)包率中，牢固地結(jié)合在脂質(zhì)體表面的F-Ins也被作為內(nèi)包物測(cè)定。由表5可知，制劑6的脂質(zhì)體與制劑1-5的脂質(zhì)體相同，具有很高的內(nèi)包率。
試驗(yàn)例4在實(shí)施例6制備的制劑6(0.02ml)中加入1.98ml的PBS，混合，作為試樣溶液?；旌现罅⒓磳⒃撛嚇尤芤?.5ml進(jìn)行凝膠過(guò)濾(Sepharose CL-4B，φ10mm×20cm，流動(dòng)相PBS，試樣添加量2ml，級(jí)分采集量約2ml)。分離脂質(zhì)體級(jí)分和未被內(nèi)包在脂質(zhì)體中的成分的級(jí)分，與試驗(yàn)例3同樣測(cè)定溶出液的熒光強(qiáng)度。由凝膠過(guò)濾得到的內(nèi)包率用式(6)算出。
由凝膠過(guò)濾得到的內(nèi)包率(％)＝[F2/(F2+G2)]×100 (6)F2脂質(zhì)體級(jí)分中的F-Ins量(mg)G2未被內(nèi)包在脂質(zhì)體中的成分的級(jí)分中F-Ins量(mg)結(jié)果在表6中給出。
表6由凝膠過(guò)濾得到的內(nèi)包率

去除牢固結(jié)合在脂質(zhì)體表面上的F-Ins之后測(cè)定凝膠過(guò)濾得到的內(nèi)包率。由表6可知，制劑6的脂質(zhì)體與制劑1-5相同，內(nèi)包率高，在脂質(zhì)體的內(nèi)水相中存在較多的F-Ins。即，制劑6可以說(shuō)是F-Ins牢固地被封入脂質(zhì)體內(nèi)、穩(wěn)定性高的制劑，F(xiàn)-Ins-脂質(zhì)復(fù)合體可由脂質(zhì)被覆。
試驗(yàn)例5將實(shí)施例7～13中制備的制劑7～13進(jìn)行超速離心分離(1小時(shí)，110,000×g，25℃)。為定量各制劑中的F-PS和超速離心分離后的上清液中的F-PS，使用熒光微量培養(yǎng)板讀出器，測(cè)定激發(fā)波長(zhǎng)485nm、熒光波長(zhǎng)530nm下的熒光強(qiáng)度。另外，對(duì)各制劑脂質(zhì)體中的PC利用磷脂C TESTWACO(和光純藥制)以酶法進(jìn)行定量。由PC濃度按加入比換算總脂質(zhì)濃度。F-PS在脂質(zhì)體上的單位脂質(zhì)封入效率和超離心分離得到的內(nèi)包率由下式(7)和式(8)算出。
單位脂質(zhì)的封入效率(mgF-Ins/mg總脂質(zhì))＝(A3-C3)/B3(7)A3各制劑中的F-PS量(mg/ml)B3各制劑中的總脂質(zhì)量(mg/ml)C3上清液中的F-PS量(mg/ml)由超速離心分離得到的內(nèi)包率(％)＝[(A3-C3)÷B3]/(D3÷E3)×100(8)A3各制劑中的F-PS量(mg/ml)B3各制劑中的總脂質(zhì)量(mg/ml)C3上清液中的F-PS量(mg/ml)D3實(shí)施例7～13中加入F-PS量(mg/ml)E3實(shí)施例7～13中加入總脂質(zhì)量(mg/ml)結(jié)果在表7和表8中給出。
表7單位脂質(zhì)的封入效率

表8由超速離心分離得到的內(nèi)包率

表7表明制劑7-13中F-PS的單位脂質(zhì)的封入效率很高。
由超速離心分離得到的內(nèi)包率中，牢固結(jié)合在脂質(zhì)體表面的F-PS也被作為內(nèi)包物質(zhì)而被測(cè)定。表8表明制劑7-13的脂質(zhì)體是F-PS的內(nèi)包率高的脂質(zhì)體。
試驗(yàn)例6在實(shí)施例7-9、11和12制備的制劑7-9、11和12的各0.02ml中加入1.98ml的PBS，混合，制成試樣溶液?；旌现罅⒓磳?duì)試樣溶液0.5ml凝膠過(guò)濾(Sepharose CL-4B，φ10mm×20cm，流動(dòng)相PBS，試樣添加量2ml，級(jí)分采集量約2ml)。分離脂質(zhì)體級(jí)分和未被內(nèi)包在脂質(zhì)體中成分的級(jí)分，與試驗(yàn)例5同樣測(cè)定溶出液的熒光強(qiáng)度。由凝膠過(guò)濾得到的內(nèi)包率用式(9)算出。
