本發(fā)明公開了一種線粒體靶向熒光碳點(diǎn)及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物納米材料技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

無論是在哺乳動物正常細(xì)胞或者是病變細(xì)胞中，線粒體都以其獨(dú)特的作用而深刻影響著細(xì)胞的生命活動，如ATP的產(chǎn)生與細(xì)胞供能、細(xì)胞內(nèi)部的鈣離子信號和自由基的產(chǎn)生、細(xì)胞凋亡的調(diào)控以及維持細(xì)胞內(nèi)部環(huán)境的穩(wěn)態(tài)等。由于線粒體對細(xì)胞新陳代謝有著重要的意義，線粒體的功能異常與糖尿病、腫瘤、帕金森氏癥和阿爾茲海默病等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此對線粒體的數(shù)量、形貌等的觀察和研究對于探知細(xì)胞的狀態(tài)和生命活動至關(guān)重要。此外，由于線粒體對活性氧和熱的敏感性，線粒體也成為了癌癥光動力學(xué)治療和光熱治療的重要靶標(biāo)。

另一方面，熒光染色法是實(shí)現(xiàn)線粒體成像的最主要方法，因此開發(fā)出相應(yīng)的線粒體熒光探針是目前的研究熱點(diǎn)?，F(xiàn)在商品化的線粒體熒光探針主要包括羅丹明123、具有線粒靶向性質(zhì)的綠色熒光蛋白(mito-GFP)和MitoTracker系列染料。這些染料因?yàn)槠涓叨忍禺惖木€粒體靶向特性以及可產(chǎn)生較強(qiáng)熒光信號而飽受青睞，但是它們也存在著許多缺點(diǎn)如合成復(fù)雜、價(jià)格昂貴、水溶性較差且光穩(wěn)定性差等，從而在一定程度上限制了它們的應(yīng)用。

與此同時(shí)，定位于線粒體的靶向癌癥治療是目前治療癌癥的新思路。這是因?yàn)獒槍€粒體的藥物能夠有效破壞對于細(xì)胞生命活動極其重要的線粒體從而提高藥物殺死癌細(xì)胞的效率。發(fā)展線粒體靶向藥物，最常用的方法是利用線粒體靶向配體如三苯基膦(TPP)對藥物進(jìn)行共價(jià)修飾，從而賦予藥物線粒體靶向的能力。但是，由于該配體毒性較大，且其本身不具備熒光性質(zhì)，因此在修飾的過程通常還須引入其他的熒光分子才能實(shí)現(xiàn)對藥物的熒光示蹤，但引入的其他分子會降低修飾后藥物的線粒體靶向性。這些缺點(diǎn)也成為了該配體用于實(shí)現(xiàn)藥物線粒體靶向輸運(yùn)的瓶頸。綜合所述，開發(fā)出一種同時(shí)具備熒光探針和藥物載體雙重功能的線粒體靶向分子或納米顆粒的重要性不言而喻。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：針對上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種熒光碳點(diǎn)，以及利用多胺基化合物和多羧基化合物，并借助水熱合成法，制備該熒光碳點(diǎn)的方法；以及所述熒光碳點(diǎn)在線粒體成像和線粒體靶向載藥性能方面的應(yīng)用。

技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種線粒體靶向熒光碳點(diǎn)，其主要是由以下重量份比例的原料制成：

殼聚糖1–20份、乙二胺1–10份和和巰基丁二酸1–10份。

優(yōu)選，所述的線粒體靶向熒光碳點(diǎn)主要是由以下重量份比例的原料制成：

殼聚糖1份、乙二胺1–10份和和巰基丁二酸1–10份。

優(yōu)選，所述的線粒體靶向熒光碳點(diǎn)主要是由以下重量份比例的原料制成：

殼聚糖20份、乙二胺1–10份和和巰基丁二酸1–10份。

優(yōu)選，所述殼聚糖分子量在10kDa-1000kDa。

本發(fā)明還提供了所述線粒體靶向熒光碳點(diǎn)制備方法，包括以下步驟：將殼聚糖、乙二胺和和巰基丁二酸制成混合液，然后水熱條件下反應(yīng)一定時(shí)間，降溫，過濾或離心即得所述靶向熒光碳點(diǎn)的溶液。

優(yōu)選，包括以下步驟：

(1)稱取殼聚糖、乙二胺和和巰基丁二酸，其中殼聚糖在稀鹽酸溶液中加熱溶解，而后將乙二胺與巰基丁二酸加入至殼聚糖溶液中混勻，并將混合液加入到水熱反應(yīng)釜中；

