專利名稱：：用于病毒增殖的非致瘤性mdck細胞系的制作方法用于病毒增殖的非致瘤性MDCK細胞系發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及可用于制備疫苗材料的新型非致瘤性MDCK細胞。非致瘤性MDCK細胞能適應無血清培養(yǎng)基。本發(fā)明還涉及用于增殖非致瘤性MDCK細胞的培養(yǎng)基制劑和培養(yǎng)方法以及維持本發(fā)明此細胞系非致瘤性質(zhì)的方法。本發(fā)明還涉及利用非致瘤性MDCK細胞進行細胞培養(yǎng)制備流感病毒的方法。本發(fā)明也涉及通過所述方法獲得的病毒(例如，流感病毒)和含有該類病毒和/或其組分的免疫原性組合物。
背景技術(shù)：
：疫苗接種是預防每年流感流行所致疾病的最重要公共衛(wèi)生手段。疫苗的有效應用取決于能否從穩(wěn)定而容易地培養(yǎng)細胞而快速制備大量疫苗材料(例如，病毒)。快速開發(fā)疫苗及大量獲得疫苗材料對抵御許多人和動物疾病至關(guān)重要。疫苗生產(chǎn)滯后及其產(chǎn)量不足可能導致不能控制疾病爆發(fā)。例如，近年的研究提出其原因關(guān)系到生產(chǎn)抗流感疫苗需要的前導時間很長。參見，例如Wood,J.M.,2001,Philos.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci.,356:1953。有效的疫苗生產(chǎn)需要在高產(chǎn)宿主系統(tǒng)大量培養(yǎng)產(chǎn)生疫苗材料。為獲得可接受的收率，不同疫苗材料需要不同的培養(yǎng)條件。可利用含胚蛋、原代組織培養(yǎng)細胞或在已建立的細胞系生產(chǎn)疫苗材料。然而，目前這些宿主系統(tǒng)有下述諸多局限性。將含胚雞蛋用于流感疫苗病毒生產(chǎn)通常是已知時間、勞動力和成本密集型加工方法，該方法需要控制雞交配和雞蛋受精。此外，對雞蛋過敏的人禁用雞蛋生產(chǎn)的流感疫苗，因為可能發(fā)生嚴重的超敏反應。因此，疫苗行業(yè)已努力開發(fā)了不利用雞蛋的替代生產(chǎn)平臺，例如在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中生產(chǎn)流感疫苗。應用原代組織培養(yǎng)細胞受阻于開發(fā)和維持穩(wěn)定的原代細胞群困難。常利用己建立的細胞系來克服原代細胞的技術(shù)局限性。然而，已知這些細胞系中許多有致瘤性，從而產(chǎn)生安全顧慮，用它們來生產(chǎn)疫苗顯然受到管理制約。事實上，世界衛(wèi)生組織的應用指南指出只有少數(shù)細胞系能用于疫苗生產(chǎn)。在細胞培養(yǎng)基中使用動物或人來源的血清和/或蛋白質(zhì)添加劑也產(chǎn)生了其它問題。例如，熟知各批次添加劑之間在質(zhì)量和組成上有差異以及污染支原體、病毒、BSE-因子和其它傳染因子的風險?？傊?，血清或血清來源的物質(zhì)，例如白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白或胰島素可能包含有害物質(zhì)從而污染培養(yǎng)物及其產(chǎn)生的生物學產(chǎn)品。因此，許多組織正試圖開發(fā)無需血清或血清來源產(chǎn)品的有效宿主系統(tǒng)和培養(yǎng)條件。因此，需要建立能以低成本、高安全性和穩(wěn)定的方式(優(yōu)選無血清或無動物蛋白的培養(yǎng)條件)生產(chǎn)疫苗材料的非致瘤性細胞系。這類細胞系統(tǒng)對生產(chǎn)流感疫苗材料特別有用。MadinDarby狗腎(MDCK)細胞通常用于流感病毒滴定(ZambonM.，刊于TextbookofInfluenza(《流感教材》)，Nicholson編，WebsterandHay，第22章，第291-313頁，BlackwellScience,(1998))。1958年從正常的雄性考克斯班尼犬(cockerspaniel)的腎臟建建立了這些細胞。ATCC列出了為S.Madin和N.B.Darby保藏的MDCK(CCL34)細胞系，然而MDCK細胞的其它許多譜系也可用。LeightonJ及其同事出版了一系列證明MDCK細胞致癌特性的論文(Leighton等，1968,Science163:472;Leighton等，1970,Cancer26:1022和Leighton等，1971EuropJ.Cancer8:281)。然而，用于這些研究的MDCK細胞譜系和傳代次數(shù)未見描述，并且早已知道譜系和傳代次數(shù)不同的MDCK細胞顯示在染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)上不同，這種不同可導致細胞具有致瘤特性(Gaush等，1966,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，122:931)。由于接受疫苗生產(chǎn)用細胞系的主要顧慮之一是關(guān)注那些細胞有無潛在的致癌作用，利用目前描述的細胞系來生產(chǎn)疫苗材料時MDCK細胞應用受限。Groner等(美國專利6,656,720)和Makizumi等(美國專利6,825，036)均聲稱發(fā)現(xiàn)了衍生自MDCK細胞的細胞系，這些細胞系適應在無血清培養(yǎng)基中懸浮生長并可用于生產(chǎn)流感病毒。然而，有報道說喪失了錨定需要與正常動物細胞轉(zhuǎn)化為致瘤性細胞之間存在相關(guān)性(Stiles等，1976,CancerRes.,36:3300)。幾個團體(Kessler等，1999，CellCultureDevBiolStand,98:13;Merten等，1999,CellCultureDevBiolStand,98:23和Tree等，2001,Vaccine,19:3444)聲稱描述了利用MDCK細胞大規(guī)模生產(chǎn)流感病毒；然而，他們未解決所用的MDCK細胞潛在的轉(zhuǎn)化(為致癌性)作用。本文引用或討論的參考文獻不應理解為承認這些文獻是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。此外，引用的專利不應理解為承認其有效。發(fā)明概述本發(fā)明提供適應在含血清或無血清培養(yǎng)基制劑，包括無動物蛋白(APF)制劑中生長的非致瘤性MDCK細胞系。在一個實施方式中，本發(fā)明的非致瘤性MDCK細胞是黏附細胞。在另一實施方式中，本發(fā)明的非致瘤性MDCK細胞具有上皮形態(tài)。在還有另一實施方式中，本發(fā)明的非致瘤性MDCK細胞是黏附細胞并具有上皮形態(tài)。在一個實施方式中，利用成年裸小鼠模型測定致瘤性(例如，Stiles等，1976，CancerRes,36:1353和以下實施例2)。也可采用其它試驗，例如通過注射入雞胚胎和/或局部應用于絨毛膜尿囊來測試致瘤性(Leighton等，1970,Cancer,26:1024)?？稍诒景l(fā)明MDCK細胞中生長的病毒包括但不限于負鏈RNA病毒，包括但不限于流感病毒、RSV、副流感病毒1、2和3以及人肺炎后病毒(metapneumovirus)。本發(fā)明還提供用于產(chǎn)生和維持非致瘤性MDCK細胞的方法和培養(yǎng)基制劑。本發(fā)明MDCK細胞對生產(chǎn)疫苗材料，例如病毒特別有用。本發(fā)明的其它方面包括通過在合適的培養(yǎng)基中，在能產(chǎn)生疫苗材料的條件下培養(yǎng)本發(fā)明任何MDCK細胞來產(chǎn)生疫苗材料(如病毒)以及從一種或多種宿主細胞或其所生長的培養(yǎng)基中分離該材料的方法。免疫原性組合物也是本發(fā)明的特征。例如，免疫原性組合物包含上述產(chǎn)生的疫苗材料和任選的賦形劑，例如藥學上可接受的賦形劑或一種或多種藥學上可接受的給藥組分。本發(fā)明也包括通過給予對象有效量的一種或多種上述免疫原性組合物從而在該對象中產(chǎn)生免疫應答的方法。此外，通過給予有效量的一種或多種上述免疫原性組合物產(chǎn)生抵御病毒感染(例如，流感病毒)的免疫應答來預防性或治療性治療病毒感染的方法也是本發(fā)明的一部分。這種治療的對象可以包括哺乳動物(例如，人)。此外，這些方法也可包括給予用本發(fā)明MDCK細胞生產(chǎn)的一種或多種病毒的組合物和藥學上可接受的賦形劑，給予對象的用量能有效地預防性或治療性治療病毒感染。閱讀以下詳述和附圖后可更完全地明白本發(fā)明的這些和其它目的及特征。附圖簡述圖1是細胞中流感毒株的生長情況。A圖是顯示熒光聚焦試驗結(jié)果的照片，該試驗比較了代表性ca/ts流感毒株在MDCK細胞和Vem細胞克隆(27F9)中的傳染擴散情況。B圖是流感毒株ca甲型/越南/1203/2004(H5N1)在MDCK細胞中的生長曲線。感染后48小時出現(xiàn)滴度高峰，約為8log1()TCID5Q/mL并在隨后的3-4天維持穩(wěn)定。圖2概述了用于衍生MDCK-SPreMCB的方法(代次編號57)。實施例2詳述了該方法。圖3是顯示MDCK-S細胞具有上皮樣形態(tài)的照片。該照片拍攝自接種后3天。圖4是MDCK-S細胞在10n/。FBSDMEM培養(yǎng)基中的生長曲線。細胞具有約1天的延滯期，然后是指數(shù)生長期，接種后第四天進入穩(wěn)定期，第5天達到約29X106個細胞的最高密度。圖5是MDCK-S細胞在10%FBSDMEM培養(yǎng)基中的葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生的圖片。對于葡萄糖和乳酸，延滯期的速率低，然后分別增加至2.93mM/天和3.43mM沃。圖6是MDCK-S細胞在10%FBSDMEM培養(yǎng)基中谷氨酰胺消耗和谷氨酸及氨產(chǎn)生的圖片。谷氨酰胺消耗速率是0.49mM/天直至第4天，氨產(chǎn)生速率是0.32mM/天直至第5天。在該研究中谷氨酸未累積。圖7是100個分裂中期低傳代(P61/4)和高傳代(P81/24)MDCK-S細胞的染色體數(shù)目分布圖。每個分裂中期的染色體計數(shù)范圍是70-84，高傳代和低傳代細胞的眾數(shù)(modal)染色體數(shù)目是78。圖8概述了用于衍生MDCK-TPreMCB的方法(代次編號64/5)。實施例3詳述了該方法。圖9是顯示MDCK-T細胞具有上皮樣形態(tài)的照片。該照片拍攝自接種后3天。圖10是MDCK-T細胞在Taub培養(yǎng)基中的生長曲線。細胞沒有延滯期，處于指數(shù)生長期直至接種后第4天進入穩(wěn)定期。圖ll是MDCK-T細胞在Taub培養(yǎng)基中葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生的圖片。在指數(shù)期葡萄糖和乳酸的速率分別是1.78mM/天和2.88mM/天。圖12是MDCK-T細胞在Taub培養(yǎng)基中谷氨酰胺消耗和谷氨酸及氨產(chǎn)生的圖片。谷氨酰胺消耗速率是0.36mM/天直至第4天，氨產(chǎn)生速率以0.22mM/天的速率線性增加直至第7天。在該研究中谷氨酸未累積。圖13是100個分裂中期低傳代(P61/4)和高傳代(P81/24)MDCK-T細胞的染色體數(shù)目分布圖。低傳代細胞每個分裂中期(細胞)的染色體計數(shù)范圍是52-82，高傳代細胞是54-82。圖14是100個分裂中期MDCK-T、MDCK-SF101(代次71/9)和MDCK-SF102細胞(代次71/9)的染色體數(shù)目分布圖。SF101和SF102細胞的眾數(shù)染色體數(shù)是78，每個分裂中期SF101和SF102(細胞)的染色體計數(shù)范圍分別是70-82和60-80。圖15是顯示MDCK-SF103具有上皮樣形態(tài)的照片。該照片拍攝自接種后3天。圖16是MDCK-SF103細胞在MediVSFM103中的生長曲線。細胞具有約1天的延滯期，然后是指數(shù)生長期，接種后第4天進入穩(wěn)定期，第4天達到約17X106個細胞的最高密度。圖17是MDCK-SF103細胞在MediVSFM103培養(yǎng)基中葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生的圖片。在指數(shù)期葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生彼此對映，乳酸濃度增加而葡萄糖濃度降低。圖18是MDCK-SF103細胞在MediVSFM103培養(yǎng)基中谷氨酰胺消耗和谷氨酸及氨產(chǎn)生的圖片。氨產(chǎn)生速率幾乎以線性增加直至第7天。在該研究中谷氨酸未累積。圖19是87代100個分裂中期MDCK-SF103細胞的染色體數(shù)目分布圖。SF103細胞的眾數(shù)染色體數(shù)是78，染色體計數(shù)范圍是66-80。圖20是生產(chǎn)規(guī)模的生長和純化。A圖是獲自250mL轉(zhuǎn)瓶中生長在Cytodex珠上的MDCK-SF103的幾種疫苗重配株，乙型/維多利亞/504/2000(約8LogTCID50/mL)、甲型/悉尼/05/97(約7.85LogTCID50/mL)和甲型/新喀里多尼亞/20/99(約8.2LogTCID50/mL)的產(chǎn)量。