一株降解氯氰菊酯金花菌的篩選鑒定及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一株從茯磚茶中篩選出的對氯氰菊酯具有較高降解能力的菌株ET1，屬于生物【技術領域】。該菌株ITS基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中的登錄號為KF317836，經(jīng)形態(tài)學及ITS序列分析被鑒定為冠突散囊菌（Eurotium?cristatum），為無毒有益菌，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2013年10月08日，保藏編號：CGMCC?No.8293。該菌株還對其它擬除蟲菊酯類農(nóng)藥有一定降解作用，并能降解其有毒中間產(chǎn)物（3-苯氧基苯甲酸）。該菌株不僅可用于被擬除蟲菊酯類農(nóng)藥所污染的茯磚茶及茶葉，也可用于土壤、污水的生物修復或生物凈化，保護生態(tài)環(huán)境，進而保障農(nóng)產(chǎn)品安全。
【專利說明】一株降解氯氰菊酯金花菌的篩選鑒定及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術領域】，具體涉及一株降解氯氰菊酯“金花菌”的篩選鑒定及其應用。
【背景技術】
[0002]氯氰菊酯(Cypermethrin, CY)是擬除蟲菊酯類農(nóng)藥中最常用品種之一,其廣泛應用于茶樹、果蔬、人畜等蟲害的防治。由于其具有疏水性強、對光熱穩(wěn)定等特性，因此自然降解速率慢，在環(huán)境中半衰期長達94.2 d-1103 d，易導致其在環(huán)境中殘留蓄積，因此其在土壤、水體、農(nóng)畜產(chǎn)品中常出現(xiàn)較高的檢出率和超標率。氯氰菊酯對魚類及其他水生動物有高毒性，其還能在動植物體內(nèi)蓄積，對神經(jīng)系統(tǒng)有急性毒性，并能損傷男性生殖系統(tǒng)發(fā)育，長期接觸還可能引發(fā)多種慢性疾病，美國環(huán)境保護局已將其認定為一種致癌劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]擬除蟲菊酯類農(nóng)藥作為目前最有發(fā)展前景的殺蟲劑，在尚未找到新型替代化合物之前，未來幾十年內(nèi)仍將被廣泛使用，因而迫切需要研究殘留農(nóng)藥的降解。微生物降解是各種農(nóng)藥降解方法中較為綠色和高效的一種。目前氯氰菊酯降解菌主要以細菌為主，報道的具有降解氯氰菊酯的真菌不多，而真菌又是一類潛在的農(nóng)藥降解菌，其氧化酶系對多種芳香族類化合物、殺蟲劑、染料等異生化合物具有較強的降解能力，有研究還指出真菌對某些頑固異生化合物的降解效果優(yōu)于細菌。現(xiàn)階段氯氰菊酯降解真菌的分離均來源于農(nóng)藥廠污泥，而源于發(fā)酵食品或發(fā)酵醅能降解氯氰菊酯的有益真菌少見報道。
[0004]茯磚茶上長有大量金黃色顆粒，俗稱“金花”，即“金花菌”(goiden flowerfungus)，在分類上屬于冠突散囊菌，它是茯磚茶中的優(yōu)勢有益菌，也是茯磚茶獨特風味的主要影響因素。長年飲用茯磚茶有調(diào)理腸胃、促進消化、降血糖、降血脂、增強人體體質(zhì)及延緩衰老等功效，而這些功效 與“金花菌”的作用是密不可分的?，F(xiàn)階段國內(nèi)外對茯磚茶中“金花菌”的研究主要集中在“金花菌”的分類鑒定及其發(fā)酵特性等方面，而對于其能否降解農(nóng)藥的研究尚未見報道。近年來擬除蟲菊酯類農(nóng)藥在茶樹栽培中的大量施用，導致茶葉中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的殘留問題較為嚴重，所以，“金花菌”對于農(nóng)藥降解方面的研究與應用具有重要意義。