(2)在水熱反應(yīng)釜中以160–200℃反應(yīng)12–48h，降至室溫后，過濾或離心即得所述靶向熒光碳點(diǎn)的溶液。

本發(fā)明還提供了所述的線粒體靶向熒光碳點(diǎn)在作為線粒體熒光探針中的應(yīng)用，

以及所述線粒體靶向熒光碳點(diǎn)在作為線粒體靶向抗癌藥物載體中的應(yīng)用。

碳點(diǎn)由于其制備簡單、具有熒光發(fā)光能力、尺寸小、水溶性好以及生物毒性低的性質(zhì)而被廣泛應(yīng)用于許多領(lǐng)域，如生物成像、生物監(jiān)測和藥物載體等。本發(fā)明制備的碳點(diǎn)，首次實(shí)現(xiàn)了對哺乳動物細(xì)胞的線粒體成像的能力，且其抗光漂白的能力遠(yuǎn)高于常規(guī)的有機(jī)分子染料。相較于商品化的線粒體成像試劑，我們合成的碳點(diǎn)由于制備簡單、水溶性好、安全性好、成本低廉，更加能夠推廣使用，并有望取代商品化的線粒體熒光探針。同時(shí)，由于碳點(diǎn)表面存在著包括氨基、羧基、巰基以及羥基等功能基團(tuán)，該碳點(diǎn)可以通過物理或化學(xué)作用有效負(fù)載抗癌藥物，實(shí)現(xiàn)定位于線粒體的靶向藥物治療。本發(fā)明將拓展熒光碳點(diǎn)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

本發(fā)明首次以殼聚糖、乙二胺和巰基丁二酸的混合物為碳源，利用水熱合成法一步制得成本低、水溶性好、生物毒性低并具有線粒體熒光成像和線粒體靶向載藥功能的新型熒光碳點(diǎn)。以溶解于0.1M硫酸中的硫酸奎寧溶液(量子產(chǎn)率為54％)作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行相對量子產(chǎn)率測試，我們發(fā)現(xiàn)該碳點(diǎn)熒光量子產(chǎn)率為12％，并且在不同激發(fā)波長下能夠分別發(fā)出藍(lán)色、綠色和紅色的熒光。制備得到的碳點(diǎn)還具備對哺乳動物細(xì)胞的線粒體成像的能力，其抗光漂白的能力遠(yuǎn)高于常規(guī)的有機(jī)分子染料。同時(shí)，由于碳點(diǎn)表面存在著包括氨基、羧基、巰基以及羥基等功能基團(tuán)，可通過物理或化學(xué)作用負(fù)載藥物，實(shí)現(xiàn)基于線粒體靶向的藥物輸運(yùn)，這將進(jìn)一步拓寬碳點(diǎn)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

技術(shù)效果：相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下優(yōu)勢：

(1)優(yōu)異的線粒體靶向成像性能：其對哺乳動物細(xì)胞線粒體的靶向成像具有普適性，在100μg/mL的濃度下便可實(shí)現(xiàn)對包括以肺細(xì)胞(AT II)與肝細(xì)胞(L02)為代表的正常組織細(xì)胞和以巨噬細(xì)胞(Raw264.7)為代表的人體免疫細(xì)胞以及以乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)、肝癌細(xì)胞(HepG2)和宮頸癌細(xì)胞(HeLa)為代表的癌細(xì)胞的線粒體成像，同時(shí)其成像可實(shí)現(xiàn)免清洗，為熒光成像操作帶來巨大的簡便；

(2)優(yōu)異的線粒體靶向載藥功能：通過共價(jià)作用，可連接抗癌藥物，所得到的碳點(diǎn)-藥物復(fù)合體仍然保持碳點(diǎn)本身的線粒體靶向性質(zhì)，從而可以實(shí)現(xiàn)定位于線粒體的癌癥治療并因此可極大地提高藥物的抗癌療效。

(3)優(yōu)異的熒光性質(zhì)：所制得的碳點(diǎn)熒光強(qiáng)度大，熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜分布均很廣，從而極大地拓寬了其對哺乳動物細(xì)胞線粒體成像檢測的應(yīng)用范圍。在作為藥物載體時(shí)，碳點(diǎn)本身的熒光可賦予藥物分子熒光示蹤的特性，為研究藥物的定位機(jī)制提供了可能；

(4)優(yōu)異的抗光漂白能力：該碳點(diǎn)在激光照射下不易被光漂白，其光穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于常規(guī)的有機(jī)染料分子如羅丹明123以及MitoTracker系列染料等，因此可以實(shí)現(xiàn)長時(shí)間連續(xù)成像觀察；