B圖概述了可用于疫苗材料的商品化規(guī)模生產(chǎn)的大規(guī)模細胞培養(yǎng)方法。發(fā)明詳述本發(fā)明部分基于發(fā)現(xiàn)MDCK細胞可在培養(yǎng)條件下維持非致瘤性。本發(fā)明提供的非致瘤性細胞系，包括MDCK細胞系和其它類型的細胞，這些細胞能適應各種細胞培養(yǎng)條件(包括無血清培養(yǎng)基制劑)，它們在本文稱為"本發(fā)明細胞"。此外，本發(fā)明提供包含本發(fā)明細胞和其它組分的細胞培養(yǎng)組合物，所述其它組分包括但不限于培養(yǎng)基(例如，本文公開的培養(yǎng)基)、培養(yǎng)基組分、緩沖液、化合物、其它類型的細胞、病毒材料(例如，病毒基因組、病毒顆粒)和異源蛋白質(zhì)。本發(fā)明也提供可用于培養(yǎng)非致瘤性細胞(包括MDCK細胞)的方法和培養(yǎng)基制劑，所述細胞具有多種具體特征，包括但不限于非致瘤性細胞(例如，在裸小鼠中不會形成小結(jié))和/或生長成為黏著細胞和/或具有上皮樣形態(tài)和/或能支持各種病毒(包括但不限于正黏病毒、副黏病毒、彈狀病毒和黃病毒(flavoviruses))復制。本發(fā)明的培養(yǎng)條件包括含血清和無血清的培養(yǎng)基制劑以及無動物蛋白(APF)制劑。此外，本發(fā)明也提供在非致瘤性細胞，包括MDCK細胞中產(chǎn)生疫苗材料(例如，流感病毒)、從非致瘤性細胞制備疫苗材料的方法和利用非致瘤性細胞產(chǎn)生的疫苗材料預防流感感染的方法。本發(fā)明細胞對在其它哺乳動物細胞系(例如，Vero、PerC6、HEK-293、MRC-5和WI-38細胞)中不能有效復制的冷適應/溫度敏感/減毒(Cfl/"/a")流感毒株(例如，F(xiàn)luMist⑧中的那些)的生產(chǎn)特別有用。細胞特征在一個實施方式中，本發(fā)明的細胞是脊椎動物細胞。在另一實施方式中，本發(fā)明細胞是哺乳動物細胞，例如倉鼠、牛、猴或狗，特別是源自這些動物的腎細胞或細胞系。在還有另一實施方式中，本發(fā)明細胞是MDCK細胞(例如，源自ATCCCCL-34MDCK)，在本文專門稱為"本發(fā)明MDCK細胞"，術(shù)語"本發(fā)明細胞"包括它們。在一具體實施方式中，本發(fā)明細胞衍生自ATCCCCL-34MDCK。本發(fā)明細胞可以采用本領(lǐng)域熟知的方法衍生自CCL-34MDCK細胞。例如，CCL-34MDCK細胞可以首先在含血清的培養(yǎng)基中(如Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)+10。/。胎牛血清(FBS)+4mM谷氨酰胺+4.5g/L葡萄糖，或本文所述的其它培養(yǎng)基)傳代有限次數(shù)，然后克隆各細胞并特征鑒定各克隆。選出具有優(yōu)良生物學和生理特性(包括但不限于倍增時間、致瘤性情況和病毒產(chǎn)量)的克隆來產(chǎn)生原始細胞庫(MCB)。一方面，本發(fā)明細胞適應在選擇培養(yǎng)基中(例如，無血清或APF培養(yǎng)基，如本文所述的)生長。這種適應性可在克隆各細胞之前、同時或之后產(chǎn)生。在某些實施方式中，本發(fā)明細胞適應在MediVSF101、MediVSF102、MediVSF103、MediVSF104或MediVSF105中生長。本文將適應在這些培養(yǎng)基中生長的本發(fā)明細胞分別稱為"MDCK-SFIOI、MDCK-SF102、MDCK-SF103、MDCK-SF104和MDCK-SF105"細胞，統(tǒng)稱為"MDCK-SF細胞"。在其它實施方式中，本發(fā)明細胞適應在含血清的培養(yǎng)基中(例如，Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)+10。/。胎牛血清(FBS)+4mM谷氨酰胺+4.5g/L葡萄糖)生長，本文將這種細胞稱為"MDCK-S"細胞。術(shù)語"本發(fā)明細胞"和"本發(fā)明MDCK細胞"也包括MDCK-SF和MDCK-S細胞。在本發(fā)明一具體實施方式中，這些細胞是以下細胞系，包括但不限于由美國模式培養(yǎng)物保藏所(10801大學大街，馬納薩斯，弗吉尼亞.20110-2209)保藏并指定ATCC保藏號PTA-6500(2005年1月5日保藏)、PTA-6501(2005年1月5曰保藏)、PTA-6502(2005年1月5日保藏)和PTA-6503(2005年1月5日保藏)的那些細胞，本文將這些細胞分別稱為"MDCK-S、MDCK-SF101、MDCK-SF102、和MDCK-SF103"，統(tǒng)稱為"本發(fā)明MDCK細胞"。這些保藏物按照國際承認用于專利程序的微生物保存布達佩斯條約的條款維持。在一個實施方式中，可利用本發(fā)明MDCK細胞產(chǎn)生用于制備美國食品與藥品管理局批準的人用疫苗材料的細胞庫。通過傳代和根據(jù)一種或多種具體特征選出了由細胞系MDCK(CCL34)所衍生的細胞系MDCK-S、MDCK-SF101、MDCK-SF102、MDCK-SF103、MDCK-SF104和MDCK-SF105，所述特征包括但不限于能在含血清或無血清培養(yǎng)基或無動物蛋白培養(yǎng)基中生長為黏著細胞，具有上皮樣形態(tài)、非致瘤性(例如，在裸小鼠中不會形成小結(jié))和/或能支持各種病毒(包括但不限于正黏病毒、副黏病毒、彈狀病毒和黃病毒)復制。在一個實施方式中，本發(fā)明MDCK細胞無致瘤性。本領(lǐng)域熟知測定細胞是否有致瘤性的方法(參見，例如Leighton等，1970,Ca"cer,26:1024和Stiles等，1976,Cawcer36:1353)，以下實施例2詳述的美國食品與藥品管理局目前首選的方法是利用裸小鼠模型。在一具體實施例方式中，本發(fā)明MDCK細胞在成年裸小鼠模型中無致瘤性(參見Stiles等，同上和以下實施例2)。在另一具體實施方式中，本發(fā)明MDCK細胞在注入雞胚和/或局部應用于絨毛膜尿囊時無致瘤性(參見Leighton等，同上)。在還有另一實施方式中，本發(fā)明MDCK細胞在成年裸小鼠模型中無致瘤性，但在注入雞胚和/或局部應用于絨毛膜尿囊時有致瘤性。在還有另一實施方式中，本發(fā)明MDCK細胞在成年裸小鼠模型中和在注入雞胚和/或局部應用于絨毛膜尿囊時均無致瘤性。在還有另一實施方式中，本發(fā)明MDCK細胞在培養(yǎng)基中傳代至少20代、或至少30代、或至少40代、或至少50代、或至少60代、或至少70代、或至少80代、或至少90代、或至少IOO代后無致瘤性。在還有另一具體實施方式中，培養(yǎng)基是本文所述的培養(yǎng)基(例如，MediSF103)?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多方法定量測定致瘤性。常規(guī)使用的一種方法是測定"TD5Q"值，其定義為誘導50%測試動物產(chǎn)生腫瘤所需的細胞數(shù)目(參見例如HillR.TheTD5()assayfortumorcells(腫瘤細胞的TDso試驗).刊于PottenC,HendryJ編，Cellclones(《細胞克隆》).，倫敦ChurchillLivingstone;1985.第223頁)。在一個實施方式中，本發(fā)明MDCK細胞的TD5。值介于約101Q-約101、或介于約108-約103、或介于約107-約104。在一具體實施方式中，本發(fā)明MDCK細胞的TDso值高于101Q、或高于約109、或高于約107、或高于約106、或高于約105、或高于約104、或高于約103、或高于約102、或高于約101。在另一實施方式中，本發(fā)明非致瘤性細胞能在含血清或無血清培養(yǎng)基或無動物蛋白培養(yǎng)基中生長為黏著細胞。在還有另一實施方式中，本發(fā)明非致瘤性細胞具有上皮樣形態(tài)。在還有另一實施方式中，本發(fā)明MDCK細胞能支持各種病毒(包括但不限于正黏病毒、副黏病毒、彈狀病毒和黃病毒)復制。認為本發(fā)明MDCK細胞可具有一種或多種具體特征的任意組合，包括但不限于非致瘤性、生長成為黏著細胞、具有上皮樣形態(tài)和能支持各種病毒復制。認為本發(fā)明MDCK細胞的每一代和每次傳代記錄應足夠詳細，從而使得各細胞系都有完整譜系可用。每一代和每次傳代的文件可能有助于美國食品與藥品管理局和世界上其它管理機構(gòu)批準使用本發(fā)明MDCK細胞來制備疫苗材料。在另一實施方式中，本發(fā)明MDCK細胞無微生物污染(例如，細菌、病毒和真菌污染)。商業(yè)承包者(例如，BioReliance,Rockville，MD)可常規(guī)進行本領(lǐng)域熟知方法來檢測細菌和真菌污染的存在。以下實施例2詳述了公認的微生物除菌和支原體檢驗。要檢驗的微生物的具體例子見表6。在還有另一實施方式中，本發(fā)明MDCK細胞能支持各種病毒復制，包括但不限于正黏病毒(包括流感A和/或B毒株)、副黏病毒(包括RSVA和/或B，人肺炎后病毒和副流感病毒1、2和/或3)、彈狀病毒和黃病毒。在一具體實施方式中，本發(fā)明MDCK細胞能支持冷適應/溫度敏感(cfl/"/a")流感病毒(例如，見于FluMist⑧中的那些)(Belshe等，1998,A^"g//Med338:1405;Nichol等，1999,282:137;Jackson等，1999,Kac"'"e,17:1905)和/或包含這些病毒為骨架或包含具有以下一個或多個特征的流感病毒為骨架(或一個或多個vRNA區(qū)段)的重配病毒復制冷適應的、減毒的和溫度敏感的。細胞能支持病毒復制的一種指標是從受感染的細胞培養(yǎng)物中獲得的病毒產(chǎn)量?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多方法測定病毒產(chǎn)量。例如，可按照檢測感染性病毒體的中值組織培養(yǎng)感染劑量(TCID5o)試驗測定樣品中存在的病毒濃度來定量測定病毒產(chǎn)量。TCID5Q值經(jīng)常表示成logu)TCID5()/mL。在一個實施方式中，本發(fā)明MDCK細胞支持流感病毒(例如，cfl/"毒株)復制可達到的logujTCID5o/mL至少為6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。在另一實施方式中，本發(fā)明MDCK細胞支持流感病毒(例如，ca/"毒株)復制可達到的logu)TCID5()/mL至少為約6.0、或至少約6.2、或至少約6.4、或至少約6.6、或至少約6.8、或至少約7.0、或至少約7.2、或至少約7.4、或至少約7.6、或至少約7.8、或至少約8.0、或至少約8.2、或至少約8.4、或至少約8.6、或至少約8.8、或至少約9.0、或至少約9.2、或至少約9.4、或至少約9.6、或至少約9.8。本領(lǐng)域技術(shù)人員應該知道，本發(fā)明細胞通常是細胞培養(yǎng)組合物的一部分。細胞培養(yǎng)組合物的組成可根據(jù)細胞和所需用途而不同。例如，對于培養(yǎng)目的，細胞培養(yǎng)組合物可包含本發(fā)明細胞與細胞生長的合適培養(yǎng)基。因此，本發(fā)明提供包含本發(fā)明細胞和其它組分的細胞培養(yǎng)組合物，所述其它組分包括但不限于培養(yǎng)基(例如，本文公開的培養(yǎng)基)、培養(yǎng)基組分、緩沖液、化合物、其它類型的細胞、病毒材料(例如，病毒基因組、病毒顆粒)和異源蛋白質(zhì)。在一個實施方式中，細胞培養(yǎng)組合物包含本發(fā)明細胞和培養(yǎng)基或其組分。細胞培養(yǎng)組合物中可能存在的培養(yǎng)基包括無血清培養(yǎng)基、含血清培養(yǎng)基和APF培養(yǎng)基。在一個實施方式中，細胞組合物包含本文公開的培養(yǎng)基(例如，MediVSF101、MediVSF102、MediVSF103、MediVSF104或MediVSF105)或其各組分。方法和培養(yǎng)基制劑本發(fā)明提供在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)非致瘤性MDCK細胞的方法和培養(yǎng)基制劑。本發(fā)明也提供使非致瘤性MDCK細胞適應無血清培養(yǎng)基(包括APF培養(yǎng)基制劑)和隨后在其中培養(yǎng)的方法。在本發(fā)明的某些方面，將培養(yǎng)基配制成能使培養(yǎng)的MDCK細胞保留以下一種或多種特征非致瘤性、生長為黏著細胞，具有上皮樣形態(tài)和能支持各種病毒復制。認為細胞培養(yǎng)組合物中可存在本文公開的培養(yǎng)基制劑或其組分。本領(lǐng)域熟知含血清的培養(yǎng)基制劑。含血清培養(yǎng)基制劑包括但不限于Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)+胎牛血清(FBS)+谷氨酰胺+葡萄糖。