[0005]本專利是從湖南省生產(chǎn)的十余種不同品牌的茯磚茶中分離、篩選出的一株可較高效降解氯氰菊酯的菌株，經(jīng)ITS測序鑒定，采用Blast進行基因同源性比對分析表明，菌株ETl的ITS序列與登錄號JX869560等冠突散囊菌有99%的相似性，也有相似的系統(tǒng)發(fā)育關系。根據(jù)菌株ETl的形態(tài)學特征和ITS序列比對，將該菌株鑒定為冠突散囊菌{EurotiumCristatumYirW0經(jīng)過試驗可知該菌株在F1D培養(yǎng)基中7d內(nèi)對50 mg/L氯氰菊酯的降解率為53.35%。動力學研究表明，該菌株在測試的底物(氯氰菊酯)質(zhì)量濃度、溫度、pH范圍內(nèi)，氯氰菊酯的半衰期為7.11~8.98d，遠遠低于其自然半衰期(94.2 d-1103 d)。此外，菌株ETl對50 mg/L溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯和氯菊酯7d降解率分別為27.53%,38.00%、33.23%和25.34%。充分說明該菌株作為有益菌株不僅在茯磚茶生產(chǎn)上具有應用價值，并且在處理含擬除蟲菊酯類農(nóng)藥污染的茶葉生產(chǎn)及土壤和水體生物修復方面具有很好的應用潛力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一株可降解氯氰菊酯的菌株一冠突散囊菌{Eurotiumcristatum, “金花菌”)及其應用。
[0007]本發(fā)明所提供的降解菌株經(jīng)鑒定為冠突散囊菌(Jkirotium cristatum),俗稱“金花菌”，編號為ETl，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2013年10月08日，保藏編號=CGMCC N0.8293。
[0008]本發(fā)明所提供的降解菌株cristatum ETl的形態(tài)學特性:菌株ETl在PDA平板上菌落呈不規(guī)則的圓形，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌落直徑逐漸長大，培養(yǎng)5d后菌落直徑達45.0mm，菌落表面粗糙，菌落邊緣呈乳白色，向外延伸呈放射狀，由外到內(nèi)顏色逐漸加深，中間呈黑褐色，可見菌株ETl產(chǎn)黑褐色色素，并且色素能滲透到培養(yǎng)基中。
[0009]本發(fā)明所提供的降解菌株的分離、篩選、鑒定。
[0010]取不同茯磚茶樣品，用茶刀將茶磚從中間切開，采用直接分離法用接種針挑取茶樣表面的金黃色顆粒點接到PDA平板上，30°C倒置培養(yǎng)，待長出“金花菌”菌落后從中挑取進行平板劃線培養(yǎng)。重復劃線培養(yǎng)3-4次至純化，4°C斜面保存?zhèn)溆谩?br> [0011]在無菌條件下將分離純化的“金花菌”分別從試管斜面上用無菌孢子稀釋液(配方:吐溫80 0.2%，瓊脂0.1%，蒸餾水IOOmL)洗下，轉移至盛有IOOmL無菌孢子稀釋液的250mL錐形瓶中，充分振蕩混勻，并調(diào)節(jié)孢子濃度約為6.0X IO8個/mL，于4°C保存?zhèn)溆谩７謩e將孢子懸液按5% (v/v)接種量接種于裝有30mL H)培養(yǎng)基(含氯氰菊酯50mg/L)的250mL三角瓶中，另設接種相同量的孢子稀釋液為空白對照，30°C，180r/min振蕩培養(yǎng)7d,測定各培養(yǎng)液中氯氰菊酯的殘留質(zhì)量濃度，確定各菌株對氯氰菊酯的降解能力，從中篩選出較高效的氯氰菊酯降解菌。
[0012]菌株形態(tài)鑒定:菌落近圓形，菌落表面粗糙，菌落邊緣呈乳白色，向外延伸呈放射狀，由外到內(nèi)顏色逐漸加深，中間呈黑褐色，產(chǎn)色素；個體形態(tài)鑒定:菌株ETl的孢子類型由有性型和無性型組成；菌株ETl的有性結構為子囊果，即黃色閉囊殼，子囊果呈球形或近球形，子囊果容易破裂釋放出子囊，子囊內(nèi)一般含有8個子囊孢子，子囊破裂釋放出子囊孢子；菌株ETl的無性結構為菌絲和頂囊，菌絲為有隔菌絲，頂囊呈球形或燒瓶型，產(chǎn)分生孢子。
[0013]菌株ETl分子遺傳學鑒定。
[0014]菌株ETl經(jīng)ITS序列測定，獲得如下序列: GGACCTCTGGGTCAACCTCCCATCCGTGTCTATCTGTACCCTGTTGCTTCGGCGTGGCCACGGCCCGCCGGA
GACTAACATTTGAACGCTGTCTGAAGTTTGCAGTCTGAGTTTTTAGTTAAACAATCGTTAAAACTTTCAACAACGGA
TCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAA·GAACGCAGCGAAATGCGATAATTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATC
GAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCA
CGGCTTGTGTGTTGGGCTTCCGTCCCTGGCAACGGGGACGGGCCCAAAAGGCAGTGGCGGCACCATGTCTGGTCCTC
GAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCCCGTAGGTCCAGCTGGCAGCTAGCCTCGCAACCAATCTTTTTAACCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAA
該菌株的ITS基因測序結果與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進行Blast同源性比對，該菌株序1^與Eurotium crisiaiw?菌株基因序列高度同源,得到登錄號為KF317836。
[0015]本發(fā)明所提供的降解氯氰菊酯的菌株ETl是從不同茯磚茶中分離、篩選得到的，根據(jù)形態(tài)學特征和ITS基因序列分析被鑒定為冠突散囊菌{Eurotium cristatum)。該菌株在一定溫度和PH范圍內(nèi)均對氯氰菊酯有降解能力，保藏于于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2013年10月08日，保藏編號:CGMCC N0.8293。
[0016]本發(fā)明所用培養(yǎng)基為:馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PD):新鮮馬鈴薯去皮切塊300g，蔗糖20g，蒸餾水1000mL,調(diào)節(jié)pH至6.0 ;固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基中再加20g/L瓊脂，121 °C，滅菌 20min。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為降解菌株ETl培養(yǎng)5d的菌落培養(yǎng)特征。
[0018]圖2為降解菌株ETl的細胞形態(tài)圖一子囊果。
[0019]圖3為降解菌株ETl的細胞形態(tài)圖一子囊和子囊孢子。
[0020]圖4為降解菌株ETl的細胞形態(tài)圖一菌絲和頂囊。
[0021]圖5為溫度對降解菌株ETl降解氯氰菊酯速率的影響。
[0022]圖6為pH值對降解菌株ETl降解氯氰菊酯速率的影響。
[0023]圖7為底物質(zhì)量濃度對降解菌株ETl降解氯氰菊酯速率的影響。
【具體實施方式】
[0024]實例1:確定氯氰菊酯降解菌株ETl的生長情況與氯氰菊酯降解的關系。
[0025]I)菌種活化:挑取降解氯氰菊酯的菌株ETl至H)液體培養(yǎng)基中，30°C，180r/min搖床振蕩培養(yǎng)4d;然后連續(xù)劃線于PDA平板、挑取單菌落培養(yǎng)兩次(30 V )4d，挑取單菌落至PDA斜面30 V培養(yǎng)4d備用；2)用無菌生理鹽水洗下斜面上菌體并調(diào)整孢子濃度為6.0 X IO8個/mL，制成種子液。
[0026]生長曲線的測定:將降解菌株ETl的種子液按5%接種量接種于含有50mg/L氯氰菊酯的H)液體培養(yǎng)基中，分裝30 mL/250mL錐形瓶，30°C、180r/min振蕩培養(yǎng)8d，取樣時間為每24h取樣I瓶，將樣品過濾，得菌絲球，于80°C干燥至恒重，以菌體干重、代表其生物量。
[0027]降解曲線的測定:將降解菌株ETl的種子液按5%接種量接種于含有50mg/L氯氰菊酯的H)液體培養(yǎng)基中，分裝30 mL/250mL錐形瓶，設接種5%無菌水為空白對照，30°C、180r/min振蕩培養(yǎng)8d,取樣時間為每24h取樣I瓶,米用全量取樣的方式，即取整瓶培養(yǎng)液作為分析樣品，測定其對氯氰菊酯的降解率。
[0028]將整瓶培養(yǎng)液，加入30mL乙腈，超聲(40kHz，300W)輔助提取30min，移取2.0mL提取液用乙腈定容至IOmL,混勻，12000r/min離心IOmin,上清液用有機相濾膜(0.45 μ m)過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液用于HPLC檢測。色譜條件:色譜柱為Gemini IOOA (:18柱(5.0μ m, 150 mm X4.60 mm (1.d.));流動相為乙腈和超純水(76: 24 (v/v));檢測波長210nm ;柱溫 25°C ;流速 1.0 mL/min ;進樣量 10 μ L。[0029]由結果可知降解菌株ETl經(jīng)過8d培養(yǎng)，除去對照組氯氰菊酯的損失部分，實驗組中53.35%氯氰菊酯被菌株ETl降解，培養(yǎng)7d內(nèi)，氯氰菊酯與降解菌株生長呈正相關，菌株對氯氰菊酯降解速率較快，培養(yǎng)7d菌體生物量達到最大，此后菌體生長趨于穩(wěn)定，降解速率也隨之減緩。