(5)較高的生物相容性：經(jīng)細(xì)胞毒性評價(jià)實(shí)驗(yàn)，該熒光碳點(diǎn)在0.5mg/mL的濃度時(shí)，對正常肺細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞的毒性依舊很低，均保持著80％左右及以上的存活率，即碳點(diǎn)本身的性質(zhì)并不會對細(xì)胞造成很強(qiáng)的毒害，表現(xiàn)出很好的生物相容性；

(6)良好的水分散性和穩(wěn)定性。所制得的熒光碳點(diǎn)具有很好的水分散性和穩(wěn)定性，適合在含水的生物體系中的線粒體成像以及線粒體靶向載藥的應(yīng)用。

(7)本發(fā)明制備方法簡單、原料價(jià)廉易得、可實(shí)現(xiàn)大量制備。

附圖說明

圖1為利用殼聚糖、乙二胺、巰基丁二酸的混合物制備熒光碳點(diǎn)的合成示意圖；

圖2為本發(fā)明制得的熒光碳點(diǎn)的透射電子顯微鏡(TEM)圖；

圖3為本發(fā)明制得的熒光碳點(diǎn)的紫外-可見吸收光譜圖；

圖4為本發(fā)明制得的熒光碳點(diǎn)的熒光發(fā)射光譜圖；

圖5為本發(fā)明制得的熒光碳點(diǎn)對于MCF-7成像效果圖；

圖6為本發(fā)明得的熒光碳點(diǎn)對于不同細(xì)胞線粒體成像效果圖；

圖7為本發(fā)明制得的熒光碳點(diǎn)對于不同細(xì)胞的毒性評價(jià)結(jié)果圖；

圖8為本發(fā)明制得的熒光碳點(diǎn)連接光敏劑孟加拉玫瑰紅(RB)后所得物質(zhì)(CDs-RB)透射電子顯微鏡圖；

圖9為本發(fā)明制得的熒光碳點(diǎn)連接光敏劑孟加拉玫瑰紅(RB)后所得物質(zhì)(CDs-RB)與碳點(diǎn)以及RB的紫外-可見吸收光譜圖；

圖10為本發(fā)明制得的熒光碳點(diǎn)連接光敏劑孟加拉玫瑰紅(RB)后所得物質(zhì)(CDs-RB)與碳點(diǎn)以及RB的熒光發(fā)射光譜圖；

圖11為本發(fā)明制得的熒光碳點(diǎn)連接光敏劑孟加拉玫瑰紅(RB)后所得物質(zhì)(CDs-RB)對MCF-7細(xì)胞的線粒體成像效果圖；

圖12為本發(fā)明制得的熒光碳點(diǎn)連接光敏劑孟加拉玫瑰紅(RB)后所得物質(zhì)對MCF-7細(xì)胞的光療效果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解這些實(shí)例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明的各種等價(jià)形式的修改均落于本申請所附權(quán)利要求所限定的范圍。

以下實(shí)施例中所用殼聚糖分子量在10kDa-1000kDa。

實(shí)施例1

本實(shí)施例熒光碳點(diǎn)的制備，包括以下步驟：

(1)原料的準(zhǔn)備：稱取殼聚糖、巰基丁二酸和乙二胺，使其質(zhì)量比為5:2:1，三者完全溶解于稀鹽酸溶液后充分混勻并轉(zhuǎn)移至水熱反應(yīng)釜中；

(2)反應(yīng)：在水熱反應(yīng)釜中以180℃反應(yīng)24h，形成碳點(diǎn)溶液；

(3)純化：離心或過濾即得目標(biāo)熒光碳點(diǎn)溶液。

該反應(yīng)的示意圖見圖1，制備所得熒光碳點(diǎn)的透射電子顯微鏡結(jié)果見圖2，制備所得熒光碳點(diǎn)的紫外–可見吸收光譜見圖3，制備所得熒光碳點(diǎn)的不同波長激發(fā)下的熒光發(fā)射光譜見圖4。