在一個實施方式中，含血清培養(yǎng)基中存在的FBS濃度介于約1%-約20%之間，或介于約5%-約15%之間，或介于約5%-約10%之間。在一具體實施方式中，含血清培養(yǎng)基中存在的FBS濃度為10%。在另一實施方式中，含血清培養(yǎng)基中存在的谷氨酰胺濃度介于約0.5mM-約10mM之間，或介于約1mM-約10mM之間，或介于約2mM-約5mM之間。在一具體實施方式中，含血清培養(yǎng)基中存在的谷氨酰胺濃度是4mM。在還有另一實施方式中，含血清培養(yǎng)基中存在的葡萄糖濃度介于約1g/L-約10g/L之間，或介于約2g/L-約5g/L之間。在一具體實施方式中，含血清培養(yǎng)基中存在的葡萄糖濃度是4.5g/L。在還有另一實施方式中，含血清培養(yǎng)基制劑包含濃度介于約1。/。-約20。/c之間的FBS，濃度介于約0.5mM-約lOmM之間的谷氨酰胺和濃度介于約1g/L-約10g/L之間的葡萄糖。在一具體實施方式中，含血清培養(yǎng)基制劑包括Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)+10%胎牛血清(FBS)+4mM谷氨酰胺+4.5g/L葡萄糖。DMEM不難從許多商業(yè)來源購得，包括例如Gibco/BRL(目錄號11965-084)。FBS不難從許多商業(yè)來源購得，包括例如JRHBiosciences(目錄號12107-500M)。雖然FBS是動物細胞培養(yǎng)基中最常用的添加劑，但本發(fā)明也包括常規(guī)使用的其它來源血清，包括新生小牛、馬和人血清。在一個實施方式中，通過在補加血清的化學成分明確的培養(yǎng)基中培養(yǎng)得自美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCCCCL34)的MadinDarby狗腎(MDCK)細胞衍生得到的本發(fā)明血清適應型非致瘤性MDCK-S細胞。在一具體實施方式中，如下所示，在補加血清的化學成分明確的培養(yǎng)基中擴增MDCK細胞(ATCCCCL34)來產(chǎn)生MDCK-S細胞系視需要使MDCK(ATCCCCL34)細胞在補加了胎牛血清(10%v/v)、4mM谷氨酰胺和4.5g/L葡萄糖的Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中傳代，從而獲得足夠的細胞來制備稱為MDCK-S的冷凍前原始細胞庫(PreMCB)。在另一具體實施方式中，采用以下實施例2所述的方法培養(yǎng)這些細胞。特別考慮從PreMCB小瓶再傳代MDCK-S血清適應型細胞20次或更多次，并在成年裸小鼠體內(nèi)模型中檢驗其致瘤性以及在核型試驗中檢驗其核型。在某些實施方式中，將擴增的MDCK-S細胞皮下注射入成年裸小鼠不產(chǎn)生小結(jié)，其眾數(shù)染色體數(shù)目為78，染色體數(shù)目的范圍不超過約60-88，或不超過約65-85，或不超過約65-80或不超過約70-85。在一個實施方式中，MDCK-S細胞在培養(yǎng)基(例如，本文所述培養(yǎng)基)中傳代至少20代、或至少30代、或至少40代、或至少50代、或至少60代、或至少70代、或至少80代、或至少90代、或至少IOO代后無致瘤性。本領(lǐng)域技術(shù)人員應知道在組織培養(yǎng)應用中使用血清或動物提取物可能有缺點陷(Lambert，K丄等，刊于AnimalCellBiotechnology(《動物細胞生物技術(shù)》)，第1巻，Spier,R.E.等編，AcademicPres，紐約，第85-122頁(1985))。例如，即使來自同一生產(chǎn)商，這些添加劑的化學組成在批次之間可能不同。此外，動物或人源的添加劑也可能污染了外來物質(zhì)(例如，支原體、病毒和朊病毒)。當細胞培養(yǎng)基制劑利用這些受污染的添加劑時，這些物質(zhì)可嚴重破壞所培養(yǎng)細胞的健康狀況。此外，當將受外來物質(zhì)污染的培養(yǎng)物所產(chǎn)生的物質(zhì)用于細胞治療和其它臨床應用時，這些物質(zhì)可能造成健康風險。主要的擔心是存在的朊病毒會在動物中導致海綿狀腦病和在人中導致克-雅病(Creutzfeld-Jakobdisease)。因此，本發(fā)明還提供無血清的培養(yǎng)基制劑。本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基制劑包括但不限于MediVSF101(Taub+植物水解物)、MediVSF102(Taub+脂質(zhì))、MediVSF103(Taub+脂質(zhì)+植物水解物)、MediVSF104(Taub+脂質(zhì)+植物水解物+生長因子)和MediSF105(除了用檸檬酸鐵銨/托酚酮或硫酸鐵銨/托酚酮替代轉(zhuǎn)鐵蛋白外與MediVSF104相同)。特別考慮的Taub的SF培養(yǎng)基(Taub和Livingston,1981,爿""AT」cadS"、372:406)是補加以下物質(zhì)的DMEM和Ham的F1250:50混合物激素、5pg/mL胰島素、5pg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白、25ng/mL前列腺素El、50nM氫化可的松、5pM碘塞羅寧、10nMNa2Se03、4.5g/L葡萄糖、2.2g/LNaHC03和4mML-谷氨酰胺。本文也將Taub的SF培養(yǎng)基稱為Taub培養(yǎng)基或簡稱為"Taub"。植物水解物包括但不限于一種或多種以下植物的水解物玉米、棉籽、豌豆、大豆、麥芽、馬鈴薯和小麥?？刹捎妹杆庵苽涞闹参锼馕?，通常含有肽、游離氨基酸和生長因子的混合物。植物水解物不難購自許多商業(yè)來源，包括例如MarcorDevelopment、HyClone和OrganoTechnie。也考慮可利用酵母水解物替代植物水解物或與之聯(lián)用。酵母水解物不難購自許多商業(yè)來源，包括例如Sigma-Aldrich、USBCorp、Gibco/BRL和其它公司。可用于補加培養(yǎng)基的脂質(zhì)包括但不限于化學成分明確的動物和植物衍生的脂質(zhì)添加劑以及合成衍生的脂質(zhì)。脂質(zhì)添加劑中可能存在的脂質(zhì)包括但不限于膽固醇、飽和和/或不飽和脂肪酸(例如，花生四烯酸、亞油酸、亞麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕櫚酸和硬脂酸)。脂質(zhì)添加劑的ioox儲液中膽固醇的濃度可以介于0.10mg/ml-0.40mg/ml之間。脂質(zhì)添加劑的IOOX儲液中脂肪酸的濃度可以介于1叫/ml-20pg/ml之間。適合于培養(yǎng)基制劑的脂質(zhì)不難購自許多商業(yè)來源，包括例如HyClone、Gibco/BRL和Sigma-Aldrich。在一個實施方式中，Taub培養(yǎng)基補加了植物水解物，其終濃度為至少0.5g/L、或至少1.0g/L、或至少1.5g/L、或至少2.0g/L、或至少2.5g/L、或至少3.0g/L、或至少5.0g/L、或至少10g/L、或至少20g/L。在一具體實施方式中，Taub培養(yǎng)基補加了小麥水解物。在另一具體實施方式中，Taub培養(yǎng)基補加了終濃度為2.5g/L的小麥水解物。本發(fā)明提供在本文中稱為MediVSFM101的無血清培養(yǎng)基，其包含補加了終濃度為2.5g/L小麥水解物的Taub培養(yǎng)基。在另一實施方式中，Taub培養(yǎng)基補加的脂質(zhì)混合物終濃度為生產(chǎn)商推薦終濃度的至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少100%、或至少125%、或至少150%、或至少200%、或至少300%。在一具體實施方式中，Taub培養(yǎng)基補加了化學成分明確的脂質(zhì)混合物。在另一具體實施方式中，Taub培養(yǎng)基補加的化學成分明確的脂質(zhì)混合物終濃度為生產(chǎn)商推薦終濃度的100%(例如，購自生產(chǎn)商的IOOX儲液可加入培養(yǎng)基中至終濃度為1X)。本發(fā)明提供在本文中稱為MediVSFM102的無血清培養(yǎng)基，其包含的Taub培養(yǎng)基補加的化學成分明確的脂質(zhì)混合物終濃度為生產(chǎn)商推薦終濃度的100%。在還有另一實施方式中，Taub培養(yǎng)基補加了植物水解物和脂質(zhì)混合物，其中所述植物水解物的終濃度為至少0.5g/L、或至少1.0g/L、或至少L5g/L、或至少2.0g/L、或至少2.5g/L、或至少3.0g/L、或至少5.0g/L、或至少10g/L、或至少20g/L，脂質(zhì)混合物的終濃度為生產(chǎn)商推薦濃度的至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少100%、或至少125%、或至少150%、或至少175%、或至少200%。在一具體實施方式中，Taub培養(yǎng)基補加了小麥水解物和化學成分明確的脂質(zhì)混合物。在另一具體實施方式中，Taub培養(yǎng)基補加了終濃度為2.5g/L的小麥水解物和終濃度為生產(chǎn)商推薦終濃度的100%的化學成分明確的脂質(zhì)混合物。本發(fā)明提供在本文中稱為MediVSFM103的無血清培養(yǎng)基，其包含的Taub培養(yǎng)基補加了終濃度為2.5g/L的小麥水解物和終濃度為生產(chǎn)商推薦終濃度的100%的化學成分明確的脂質(zhì)混合物。在還有另一實施方式中，Taub培養(yǎng)基補加了生長激素。可用的生長激素包括但不限于表皮生長因子(EGF)、胰島素生長因子(IGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)和成纖維細胞生長因子(FGF)。在一具體實施方式中，所述生長因子是表皮生長因子(EGF)。在一個實施方式中，Taub培養(yǎng)基補加的生長因子終濃度介于約0.1-約50.0ng/ml之間、或介于約0.5-約25.0ng/ml之間、或介于約1.0-約20ng/ml之間、或介于約5.0-約15.0ng/ml之間、或介于約8ng/ml-約12ng/ml之間。在一具體實施方式中，Taub培養(yǎng)基補加的EGF的終濃度是約10ng/ml。在還有其它實施方式中，Taub培養(yǎng)基補加了生長因子、植物水解物和脂質(zhì)混合物，其中所述生長因子的終濃度介于約0.1-約50.0ng/ml之間、或介于約0.5-約25.0ng/ml之間、或介于約1.0-約20ng/ml之間、或介于約5.0-約15.0ng/ml之間、或介于約8ng/ml-約12ng/ml之間，所述植物水解物的終濃度為至少0.5g/L、或至少1.0g/L、或至少1.5g/L、或至少2.0g/L、或至少2.5g/L、或至少3.0g/L、或至少5.0g/L、或至少10g/L、或至少20g/L，所述脂質(zhì)混合物的終濃度為生產(chǎn)商推薦濃度的至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少卯％、或至少100%、或至少125%、或至少150%、或至少175%、或至少200%。在另一具體實施方式中，Taub培養(yǎng)基補加了終濃度為2.5g/L的小麥水解物和終濃度為生產(chǎn)商推薦終濃度的100%的化學成分明確的脂質(zhì)混合物及終濃度約10ng/ml的EGF。本發(fā)明提供在本文中稱為MediVSFM104的無血清培養(yǎng)基，其包含的Taub培養(yǎng)基補加了終濃度為2.5g/L的小麥水解物和終濃度為生產(chǎn)商推薦終濃度的100%的化學成分明確的脂質(zhì)混合物及終濃度約10ng/ml的EGF。本領(lǐng)域技術(shù)人員也應知道制備用于生產(chǎn)疫苗的病毒可能需要無動物蛋白的培養(yǎng)基制劑。因此，在某些實施方式中，用無動物的衍生物替代本文公開的無血清培養(yǎng)基(例如，MediVSFlOl、MediVSF102、MediVSF103、MediVSF104和MediSF105)中一種或多種或所有的動物來源的成分。例如，利用可商品化購得的非動物來源重組胰島素(例如，BiologicalIndustries目錄號01-818-1)替代動物來源的胰島素。類似地，可利用鐵結(jié)合試劑(參見例如美國專利5,045,454;5,118,513;6,593,140和PCT公布號WO01/16294)替代動物來源的轉(zhuǎn)鐵蛋白。在一個實施方式中，本發(fā)明無血清培養(yǎng)基制劑含有托酚酮(2-羥基-2,4，6-環(huán)庚三烯-l)和鐵來源(例如，檸檬酸鐵銨、硫酸鐵銨)替代轉(zhuǎn)鐵蛋白。例如，該培養(yǎng)基中托酚酮或托酚酮衍生物與鐵的摩爾濃度相比可過量，摩爾比約為5比1到約70比1，或約10比1到約70比1。因此，當該培養(yǎng)基中鐵濃度約為0.3時，所用托酚酮或其衍生物的濃度約為1.5^M-約20pM，例如約3nM-約20^M。鐵可以亞鐵或鐵離子存在，例如在該培養(yǎng)基中使用簡單或絡(luò)合的鐵鹽，如硫酸亞鐵、氯化鐵、硝酸鐵或者特別是檸檬酸鐵銨。