專利名稱：一種漢族人腎肉瘤樣癌細胞系及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物動物細胞系領(lǐng)域，具體涉及一種漢族人腎肉瘤樣癌細胞系 RCC09HYF，及其制備方法。
背景技術(shù)：
腫瘤細胞系在腫瘤的基礎(chǔ)研究中具有重要的地位，采用細胞系進行體外實驗及體內(nèi)動物模型的構(gòu)建，對于在后基因組時代即功能基因組時代，挖掘重要基因的潛在功能至關(guān)重要。由于細胞系具有比較恒定的遺傳背景，因此細胞系仍是目前完成基因功能的體外檢測和驗證的重要工具。人癌細胞的體外培養(yǎng)，不僅能從分子、基因水平深入研究腫瘤發(fā)生和發(fā)展機理，而且對臨床的早期診斷、藥物篩選和腫瘤治療具有重要意義，如sunitinib malate治療轉(zhuǎn)移性腎透明細胞癌目前進入了 III期臨床實驗，之前該藥物在786-0等腎癌細胞系的作用機制的深入研究起到了奠基作用。腎肉瘤樣癌是腎臟惡性腫瘤的特殊類型，僅占腎實質(zhì)腫瘤的1.0% -8.0%，臨床少見，瘤體具有浸潤性生長的生物學(xué)特性，惡性程度高，病程進展迅速，轉(zhuǎn)移通常發(fā)生早，多數(shù)患者對放化療不敏感，預(yù)后極差。Tl患者的平均生存期為49. 7個月，T2-T4患者的平均生存期為6. 8個月。1968年Farrow等首先發(fā)現(xiàn)并命名為肉瘤樣癌(Farrow GM, Harrison EG,UTZ DG. Sarcomas and sarcomatoid and mixed malignant tumors of the kidney in adults-Part III. Cancer 1968,22 :556-563)。該腫瘤成分中，上皮部分可以是各種病理類型的腎細胞癌，70%為透明細胞癌或顆粒細胞癌；肉瘤樣部分可以表現(xiàn)為血管外皮肉瘤樣、 橫紋肌肉瘤樣、骨肉瘤樣、軟骨肉瘤樣及未分化肉瘤樣等結(jié)構(gòu)。目前腎肉瘤樣癌的診斷水平和治療效果沒有突破性進展，早期發(fā)現(xiàn)并進行根治性手術(shù)治療仍然是首選的診斷治療方案。臨床上證實少部分腎肉瘤樣癌病例對細胞因子治療有一定效果，但屬于個案報道，尚未得到臨床實驗的證據(jù)。由于腎肉瘤樣癌中，肉瘤樣結(jié)構(gòu)與上皮結(jié)構(gòu)的混合比例直接影響了患者預(yù)后及系統(tǒng)治療，肉瘤樣結(jié)構(gòu)占的比例越高，患者預(yù)后越差，系統(tǒng)治療越困難。為了闡明腎肉瘤樣癌的遺傳特性，特別是肉瘤樣結(jié)構(gòu)與上皮結(jié)構(gòu)部分的相互作用在腎細胞癌惡性進展中發(fā)生的作用，從而指導(dǎo)臨床的系統(tǒng)治療，建立體外腎肉瘤樣癌細胞模型是必經(jīng)之路也是當務(wù)之急。目前，ATCC尚未收錄任何有關(guān)腎肉瘤樣癌的細胞系，鑒于全世界人種的遺傳背景和生活條件的差異，腫瘤發(fā)病率和病死率也有所不同，對漢族人新鮮腎肉瘤樣癌細胞的培養(yǎng)及細胞系的建立是研究中國人腎癌轉(zhuǎn)移機制的重要步驟，具有切實的科學(xué)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種漢族人腎肉瘤樣癌細胞系。本發(fā)明應(yīng)用體外細胞培養(yǎng)技術(shù)建立人腎肉瘤樣癌細胞系，采用細胞株作為實驗對象，分析腫瘤細胞的生長、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為特點，為進一步研究漢族人腎細胞癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移機制，為臨床預(yù)測、診斷及治療提供有效且穩(wěn)定的細胞模型。