由凝膠過(guò)濾得到的內(nèi)包率(％)＝[F3/(F3+G3)]×100 (6)F3脂質(zhì)體級(jí)分中的F-PS量(mg)G3未被內(nèi)包在脂質(zhì)體中的成分的級(jí)分中F-PS量(mg)結(jié)果在表9中給出。
表9由凝膠過(guò)濾得到的內(nèi)包率

去除牢固結(jié)合在脂質(zhì)體表面上的F-PS之后測(cè)定凝膠過(guò)濾得到的內(nèi)包率。由表9可知，制劑7-9、11和12的脂質(zhì)體內(nèi)包率高，在脂質(zhì)體的內(nèi)水相中存在較多的F-PS。即，制劑7-9、11和12可以說(shuō)是F-PS牢固地被封入脂質(zhì)體內(nèi)、穩(wěn)定性高的制劑，F(xiàn)-PS-脂質(zhì)復(fù)合體可由脂質(zhì)被覆。
試驗(yàn)例7進(jìn)行腫瘤轉(zhuǎn)移性的比較。將人腎臟癌細(xì)胞Caki-1株的2mm見(jiàn)方的腫瘤切片移植到BALB/cAJcl-nu系6周齡NUDO小鼠(日本KUREA)的右體例皮下，將移植20天后腫瘤體積達(dá)到102-349mm3的小鼠按每組3只分組，將實(shí)施例7中制備的制劑7和比較例6中制備的制劑f以F-PS25mg/kg的容量，用注射筒(26G，1ml，Termo制)在小鼠尾靜脈給藥。經(jīng)時(shí)性地摘出腫瘤，將腫瘤勻化，與試驗(yàn)例5同樣測(cè)定勻化物中的熒光強(qiáng)度。算出各時(shí)點(diǎn)的腫瘤內(nèi)F-PS量(μg/g)，評(píng)價(jià)F-PS的腫瘤轉(zhuǎn)移性。
結(jié)果在

圖1中給出。
圖1表明給予制劑7的小鼠比給予制劑f的小鼠的F-PS的轉(zhuǎn)移量增加。
試驗(yàn)例8用電子顯微鏡觀察實(shí)施例1中制備的制劑1的形態(tài)。在1％的鉬酸銨水溶液(用氨水調(diào)pH為7.3)中添加制劑1使總脂質(zhì)濃度達(dá)到0.5mg/ml。將其滴加到裝有火棉膠膜的篩網(wǎng)(400目，日新EM)上，約1分鐘后用濾紙吸取多余的水分，使其干燥。用透射電子顯微鏡(H-7000型，日立)以加速電壓75kV觀察。
結(jié)果表明在制劑1中，存在很多內(nèi)部具有與包圍外側(cè)的膜形狀不同的團(tuán)塊的粒子。即，該結(jié)果表明內(nèi)部粒子被脂質(zhì)雙層膜被覆。
試驗(yàn)例9將實(shí)施例1中制備的制劑1和比較例1和2中制備的制劑a和b給予到尿烷麻醉下的CD(SD)IGS雄性大鼠(體重200-300g，每組2或3只)的大腿靜脈中(給藥量與總脂質(zhì)10mg/kg相當(dāng))。用經(jīng)肝素處理過(guò)的注射器經(jīng)時(shí)從頸靜脈采血，離心分離(5分鐘，10,000×g，4℃)后，與試驗(yàn)例1同樣測(cè)定血漿中的FD熒光強(qiáng)度，算出血漿中FD濃度。
結(jié)果在圖2中給出。
圖2表明給予制劑1的大鼠與給予制劑a或b的大鼠相比，F(xiàn)D的血漿中濃度推移較高。即，F(xiàn)D-脂質(zhì)復(fù)合體被脂質(zhì)被覆后改善了血中滯留性。
試驗(yàn)例10將實(shí)施例7-13中制備的制劑7-13和比較例6中制備的制劑f給予到尿烷麻醉下的CD(SD)IGS雄性大鼠(體重200-300g，每組2只)的大腿靜脈中(給藥量與總脂質(zhì)10mg/kg相當(dāng))。用經(jīng)肝素處理過(guò)的注射器經(jīng)時(shí)從頸靜脈采血，離心分離(5分鐘，10,000×g，4℃)后，與試驗(yàn)例5同樣測(cè)定血漿中的FD熒光強(qiáng)度，算出血漿中FD濃度。
結(jié)果在圖3中給出。
圖3表明給予制劑7-13的大鼠與給予制劑f的大鼠相比，F(xiàn)D的血漿中濃度推移都較高。
試驗(yàn)例11將實(shí)施例7中制備的制劑7和比較例6-7中制備的制劑f-g由BALB/cAJcl雄性小鼠(體重20-30g，每組2或3只)的尾靜脈給藥(給藥量與總脂質(zhì)10mg/kg相當(dāng))。在乙醚麻醉下，用經(jīng)肝素處理過(guò)的注射器從大腿靜脈采血，離心分離(5分鐘，10,000×g，4℃)后，與試驗(yàn)例5同樣測(cè)定血漿中的F-PS熒光強(qiáng)度，算出血漿中的F-PS濃度。