本發(fā)明提供在本文中稱為MediVSFM105的無血清培養(yǎng)基，其包含的Taub培養(yǎng)基補加了終濃度為2.5g/L的小麥水解物、終濃度為生產(chǎn)商推薦終濃度的100%的化學成分明確的脂質(zhì)混合物和終濃度約10ng/ml的EGF及比例介于10比1到70比1之間的檸檬酸鐵銨托酚酮或硫酸鐵銨托酚酮。在一個實施方式中，通過在補加血清的化學成分明確的培養(yǎng)基中傳代得自美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCCCCL34)的MadinDarby狗腎(MDCK)細胞至少一次，然后在無血清培養(yǎng)基，例如上述的無血清培養(yǎng)基中傳代而衍生得到適應無血清的MDCK-SF101、MDCK陽SF102、MDCK-SF103、MDCK-SF104和MDCK-SF105非致瘤性細胞(在本文中統(tǒng)稱為MDCK-SF)。在一具體實施方式中，如下所示，使MDCK細胞(ATCCCCL34)適應無血清培養(yǎng)基來產(chǎn)生MDCK-SF細胞系MDCK(ATCCCCL34)細胞在補加了胎牛血清(10。/。v/v)、4mM谷氨酰胺和4.5g/L葡萄糖的Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中傳代至少一次，然后在無血清培養(yǎng)基中傳代。然后視需要使MDCK-SF細胞在無血清培養(yǎng)基中傳代以獲得足夠的細胞來制備冷凍前原始細胞庫(PreMCB)。在某些實施方式中，這些細胞在含血清培養(yǎng)基(例如，補加了胎牛血清(10。/。v/v)、4mM谷氨酰胺和4.5g/L葡萄糖的Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基(DMEM))中傳代1-5次、或4-10次、或9-20次、或20次以上，然后在無血清培養(yǎng)基(例如，MediVSFIOI、MediVSF102、MediVSF103、MediVSF104和MediSF105)中傳代。特別考慮從PreMCB小瓶再傳代MDCK-SF適應無血清的細胞20次或更多次，并在成年裸小鼠體內(nèi)模型中檢驗其致瘤性以及在核型試驗中檢驗其核型。在某些實施方式中，將擴增的MDCK-SF細胞皮下注射入成年裸小鼠時不產(chǎn)生小結(jié)和/或其眾數(shù)染色體數(shù)目為78。在另一實施方式中，擴增的MDCK-SF細胞的眾數(shù)染色體數(shù)目為78，染色體數(shù)目的范圍不超過約60-約88，或不超過約65-約85，或不超過約65-80或不超過約70-約85。在一個實施方式中，MDCK-SF細胞在培養(yǎng)基(例如，本文所述培養(yǎng)基)中傳代至少20代、或至少30代、或至少40代、或至少50代、或至少60代、或至少70代、或至少80代、或至少卯代、或至少100代后無致瘤性。在一個實施方式中，用于衍生得到MDCK-SF細胞的無血清培養(yǎng)基是MediVSFIOI。在另一實施方式中，用于衍生得到MDCK-SF細胞的無血清培養(yǎng)基是MediVSF102。在還有另一實施方式中，用于衍生得到MDCK-SF細胞的無血清培養(yǎng)基是MediVSF103。在還有另一實施方式中，用于衍生得到MDCK-SF細胞的無血清培養(yǎng)基是MediVSF104。在另一實施方式中，用于衍生得到MDCK-SF細胞的無血清培養(yǎng)基是MediVSF105。在還有另一實施方式中，用于衍生得到MDCK-SF細胞的無血清培養(yǎng)基是APF培養(yǎng)基?？紤]本文所述培養(yǎng)基的配制除去動物蛋白。例如，可用非動物來源的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白替代牛轉(zhuǎn)鐵蛋白。培養(yǎng)條件本發(fā)明提供在含血清和無血清培養(yǎng)基制劑(同上)中培養(yǎng)MDCK細胞(最好無致瘤性)和其它動物細胞(致瘤性或非致瘤性)的方法。特別考慮了其它培養(yǎng)條件也可能在維持MDCK-S和MDCK-SF細胞處于非致瘤狀態(tài)中起作用。這些培養(yǎng)條件包括但不限于選擇黏著表面、細胞密度、溫度、C02濃度、培養(yǎng)方法、溶氧含量和pH。特別考慮了本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用許多方式改進培養(yǎng)條件來優(yōu)化本發(fā)明MDCK細胞的生長。這種改進也可導致病毒材料(例如，病毒)產(chǎn)量提高，或者本領(lǐng)域技術(shù)人員可改進培養(yǎng)條件來優(yōu)化本發(fā)明MDCK細胞的疫苗材料產(chǎn)量，而不考慮細胞生長。這些培養(yǎng)條件包括但不限于黏著表面、細胞密度、溫度、C02濃度、培養(yǎng)方法、溶氧含量和pH。在一個實施方式中，將本發(fā)明MDCK細胞在所附著表面培養(yǎng)為黏著細胞。本領(lǐng)域熟知組織培養(yǎng)細胞能生長在黏著表面上。黏著表面包括但不限于經(jīng)修飾的聚苯乙烯塑料表面、蛋白質(zhì)包被表面(例如，纖連蛋白和/或膠原包被玻璃/塑料)以及各種商品化購得的微載體(例如，DEAE-葡聚糖微載體珠，如Dormacell，Pfeifer&Langen;Superbead，F(xiàn)lowLaboratories;苯乙烯共聚物-三-甲胺珠，如Hillex、SoloHill、AnnArbor)。微載體珠是能為每份體積的黏著細胞生長提供大表面積的小球(直徑100-200微米)。例如，l升培養(yǎng)基可容納超過2千萬個微載體珠，從而能提供超過8000cn^的生長表面。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)培養(yǎng)本發(fā)明MDCK細胞所用的方法決定黏著表面的選擇。本發(fā)明方法中可用的合適培養(yǎng)容器均是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的那些容器，例如，轉(zhuǎn)瓶、滾瓶(rollerbottle)、發(fā)酵罐或生物反應器。對于病毒的商業(yè)生產(chǎn)，例如疫苗生產(chǎn)，常需要在生物反應器或發(fā)酵罐中培養(yǎng)細胞。生物反應器可用容積從1升以下到100升以上，例如Cyto3生物反應器(Osmonics，Minnetonka，MN);NBS生物反應器(NewBrunswickScientific,Edison,新澤西)；B.BraunBiotechInternational的實驗室和商業(yè)規(guī)模生物反應器(B.BraunBiotech,Melsungen，德國)。在一個實施方式中，可用分批培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)作為黏著細胞的本發(fā)明MDCK細胞。在還有另一實施方式中，可用灌注培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)作為黏著細胞的本發(fā)明MDCK細胞。對于生產(chǎn)疫苗材料(例如，病毒)，特別考慮用灌注培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)本發(fā)明MDCK細胞(例如，在攪拌式容器發(fā)酵罐中利用本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的細胞保留系統(tǒng)，例如離心、過濾、旋轉(zhuǎn)過濾器等)。在一個實施方式中，在(^02濃度至少為1%、或至少為2%、或至少為3%、或至少為4%、或至少為5%、或至少為6%、或至少為7%、或至少為8%、或至少為9%、或至少為10%、或至少為20M下培養(yǎng)本發(fā)明MDCK細胞。在一個實施方式中，在培養(yǎng)本發(fā)明MDCK細胞期間優(yōu)選將溶氧(D0)濃度(p02值)范圍調(diào)節(jié)為介于5%-95%(根據(jù)空氣飽和)之間，或介于10%-60%之間。在一具體實施方式中，溶氧(DO)濃度(p02值)為至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少50%、或至少60%。在另一實施方式中，在培養(yǎng)期間將用于培養(yǎng)本發(fā)明MDCK細胞的培養(yǎng)基pH范圍調(diào)節(jié)為pH6.4-pH8.0，或pH6.8-pH7.4。在一具體實施方式中，培養(yǎng)基pH為至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0。在還有一實施方式中，在溫度25'C-39'C培養(yǎng)本發(fā)明MDCK細胞。特別考慮了培養(yǎng)溫度可按照所需方法而不同。例如，對于細胞增殖，可以在37"C培養(yǎng)本發(fā)明MDCK細胞，對于生產(chǎn)疫苗材料(例如，病毒)，可以在較低溫度(例如，25°C-35"C)培養(yǎng)。在另一實施方式中，為生產(chǎn)疫苗材料，在低于3(TC、或低于3TC、或低于32'C、或低于33t、或低于34'C溫度培養(yǎng)細胞。在另一實施方式中，為生產(chǎn)疫苗材料，在30。C、或31'C、或32'C、或33卩、或34匸溫度培養(yǎng)細胞。為生產(chǎn)疫苗材料(例如，病毒)，特別考慮了在易于更換培養(yǎng)基(的條件下)培養(yǎng)本發(fā)明MDCK細胞(例如，灌注系統(tǒng))。可將細胞培養(yǎng)至極高細胞密度，例如介于l乂106和25Xl(^個細胞/mL之間。在培養(yǎng)本發(fā)明MDCK細胞期間，應能方便地操控培養(yǎng)基中葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸的含量以及pH和p02值與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它參數(shù)，例如攪拌速率，從而能優(yōu)化細胞密度和/或病毒生產(chǎn)。生產(chǎn)疫苗材料(例如，病毒)本發(fā)明提供在細胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)病毒的方法(下文稱為"本發(fā)明方法")，此法利用了本發(fā)明MDCK細胞。在一個實施方式中，所述方法包括以下步驟i)在培養(yǎng)基中增殖本發(fā)明MDCK細胞；ii)用病毒感染這些細胞；和iii)再一階段培養(yǎng)階段后，分離在非致瘤性細胞中復制的病毒。在一個實施方式中，本發(fā)明MDCK細胞在步驟(i)中增殖為黏著細胞。在該方法(實施)期間，本發(fā)明MDCK細胞可以在任何培養(yǎng)基中培養(yǎng)，包括但不限于上述那些。在某些實施方式中，在該方法(實施)期間，本發(fā)明MDCK細胞可以在無血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，例如MediV-SFlOl、MediV-SF102、MediV-SF103、MediV-SF104、MediV-SF105和其APF制劑。在該方法(實施)期間，本發(fā)明MDCK細胞任選在含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)(例如，DMEM+10。/。FBS+4mM谷氨酰胺+4.5g/L葡萄糖)。上文詳述了其它培養(yǎng)條件，例如溫度、pH、p02、C02濃度和細胞密度。為增殖用于生產(chǎn)病毒的本發(fā)明MDCK細胞，本領(lǐng)域技術(shù)人員可組合各培養(yǎng)條件。在一個實施方式中，用病毒感染前，細胞增殖的溫度介于22'C-4(TC之間。在某些實施方式中，用病毒感染前，細胞增殖的溫度低于39'C、或低于38"C、或低于37°C、或低于36°C、或低于35°C、或低于34°C、或低于33°C、或低于32°C、或低于30'C、或低于28'C、或低于26'C、或低于24'C。在該方法的一個實施方式中，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的細胞保留系統(tǒng)，例如離心、過濾、旋轉(zhuǎn)過濾器等、微載體等在灌注系統(tǒng)，例如攪拌式容器發(fā)酵罐中進行細胞增殖培養(yǎng)(步驟(i))。在此情況中，細胞增殖l-20天、或3-ll天。在此期間進行培養(yǎng)基替換，每天從O增加至約l-5個發(fā)酵罐體積。細胞以此方式增殖至高細胞密度，例如高達至少1X10、25X10S個細胞/mL。培養(yǎng)期間，可通過細胞計數(shù)、培養(yǎng)基中葡萄糖、谷氨酰胺或乳酸含量和通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它參數(shù)調(diào)節(jié)灌注系統(tǒng)中的灌注速率?