本發(fā)明提供一種漢族人腎肉瘤樣癌細胞系RCC09HYF，其保藏號為CCTCC C201130, 于2011年5月11日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。本發(fā)明還提供了上述漢族人腎肉瘤樣癌細胞系RCC09HYF的制備方法，包括以下步驟本發(fā)明的RCC09HYF細胞取自一位漢族腎肉瘤樣癌患者的腎原位腫瘤組織。將切除的腫瘤組織放入盛有少量無血清DMEM培養(yǎng)基(含1000單位/ml青霉素，3 μ g/ml兩性霉素B)的細胞培養(yǎng)平皿中，剔除壞死組織、脂肪結(jié)締組織、血管等，隨后將可肉眼分辨的腫瘤組織塊于4°C下浸泡于無血清的DMEM培養(yǎng)基中。30min后，將組織塊用眼科剪剪成l_3mm3 的小塊，將組織塊隨同浸泡液轉(zhuǎn)移至離心管中，反復(fù)搖晃清洗2-aiiin，1500轉(zhuǎn)/分，離心 IOmin0棄上清，重新加入DMEM培養(yǎng)基懸浮組織塊，反復(fù)搖晃清洗2_;3min，1500轉(zhuǎn)/分，離心lOmin，棄上清。用Iml的DMEM完全培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基，10%胎牛血清，青霉素100單位/ml，鏈霉素100 μ g/ml)重懸組織塊，并接種到玻璃細胞培養(yǎng)瓶(IOOml)中。將培養(yǎng)瓶置于37°C ,5% C02，95%濕度的(X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Mh。24h組織塊貼壁后補充加入DMEM完全培養(yǎng)基2-2. 5ml繼續(xù)培養(yǎng)。本發(fā)明的漢族人腎肉瘤樣癌細胞系RCC09HYF的具體制備方法如下1.原代培養(yǎng)無菌條件下，取行腎癌根治術(shù)患者的腎原位腫瘤組織(后病理鑒定為腎肉瘤樣癌)，放入盛有少量無血清DMEM培養(yǎng)基(含1000單位/ml青霉素，3 μ g/ml兩性霉素B)的細胞培養(yǎng)平皿中，剔除壞死組織、脂肪結(jié)締組織、血管等，隨后將可肉眼分辨的腫瘤組織塊于4°C下浸泡于無血清的DMEM培養(yǎng)基中。30min后，將組織塊用眼科剪剪成l_3mm3的小塊， 將組織塊隨同浸泡液轉(zhuǎn)移至離心管中，反復(fù)搖晃清洗2-;3min，1500轉(zhuǎn)/分，離心lOmin。棄上清，重新加入DMEM培養(yǎng)基懸浮組織塊，反復(fù)搖晃清洗2-aiiin，1500轉(zhuǎn)/分，離心lOmin， 棄上清。用Iml的DMEM完全培養(yǎng)基重懸組織塊，并接種到玻璃細胞培養(yǎng)瓶(IOOml)中。將培養(yǎng)瓶置于37°C，5% C02，95%濕度的(X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Mh。24h組織塊貼壁后補充加入 DMEM完全培養(yǎng)基2-2. 5ml繼續(xù)培養(yǎng)。2.傳代當細胞從組織塊中爬出，并有85%以上融合的時候，進行細胞傳代。在超凈工作臺內(nèi)，于無菌條件下，吸除培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)液。用少量D-hanks液清洗培養(yǎng)瓶2次后，加入0. 25% 胰酶1ml，置37°C，5% C02，95%濕度的(X)2培養(yǎng)箱中4-5min。待鏡下觀察大部分細胞的細胞質(zhì)回縮、細胞間隙增大時(甚至看到有個別細胞漂浮起來)，加入DMEM完全培養(yǎng)基中和，反復(fù)吹打貼壁的細胞，形成單細胞懸液。3.凍存與復(fù)蘇凍存凍存前24h更換新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基，使細胞處于指數(shù)生長期。在超凈工作臺內(nèi)，于無菌條件下，吸除培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)液。用D-hanks液清洗培養(yǎng)瓶2次后，加入 0. 25%胰酶1ml，置37°C，5% C02，95%濕度的(X)2培養(yǎng)箱中4-5min。待鏡下觀察大部分細胞的細胞質(zhì)回縮、細胞間隙增大時(甚至看到有個別細胞漂浮起來)，加入DMEM完全培養(yǎng)基細1，反復(fù)吹吸貼壁的細胞，形成單細胞懸液。將細胞懸液收集至離心管中，室溫下1500rpm 離心IOmin收集培養(yǎng)細胞。