專(zhuān)利名稱(chēng)：一株咔唑降解細(xì)菌及其培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一株咔唑降解細(xì)菌及其培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
受啟于地球自?xún)暨^(guò)程的生物作用具有成本低、二次污染輕、環(huán)境相容性好等優(yōu)勢(shì)， 以微生物處理廢水的生物處理技術(shù)日益受到人們的關(guān)注。在生物處理技術(shù)中，具有高活性降解功能的微生物群體充當(dāng)著重要角色。傳統(tǒng)廢水生物處理法利用的是大量自然的、或經(jīng)過(guò)一定馴化的微生物種群，在處理系統(tǒng)的工作條件下有效地去除易降解的有機(jī)污染物；然而，隨著現(xiàn)代工業(yè)的迅速發(fā)展，當(dāng)前越來(lái)越多的廢水中含有多種有毒有害物質(zhì)，致使傳統(tǒng)生物處理系統(tǒng)中大多數(shù)普通微生物種群失活和失效。因此，對(duì)特種微生物進(jìn)行分離、篩選，對(duì)功能基因進(jìn)行分離、提取，以及借此獲得或構(gòu)建各種環(huán)境工程菌已成為環(huán)境科學(xué)、生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)。目前工業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生和排放大量的芳香族化合物，這其中包含大量的雜環(huán)化合物， 且絕大多數(shù)屬高毒性、難降解污染物。有研究表明，烷基化多環(huán)芳烴物質(zhì)與雜環(huán)芳烴共存時(shí)所具有的生物毒性比其自身毒性高40-70倍，因此雜環(huán)類(lèi)化合物一直受到許多研究者的關(guān)注。咔唑?yàn)槿菈A性氮雜環(huán)芳烴化合物，為無(wú)色單斜片狀結(jié)晶，微溶于水，溶于乙醇、乙醚等多種有機(jī)溶劑，對(duì)人體健康和生態(tài)環(huán)境存在著危害。咔唑在化工行業(yè)(如焦化、石油、染料、制藥等)中廣泛存在，是一種常見(jiàn)的有毒污染物。關(guān)于咔唑的生物降解的研究，在20世紀(jì)90年代才有第一例報(bào)道，隨著科學(xué)研究的深入，咔唑的微生物降解機(jī)理(包括降解途徑以及降解基因等)已被完整報(bào)道，降解時(shí)咔唑雜環(huán)中的氮被轉(zhuǎn)化為氨氮釋放到水體，易產(chǎn)生氨氮二次污染。在全球氮循環(huán)轉(zhuǎn)化中，微生物起著關(guān)鍵的作用，傳統(tǒng)的生物脫氮理論包括好氧硝化、異養(yǎng)反硝化，后由Robertson和 Kuenen發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌的好氧反硝化現(xiàn)象，補(bǔ)充完善了氮轉(zhuǎn)化的理論。對(duì)于特異性的咔唑降解菌株的降解特性及機(jī)理的研究是解決實(shí)際污染問(wèn)題的根本，也是實(shí)現(xiàn)生物基因技術(shù)突破的基礎(chǔ)。因此，有必要研究菌株的咔唑降解性能和降解途徑，另外考察其對(duì)副產(chǎn)物氨氮的轉(zhuǎn)化能力，以期獲得具有同步去除咔唑和氨氮污染的復(fù)合功能的菌株材料，有望應(yīng)用于我國(guó)有機(jī)工業(yè)廢水的生物治理中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一株假單胞菌(I^eudomonas sp. ) BC039。本發(fā)明提供的假單胞菌G^seudomonas sp. )BC039，其保藏號(hào)為CGMCC No. 4222。所述的假單胞菌(Pseudomonas sp. )BC039CGMCC No. 4222在降解咔唑中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；或所述的假單胞菌(Pseudomonas sp. )BC039CGMCC No. 4222在制備降解咔唑產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述降解的溫度為30°C -35°C，所述降解的溫度具體為30°C，所述降解初始pH值為7. 0，所述降解的時(shí)間為0h-48h，所述降解的時(shí)間具體為36h。所述的假單胞菌(Pseudomonas sp. )BC039CGMCC No. 4222在轉(zhuǎn)化氨氮中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；或所述的假單胞菌(Pseudomonas sp. )BC039CGMCC No. 4222在制備轉(zhuǎn)化氨氮產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述轉(zhuǎn)化氨氮采用硝化和反硝化的方式；所述硝化的溫度為30°C -35°C，所述硝化的溫度具體為30°C，所述硝化的時(shí)間為 Oh-3^!