結(jié)果在圖4中給出。
圖4表明，與給予制劑f-g的小鼠中給予F-PS后迅速?gòu)难獫{中消失相比，給以制劑7的小鼠中F-PS的血漿中濃度推移較高。
試驗(yàn)例12將實(shí)施例13-18中制備的制劑13-18進(jìn)行超速離心分離(1小時(shí)，110,000×g，25℃)。為定量各制劑中的F-PS和超速離心分離后的上清液中的F-PS，使用熒光微量培養(yǎng)板讀出器，測(cè)定激發(fā)波長(zhǎng)485nm、熒光波長(zhǎng)530nm下的熒光強(qiáng)度。由下述式(10)算出F-PS在脂質(zhì)體上由超速離心分離得到的內(nèi)包率。
由超速離心分離得到的內(nèi)包率(％)＝[(A4-B4)]/B4×100 (10)A4各制劑中的F-PS量(mg/ml)B4上清液中的F-PS量(mg/ml)結(jié)果在表10中給出。
表10由超速離心分離得到的內(nèi)包率

試驗(yàn)例13
在實(shí)施例7和14-18中制備的制劑7和14-18的各0.08ml中加入胎牛血清(FBS)7.92ml，混合，作為試樣溶液。在混合之后(0小時(shí))和37℃下放置6-168小時(shí)后取樣，將各試樣溶液0.5ml凝膠過(guò)濾(Sepharose CL-4B，φ10mm×20cm，流動(dòng)相PBS，試樣添加量2ml，級(jí)分采集量約2ml)。分離脂質(zhì)體級(jí)分和未被內(nèi)包在脂質(zhì)體中的成分的級(jí)分。為定量各級(jí)分的F-PS，用熒光微量培養(yǎng)板讀出器，測(cè)定激發(fā)波長(zhǎng)485nm、熒光波長(zhǎng)530nm下的熒光強(qiáng)度。由下式(11)算出由脂質(zhì)體漏出的F-PS量。
A5脂質(zhì)體級(jí)分中的F-PS量(mg)B5未被內(nèi)包在脂質(zhì)體內(nèi)的成分的F-PS量(mg)結(jié)果在表11中給出。
表11由FBS中脂質(zhì)體的F-PS漏出性(漏出％)

表11表明，制劑7和14-18中F-PS經(jīng)時(shí)性地由脂質(zhì)體漏出。即，利用本發(fā)明方法由脂質(zhì)膜被覆微粒，集積到體內(nèi)的靶部位后，內(nèi)包在脂質(zhì)膜內(nèi)的藥物等微粒經(jīng)時(shí)性地漏出，所以可以經(jīng)時(shí)性地表達(dá)藥效。
試驗(yàn)例14凝膠過(guò)濾實(shí)施例19-21中制備的制劑19-21。以脂質(zhì)體懸浮液0.5ml為試樣溶液，添加到凝膠過(guò)濾柱(Sepharose CL-4B，φ10mm×20cm，移動(dòng)相PBS，試樣添加量0.5ml，試樣采集量約1.5ml)上。分離脂質(zhì)體級(jí)分和游離G-CSF級(jí)分，分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。在濃縮后的脂質(zhì)體級(jí)分中加入蒸餾水，至總量為2ml。在該脂質(zhì)體懸浮液200μl中加入含有10％月桂基硫酸鈉的pH7的50mmol/L的磷酸緩沖液50μl，蒸餾水150μl，攪拌。再加入400μl的2-丙醇，攪拌，完全破壞脂質(zhì)體后，加入下述的移動(dòng)相I 800μl，混合。進(jìn)行離心分離(10000×g，5分鐘)，用HPLC分析上清液。在濃縮的游離G-CSF級(jí)分中加入含有2％普朗尼克F127(Sigma制)、0.5％三氟乙酸(TFA)的50％乙腈水溶液，至總量為5ml，進(jìn)行HPLC分析。
柱YMC pack ODS-AM，φ6.0mm×15cm移動(dòng)相I含有0.5％TFA的50％乙腈II含有0.5％TFA的80％乙腈分析開(kāi)始后II液的比例如下設(shè)定0-5分鐘為0％，5-35分鐘內(nèi)線性增加為0％-100％，35-45分鐘為100％。
檢測(cè)280nm分析溫度30℃流速1ml/分鐘注入量200μl各脂質(zhì)體中內(nèi)包的G-CSF的內(nèi)包率由下式(12)算出。