棄上清，細胞沉淀用1.5ml凍存液懸浮，計數(shù)，調(diào)整至5 X IO6/ ml。移入凍存管，將凍存管口封嚴。貼上標簽，注明細胞種類、凍存日期、凍存者。凍存管置于-80°C 12h以上，次日移入液氮。復(fù)蘇從液氮中取出凍存管、迅速置于37°C溫水中。待凍存管中的凍存物融化成液體后，將細胞懸液吸至離心管中，1500rpm離心lOmin，棄去上清液。沉淀加5ml DMEM完全培養(yǎng)基，吹打均勻至單細胞懸液(細胞濃度5 X 105/ml)，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，置37°C，5% CO2, 95%濕度的(X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。目前中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的是我們培養(yǎng)的第64代、69代RCC09HYF。本發(fā)明涉及到的培養(yǎng)液配方如下D-Hanks 液=NaCl 8. Og, KCl 0. 4g, Na2HPO4 12H20 0. 08g, KH2PO4 0. 06g, NaHCO3 0. !35g，l%酚紅anl，超純水溶解并定容至1000ml。121°C 30min滅菌，4°C保存。DMEM培養(yǎng)基Hyclone，hvitrogen (高糖，添加丙酮酸鈉及L-谷氨酰胺)。DMEM完全培養(yǎng)基DMEM培養(yǎng)基，10 %胎牛血清，青霉素100單位/ml，鏈霉素 100μ g/ml。凍存液(使用前現(xiàn)配)采用胎牛血清添加二甲基亞砜(DMSO)配制凍存液，其體積比 14-20 1。本發(fā)明的漢族人腎肉瘤樣癌細胞系RCC09HYF，能在體外長期生長和穩(wěn)定傳代， 呈雙相分化特征，由肉瘤樣結(jié)構(gòu)和上皮樣結(jié)構(gòu)(主要為透明細胞癌)，失去接觸抑制； RCC09HYF染色體為異倍體，染色體數(shù)目主要集中在55-68，染色體眾數(shù)為63，染色體的數(shù)目及結(jié)構(gòu)均有畸變 ’經(jīng)歷12個月傳120代，群體倍增時間為18h，集落形成率為31% ；免疫組化分析 RCC09HYF 對應(yīng)腫瘤，顯示 Vimentin、CD10、CAM、Ki67 呈強陽性，ABC、CACP、HMB、P53、 SMA陰性。本發(fā)明的漢族人腎肉瘤樣癌細胞系RCC09HYF，經(jīng)體外原位動物模型致瘤實驗發(fā)現(xiàn)，動物體內(nèi)成瘤速度較快，接種瘤體3-4周后，50%以上的裸鼠移植瘤充滿整個腹腔，惡液質(zhì)，個別已存在肺轉(zhuǎn)移。凍存后復(fù)蘇率達80%以上，復(fù)蘇后的細胞生長狀態(tài)與原培養(yǎng)細胞一致。采用本發(fā)明的漢族人腎肉瘤樣癌細胞系細胞作為實驗對象，可以分析腫瘤細胞的生長特性，及腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移等相關(guān)惡性生物學(xué)行為及發(fā)生機制，為進一步研究漢族人腎肉瘤樣癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移，為臨床預(yù)測、診斷及治療提供有效且穩(wěn)定的細胞模型。本發(fā)明的漢族人腎肉瘤樣癌細胞系RCC09HYF，為進行腎肉瘤樣癌的早期發(fā)現(xiàn)、有效治療篩選特異的標志物和治療靶點。


圖1為RCC09HYF的12代細胞于光學(xué)顯微鏡下觀察QOO X)，細胞均呈貼壁生長， 培養(yǎng)早期細胞形態(tài)及其不規(guī)則，失去接觸抑制，呈雙相分化特征(A)，細胞異質(zhì)性明顯(B)， 部分細胞呈現(xiàn)肉瘤樣結(jié)構(gòu)(藍色箭頭所指)，部分細胞呈現(xiàn)上皮樣結(jié)構(gòu)——透明細胞癌(紅色箭頭所指)。圖2為RCC09HYF細胞生長曲線。圖3為RCC05HYF HE染色。細胞大，核膜、核仁輪廓明顯，核仁清晰，胞質(zhì)少，核糖體顆粒豐富，大部分細胞雙核或多核，核質(zhì)比例倒置。箭頭所指為細胞雙核的現(xiàn)象。 圖4為RCC05HYF對應(yīng)的腫瘤組織HE染色分析。部分為肉瘤樣結(jié)構(gòu)(A)，上皮樣結(jié)構(gòu)主要以透明細胞癌為主(B)。圖5為RCC05HYF對應(yīng)的腫瘤組織免疫組化分析顯示CAM、Vimentin、CD10、Ki67呈