[0030]實例2:降解菌株ETl對氯氰菊酯的降解特性。
[0031]I)培養(yǎng)溫度對菌株ETl降解氯氰菊酯速率的影響按5.0% (v/v)的接種量，將菌株種子液(6.0X IO8個/mL)接種于氯氰菊酯濃度為50 mg/L的H)液體培養(yǎng)基(pH6.0)中，分裝30 mL/250 mL錐形瓶，于不同溫度下(25 °C, 30 °C, 35 °C ) 180 r/min振蕩培養(yǎng)，間隔24h取樣。用[0023]所述方法測定氯氰菊酯降解率。
[0032]2) pH對菌株ETl降解氯氰菊酯速率的影響按5.0% (v/v)的接種量，將菌株種子液(6.0X108個/mL)接種于不同pH (5.0，6.0，7.0)的氯氰菊酯濃度為50 mg/L的PD液體培養(yǎng)基中，分裝30 mL/250 mL錐形瓶，30°C，180 r/min振蕩培養(yǎng)，間隔24h取樣。用
[0023]所述方法測定氯氰菊酯降解率。
[0033]3)底物濃度對菌株ETl降解氯氰菊酯速率的影響按5.0% (v/v)的接種量，將菌株種子液(6.0XlO8個/mL)接種于氯氰菊酯質(zhì)量濃度不同的H)液體培養(yǎng)基(pH6.0 ; 20mg/L，50 mg/L, 100 mg/L)中，分裝 30 mL/250 mL 錐形瓶，30°C、180 r/min 振蕩培養(yǎng)，間隔24h取樣。用[0023]所述方法測定氯氰菊酯降解率。
[0034]菌株ETl對氯氰菊酯的降解特性結果:在測試的培養(yǎng)溫度、PH值、底物(氯氰菊酯)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，氯氰菊酯半衰期為7.11~8.98d，遠遠低于其自然降解半衰期(94.2 d-1103d)，隨著底物質(zhì)量濃度的降低，氯氰菊酯的降解速率加快，降解率增高，7d內(nèi)對20mg/L氯氰菊酯降解率可達63.5% ;溫度在25°C~35°C范圍內(nèi)，菌株ETl對氯氰菊酯降解率的變化相對不大；在PH5 -7范圍內(nèi)，pH對底物降解率的影響相對較小，在pH6時，菌株對氯氰菊酯的降解速率相對較高。這一研究結果可為菌株ETl應用于茯磚茶的生產(chǎn)以及污水處理和土壤修復提供一定的數(shù)據(jù)參考。
[0035]實例3:氯氰菊酯降解菌株ETl對其降解中間產(chǎn)物3-苯氧基苯甲酸的降解效果。
[0036]將降解菌株的種子液按5%接種量接種于50mg/L3_苯氧基苯甲酸的H)液體培養(yǎng)基中，分裝30 mL/250mL錐形瓶，設接種5%無菌水為空白對照，30°C、180r/min振蕩培養(yǎng)7d，采用全量取樣的方式，即取整瓶培養(yǎng)液作為分析樣品，測定其對3-苯氧基苯甲酸的降解率。
[0037]將整瓶培養(yǎng)液，加入30mL乙腈，超聲(40kHz，300W)輔助提取30min，移取2.0mL提取液用乙腈定容至IOmL,混勻，12000r/min離心IOmin,上清液用有機相濾膜(0.45 μ m)過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液用于HPLC檢測。色譜條件:色譜柱為Gemini IOOA C18柱(5.0ym,150mm X4.60mm);流動相為乙腈和pH 2.5的磷酸去離子水溶液，體積比為55:45，流速
0.7mL/min,檢測波長210nm，柱溫25°C，進樣量10 μ L。
[0038]測定結果表明，去除對照組3-苯氧基苯甲酸的損失部分，實驗組中3-苯氧基苯甲酸可被菌株ETl完全降解。
[0039]實例4:氯氰菊酯降解菌株ETl對其它擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的降解效果。
[0040]將降解菌株ETl的種子液按5%接種量接種于50mg/溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯和氯菊酯的H)液體培養(yǎng)基中，分裝30 mL/250mL錐形瓶，設接種5%無菌水為空白對照，30°C、180r/min振蕩培養(yǎng)。