內(nèi)包率(％)＝A6/(A6+B6)×100 (12)A6脂質(zhì)體級(jí)分中的G-CSF量(μg)B6游離G-CSF級(jí)分中的G-CSF量(μg)結(jié)果在表12中給出。
表12內(nèi)包率

表12表明制劑19-21中不含由凝膠過(guò)濾分離的游離G-CSF。
圖2表示血漿中的FD濃度。橫軸為給以制劑后的時(shí)間(小時(shí))，縱軸為血漿中的FD濃度。
圖3表示血漿中F-PS濃度。橫軸為給以制劑后的時(shí)間(小時(shí))，縱軸為血漿中的F-PS濃度。
圖4表示血漿中的F-PS濃度。橫軸為給以制劑后的時(shí)間(小時(shí))，縱軸為血漿中的F-PS濃度。
圖1-4中符號(hào)的含義如下。
圖1●-制劑7給藥組-○-制劑f給藥組圖2●制劑1給藥組-◇-制劑a給藥組△制劑b給藥組圖3●-制劑7給藥組◇-制劑8給藥組◆制劑9給藥組△制劑10給藥組▲制劑11給藥組□制劑12給藥組-■-制劑13給藥組+制劑f給藥組圖4●制劑7給藥組+制劑給藥組◆制劑g給藥組利用本發(fā)明可以簡(jiǎn)便且高效地利用脂質(zhì)膜被覆微粒。
權(quán)利要求
1.由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法，特征在于，通過(guò)減少含有極性有機(jī)溶劑的水溶液中的極性有機(jī)溶劑的比例而在微粒表面被覆脂質(zhì)膜，所說(shuō)的微粒分散于所說(shuō)的極性有機(jī)溶劑中且在所說(shuō)的極性有機(jī)溶劑中溶解有脂質(zhì)。
2.由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法，特征在于，使微粒分散于含有極性有機(jī)溶劑的水溶液中(A液)，在與該含有極性有機(jī)溶劑的水溶液相同或不同的含有極性有機(jī)溶劑的水溶液或極性有機(jī)溶劑中溶解脂質(zhì)(B液)，混合A液和B液(C液)，然后減少C液中的極性有機(jī)溶劑的比例(D液)，由此在該微粒上被覆脂質(zhì)膜。
3.權(quán)利要求2中記載的由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法，其中B液是與脂質(zhì)一起使水溶性高分子衍生物(I)溶解得到的溶液。
4.權(quán)利要求2或3中記載的由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法，其中A液和B液中極性有機(jī)溶劑的濃度為30％以上。
5.權(quán)利要求2或3中記載的由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法，其中A液和B液中的極性有機(jī)溶劑的濃度為60～90％。
6.權(quán)利要求5中記載的由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法，其中D液中的極性有機(jī)溶劑的濃度為50％以下。
7.權(quán)利要求1～6中任一項(xiàng)記載的由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法，其中微粒是含有與權(quán)利要求3中記載的水溶性高分子衍生物(I)相同或不同的水溶性高分子衍生物的微粒。
8.權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)記載的由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法，其中微粒是含有從藥物、脂質(zhì)聚集體、脂質(zhì)體、乳液中的微粒、天然高分子、合成高分子、金屬膠體、陽(yáng)離子脂質(zhì)、陰離子脂質(zhì)和微粒制劑中選擇的一種以上的微粒。
9.權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)記載的由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法，其中微粒是含有藥物的微粒。