強陽性。圖6為RCC05HYF染色體核型分析圖。從圖中可見，RCC05HYF細胞存在超二倍體情況，許多染色體均超過了 2條。
具體實施例方式下面結(jié)合本發(fā)明的實施例和附圖對本發(fā)明的實施作詳細說明，以下實施例是在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。實施例1 漢族人腎肉瘤樣癌細胞系RCC09HYF的獲得1.原代培養(yǎng)無菌條件下，取行腎癌根治術(shù)患者的腎原位腫瘤組織(后病理鑒定為腎肉瘤樣癌)，放入盛有少量無血清DMEM培養(yǎng)基(含1000單位/ml青霉素，3 μ g/ml兩性霉素B)的細胞培養(yǎng)平皿中，剔除壞死組織、脂肪結(jié)締組織、血管等，隨后將可肉眼分辨的腫瘤組織塊于4°C下浸泡于無血清的DMEM培養(yǎng)基中。30min后，將組織塊用眼科剪剪成l_3mm3的小塊， 將組織塊隨同浸泡液轉(zhuǎn)移至離心管中，反復(fù)搖晃清洗2-;3min，1500轉(zhuǎn)/分，離心lOmin。棄上清，重新加入DMEM培養(yǎng)基懸浮組織塊，反復(fù)搖晃清洗2-aiiin，1500轉(zhuǎn)/分，離心lOmin， 棄上清。用Iml的DMEM完全培養(yǎng)基重懸組織塊，并接種到玻璃細胞培養(yǎng)瓶(IOOml)中。將培養(yǎng)瓶置于37°C，5% C02，95%濕度的(X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Mh。24h組織塊貼壁后補充加入 DMEM完全培養(yǎng)基2-2. 5ml繼續(xù)培養(yǎng)。2.傳代當細胞從組織塊中爬出，并有85%以上融合的時候，進行細胞傳代。在超凈工作臺內(nèi)，于無菌條件下，吸除培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)液。用少量D-hanks液清洗培養(yǎng)瓶2次后，加入0. 25% 胰酶1ml，置37°C，5% C02，95%濕度的(X)2培養(yǎng)箱中4-5min。待鏡下觀察大部分細胞的細胞質(zhì)回縮、細胞間隙增大時(甚至看到有個別細胞漂浮起來)，加入DMEM完全培養(yǎng)基中和，反復(fù)吹打貼壁的細胞，形成單細胞懸液。3.凍存與復(fù)蘇凍存凍存前24h更換新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基，使細胞處于指數(shù)生長期。在超凈工作臺內(nèi)，于無菌條件下，吸除培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)液。用D-Hanks液清洗培養(yǎng)瓶2次后，加入 0. 25%胰酶1ml，置37°C，5% C02，95%濕度的(X)2培養(yǎng)箱中4-5min。待鏡下觀察大部分細胞的細胞質(zhì)回縮、細胞間隙增大時(甚至看到有個別細胞漂浮起來)，加入DMEM完全培養(yǎng)基細1，反復(fù)吹吸貼壁的細胞，形成單細胞懸液。將細胞懸液收集至離心管中，室溫下1500rpm 離心IOmin收集培養(yǎng)細胞。棄上清，細胞沉淀用1.5ml凍存液懸浮，計數(shù)，調(diào)整至5 X IO6/ ml。移入凍存管，將凍存管口封嚴。貼上標簽，注明細胞種類、凍存日期、凍存者。凍存管置于-80°C 12h以上，次日移入液氮。復(fù)蘇從液氮中取出凍存管、迅速置于37°C溫水中。待凍存管中的凍存物融化成液體后，將細胞懸液吸至離心管中，1500rpm離心lOmin，棄去上清液。沉淀加5ml DMEM完全培養(yǎng)基，吹打均勻至單細胞懸液(細胞濃度5 X 105/ml)，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，置37°C，5% CO2,95%濕度的(X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本發(fā)明涉及到的培養(yǎng)液配方如下D-Hanks 液=NaCl 8. 