實(shí)施例2到9

實(shí)施例2熒光碳點(diǎn)的制備步驟與實(shí)施例1相同，只是步驟(1)中殼聚糖、巰基丁二酸和乙二胺三者質(zhì)量比為1:1:1。

實(shí)施例3熒光碳點(diǎn)的制備步驟與實(shí)施例1相同，只是步驟(1)中殼聚糖、巰基丁二酸和乙二胺三者質(zhì)量比為1:1:10。

實(shí)施例4熒光碳點(diǎn)的制備步驟與實(shí)施例1相同，只是步驟(1)中殼聚糖、巰基丁二酸和乙二胺三者質(zhì)量比為1:10:1。

實(shí)施例5熒光碳點(diǎn)的制備步驟與實(shí)施例1相同，只是步驟(1)中殼聚糖、巰基丁二酸和乙二胺三者質(zhì)量比為1:10:10。

實(shí)施例6熒光碳點(diǎn)的制備步驟與實(shí)施例1相同，只是步驟(1)中殼聚糖、巰基丁二酸和乙二胺三者質(zhì)量比為20:1:1。

實(shí)施例7熒光碳點(diǎn)的制備步驟與實(shí)施例1相同，只是步驟(1)中殼聚糖、巰基丁二酸和乙二胺三者質(zhì)量比為20:1:10。

實(shí)施例8熒光碳點(diǎn)的制備步驟與實(shí)施例1相同，只是步驟(1)中殼聚糖、巰基丁二酸和乙二胺三者質(zhì)量比為20:10:1。

實(shí)施例9熒光碳點(diǎn)的制備步驟與實(shí)施例1相同，只是步驟(1)中殼聚糖、巰基丁二酸和乙二胺三者質(zhì)量比為2:1:1。

實(shí)施例10到11

實(shí)施例10熒光碳點(diǎn)的制備步驟與實(shí)施例1相同，只是步驟(2)中，反應(yīng)條件為：在160℃下反應(yīng)48h。

實(shí)施例11熒光碳點(diǎn)的制備步驟與實(shí)施例1相同，只是步驟(2)中，反應(yīng)條件為：在200℃下反應(yīng)12h。

實(shí)施例12

測試實(shí)施例1所制得的熒光碳點(diǎn)對MCF-7細(xì)胞的成像效果，方法如下：

(1)細(xì)胞培養(yǎng)：復(fù)蘇MCF-7細(xì)胞，在RPMI-1640完全培養(yǎng)基中于37℃、5％CO₂環(huán)境中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度長至80％左右時(shí)，用胰酶消化并通過流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)，使最終每個(gè)孔中細(xì)胞數(shù)量為5×10⁴個(gè)/mL，仍于37℃、5％CO₂環(huán)境中培養(yǎng)24h。

(2)細(xì)胞染色：分別配制線粒體染料(MitoTracker)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染料(ER Tracker)、高爾基體染料(Golgi Tracker)以及溶酶體染料(LysoTracker)，與實(shí)施例1中所制得的碳點(diǎn)溶液混合，使混合液中碳點(diǎn)濃度為200μg/mL。而后，用磷酸緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞2–3次，加入200μL已配好的混合染液，于37℃、5％CO₂環(huán)境中共孵育30min。最后用RPMI-1640完全培養(yǎng)基清洗細(xì)胞，除去溶液中游離的染料分子。

(3)共聚焦熒光顯微鏡成像觀測：用波長為488nm、552nm和638nm的激光作為激發(fā)光，其中碳點(diǎn)經(jīng)488nm激光激發(fā)發(fā)射綠色熒光，而線粒體染料經(jīng)638nm激光激發(fā)發(fā)射紅色熒光而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染料、高爾基體染料和溶酶體染料經(jīng)552nm激發(fā)發(fā)射紅色熒光?？紤]上述染料與碳點(diǎn)本身的熒光發(fā)射存在一定的重疊，故每次的共染通過控制單一染色時(shí)的拍攝條件，保證在相應(yīng)的拍攝條件下碳點(diǎn)與不同細(xì)胞器染料不會發(fā)生串色現(xiàn)象，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

熒光成像結(jié)果見圖5。由圖可見，碳點(diǎn)的綠色熒光與線粒體染料的紅色熒光重疊在一起，表明二者具有共定位的性質(zhì)，也即碳點(diǎn)能特異地靶向到MCF-7細(xì)胞的線粒體，實(shí)現(xiàn)對線粒體的染色。

實(shí)施例13

測試實(shí)施例1所制得的熒光碳點(diǎn)對HeLa,HepG2,AT II,L02以及Raw264.7細(xì)胞的線粒體成像效果，其方法與實(shí)施例12相同，其中細(xì)胞器染料僅選擇線粒體染料進(jìn)行與碳點(diǎn)的共染。結(jié)果如圖6。由圖可見，實(shí)施例1所制得碳點(diǎn)對上述五種細(xì)胞均具有優(yōu)異線粒體靶向成像的性能。