，所述硝化的時(shí)間具體為36h ；所述反硝化的溫度為30°C _35°C，所述反硝化的溫度具體為30°C，所述反硝化的時(shí)間為0h-120h，所述反硝化的時(shí)間具體為Mh。所述的假單胞菌(Pseudomonas sp. )BC039CGMCC No. 4222在防治廢水中咔唑和/ 或氨氮污染的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；或所述的假單胞菌G3SeudomonaS sp. )BC039CGMCC No. 4222在制備降解咔唑和/ 或轉(zhuǎn)化氨氮產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備降解咔唑和/或轉(zhuǎn)化氨氮產(chǎn)品的方法。本發(fā)明提供的方法，為發(fā)酵所述的假單胞菌(I^eudomonas sp. ) BC039CGMCC No. 4222，收集發(fā)酵產(chǎn)物，即得到降解咔唑產(chǎn)品。所述發(fā)酵的溫度為30°C _35°C，所述發(fā)酵的溫度具體為30°C ；所述發(fā)酵時(shí)間為20h_36h，所述發(fā)酵時(shí)間具體為20h、24h或36h ；所述發(fā)酵的振蕩頻率為150rpm-180rpm，所述發(fā)酵的振蕩頻率具體為180rpm，所述發(fā)酵的振幅為26mm。所述發(fā)酵的培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基或無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(MSM)；LB培養(yǎng)基每IOOOmL水中含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 7. 0。無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(MSM)每IOOOmL水中含=Na2HPO4 4. 26g,KH2PO4 2. 65g,MgSO4 ·7Η20 0. 20g, CaCl2 0. 006g, H3BO3 0. 000006g, ZnCl2 0. 00007g, MnSO4 · H2OO. 0012g, CuCl2 · 2H20 0. 000002g, CoCl2 · 6H20 0. 00019g, Na2MoO4 · 2H20 0. 000024g, FeCl3 · 6H20 0. 00015g, NiCl · 6H20 0. 000024g，調(diào)節(jié) pH 7. 0。固體 MSM 添加瓊脂 1. 5% _2· 0% (m/v)。假單胞菌O^seudomonas sp. )BC039于2010年10月13日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏單位地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路一號(hào)院 3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)CGMCC No. 4222，該菌株的分類(lèi)命名為假單胞菌 Pseudomonas sp.。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的假單胞菌(Pseudomonas sp. )BC039，一方面對(duì)咔唑具有很強(qiáng)的降解活性，另一方面可對(duì)氨氮及其它含氮物質(zhì)轉(zhuǎn)化，且其具有培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單，生長(zhǎng)速度快的優(yōu)點(diǎn)，非常適用于含有咔唑類(lèi)污染物的高氨氮廢水(如焦化廢水)的生物治理，可作為難降解有機(jī)廢水生物治理工藝中的生物強(qiáng)化劑，并借此開(kāi)發(fā)出相應(yīng)的環(huán)保生物制劑，具有較高的研究、應(yīng)用及市場(chǎng)價(jià)值。


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圖1為假單胞菌O^seudomonassp. )BC039的電鏡照片圖2為假單胞菌G^seudomonassp. )BC039對(duì)咔唑的降解圖3為假單胞菌G^seudomonassp. )BC039咔唑降解基因carAa電泳譜4為假單胞菌O^seudomonassp. )BC039的硝化特征曲線圖5為假單胞菌O^seudomonassp. )BC039的反硝化特征曲線圖6為假單胞菌(Pseudomonassp. ) BC039反硝化基因nirS和nosZ電泳譜圖