0g, KCl 0. 4g, Na2HPO4 12H20 0. 08g, KH2PO4 0. 06g, NaHCO3 0. !35g，l%酚紅anl，超純水溶解并定容至1000ml。121°C 30min滅菌，4°C保存。DMEM培養(yǎng)基Hyclone，Invitrogen (高糖，添加丙酮酸鈉及L-谷氨酰胺)。DMEM完全培養(yǎng)基DMEM培養(yǎng)基，10 %胎牛血清，青霉素100單位/ml，鏈霉素 100μ g/ml。凍存液(使用前現(xiàn)配)采用胎牛血清添加二甲基亞砜(DMSO)配制凍存液，其體積比 14-20 1。實施例2 本發(fā)明的漢族人腎肉瘤樣癌細胞系RCC09HYF的生長及遺傳特性鑒定。1.細胞形態(tài)學(xué)觀察原代培養(yǎng)成功后，常規(guī)進行細胞傳代，能在體外長期生長和穩(wěn)定傳代，經(jīng)歷12個月傳120代。倒置顯微鏡鏡下觀察第12代O00X)，可見細胞均呈貼壁生長，培養(yǎng)早期細胞形態(tài)及其不規(guī)則，失去接觸抑制，呈雙相分化特征(圖1-A)，細胞異質(zhì)性明顯(圖1-B)，部分細胞呈現(xiàn)肉瘤樣結(jié)構(gòu)(圖1-B，藍色箭頭所指)，部分細胞呈現(xiàn)上皮樣結(jié)構(gòu)——透明細胞癌(圖1-B，紅色箭頭所指)。 2. RCC09HYF細胞生長曲線將5 X IO4個細胞接種到24孔板中，加2ml的1640完全培養(yǎng)基，共接種21個孔。 以后每隔一天消化3個孔并進行細胞計數(shù)。計算細胞數(shù)量的平均數(shù)和標準差，繪制細胞生長曲線(圖2)。從圖中可見細胞在第1-4天成對數(shù)生長，到第5天后達到平臺期，倍增時間為 18h。3. RCC05HYF HE 染色將處于對數(shù)生長期的RCC09HYF細胞取出后，PBS清洗，浸入95%酒精固定。PBS清洗后，采用蘇木素染液及伊紅染液染色，隨后梯度酒精脫色、固定、中性樹膠封片，顯微鏡觀察結(jié)果。鏡下觀察，細胞大，核膜、核仁輪廓明顯，核仁清晰，胞質(zhì)少，核糖體顆粒豐富，大部分細胞雙核或多核，核質(zhì)比例倒置。箭頭所指為細胞雙核的現(xiàn)象。4. RCC09HYF軟瓊脂克隆形成分析(以6孔板的單個孔為分析單位)首先制備下層瓊脂采用1.8%的瓊脂糖、2XDMEM、100XL-谷氨酰胺、100X青鏈霉素、胎牛血清等配制成終濃度為0. 6%的混合體系，待其凝固。將RCC09HYF細胞消化后，計數(shù)，制成5000/ml的細胞懸液。隨后制備上層瓊脂采用1.8%的瓊脂糖、2XDMEM、 100XL-谷氨酰胺、100X青鏈霉素、胎牛血清等配制成終濃度為0.3%的混合體系，并與 500 μ 1細胞懸液充分混合，立即傾注于下層瓊脂上，待其凝固后置C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。15 天后MTT染色觀察計算集落形成率。鏡下觀察，隨機選擇10個視野，計算每個視野中的集落形成率=含有10個以上細胞數(shù)的克隆/接種細胞數(shù)X 100。經(jīng)15天的培養(yǎng)，RCC09HYF 的克隆形成率為31%。5. RCC09HYF對應(yīng)的腫瘤組織HE染色及免疫組化分析按照第二軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會的規(guī)定，經(jīng)患者知情同意后，取該患者腫瘤組織標本。常規(guī)4 μ m石蠟切片，貼在涂有切片粘合劑的干凈載玻片上，58°C烤18小時，常規(guī)二甲苯脫蠟至水。一部分進行HE染色，鏡下觀察(圖4)，部分為肉瘤樣結(jié)構(gòu)(圖4-A)，上皮樣結(jié)構(gòu)主要以透明細胞癌為主(圖4-B)。另一部分進行免疫組化分析采用0. lmol/L PBS (PH =7.4)對脫蠟后的切片進行清洗。95°C抗原修復(fù)(AR) 10分鐘，自然冷卻，PBS清洗。一抗 (Vimentin、CD10、CAM、Ki67、ABC、CACP、HMB、P53、SMA) 4°C孵育過夜，PBS 清洗。