；蛘撸梢苑峙椒ㄅ囵B(yǎng)本發(fā)明方法步驟(i)的細胞。在本發(fā)明方法的一個實施方式中，在培養(yǎng)期間，可如上所述采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法調(diào)節(jié)步驟(i)所用培養(yǎng)基的pH、p02值、葡萄糖濃度和其它參數(shù)。在另一實施方式中，用約0.0001-約10、或約0.0005-約5、或約0.002-約0.5m.o丄(感染復數(shù))的病毒感染細胞。在還有另一實施方式中，用0.0001-10、或0.0005-5、或0.002-0.5m.o丄(感染復數(shù))的病毒感染細胞。感染后，進一步培養(yǎng)感染的細胞培養(yǎng)物以復制細胞，特別是直至能檢測到最大致細胞病變效應或最大病毒抗原含量。在一個實施方式中，感染后在介于22'C-40'C之間的溫度培養(yǎng)細胞。在某些實施方式中，用病毒感染后，在低于39'C、或低于38'C、或低于37"C、或低于36'C、或低于35"C、或低于34'C、或低于33'C、或低于32°C、或低于30'C、或低于28'C、或低于26X:、或低于24"C的溫度培養(yǎng)細胞。在另一實施方式中，用病毒感染后，在低于33'C的溫度培養(yǎng)細胞。在另一實施方式中，用病毒感染后，在3rc的溫度培養(yǎng)細胞。在某些實施方式中，培養(yǎng)細胞2-10天?？梢栽诠嘧⑾到y(tǒng)中或任選以分批方法進行培養(yǎng)。進而在如上所述維持pH和p02值(的條件下)進行病毒感染后細胞的培養(yǎng)(步驟(iii))。在所述方法步驟(iii)的細胞培養(yǎng)或病毒復制期間，也可以用新鮮制備的培養(yǎng)基、培養(yǎng)基濃縮液或成分(例如氨基酸、維生素、脂質(zhì)組分、磷酸等)明確的培養(yǎng)基替換細胞培養(yǎng)基來優(yōu)化抗原產(chǎn)量?？稍趲滋熘羞M一步加入培養(yǎng)基或培養(yǎng)基濃縮液來緩慢稀釋細胞，或者可在用培養(yǎng)基或培養(yǎng)基濃縮液進一步灌注期間培育細胞。在此情況中，進而可通過細胞計數(shù)、培養(yǎng)基中葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸或乳酸脫氫酶含量或本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的其它參數(shù)來調(diào)節(jié)灌注速率。也可以聯(lián)用灌注系統(tǒng)與分批方法。在所述方法的一個實施方式中，感染后經(jīng)過充分時間，例如2-10天、或任選3-7天獲得合適病毒產(chǎn)量后，進行所生產(chǎn)病毒的收集和分離(步驟(iii))。在所述方法的一個實施方式中，在感染2天、或3天、或4天、或5天、或6天、或7天、或8天、或9天、或10天后收集和分離所生產(chǎn)的病毒(步驟(iii))?？稍诒景l(fā)明MDCK細胞中生產(chǎn)的病毒包括但不限于動物病毒，包括正粘病毒科、副粘病毒科、披膜病毒科、皰疹病毒科、彈狀病毒科、逆轉(zhuǎn)錄病毒科、呼腸孤病毒科、黃病毒科、腺病毒科、小RNA病毒科、沙粒病毒科和痘病毒科。近年來也開發(fā)了用于在細胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)流感病毒的系統(tǒng)(參見，例如Furminger.干U于rejcAooA:o//"/7wewza(《流感教禾才》)，Nicholson,Webster禾口Hay編，第324-332頁，BlackwellScience(1998);Merten等，刊于A^ve/^ra"g/ej/"T7zeDew'g"aw/7Voafwc"o"0/Fflcc/wes(《疫苗設(shè)計和生產(chǎn)的新策略》)，Cohen和Shafferman編，第141-151頁，KluwerAcademic(1996))。這些方法通常包括用選擇的病毒株感染合適的無限增殖宿主細胞。雖然消除了在雞蛋中生產(chǎn)疫苗有關(guān)的許多困難，但不是所有致病流感毒株均能按照已建立的組織培養(yǎng)方法良好培養(yǎng)并生產(chǎn)。此外，在采用己建立方法的組織培養(yǎng)中，具有所需特征(例如減毒、溫度敏感性和冷適應)的適合于生產(chǎn)減毒活疫苗的許多毒株培養(yǎng)并不成功，特別是在商品化規(guī)模。本發(fā)明提供幾種非致瘤性MDCK細胞系，這些細胞系已適應在含血清或無血清培養(yǎng)基中生長，在培養(yǎng)時能支持病毒(包括但不限于流感病毒)復制。這些細胞系適用于在細胞培養(yǎng)物中經(jīng)濟地復制用作疫苗材料的病毒。本發(fā)明MDCK細胞特別可用于生產(chǎn)用其它已建立細胞系(參見，下文實施例l)培養(yǎng)不佳的冷適應、溫度敏感的(c"々"流感病毒株(例如，F(xiàn)luMist中發(fā)現(xiàn)的流感病毒株)。此外，可用本發(fā)明MDCK細胞生產(chǎn)在含胚雞蛋中培養(yǎng)的流感病毒株，例如可在人中致病的禽流感病毒(例如，"流行"毒株)。可采用本發(fā)明方法在本發(fā)明MDCK細胞中生產(chǎn)的流感病毒包括但不限于將選擇的血凝素和/或神經(jīng)氨酸酶抗原摻入減毒、溫度敏感、冷適應的(ca/")原始毒株的重配病毒。例如，這些病毒可包含如溫度敏感O)、冷適應(ca)或減毒O")的原始毒株(例如，甲型/AnnArbor/6/60、乙型/AnnArbor/1/66、PR8、乙型/列寧格勒/14/17/55、乙型/14/5/1、乙型/USSR/60紙乙型/列寧格勒/179/86、乙型/列寧格勒/14/55、乙型/英格蘭/2608/76等)中一種或多種的骨架(或一個或多個vRNA區(qū)段)。本領(lǐng)域已知在雞蛋或細胞系中生產(chǎn)重配流感疫苗毒株的方法，包括Kilbourne，E.D.刊于^cc/,(《疫苗》)(第2版)，Plotkin和Mortimer編，WBSaundersCo.(1988)和PCT申請PCT專利公布號WO05/062820和WO03/091401所公開的那些方法?？刹捎帽景l(fā)明方法在本發(fā)明MDCK細胞中生產(chǎn)的其它流感病毒包括能表達異源基因產(chǎn)物的重組流感病毒，參見例如美國專利公布號2004/0241139和2004/0253273。在一個實施方式中，如上所述使這些細胞增殖(步驟(i))，然后用流感病毒感染這些細胞(步驟(ii))。在某些實施方式中，以0.0001-10、或0.0005-5、或0.002-0.5的m.o丄(感染復數(shù))進行感染。在其它實施方式中，以約0.0001-約10、或約0.0005-約5、或約0.002-約0.5的m.o.i.(感染復數(shù))進行感染。任選加入蛋白酶來切割血凝素[HAo]的前體蛋白，從而使病毒吸附到細胞上。按照本發(fā)明，可在用流感病毒感染細胞(步驟(ii))之前、同時或之后不久加入蛋白酶。如果在感染同時加入蛋白酶，可將其直接加入待感染的細胞培養(yǎng)物中，或者作為濃縮液與病毒接種物一起加入。在本發(fā)明的某些方面，所述蛋白酶是絲氨酸蛋白酶、或半胱氨酸蛋白酶或天冬酰胺蛋白酶。一個實施方式利用胰蛋白酶。一具體實施方式利用TPCK-處理的胰蛋白酶。在一個實施方式中，向細胞培養(yǎng)物中加入胰蛋白酶最高至終濃度為1-5000mU/ml，或5-1000mU/ml，或100-500mU/ml。在另一實施方式中，向細胞培養(yǎng)物中加入胰蛋白酶最高至培養(yǎng)基中終濃度為1-200^g/ml，或5-50pg/ml，或5-30pg/ml。在本發(fā)明方法步驟(iii)的感染細胞的進一步培養(yǎng)期間，以分批方法為例可通過加入新鮮的胰蛋白酶以再活化胰蛋白酶，或者以灌注系統(tǒng)為例中可通過連續(xù)加入或間歇加入胰蛋白酶溶液以再活化胰蛋白酶。感染后，進一步培養(yǎng)感染的細胞培養(yǎng)物以復制病毒，特別是直至能檢測到最大致細胞病變效應或最大病毒和/或病毒抗原含量。在某些實施方式中，培養(yǎng)細胞2-10天。進而可在灌注系統(tǒng)中或任選以分批方法進行培養(yǎng)。在另一實施方式中，用流感病毒感染后，在25'C-36'C、29'C-34t:的溫度培養(yǎng)細胞。在低于33x:的溫度，特別是在上述溫度范圍培養(yǎng)受感染的細胞能導致某些流感病毒，例如乙型毒株產(chǎn)量較高。此外，考慮在低于35T:培養(yǎng)受感染的細胞能產(chǎn)生溫度敏感、冷適應(G/ca)的流感病毒?？紤]G/ca病毒也可以是減毒的(fl")。在另一實施方式中，在低于3(TC、或低于31'C、或低于32'C、或低于33'C、或低于34t;的溫度培養(yǎng)細胞來產(chǎn)生"/ca流感病毒株。在一具體實施方式中，在3rc的溫度培養(yǎng)細胞來產(chǎn)生乙型流感病毒毒株。用流感病毒感染后進行上述細胞培養(yǎng)(步驟(iii))。在所述方法的一個實施方式中，感染后經(jīng)過充分時間，例如2-10天、或3-7天以產(chǎn)生合適病毒產(chǎn)量后，進行所產(chǎn)生流感病毒的收集和分離(步驟(iii))。通常從受感染細胞生長的培養(yǎng)基中回收病毒。一般先澄清原始培養(yǎng)基，再濃縮流感病毒。常規(guī)方法包括過濾、超濾、吸附到硫酸鋇上并洗脫以及離心。例如，首先可通過離心(例如1000-2000Xg)足夠時間(例如，10-30分鐘直接)除去細胞碎片和其它大的顆粒物質(zhì)以澄清受感染培養(yǎng)物的原始培養(yǎng)基?；蛘撸囵B(yǎng)基可經(jīng)0.8pm醋酸纖維素膜過濾器過濾以除去完整的細胞和其它大的顆粒物質(zhì)。然后可任選離心(例如，15,000Xg，約3-5小時)澄清的培養(yǎng)上清液以沉淀流感病毒。將病毒沉淀物重懸于合適的緩沖液，例如STE(0.01MTris-HCl;0.15MNaCl;0.0001MEDTA)或pH7.4的磷酸緩沖鹽水(PBS)后，可利用蔗糖(60%-12%)或酒石酸鉀(50%-10%)密度梯度離心濃縮病毒。無論連續(xù)或分梯度離心(例如將介于12%-60%之間的蔗糖梯度分成四個12%步驟)均合適。以某梯度離心的速度和時間應使病毒濃縮成可回收的可見條帶。或者，對于最大規(guī)模的商品化應用，利用以連續(xù)方式操作的區(qū)帶離心機轉(zhuǎn)頭進行密度梯度離心淘選病毒。足以指導技術(shù)人員從組織培養(yǎng)物中制備流感病毒的其它細節(jié)見，例如Furminger，刊于rex^ooAo//"/7we"za(《流感教材》)，第324-332頁，Nicholson等編;Merten等，干U于7Vove/iSYm^7'es/"Z)ew'g"尸/Wwc"o"o/F"ac"'"es(《疫苗設(shè)計和生產(chǎn)的新策略》)，第141-151頁，Cohen和Shafferman編；和美國專利號5,6卯,937。如果需要，可在有穩(wěn)定劑，例如蔗糖-磷酸鹽-谷氨酸(SPG)存在下-8(TC保存回收的病毒。在所述方法的某些實施方式中，用Benzonase③或其它非特異性內(nèi)切酶處理病毒。Benzonase⑧處理任選在收集和分離所產(chǎn)生流感病毒(步驟(iii))之前進行。在所述方法的其它實施方式中，Benzonas^處理后澄清病毒材料。用于澄清的方法包括但不限于直接流動過濾(directflowfiltration)(DFF)。收集和分離所產(chǎn)生流感病毒(步驟(iii))可用的其它步驟包括但不限于正切線流過濾(TFF)、親和層析以及離子交換層析和/或羥基磷灰石層析。其它步驟示范于下文實施例章節(jié)。疫苗組合物和用法本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明方法獲得的病毒(例如，流感病毒)?？刹捎靡阎椒ㄅ渲七@些病毒從而提供用于給予人或動物的疫苗。這些病毒可以完整的病毒顆粒(例如，減毒的活病毒)或滅活/裂解的病毒(例如，用洗滌劑或甲醛處理的)存在?？扇芜x采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法分離病毒的確定病毒組分(例如，蛋白質(zhì))用于制備疫苗。配制完整的病毒顆粒(例如，減毒的活病毒)可包括其它步驟，包括但不限于通過過濾將緩沖液替換為最終制劑，然后進行滅菌步驟。用于這種制劑的緩沖液三加入油其它氨基酸賦形劑，例如精氨酸的200mM蔗糖和pH7.0-7.2的磷酸鹽或組氨酸緩沖液。在某些實施方式中，加入能穩(wěn)定蛋白質(zhì)的水解物，例如豬明膠。在某些實施方式中，本發(fā)明最終病毒溶液/疫苗包含活病毒，該活病毒的液體形式可穩(wěn)定足夠時間從而能在整個流感疫苗接種季節(jié)(例如，在北半球約從9月到3月)"現(xiàn)場"保存(例如，在2-8°C、4"C、5卩等冷藏銷售和商品化)。因此，需要病毒/疫苗組合物能在整個保存期間保留其效力或其效力喪失速度可接受。在其它實施方式中，這種溶液/疫苗的液體形式能在約2"C-約8"C(例如冷藏溫度)穩(wěn)定。