實(shí)施例14

測試實(shí)施例1所制得的熒光碳點(diǎn)的細(xì)胞毒性，步驟如下：選擇正常肺細(xì)胞(ATII)和乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)，以5×10⁴個(gè)/mL細(xì)胞懸液分別與濃度為0,10,20,50,100,200,500,1000μg/mL的熒光碳點(diǎn)孵育24h后，利用酶標(biāo)儀采用MTT檢測法測熒光碳點(diǎn)對兩種細(xì)胞的毒性。結(jié)果見圖7。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明熒光碳點(diǎn)在工作濃度(100μg/mL)及以上(200,500μg/mL)時(shí)，正常細(xì)胞和癌細(xì)胞都有80％及以上的存活率，說明該熒光碳點(diǎn)材料具有良好的生物相容性。

實(shí)施例15

測試實(shí)施例1所制得的熒光碳點(diǎn)(CDs)與孟加拉玫瑰紅(RB)的化學(xué)連接，即制備CDs-RB，方法如下。

(1)RB溶于二甲基甲酰胺(DMF)，與二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和1-羥基苯并三唑(HoBt)按照1:6:6的物質(zhì)的量比在室溫活化4小時(shí)。

(2)將經(jīng)活化后的RB與碳點(diǎn)按照1:10的質(zhì)量比室溫反應(yīng)12小時(shí)。

(3)用分子量為1000的透析袋在二甲基亞砜(DMSO)和水的混合物中透析2天。該反應(yīng)所得CDs-RB的透射電子顯微鏡圖見圖8，紫外–可見吸收光譜見圖9，熒光發(fā)射光譜(以347nm為激發(fā)波長)見圖10。由圖可見，所制得的CDs-RB粒徑為30nm左右，其在418nm處的熒光發(fā)射出現(xiàn)了碳點(diǎn)的發(fā)射峰和RB的發(fā)射峰，證明了CD-RB的成功合成，且碳點(diǎn)和RB之間存在一定的熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，導(dǎo)致其能在418nm處激發(fā)出RB的發(fā)射峰。

實(shí)施例16

測試實(shí)施例15所制得的CDs-RB對MCF-7線粒體靶向特性，其方法與實(shí)施例13相同。結(jié)果見圖11。由圖可見，實(shí)施例15所制得CDs-RB在488nm激發(fā)光下所發(fā)射的綠色熒光與MitoTracker在638nm處激發(fā)所發(fā)射的紅光基本重合，說明CDs-RB能特異性靶向在線粒體中，成功保持了碳點(diǎn)本身的靶向性質(zhì)。

實(shí)施例17

測試實(shí)施例15所制得的CDs-RB與RB的MCF-7光療效果，其方法如下：

(1)細(xì)胞培養(yǎng)：復(fù)蘇MCF-7細(xì)胞，在RPMI-1640完全培養(yǎng)基中于37℃、5％CO₂環(huán)境中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度長至80％左右時(shí)，用胰酶消化并通過流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)，使最終種96孔板時(shí)細(xì)胞數(shù)量為5×10⁴個(gè)/mL，仍于37℃、5％CO₂環(huán)境中培養(yǎng)24h。

(2)細(xì)胞光療：在RPMI-1640完全培養(yǎng)基中配制RB溶液與CDs-RB溶液，使兩者最終含有的RB濃度為5μg/mL。而后再用cell PBS清洗細(xì)胞，分別加入100μL上述配制的RB和CDs-RB溶液于相應(yīng)的孔中，于37℃、5％CO₂環(huán)境中培養(yǎng)30min。而后用RPMI-1640完全培養(yǎng)基清洗2–3次。以532nm激光在不同強(qiáng)度(0,10,20,30,40,50mW)下分別照射5min，而后轉(zhuǎn)移至37℃、5％CO₂環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)4h。

(3)細(xì)胞存活率檢測：配制5mg/mL噻唑藍(lán)(MTT)，并于每個(gè)細(xì)胞孔中加入10μL配好的5mg/mL的MTT溶液，于37℃、5％CO2環(huán)境中培養(yǎng)4h。而后倒出每個(gè)孔中的培養(yǎng)液，各加入150μL DMSO，最后用酶標(biāo)儀測量在492nm處的吸光度。結(jié)果見圖12。

如圖12所示，在30mW的光照強(qiáng)度下，CDs-RB組的細(xì)胞存活率很低，在20％左右。這說明絕大部分細(xì)胞在RB的光動力治療效果下死亡。與之相反，RB組的細(xì)胞即使在50mW強(qiáng)度的激光照射下，其細(xì)胞存活率仍高達(dá)90％以上，說明RB本身的光動力療效很差。以上實(shí)驗(yàn)證明了CDs-RB在靶向線粒體的光動力抗癌治療上的應(yīng)用潛力。