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。所有培養(yǎng)基中的溶劑均為去離子水。無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(MSM)每IOOOmL水中含=Na2HPO4 4. 26g,KH2PO4 2. 65g,MgSO4 ·7Η20 0. 20g, CaCl2 0. 006g, H3BO3 0. 000006g, ZnCl2 0. 00007g, MnSO4 · H2OO. 0012g, CuCl2 · 2H20
0.000002g, CoCl2 · 6H20 0. 00019g, Na2MoO4 · 2H20 0. 000024g, FeCl3 · 6H20 0. 00015g, NiCl · 6H20 0. 000024g，調(diào)節(jié) pH 7. O。固體 MSM 添加瓊脂 1. 5% _2· 0% (m/v)。實(shí)施例1、假單胞菌(I^eudomonas sp.)BC039的分離純化、鑒定及耐藥性1、分離純化假單胞菌(I^eudomonas sp. ) BC039是從焦化活性污泥中分離、純化而得到的一株 G-細(xì)菌，在以一定濃度的咔唑(DMS0溶解態(tài))為選擇壓力的條件下，即以咔唑作為唯一可利用的碳源與氮源，從長(zhǎng)期馴養(yǎng)的活性污泥中，經(jīng)過(guò)富集、分離、篩選、純化等步驟得到菌株 BC039。具體分離過(guò)程如下將采集的焦化活性污泥樣品，接種到含咔唑的液體MSM選擇培養(yǎng)基(該培養(yǎng)基中填加咔唑?yàn)槲⑸锟衫玫奈ㄒ惶荚磁c氮源，DMSO溶解態(tài)咔唑+MSM) 的搖瓶中，30°C、ISOrpm下振蕩培養(yǎng)五個(gè)周期，每個(gè)周期約3d，五個(gè)周期的咔唑濃度依次為 100、200、300、500、500mg/L。將富集菌液稀釋至10〃倍，涂布到固體MSM咔唑選擇培養(yǎng)基上，30°C恒溫培養(yǎng)，直至長(zhǎng)出明顯可見(jiàn)的菌落。挑取單菌落，采用平板劃線純化法對(duì)菌種進(jìn)行純化，觀察記錄菌落形態(tài)，檢測(cè)純度，直至獲得以咔唑?yàn)槲ㄒ惶荚磁c氮源生長(zhǎng)的純菌株， 命名為BC039。2、鑒定1)形態(tài)觀察將該菌株BC039分別接種在加咔唑的普通細(xì)菌LB固體培養(yǎng)基及無(wú)機(jī)鹽加咔唑(500mg/L)選擇性固體培養(yǎng)基(咔唑+MSM/LB)上生長(zhǎng)，觀察菌落，該菌均可在上述培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，且菌落淡黃色、不透明、呈圓形，邊緣光滑，菌株為G-球形或短桿菌，長(zhǎng)約
1.3-1. 8 μ m，直徑約0. 5-0. 6 μ m(見(jiàn)圖1)，易聚堆，不運(yùn)動(dòng)。2)分子生物學(xué)鑒定從MSM固體培養(yǎng)基中挑取單克隆BC039，接種于50mL的LB液體培養(yǎng)基中，在30°C、 180rpm條件下振蕩，過(guò)夜培養(yǎng)至0D602為1左右，4000rpm離心IOmin收集菌體；取l_2mL 菌液，采用TIANamp細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化，北京)提取細(xì)菌的總DNA。以菌株 BC039 的總 DNA 作為模板，以 27F(5，AGAGTTTGATCATGGCTCAG 3，)與1492R(5‘TACGGTTACCTTGTTACGACTT 3，)為引物，對(duì)該菌株的 16S rDNA 片段 PCR 進(jìn)行擴(kuò)增， 得到16S rDNA，測(cè)序?yàn)樾蛄?，將該序列進(jìn)行blast比對(duì)，與Pseudomonas stutzeri strain 53 (HQ680964)的同源性為99%，因此鑒定為菌株BC039是假單胞菌屬(I^seudomonas sp.)。3)生理生化鑒定好氧呼吸代謝取ImL生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的BC039菌液，與冷卻至40°C左右的半固體培養(yǎng)基在培養(yǎng)皿中混合均勻，于30°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d，若只在培養(yǎng)基表面長(zhǎng)出菌落，則為好氧菌；若在培養(yǎng)基的表層和內(nèi)部都有菌落出現(xiàn)，則為兼性菌；如果只在培養(yǎng)基內(nèi)部生長(zhǎng)則為厭氧菌。BC039菌株僅生長(zhǎng)于培養(yǎng)基表面，說(shuō)明其營(yíng)好氧呼吸。綜合菌株形態(tài)特征、生理生化特征和16S rDNA序列，鑒定BC039為假單胞菌 (Pseudomonas sp.),命名為假單胞菌(Pseudomonas sp.)BC039o假單胞菌O^seudomonas sp. )BC039于2010年10月13日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏單位地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路一號(hào)院 3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)CGMCC No. 4222，該菌株的分類(lèi)命名為假單胞菌 Pseudomonas sp.。