例如，配制冷藏穩(wěn)定的減毒流感疫苗的方法和組合物描述于2005年IO月4日提交的PCT專利申請PCT/US2005/035614，也參見PCT公布WO05/014862?？扇芜x采用噴霧干燥(一種在干熱空氣流下將制劑料液噴霧霧化成細小液滴的快速干燥方法)來延長疫苗制劑的保存時間。細小液滴蒸發(fā)得到溶質(zhì)構(gòu)成的干粉(參見，例如美國專利公布2004/0042972)。本領(lǐng)域熟知制備和配制疫苗組合物的滅活/裂解的病毒顆粒的方法，這些方法已用了超過40年。通?？深A防性給予合適載體或賦形劑制備的病毒或病毒組分來剌激對一種或多種病毒毒株特異的免疫應答。載體或賦形劑一般是藥學上可接受的載體或賦形劑，例如無菌水、鹽水溶液、緩沖鹽水溶液、葡萄糖水溶液、甘油水溶液、乙醇或它們的組合?？砂凑毡绢I(lǐng)域已建立的方法制備這種確保無菌、pH、等滲性和穩(wěn)定性的溶液。通常要選擇載體或賦形劑以盡可能降低過敏和其它不良作用，以及配合具體給藥途徑，例如皮下、肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)等。用于病毒的預防性給藥的制劑也任選含有一種或多種佐劑以提高針對流感抗原的免疫應答。合適的佐劑包括皂苷，礦物凝膠，例如氫氧化鋁，表面活性物質(zhì)，例如溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚陰離子、肽、油或烴乳液，卡介菌(BCG)，短小棒狀桿菌(Co/jwe6fl"en'Mmpfln;wm)和合成佐劑QS-21及MF59。疫苗制劑的給予量通常應足以刺激對流感病毒的一種或多種毒株的特異性免疫應答。給予病毒最好能引發(fā)保護性免疫應答。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知引發(fā)抗一種或多種病毒株的保護性免疫應答的劑量和方法。例如，滅活流感病毒的范圍是約1-1000HIDso(人感染劑量)，即每份給予的劑量約10S-l()Spfu(噬斑形成單位)?；蛘?，不用佐劑時給予約10-50pg，例如約15pgHA，使用佐劑時給予的劑量較低。一般可在該范圍內(nèi)根據(jù)，例如年齡、身體狀況、體重、性別、飲食、給藥時間和其它臨床因素調(diào)節(jié)該劑量?？扇硇越o予預防性疫苗制劑，例如通過針頭和注射器或無針注射裝置的皮下或肌肉內(nèi)注射?；蛘?，鼻內(nèi)給予疫苗制劑，可利用滴劑、大顆粒氣溶膠(大于約IO微米)或噴入上呼吸道。雖然任何上述遞送途徑能導致保護性全身免疫應答，但鼻內(nèi)給藥能賦予在流感病毒進入部位引發(fā)粘膜免疫力的額外優(yōu)點。對于鼻內(nèi)給藥，優(yōu)選減毒的活病毒疫苗，例如減毒的冷適應和/或溫度敏感的重組或重配流感病毒。雖然優(yōu)選用一次劑量刺激保護性免疫應答，但也可通過同一或不同途徑給予再次劑量來實現(xiàn)所需保護作用。這些方法可適合于任何病毒，包括但不限于正黏病毒(包括甲型和乙型流感病毒)、副黏病毒(包括RSV、人肺炎后病毒和副流感病毒)、彈狀病毒和黃病毒°流感病毒本文的方法、工藝和組合物主要涉及制備流感病毒疫苗。流感病毒由含分區(qū)段單鏈RNA基因組的內(nèi)部核蛋白核心和由基質(zhì)蛋白相連的脂蛋白外膜構(gòu)成。甲型流感病毒和乙型流感病毒各含有單鏈負RNA的8個區(qū)段。甲型流感病毒基因組編碼11種多肽。區(qū)段1-3編碼構(gòu)成RNA依賴性RNA聚合酶的3種多肽。區(qū)段1編碼聚合酶復合體蛋白PB2。區(qū)段2和3分別編碼其余的聚合酶蛋白PB1和PA。此外，一些流感病毒株的區(qū)段1編碼PB1編碼區(qū)內(nèi)的另起讀框產(chǎn)生的小蛋白，PB1-F2。區(qū)段4編碼參與感染期間細胞附著和進入的血凝素(HA)表面糖蛋白。區(qū)段5編碼核衣殼核蛋白(NP)多肽，病毒RNA有關(guān)的主要結(jié)構(gòu)組分。區(qū)段6編碼神經(jīng)氨酸酶(NA)被膜糖蛋白。區(qū)段7編碼從另路剪接的mRNA翻譯的兩種基質(zhì)蛋白，稱為M1和M2。區(qū)段8編碼從另路剪接的mRNA變體翻譯的兩種非結(jié)構(gòu)蛋白，NS1和NS2。乙型流感病毒的8個基因組區(qū)段編碼11種蛋白質(zhì)。3個最大的基因編碼RNA聚合酶的組分，PB1、PB2和PA。區(qū)段4編碼HA蛋白。區(qū)段5編碼NP。區(qū)段6編碼NA蛋白和NB蛋白。NB和NA兩種蛋白均從雙順反子(biscistronic)mRNA的重疊讀框翻譯。乙型流感病毒的區(qū)段7也編碼兩種蛋白M1和M2。最小的區(qū)段編碼兩種產(chǎn)物，其中NS1從全長RNA翻譯，NS2從剪接的mRNA變體翻譯。制備重配病毒以在批準的原始毒株(也稱為原始供體病毒(MDV))中摻入選擇的血凝素和神經(jīng)氨酸酶抗原。FluMist⑧利用批準的冷適應、減毒、溫度敏感的MDV毒株(例如，甲型/AnnArbor/6/60和乙型/AnnArbor/1/66)。可采用許多方法來制備重配病毒，包括雞蛋方法和更新的細胞培養(yǎng)方法(參見，例如PCT公布WO03/091401;WO05/062820和美國專利號6,544,785;6,649,372;6,951,754)?？紤]可利用本發(fā)明MDCK細胞、培養(yǎng)基和方法來生產(chǎn)流感病毒，包括但不限于本文公開的流感病毒株(例如，甲型/AnnArbor/6/60和乙型/AnnArbor/l/66)和包含甲型/AnnArbor/6/60、乙型/AnnArbor/1/66的基因，PR8的重配病毒。還考慮可利用本發(fā)明MDCK細胞、培養(yǎng)基和方法來生產(chǎn)具有溫度敏感、冷適應、減毒的一種或多種表型的流感病毒(包括重配病毒)?？刹捎媒?jīng)典重配技術(shù)，例如共感染方法或任選通過質(zhì)粒拯救技術(shù)制備重配體(參見，例如PCT公布WO03/091401;WO05/062820和美國專利號6,544,785;6,649,372;6,951,754)。實施例現(xiàn)在參考以下實施例描述本發(fā)明。提供這些實施例的目的只是為了說明，本發(fā)明決不應理解為局限于這些實施例，而應理解為包括根據(jù)本文所提供指導顯而易見的任何及所有改進形式。實施例l測定ca/ts流感病毒株在細胞系中的感染傳播速度和特征鑒定MDCK細胞產(chǎn)生的流感病毒疫苗工業(yè)已努力開發(fā)了不利用雞蛋而能在哺乳動物或昆蟲細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中生產(chǎn)流感疫苗的替代生產(chǎn)平臺。(該平臺)的明顯優(yōu)點是易于放大、對生產(chǎn)過程的控制提高和除去了在一些疫苗中可能導致過敏反應的雞蛋蛋白。因為細胞培養(yǎng)系統(tǒng)可快速放大，其在流感流行，雞蛋供應短缺和需要快速生產(chǎn)疫苗之時能賦予額外的優(yōu)點。用總共7種不同的以下細胞系進行了初步研究2種人二倍體肺成纖維細胞系(MRC-5和WI-38)(數(shù)據(jù)未顯示)；人視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞系和人腎細胞系(分別是？￡1^6和29)(數(shù)據(jù)未顯示)，二者均遺傳構(gòu)建成能產(chǎn)生腺病毒產(chǎn)物；恒河猴胎肺細胞系(FRhL2)(數(shù)據(jù)未顯示)；非洲綠猴腎細胞系(Vero);和Marin-Darby狗腎細胞系(MDCK)。MDCK細胞是所測試的那些細胞系中唯一能使以下所有4種類型的毒株增殖至商品化合理滴度(〉l(TLogTCIDso/mL)(圖l，數(shù)據(jù)未顯示)的細胞系冷適應、溫度敏感的減毒(ca/fe/a")重配流感病毒株，H1N2、H3N2;潛在的流行疫苗毒株H5N1以及乙型毒株。比較了在MDCK細胞中與雞蛋中培養(yǎng)的病毒的遺傳和抗原特性。發(fā)現(xiàn)基因組序列沒有明顯變化(數(shù)據(jù)未顯示)，HAI滴度測定抗原活性相當(表1)。黃力褒處微:在96孔黑色平板中培養(yǎng)MDCK和Vero細胞超過4天(DMEM+4111]^谷氨酰胺+青霉素/鏈霉素)。在DMEM+4mM谷氨酰胺+60mU/mLTPCK胰蛋白酶中用0.01MOI的ca/ts乙型流感病毒株(乙型/香港/330/01和乙型/Yamanashi/166/98)感染各孔。固定病毒感染的各板，如下所示進行免疫染色來測定感染傳播。除去各板的含病毒培養(yǎng)液，用200pl/孔DPBS(無0&2+^§2+)洗滌各板一次，然后加入200pl/孔PBS配制的4%0)冷低聚甲酸固定各板。用200^1/孔DPBS(無Ca2+ZMg2+)洗滌各板兩次，然后用第一抗體(用PBS配制的0.1%皂苷、P/。BSA作1:1000稀釋的綿羊抗乙型yamanshi(抗體)和綿羊抗乙型香港(抗體))培育細胞。培育1小時后，除去第一抗體，用PBS配制的0."/。吐溫20洗滌細胞三次，用第二抗體(用PBS配制的0.1%皂苷、1。/。BSA作1:100稀釋的FITC標記家兔抗綿羊(抗體))培育各孔。利用熒光顯微鏡每天目測檢査各孔，共4天，采用SPOT程序每日拍攝圖像。結(jié)果和討論采用熒光聚焦試驗評估乙型ca/ts流感病毒株感染是否能在MDCK和Vero中傳播，也評估了在50個Vero克隆中病毒感染的傳播中是否有差異。因為MDCK細胞單層的熒光增加超過4天，而在Vero細胞中沒有(參見圖1A)，可以得出結(jié)論Vero不允許乙型ca/ts毒株產(chǎn)生，而MDCK允許。該數(shù)據(jù)類似于早先實驗的數(shù)據(jù)，顯示在MDCK細胞中乙型毒株的產(chǎn)量能達到7-7.5log1QTCID5()但在Vero細胞中只能達到4-4.5log1()TCIDso(數(shù)據(jù)未顯示)。也測試了MDCK細胞能否支持多種co^/a"重配毒株(包括潛在的流行疫苗毒株，ca甲型/越南/1203/2004)復制。用低感染復數(shù)的ca甲型/越南/1203/2004感染MDCK細胞，定量測定感染后各種時間上清液中的病毒。感染48小時時，ca甲型/越南/1203/2004的滴度達到約8log1()TCID5()/mL，并且在接下來的3-4天維持穩(wěn)定。參見圖1B和表2。甲型/HlNl、甲型/H5Nl、甲型/H3N2和乙型C"/"/a〃毒株可在MDCK細胞中復制達到較高滴度。此外，在MDCK細胞中傳代這些caAy/a"毒株未明顯改變它們的基因組序列。將三種caAs/a"毒株cfl甲型/悉尼/05/97、ca甲型/北京/262/95和ca乙型/AnnArbor/1/94在MDCK細胞中傳代一次或兩次，測序所有6個內(nèi)部基因的整個編碼區(qū)并與起始材料作比較。未觀察到核苷酸變化(數(shù)據(jù)未顯示)，證明經(jīng)此底物(細胞)傳代未改變這些毒株的遺傳組成。在預計能模擬該生產(chǎn)過程的條件下(包括培養(yǎng)基組成、輸入劑量(moi)、培養(yǎng)溫度和收集時間)對MDCK細胞產(chǎn)生的不同疫苗毒株作進一步序列特征鑒定。根據(jù)初步數(shù)據(jù)，預計MDCK產(chǎn)生的病毒基因組序列不會有明顯變化。因為在MDCK細胞中傳代后基因組在遺傳上穩(wěn)定，估計在雞蛋或MDCK細胞中產(chǎn)生的疫苗的生物學特性沒有區(qū)別。然而，與雞蛋產(chǎn)品相比，細胞培養(yǎng)的主要病毒產(chǎn)品可能有一些微小差異，特別是對于病毒蛋白質(zhì)(包括HA和NA)的翻譯后修飾，或病毒包膜的脂質(zhì)組成；二者均可能改變病毒粒子的總體物理特性。細胞培養(yǎng)生產(chǎn)的和雞蛋生產(chǎn)的疫苗的抗原性初步臨床前數(shù)據(jù)證明此重要參數(shù)沒有可檢測的差異。通過MDCK細胞傳代幾種疫苗毒株的雞蛋儲液，利用參比抗血清檢測HAI滴度來測定兩種產(chǎn)物的抗原性。如表1所示，所有HAI滴度彼此在兩倍之內(nèi)，表明與雞蛋衍生的病毒材料相比，該疫苗在細胞中的復制未改變其抗原性。表l.在雞蛋和MDCK細胞中生產(chǎn)的菌株的HAI滴度<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>實施例2非致瘤性血清MDCK細胞的衍生MDCK細胞已常規(guī)用于滴定流感病毒(Zambon，1988，刊于TextbookofInfluenza(《流感教材》)，Nicholson、Webster和Hay編，第24章，第324-332頁，BlackwellScience),因此可用于為生產(chǎn)疫苗材料而增殖流感病毒。然而，常規(guī)用基礎(chǔ)培養(yǎng)基制劑，例如補加了FBS的Eagle極限必需培養(yǎng)基(EMEM)培養(yǎng)MDCK細胞。多份報道表明MDCK細胞在這些條件下培養(yǎng)和/或長期培養(yǎng)可能有致瘤性(參見例如Gaush等，/VocSoc丑!'o/Med，122:931;Leighton等，1968，Sc/露e，163:472和Leighton等，1970，Ca"cer，26:1022)。