0. 3% H202 抑制內(nèi)源性過氧化物酶。二抗37°C孵育30分鐘，PBS清洗。0. 05%DAB+0. 03%H202顯色 8-12分鐘，自來水充分沖洗終止反應(yīng)。蘇木素襯染30s，水洗，藍化(37°C ),0. 5%鹽酸乙醇分化，水洗藍化。常規(guī)樹脂封片。觀察陽性產(chǎn)物為棕黃色或呈棕褐色，背景為紫藍色。結(jié)果顯示Vimentin、CD10、CAM、Κ 67 呈強陽性(圖 5)，ABC、CACP、HMB、P53、SMA 陰性。6.染色體顯示和結(jié)構(gòu)分析取處于指數(shù)生長期、80% -90%融合單層培養(yǎng)的細胞。加秋水仙素阻抑中期分裂， 使其在培養(yǎng)基中最終濃度為0. 04-0. 1 μ g/ml培養(yǎng)基，C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4小時。經(jīng)過固定染色后，對30個處于分裂中期的細胞染色體進行計數(shù)，RCC09HYF細胞系染色體數(shù)目主要集中在55-68，染色體眾數(shù)為63，提示存在超二倍體的情況。同時采用R帶顯色法分析染色體結(jié)構(gòu)(鄂征主編，組織培養(yǎng)和分子細胞學(xué)技術(shù)，北京出版社，出版日期2001-1-1)。表1-2為RCC05HYF染色體核型分析結(jié)果。對30個處于分裂中期的細胞染色體進行分析，對異常情況進行計數(shù)，超過10個分裂相的異常情況如表1、表2所示第1號染色體存在缺失，檢出率為90. 0%。第7、9、10、11、12號染色體普遍存在超二倍體情況，檢出率分別為96. 7%U00%,83. 3%,96. 7%U00% ；第9、11、12號染色體同時存在結(jié)構(gòu)異常， 檢出率分別為100^^56.7^^63.3 ^此外，第1、2號染色體普遍存在結(jié)構(gòu)異常，del (1) (qter — p31 )，del (2) (pter — q33 )，檢出率均為 93. 3% (28/30)。表1 RCC09HYF細胞染色體數(shù)目異常分析(異常超過10個分裂相)
權(quán)利要求
1.漢族人腎肉瘤樣癌細胞系RCC09HYF，其保藏號為CCTCCC201130。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的漢族人腎肉瘤樣癌細胞系RCC09HYF的制備方法，包括以下步驟將切除的漢族腎肉瘤樣癌患者的腎原位腫瘤組織塊放入盛有少量無血清含1000單位 /ml青霉素和3 μ g/ml兩性霉素B的DMEM培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)平皿中，剔除壞死組織、脂肪結(jié)締組織和血管，將腫瘤組織塊于4°C下浸泡于無血清的DMEM培養(yǎng)基中；30分鐘后，將腫瘤組織塊用剪成l_3mm3的小塊，將腫瘤組織塊隨同浸泡液轉(zhuǎn)移至離心管中，反復(fù)搖晃清洗2-3 分鐘，1500轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘；棄上清，重新加入DMEM培養(yǎng)基懸浮組織塊，反復(fù)搖晃清洗 2-3分鐘，1500轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，棄上清；用Iml的DMEM完全培養(yǎng)基重懸組織塊，并接種到玻璃細胞培養(yǎng)瓶中；將培養(yǎng)瓶置于37°C，5% C02，95%濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)對小時；組織塊貼壁后補充加入DMEM完全培養(yǎng)基2-2. 