3、假單胞菌(Pseudomonas sp. ) BC039 的抗性譜假單胞菌(Pseudomonas sp. )BC039對(duì)頭孢、卡那霉素、利福平、氨芐青霉素、氯霉素、四環(huán)素、壯觀霉素七種抗生素的抗性。采用稀釋涂布法將該菌株分別接種于含有不同濃度的上述抗生素的LB固體培養(yǎng)基，30°C靜置培養(yǎng)3d，觀察菌體在培養(yǎng)基表面上形成菌落的情況?？剐栽囼?yàn)結(jié)果列于表1。表1假單胞菌(I^eudomonas sp. )BC039在不同抗生素條件下的生長(zhǎng)狀況
權(quán)利要求
1.假單胞菌(Pseudomonassp.) BC039，其保藏號(hào)為 CGMCC No. 4222。
2.權(quán)利要求1所述的假單胞菌(Pseudomonassp.)BC039CGMCC No. 4222在降解咔唑中的應(yīng)用；或權(quán)利要求1所述的假單胞菌O^seudomonas sp.) BC039CGMCC No. 4222在制備降解咔唑產(chǎn)品中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述降解的溫度為30°C _35°C，所述降解的溫度具體為30°C，所述降解初始pH值為 7. 0，所述降解的時(shí)間為0h-48h，所述降解的時(shí)間具體為36h。
4.權(quán)利要求1所述的假單胞菌(Pseudomonassp.)BC039CGMCC No. 4222在轉(zhuǎn)化氨氮中的應(yīng)用；或權(quán)利要求1所述的假單胞菌O3SeudomonaS sp.) BC039CGMCC No. 4222在制備轉(zhuǎn)化氨氮產(chǎn)品中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述轉(zhuǎn)化氨氮采用硝化和反硝化的方式；所述硝化的溫度為30°C _35°C，所述硝化的溫度具體為30°C，所述硝化的時(shí)間為 Oh-3^!，所述硝化的時(shí)間具體為36h ；所述反硝化的溫度為30°C _35°C，所述反硝化的溫度具體為30°C，所述反硝化的時(shí)間為0h-120h，所述反硝化的時(shí)間具體為Mh。
6.權(quán)利要求1所述的假單胞菌(Pseudomonassp.)BC039CGMCC No. 4222在防治廢水中咔唑和/或氨氮污染中的應(yīng)用；或權(quán)利要求1所述的假單胞菌O^seudomonas sp.) BC039CGMCC No. 4222在制備降解咔唑和/或轉(zhuǎn)化氨氮產(chǎn)品中的應(yīng)用。
7.一種制備降解咔唑和/或轉(zhuǎn)化氨氮產(chǎn)品的方法，為發(fā)酵權(quán)利要求1所述的假單胞菌 (Pseudomonas sp.)BC039CGMCC No. 4222，收集發(fā)酵產(chǎn)物，即得到降解咔唑產(chǎn)品。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵的溫度為30°C _35°C，所述發(fā)酵的溫度具體為30°C ；所述發(fā)酵時(shí)間為20h-36h，所述發(fā)酵時(shí)間具體為20h、24h或36h ；所述發(fā)酵的振蕩頻率為150rpm-180rpm，所述發(fā)酵的振蕩頻率具體為180rpm，所述發(fā)酵的振幅為^mm。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一株咔唑降解細(xì)菌及其培養(yǎng)方法。本發(fā)明提供的假單胞菌(Pseudomonas sp.)BC039，其保藏號(hào)為CGMCC No.4222，還提供了假單胞菌(Pseudomonas sp.)BC039CGMCC No.4222在降解咔唑中的應(yīng)用。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的假單胞菌(Pseudomonas sp.)BC039，可作為難降解有機(jī)廢水生物治理工藝中的生物強(qiáng)化劑，并借此開(kāi)發(fā)出相應(yīng)的環(huán)保生物制劑，具有較高的研究、應(yīng)用及市場(chǎng)價(jià)值。
文檔編號(hào)C02F3/34GK102367423SQ201110277688
公開(kāi)日2012年3月7日 申請(qǐng)日期2011年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月19日
發(fā)明者唐孝炎, 溫東輝, 趙翠 申請(qǐng)人:北京大學(xué)