[0041]培養(yǎng)7d后取樣，用[0023]所述方法測定其降解情況，去除對照組的損失部分，實驗組中溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯和氯菊酯的降解率分別為:27.53%、38.00 %、33.23% 和 25.34%ο
[0042]實例5:氯氰菊酯降解菌株ETl對被污染的土壤中氯氰菊酯的降解效果。
[0043]從四川省雅安市名山區(qū)某茶園土壤中取一定量的土壤樣品，添加氯氰菊酯使其濃度約為20mg/kg，將降解菌株ETl的種子液按5%接種量接種(實驗組)，設接種5%無菌水為空白對照，30°C培養(yǎng)，每24h取樣，用[0023]所述方法采用HPLC檢測。
[0044]通過HPLC檢測樣品中氯氰菊酯的殘留量，空白樣品內(nèi)氯氰菊酯含量變化較小，實驗組的樣品在7d時氯氰菊酯的降解率可達41.83%。
[0045]實例6:氯氰菊酯降解菌株ETl對茶葉樣品中氯氰菊酯的降解效果。
[0046]從四川省雅安市某茶店購買一定量的黑毛茶，添加氯氰菊酯使其濃度約為20mg/kg,將降解菌株ETl的種子液按5%接種量接種(實驗組)，設接種5%無菌水為空白對照，30°C培養(yǎng)，每24h取樣，用[0023]所述方法檢測。
[0047]通過HPLC檢測樣品中氯氰菊酯的殘留量，空白樣品內(nèi)氯氰菊酯含量變化較小，實驗組的樣品在7d時氯氰菊酯的降解率可達60.5%，若再延長發(fā)酵時間，將會進一步提高降解率。據(jù)報道，茶葉中農(nóng)藥的實際污染量較高時也僅有幾個mg/kg，茯磚茶的發(fā)酵周期一般在15天左右，因此，可以推測用菌株ETl制作茯磚茶時，可將殘留農(nóng)藥完全降解。
[0048]以上的實例僅僅是對本發(fā)明的實施方式進行描述，而并非對本發(fā)明的范圍進行限定，對于本領域的技術人員來說，可以對上述說明進行改進或變形，但所有的這些改進或變形均應落入本發(fā)明的權利要求確定的保護范圍。
【權利要求】
1.一株冠突散囊菌crisiaiw?),俗稱“金花菌”,其特征在于保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.8293，保藏日期2013年10月08日。
2.權利要求1所述冠突散囊菌ETl{Eurotium cristatum),其特征在于:(I)個體形態(tài)特征:真菌，由有性結構和無性結構組成，有性結構為子囊果，呈球形或近球形，子囊果容易破裂釋放子囊及子囊孢子，無性結構為菌絲和頂囊，菌絲為有隔菌絲，頂囊呈球形或燒瓶型，產(chǎn)分生孢子；(2)菌落特征:在PDA平板上菌落呈不規(guī)則的圓形，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌落直徑逐漸長大，培養(yǎng)5d后菌落直徑達45.0mm,菌落表面粗糙，菌落邊緣呈乳白色，向外延伸呈放射狀，由外到內(nèi)顏色逐漸加深，中間呈黑褐色，可見菌株ETl產(chǎn)黑褐色色素，并且色素能滲透到培養(yǎng)基中；(3) ITS序列特征:該菌株的ITS基因測序結果與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進行Blast同源性比對,該菌株序列菌株基因序列高度同源，得到登錄號為KF317836。
3.權利要求1-2所述冠突散囊菌ETl在降解氯氰菊酯中的應用。
4.根據(jù)權利要求3所述的冠突散囊菌ETl的應用，其特征在于，降解組合條件為:溫度25-35°C, pH=5.0-7.0。
5.根據(jù)權利要求3所述的冠突散囊菌ETl的應用，其特征在于，降解組合條件為:溫度300C，pH=6.0,接種量5%，裝液量30mL，搖床轉速180r/min。
6.根據(jù)權利要求3所述的冠突散囊菌ETl的應用，該菌株可用于多種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的生物降解，同時可降解氯氰菊酯的降解中間產(chǎn)物3-苯氧基苯甲酸，以及這些物質(zhì)污染的茯磚茶及茶葉的生物降解和土壤、水體的生物修復或生物凈化，保護生態(tài)環(huán)境，進而保障農(nóng)產(chǎn)品安全。`
【文檔編號】B09C1/10GK103627641SQ201310541152
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年11月5日 優(yōu)先權日:2013年11月5日
【發(fā)明者】不公告發(fā)明人 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學