5ml繼續(xù)培養(yǎng)；DMEM完全培養(yǎng)基的配方為 DMEM培養(yǎng)基，10%胎牛血清，青霉素100單位/ml，和鏈霉素100 μ g/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的漢族人腎肉瘤樣癌細胞系RCC09HYF的制備方法，具體步驟如下A、原代培養(yǎng)無菌條件下，取行腎癌根治術(shù)患者的腎原位腫瘤組織，放入盛有少量無血清含1000單位/ml青霉素和3 μ g/ml兩性霉素B的DMEM培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)平皿中，剔除壞死組織、脂肪結(jié)締組織、血管等，隨后將可肉眼分辨的腫瘤組織塊于4°C下浸泡于無血清的DMEM培養(yǎng)基中；30分鐘后，將組織塊用眼科剪剪成l-3mm3的小塊，將組織塊隨同浸泡液轉(zhuǎn)移至離心管中，反復(fù)搖晃清洗2-3分鐘，1500轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘；棄上清，重新加入DMEM培養(yǎng)基懸浮組織塊，反復(fù)搖晃清洗2-3分鐘，1500轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，棄上清；用Iml的DMEM完全培養(yǎng)基重懸組織塊，并接種到玻璃細胞培養(yǎng)瓶中；將培養(yǎng)瓶置于37°C，5% C02，95%濕度的 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)M小時；對小時組織塊貼壁后補充加入DMEM完全培養(yǎng)基2-2. 5ml繼續(xù)培養(yǎng)；DMEM完全培養(yǎng)基的配方為DMEM培養(yǎng)基，10%胎牛血清，青霉素100單位/ml，和鏈霉素 100 μ g/ml ；B、傳代當細胞從組織塊中爬出，并有85%以上融合的時候，進行細胞傳代；在超凈工作臺內(nèi)， 于無菌條件下，吸除培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)液；用少量D-hanks液清洗培養(yǎng)瓶2次后，加入0. 25%胰酶1ml，置37°C，5% C02，95%濕度的(X)2培養(yǎng)箱中4_5分鐘；待鏡下觀察大部分細胞的細胞質(zhì)回縮、細胞間隙增大時，加入DMEM完全培養(yǎng)基中和，反復(fù)吹打貼壁的細胞，形成單細胞懸液；D-Hanks 液的配方為 NaCl 8. 0g, KCl 0. 4g, Na2HPO4 12H20 0. 08g, KH2PO4 0. 06g, NaHCO3 0. 35g，酚紅^il，超純水溶解并定容至1000ml，121°C 30min滅菌，4°C保存。
全文摘要
本發(fā)明屬微生物動物細胞系領(lǐng)域。腎肉瘤樣癌是腎臟惡性腫瘤的特殊類型，僅占腎實質(zhì)腫瘤的1.0％-8.0％，臨床少見，目前，ATCC尚未收錄任何有關(guān)腎肉瘤樣癌的細胞系。本發(fā)明提供一種漢族人腎肉瘤樣癌細胞系RCC09HYF，其保藏號為CCTCC C201130，本發(fā)明還提供了制備方法。本發(fā)明的漢族人腎肉瘤樣癌細胞系RCC09HYF，能在體外長期生長和穩(wěn)定傳代，具有上皮樣細胞形態(tài)，失去接觸抑制；細胞為異倍體，染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)畸變；免疫組化分析RCC09HYF對應(yīng)的腫瘤組織，顯示Vimentin、CD10、CAM、Ki67呈強陽性，ABC、CACP、HMB、P53、SMA陰性；經(jīng)體外原位動物模型致瘤實驗發(fā)現(xiàn)，動物體內(nèi)成瘤速度較快，接種瘤體3-4周后，50％以上的裸鼠移植瘤充滿整個腹腔，惡液質(zhì)，個別已存在肺轉(zhuǎn)移。本發(fā)明可為進一步研究漢族人腎肉瘤樣癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移機制，為臨床預(yù)測、診斷及治療提供有效且穩(wěn)定的細胞模型。
文檔編號C12N5/09GK102286429SQ20111020255
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月20日
發(fā)明者關(guān)蔚, 常文軍, 曹廣文, 譚曉*, 韓一芳 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)