10.權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)記載的由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法，其中微粒是藥物與選自下列物質(zhì)中一種以上物質(zhì)形成的復(fù)合體脂質(zhì)聚集體、脂質(zhì)體、乳液中的微粒、天然高分子、合成高分子、金屬膠體、陽(yáng)離子脂質(zhì)、陰離子脂質(zhì)和微粒制劑。
11.權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)記載的由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法，其中微粒是藥物與陽(yáng)離子脂質(zhì)的復(fù)合體。
12.權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)記載的由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法，其中微粒是藥物與陽(yáng)離子脂質(zhì)的復(fù)合體。
13.權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)記載的由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法，其中微粒是藥物與含有磷脂的脂質(zhì)體和葡聚糖硫酸鈉的復(fù)合體。
14.權(quán)利要求8～13中任一項(xiàng)記載的由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法，其中藥物是選自肽、蛋白質(zhì)、核酸、低分子化合物、糖類、高分子化合物中的藥物。
15.權(quán)利要求1～14中任一項(xiàng)記載的由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法，其中極性有機(jī)溶劑是從醇類、二醇類和聚亞烷基二醇類中選擇的一種以上。
16.權(quán)利要求15中記載的由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法，其中醇類是乙醇。
17.權(quán)利要求15或16中記載的由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法，其中二醇類是丙二醇。
18.權(quán)利要求15～17中任一項(xiàng)記載的由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法，其中聚亞烷基二醇類是聚乙二醇。
19.權(quán)利要求3～18中任一項(xiàng)記載的由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法，其中水溶性高分子衍生物是選自聚乙二醇化脂質(zhì)、聚乙二醇烷基醚、聚乙二醇蓖麻油衍生物、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯類、聚乙二醇硬脂酸酯類、乙二醇丙二醇共聚物和甘油酯類中的一種以上。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種安全、簡(jiǎn)便且高效的由脂質(zhì)膜被覆微粒的方法。該方法通過(guò)減少含有極性有機(jī)溶劑的水溶液中的極性有機(jī)溶劑的比例而在微粒表面被覆脂質(zhì)膜，所說(shuō)的微粒分散于所說(shuō)的極性有機(jī)溶劑中且在所說(shuō)的極性有機(jī)溶劑中溶解有脂質(zhì)。
文檔編號(hào)B01J13/12GK1455664SQ01815487
公開(kāi)日2003年11月12日 申請(qǐng)日期2001年10月4日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月4日
發(fā)明者加藤泰己, 山內(nèi)雅博, 草野宏子, 巖田武士, 魚(yú)地孝聰, 秋永士朗 申請(qǐng)人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會(huì)社