因此，關(guān)注的是利用MDCK細胞生產(chǎn)疫苗材料并致力于開發(fā)其它細胞系(例如，PER.C6和VERO)。不幸的是，不是所有的流感病毒株均能在其它哺乳動物細胞系中生長良好，特別是包括？1111^&(—種減毒流感活疫苗)的冷適應流感病毒只能在MDCK細胞中生長到適當?shù)味?>107TCID50/mL)(參見上文實施例1)。特征鑒定MDCK細胞系的早期報道表明早期代次的MDCK細胞可能不致瘤(Gaush等，1966，ProcSoc五x;5/o/122:931)。本實驗的目標是建立培養(yǎng)基和傳代方法以使MDCK細胞維持非致瘤狀態(tài)。利用補加10%FBS、4mM谷氨酰胺和4.5g/L葡萄糖的DMEM作為生長培養(yǎng)基在T-培養(yǎng)瓶中擴增得自ATCC(CCL34)的MDCK細胞。對血清培養(yǎng)的MDCK細胞(MDCK-S細胞)建立前原始MDCK細胞庫，采用商業(yè)承包者(BioReliance,Rockville，MD)的常規(guī)測試檢驗該細胞庫有無細菌/真菌污染和支原體污染。發(fā)現(xiàn)這些細胞中不存在細菌/真菌污染。也發(fā)現(xiàn)MDCK-S細胞中不存在可培養(yǎng)的支原體。也通過核型試驗檢驗了該庫的MDCK-S細胞，發(fā)現(xiàn)這些細胞是狗來源的，眾數(shù)染色體數(shù)是78，染色體數(shù)范圍是70-84。然后從PreMCB小瓶再傳代MDCK-S細胞20次，利用體內(nèi)裸小鼠模型檢驗核型和致瘤性。核型檢驗顯示最后一代的MDCK-S細胞(p81/24)表現(xiàn)出與早期代次的MDCK-S細胞相同的眾數(shù)染色體數(shù)(78)和染色體范圍(70-84)，表明這些細胞未因長期傳代而改變。將IX107個MDCK-S細胞皮下注射入成年裸小鼠未形成任何小結(jié)，故可視作非致瘤性。材料與方法#雞MDCK細胞(ATCC，目錄號CCL-34);T-25、T-75、T-225培養(yǎng)瓶(Coming,目錄號430639、430641、431082);Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)粉末(Gibco，GrandIslandNY，制劑號01-5052EF);胎牛血清，經(jīng)y-射線照射過(JRH，LenexaKS，目錄號12107-500M);L-谷氨酰胺(JRH，LenexaKS，目錄號59202-100M);D-葡萄糖(Amresco，目錄號0188-1KG);無Ca2+和Mg2+的Dulbecco磷酸緩沖鹽水(DPBS)粉末(Gibco，GrandIsandNY，目錄號21600-069);0.05%胰蛋白酶-EDTA(Gibco，GrandIslandNY，目錄號25300);二甲基亞砜DMSO(Sigma,St.LouisMS,目錄號D2650);PBS配制的0.4%w/v臺盼藍染料(Sigma，St.LouisMS，目錄號T8154);002培養(yǎng)箱(FormaScientific,型號3110);YSI生物分析儀(YSI，型號2700select);體外化學系統(tǒng)(Orthoclinic,DT60II型)；改進的Neubaurr血細胞計數(shù)器(HausserScientific,Brightline0.1mm深/Reichert，Brightline0.1mm深)。在資織智養(yǎng)嚴^f錄孝i獰MDCJ^MDCa潘應:一小瓶血清MDCK細胞得自ATCC。利用補加10%(v/v)FBS、4.5g/L葡萄糖、2.2g/LNaHC03和4mM谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)基在T-75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)這些細胞。細胞在接種后3或4天傳代，如果在第4天傳代，則在接種后第3天進行培養(yǎng)基完全替換。如下所述從T-瓶回收細胞。除去消耗的生長培養(yǎng)基，用DPBS(無鈣和鎂)洗滌細胞單層兩次。向各瓶中加入在37。C水浴預熱的合適量胰蛋白酶-EDTA(3mL/T-75，7.5mL/T-225)，T-瓶在37r，5%C02培養(yǎng)箱中培育約15-20分鐘。每5分鐘檢査培養(yǎng)瓶看細胞是否脫離，拍打培養(yǎng)瓶幾次以幫助細胞脫離。當細胞完全從T-瓶式脫離后，加入等體積的含10%血清的完全生長培養(yǎng)基(3mL/T-75，7.5mL/T-225)以抑制胰蛋白酶。用大小合適的移液管上下抽吸細胞懸浮液以破碎任何大細胞塊。用血細胞計數(shù)器計數(shù)兩份0.5mL細胞懸液樣品。如果兩次計數(shù)的結(jié)果彼此相差不在15%以內(nèi)，重復計數(shù)細胞。在新鮮培養(yǎng)瓶中用新鮮溫熱的生長培養(yǎng)基(DMEM+10%FBS+4.5g/L葡萄糖+4mM谷氨酰胺)將細胞稀釋至0.05X106個活細胞/mL，接種于T-培養(yǎng)瓶中(35mL/T75或100mL/T-225)。然后在37土1。C，5。/。C02中培育培養(yǎng)瓶3天，再進行亞培養(yǎng)或培養(yǎng)基更換。織雄CM雄庫:如上所述在T-培養(yǎng)瓶中擴增MDCK-S細胞直至回收到構(gòu)建細胞庫所需的細胞量(4X1(^個細胞/小瓶X小瓶數(shù)目)。在指數(shù)生長期(接種后3天)通過所述胰蛋白酶消化回收MDCK-S細胞。合并各培養(yǎng)瓶的MDCK-S細胞懸液，在150-250g離心7士l分鐘回收細胞。從各試管中吸棄上清液，用新鮮的完全生長培養(yǎng)基(DMEM+10%FBS+4.5g/L葡萄糖+4mM谷氨酰胺)重懸細胞沉淀物。合并不同離心瓶的細胞懸液，用移液管上下抽吸幾次以破碎任何大細胞塊。測定細胞總數(shù)，以及確定每小瓶4X106個細胞所用的冷凍小瓶總數(shù)。然后利用新鮮的生長培養(yǎng)基將細胞懸液的體積調(diào)節(jié)至上述值。在細胞懸液中加入等體積的新鮮制備2X冷凍培養(yǎng)基(DMEM+10%FBS+4mM谷氨酰胺十4.5/L葡萄糖+15%DMS0)。徹底混合細胞懸液，將lml細胞懸液加入各冷凍小管中。將所有小瓶轉(zhuǎn)移入Nalgene冷凍容器，置于^-60°C的冰箱中。再將冷凍小瓶轉(zhuǎn)移至液氮儲藏罐。劍吝潛蕎^^MDCK-S潘應游生長必遂:細胞在其生長培養(yǎng)基中至少傳代4次(融化后)，然后進行生長曲線研究。使MDCK-S細胞在T-225瓶中擴增，從而獲得總共至少2.7X107個細胞。培養(yǎng)各瓶細胞至80-95%匯合，然后如上所述胰蛋白酶消化。合并回收的MDCK-S細胞，用移液管上下抽吸細胞懸液幾次以破碎任何大細胞塊。取兩份樣品(0.5ml)作細胞計數(shù)及測定細胞密度。如果兩次樣品計數(shù)的結(jié)果彼此相差不在15%以內(nèi)，重復計數(shù)。然后用總體積為540ml的完全生長培養(yǎng)基稀釋總共2.7X107個MDCK-S細胞(5.0X104個細胞/mL)。然后將該MDCK-S細胞懸液分散入14XT-75培養(yǎng)瓶中(35mL/T75培養(yǎng)瓶)。將各瓶置于37士rc，5%<:02培養(yǎng)箱中。每天從培養(yǎng)箱中取出兩個T-培養(yǎng)瓶作細胞計數(shù)和代謝分析。從各瓶中取兩份細胞培養(yǎng)基樣品(約1.0mL)作代謝分析。利用YSI和Vitros分析儀測定一份樣品的葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸和氨濃度。將另一份樣品冷凍于-70'C待日后作氨基酸分析。如上所述通過胰蛋白酶消化回收各瓶的MDCK-S細胞。測定細胞密度，也測定每個T-培養(yǎng)瓶的細胞總數(shù)。如果兩次樣品計數(shù)的結(jié)果彼此形成不在15"/。以內(nèi)，重復計數(shù)。給出的數(shù)值是對兩份不同代次(p63和p65)的MDCK-S細胞的兩份獨立生長曲線研究的平均值。在佛羅里達州，墨爾本的AppliedGeneticsLaboratories(應用遺傳學實驗室)進行核型檢驗。簡言之，將T-225培養(yǎng)瓶中生長的MDCK-S細胞運至AppliedGeneticsLaboratories(應用遺傳學實驗室)。按照上述方法維持和亞培養(yǎng)細胞。當認為這些細胞具有足夠的有絲分裂細胞時，收集這些細胞作有絲分裂分析。37'C用秋水仙胺(0.02pg/mL)處理這些細胞150分鐘。然后用胰蛋白酶消化收集細胞，200g離心細胞5分鐘。吸棄上清液，將細胞懸浮在預溫暖的低滲溶液中，37'C培育10分鐘。離心沉淀溶脹的細胞，然后室溫用卡諾依溶液(3:1甲醇冰醋酸)固定40分鐘。再次離心細胞，用卡諾依固定液洗滌至少兩次。最后離心一次后，將細胞重懸在l-3ml新鮮的固定液中產(chǎn)生乳白色的細胞懸浮液。將數(shù)滴最終細胞懸液置于清潔載玻片上，空氣干燥。向載玻片上加入磷酸緩沖液配制的賴特染液，培育7-10分鐘染色細胞。7-10分鐘后用自來水洗滌載玻片，然后空氣干燥。用低倍物鏡(10X)掃描觀察細胞以找尋細胞分裂中期的細胞，用高倍油鏡(ioox)分析分裂中期細胞的染色體。對IOO個分裂中期細胞分析其細胞形成異常和染色體計數(shù)。掃描觀察1000個細胞測定多倍體頻率和有絲分裂指數(shù)(正發(fā)生有絲分裂的細胞百分數(shù))。MDCSPi^-MCS游無蘑澄驗6智慮滯虔y浙真蘑滯劍J4神潛養(yǎng)某游無慮檢鄉(xiāng):在馬里蘭，Rockville的BiorelianceInc.檢驗了MDCK-SPre-MCB的細菌抑制和真菌抑制活性。進行該試驗以符、合US26和21CFR610.12要求。該試驗檢驗接種在含O.lmL測試樣品的合適肉湯培養(yǎng)基中的對照生物(枯草芽胞桿菌(5ac/〃w白色念珠菌(OmAWaa/6/ca/w)、產(chǎn)芽胞梭狀芽胞桿菌(C7o血'W,，roge"es)、金黃色葡萄球菌OS啤一ococcwsawew力、銅綠假單胞菌(i^ewofomo"(xsflewg/"owa)、黑曲霉(^s/erg/〃Mj7Wge。)與只含對照生物的肉湯培養(yǎng)基之間是否有生長差異。簡言之，將測試品接種于3試管的TSB(大豆酪蛋白消化培養(yǎng)基)、4試管的THI0(巰基乙酸鈉液體培養(yǎng)基)、2試管的SAB(Sabourand葡萄糖瓊脂)和1試管的PYG(蛋白胨酵母提取物)中。然后將含少于100cfu的各對照生物接種入合適類型的培養(yǎng)基中。陽性對照是接種于TSB和THIO的枯草芽胞桿菌、接種于TSB和SAB的白色念珠菌(20-25°C和30-35°C)、接種于THIO和PYG的產(chǎn)芽胞梭狀芽胞桿菌、綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉。陰性對照是無菌PBS。培養(yǎng)基培育35-天，檢查生物的生長情況。也在Bioreliance，RockvilleMD采用4種培養(yǎng)基無菌檢驗分析測試品中是否存在細菌和真菌污染，設(shè)計該試驗以符合USP26,EP和21CFR610.12的要求。簡言之，將測試品接種于2試管的TSB(大豆酪蛋白消化培養(yǎng)基)、2試管的THI0(巰基乙酸鈉液體培養(yǎng)基)、3試管的SAB(Sabourand葡萄糖瓊脂)和2試管的PYG(蛋白胨酵母提取物)中。培養(yǎng)基在合適溫度培育(SAB斜面培養(yǎng)基用兩種溫度培育)，在整個14天期間觀察所有試管，在第3/第4或第5天、第7天或第8天和第14天檢査各試管。將顯示混濁的任何測試品接種試管接種平板，對各平板進行革蘭染色。陰性對照是無菌PBS。支嚴沐/支嚴沐鄉(xiāng)麵婦/麵血W澄驗:將一小瓶凍存的MDCK-S細胞(MDCKpreMCB，批號747pl05)發(fā)往Bioreliance。如上所述擴增細胞并在T-培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。制備濃度為5Xl()S個細胞/mL的細胞裂解液，-70^冷凍。檢驗測試品在瓊脂肉湯/平板和/或VERO細胞中能否抑制肺炎支原體(M;;co;7/wmflpwewmow/ae)、口月空支原體(Afycop/<xsmaora/e)禾卩豬鼻支原體(Afyco/7/asmaZywA/"")的生長。對于瓊脂分離試驗，在瓊脂平板或肉湯瓶中檢驗掾加或不摻加的測試品。用肺炎支原體和口腔支原體摻加測試品以達到10-100cfu/0.2mL(對于瓊脂檢驗)和10-100cfu/10mL(對于半肉湯試驗)的稀釋度。一部分測試樣品不摻加。用摻加(2瓶)或不摻加的(2瓶)各10ml接種4個半固體肉湯瓶。在合適溫度以需氧或厭氧方式培養(yǎng)摻加/未摻加的各一瓶。用各摻加樣品或未摻加樣品接種10塊A型瓊脂板和10塊B型瓊脂板。在合適溫度以需氧或厭氧方式培養(yǎng)A型瓊脂板和B型瓊脂板的一半。未接種的支原體半固體肉湯用作未接種陰性對照。觀察所有肉湯瓶21天。在第3、7和14天將各肉湯瓶(除未接種陰性對照之外)在A型瓊脂板或B型瓊脂板上(各10塊平板，0.2ml/平板)亞培養(yǎng)，在與相應肉湯瓶相同的條件下培育。每天檢査各板一次，共21天。對于增強的VERO細胞培養(yǎng)試驗，檢驗摻加或不摻加的測試品。測試品摻加了10-100cfu/0.2mL濃度的口腔枝原和豬鼻支原體。摻加的測試品、未摻加的測試品、陽性對照和陰性對照各接種在VERO細胞培養(yǎng)物的T-75培養(yǎng)瓶中。培育3-5天后，刮下各瓶的細胞，快速冷凍。將各瓶中l(wèi)mL細胞裂解液的十分之二接種入含VERO細胞個6孔板各孔中。此外，將陽性和陰性對照接種入含VERO細胞的6孔板合適孔中。3-5天后，固定細胞，用DNA結(jié)合性HOECHT染料染色，評估支原體的存在。MDCS謝應在凝z力嚴^7游發(fā)磨絲澄邀:BioReliance,Rockville,MD進行了在無胸腺裸(nu/nu)小鼠中評估腫瘤形成。簡言之，用0.2mL(lXl(^個細胞/小鼠)的陽性對照(18C1-10T細胞)、陰性對照(敘利亞倉鼠胚胎細胞；SHE細胞)或測試細胞(血清MDCK細胞，747pl05高代次)皮下注射30只雌性無胸腺小鼠(4周齡)。注射前隨機分組小鼠，所有小鼠用22號針頭在同一天注射。每個工作日觀察所有小鼠，每周兩次觸診注射部位有無病灶產(chǎn)生發(fā)展，共84天。測量各病灶，只要病灶大小沒有可見增加則保留小鼠。最長3個月。84天后處死所有小鼠并尸檢，通過組織病理學方法分析注射部位、肺、肩胛骨淋巴結(jié)和總體病灶。在Affi)OJ:-S激應^復煮y冷適應魔感嫁毒樣:以5X104個細胞/mL接種T-75培養(yǎng)瓶(35mLDMEM+10%FBS+4mM谷氨酰胺)，細胞維持于37"C和5%C02的培養(yǎng)箱內(nèi)培育3天。接種3天后，利用胰蛋白酶EDTA收集測定每個T-培養(yǎng)瓶的總細胞，通過臺盼藍排除試驗測定細胞計數(shù)。然后如下所示感染其余T-培養(yǎng)瓶細胞。吸出生長培養(yǎng)基，每培養(yǎng)瓶用10mLDPBS(無Ca"Mg^)洗滌細胞一次。按照以下方程測定以0.01感染復數(shù)(MOI)感染各T-培養(yǎng)瓶細胞的病毒量r、每培養(yǎng)瓶的總細胞數(shù)xMO/病毒量0丄)=-1。A(iogrc/"50/wi:)MOI定義為每個細胞加入的病毒顆粒。然后向各T-培養(yǎng)瓶35mL感染后的培養(yǎng)基(DMEM+4mM谷氨酰胺+60mu/mLTPCK胰蛋白酶)中加入所需量的病毒。隨后將T-培養(yǎng)瓶在33°C，5%C02下培育，每天取樣，共6天。向各樣品中加入10XSP作為穩(wěn)定劑，將樣品保存于《7(TC，然后檢驗感染性。按照檢測感染性病毒粒子的中值組織培養(yǎng)感染性劑量CTCID5o)試驗測定各樣品中存在的病毒濃度。簡言之，MDCK細胞在96-孔板中生長至匯合，加入ca/ts流感病毒樣品的連續(xù)稀釋液。MDCK細胞試驗平板中的樣品通常最終稀釋為10_4-10—1()。列1-5和8-12中各孔含有稀釋的病毒和樣品，列6-7中各孔只接受病毒稀釋液并用作細胞對照。該方式在每塊板上產(chǎn)生兩個數(shù)據(jù)點(11=2)。MDCK細胞中病毒復制導致細胞死亡，子代病毒釋放入培養(yǎng)上清液中。子代病毒感染其它細胞，最終導致細胞單層破壞。在33土rC，C02環(huán)境中培育6天會發(fā)生因感染所致的致細胞病變效應(CPE)。然后從培養(yǎng)箱中取出平板，棄去孔中的培養(yǎng)基，向各孔中加入100plMEM+4mM谷氨酰胺+青霉素/鏈霉素十MTT。平板在37'C5%(:02培育6小時，目測檢查各孔產(chǎn)生的顏色(黃色/橙色表明CPE孔，固體紫色結(jié)晶表明無CPE)來確定顯示CPE的孔數(shù)。按照Karber改進的Reed-Muench方法，利用每半塊板中顯示CPE的孔數(shù)計算滴度(10§1()TCID50/mL)。結(jié)果和討論在T-75培養(yǎng)瓶中，用完全生長培養(yǎng)基(0^^]^1+10%FBS+4mM谷氨酰胺+4.5g/L葡萄糖)分別融化兩冷凍管的血清MDCK細胞。融化后細胞存活率分別是97%和98%。融化3天后細胞達到匯合。細胞的形態(tài)是上皮樣的，類似于得自ATCC的儲備物(圖3)。將這些細胞傳代5次，構(gòu)建這些血清培養(yǎng)的MDCK細胞(MDCK-S細胞)的前原始細胞庫PreMCB。圖2概述了獲得MDCK-S前原始細胞庫(PreMCB)所用的方法。圖4顯示了MDCK-S細胞在10。/。FBSDMEM培養(yǎng)基中的生長曲線。所示結(jié)果是用不同代次(P63和P65)細胞的兩個實驗的平均值。MDCK-S細胞有約1天的延滯期，在此期間細胞數(shù)未從接種時倍增(接種時1.75X106總細胞/丁75培養(yǎng)瓶，第1天2.9X106總細胞丌-75)。在第1天葡萄糖消耗/乳酸產(chǎn)生速率幾乎是O，表明細胞處于延滯期(圖5)。然后細胞在細胞生長期間呈指數(shù)生長，接著在接種后第4天進入穩(wěn)定期。指數(shù)生長期中MDCK-S細胞的倍增時間是23.1小時。指數(shù)期葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生彼此對映，乳酸濃度增加與葡萄糖濃度降低一致(圖5)。葡萄糖消耗/乳酸產(chǎn)生速率與細胞生長曲線良好相關(guān)(比較圖4和5)。延滯期此二速率低，在指數(shù)期的第1到第4天葡萄糖(消耗速率)上升至2.93mM/天，乳酸(產(chǎn)生速率)上升至3.43mM/天。MDCK細胞在接種后第4天進入穩(wěn)定期，在接種后第5天達到最大細胞密度約29±0.99X106個細胞(圖4)。在此項研究中，達到最大密度后細胞數(shù)維持恒定直至第7天。穩(wěn)定期的葡萄糖消耗速率和乳酸產(chǎn)生速率分別降低至0.33mM/天和0.25mM/天。培養(yǎng)7天后，培養(yǎng)基中仍有約12mM葡萄糖。在第4天，葡萄糖消耗量與乳酸產(chǎn)生量之比是1.2。圖6顯示了MDCK-S細胞中谷氨酰胺消耗和谷氨酸及氨的產(chǎn)生。谷氨酰胺消耗速率和氨的產(chǎn)生速率也與細胞生長曲線有關(guān)(比較圖4和6)。指數(shù)生長期間，MDCK-S細胞以0.49mM/天的速率消耗谷氨酰胺直至第4天，同時以0.32mM/天的速率產(chǎn)生氨直至第5天。然后在細胞進入穩(wěn)定期時，谷氨酰胺的消耗速率降低至0.24mM/天，同時氨的產(chǎn)生速率降低至0.11mM/天。接種后第4天，氨產(chǎn)生和谷氨酰胺消耗量速率之比是0.7。在此7天的細胞生長研究中，谷氨酰胺代謝所產(chǎn)生的谷氨酸未累積。檢驗了61/4代和81/24代的MDCK-S細胞的核型。G帶染色體分析顯示細胞是狗來源。圖7顯示了IOO個分裂中期細胞中染色體數(shù)的分布。對于低代次61/4細胞，每個分裂中期(細胞)的染色體計數(shù)范圍是70-84條染色體，高代次81/24細胞是70-84條染色體。兩種代次的眾數(shù)染色體數(shù)是78條染色體。染色體分布未隨傳代而改變。估計這些細胞的形態(tài)(modality)與正常狗腎細胞一樣(Starke等，1972，/Vog7mmw"o6/o/5:178)。檢驗了MDCK-SpreMCB中是否存在任何細菌、真菌或支原體污染。pre-MCB經(jīng)無菌檢驗(采用直接接種方法檢查細菌和真菌污染的4種培養(yǎng)基的無菌檢驗)，發(fā)現(xiàn)不存在支原體(瓊脂可培養(yǎng)和非瓊脂可培養(yǎng)試驗)。在細菌抑制/真菌抑制檢驗和支原體抑制檢驗中均發(fā)現(xiàn)測試品未抑制陽性對照生長。將81/24代(pre-MCB+20次傳代)的MDCK-S細胞接種于裸小鼠進行3個月的致瘤性檢驗。在接種了MDCK-S細胞的任何小鼠中未診斷到贅生物，表明MDCK-S細胞無致瘤性(表4)。檢驗了MDCK-S細胞，發(fā)現(xiàn)它能支持冷適應溫度敏感的重配流感病毒株復制(表2)。表2:冷適應流感病毒株在適應含血清和無血清MediVSF101的MDCK細胞中的生長情況<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>實施例3在Taub培養(yǎng)基中衍生無血清MDCK細胞以上實施例2詳述的結(jié)果表明可在維持MDCK細胞的上皮形態(tài)和正常核型以及支持冷適應流感病毒復制的條件下培養(yǎng)它們。此外，我們證明在以上研究開發(fā)的條件下培養(yǎng)MDCK細胞能得到非致瘤性MDCK細胞。然而，實施例2所用的培養(yǎng)基含有胎牛血清(FBS)。FBS是成分復雜的混合物，其批次之間差異的問題己見報道。目前牛的牛海綿狀腦病(BSE)問題也產(chǎn)生了安全顧慮。為提高治療和疫苗接種而生產(chǎn)的生物制品安全性，開發(fā)能維持MDCK-S細胞系的非致瘤性本質(zhì)和生長特征的無血清培養(yǎng)基至關(guān)重要。利用補加了10%FBS、4mM谷氨酰胺和4.5g/L葡萄糖的DMEM作為生長培養(yǎng)基將得自ATCC(ccl34)的MadinDarby狗腎細胞(MDCK)在T-培養(yǎng)瓶中傳代5次來擴增。然后將細胞轉(zhuǎn)移至無血清的Taub培養(yǎng)基(配方見下文)。適應在Taub培養(yǎng)基制劑中生長的細胞稱為MDCK-T。建立MDCK-T細胞的pre-MCB(參見圖8)，檢驗細菌/真菌污染和支原體污染。也通過核型試驗檢驗了MDCK-T細胞前原始細胞庫中的細胞，發(fā)現(xiàn)其是狗來源的，眾數(shù)染色體數(shù)是78，染色體數(shù)范圍是52-84。此外，從PreMCB小瓶傳代MDCK-T細胞至少20次，利用成年裸小鼠體內(nèi)模型檢驗核型和致瘤性。然而，發(fā)現(xiàn)MDCK-T細胞在此模型中有致瘤性，表明公布的Taub培養(yǎng)基不支持為生產(chǎn)人用疫苗材料而穩(wěn)定地培養(yǎng)MDCK細胞。材料與方法#銀MDCK細胞(ATCC，目錄號CCL-34，54代)；T-25、T-75、T-225培養(yǎng)瓶(Corning,目錄號430639、430641、431082);Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)粉末(Gibco，GrandIslandNY，制劑號01-5052EF);HamF12營養(yǎng)混合物粉末(Gibco，GrandIslandNY，目錄號21700-075);胎牛血清，經(jīng)Y-射線照射過的(JRH，LenexaKS，目錄號12107-500M);L-谷氨酰胺(JRH，LenexaKS，目錄號59202-100M);D-葡萄糖(Amresco，目錄號0188-1KG);無Ca2+和Mg2+的Dulbecco磷酸緩沖鹽水(DPBS)粉末(Gibco，GrandIsandNY，目錄號21600-069);胰島素粉末(Serological,目錄號4506);轉(zhuǎn)鐵蛋白(APO形式)(Gibco,GrandIslandNY,目錄號11108-016);前列腺素El(Sigma,St.LouisMS,目錄號P7527);氫化可的松(Mallinckrodt，目錄號8830(-05》;碘塞羅寧(Sigma,St.LouisMS,目錄號T5516);鈉硒(SodiumSelenium)(EMD,目錄號6607-31);0.05%胰蛋白酶-EDTA(Gibco，GrandIslandNY，目錄號25300);利馬豆胰蛋白酶抑制劑(Worthington,目錄號LS002829);二甲基亞砜，DMSO(Sigma,St.LouisMS,目錄號D2650);PBS配制的0.4%w/v臺盼藍染料(Sigma，St.LouisMS,目錄號T8154);改進的Neubaurr血細胞計數(shù)器(HausserScientific,Brightline0.1mm深/Reichert，Brightline0.1mm深)；YSI生物分析儀(YSI，型號2700select);體外化學系統(tǒng)(Orthoclinic,DT60II型)。紀煮yr""6無逾淳潛養(yǎng)基Taub培養(yǎng)基(Taub禾卩Livingston,1981，TVF^ca^Sc/.,372:406)是由DMEM/HAMF12(1:l)構(gòu)成的一種無血清培養(yǎng)基制劑，其含有4.5g/L葡萄糖和4mM谷氨酰胺作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基制劑并向其中加入表3所示的激素/因子。表3:加入無血清培養(yǎng)基制劑的激素和生長因子<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>在傳代或重加料之時通過向SFDMEM/HamF12培養(yǎng)基+4^11^谷氨酰胺+4.5g/L葡萄糖+l(T8M亞硒酸鈉中加入激素儲備液來新鮮制備TaubSFM。通過將lOOnL胰島素儲備液(5mg/mL)、100pL轉(zhuǎn)鐵蛋白儲備液(5mg/mL)、100uL碘塞羅寧(T3)儲備液(5X1(T9M)、5)iL氫化可的松儲備液(l(T3M)和50前列腺素El儲備液(50pg/mL)加入基礎(chǔ)DMEM/HamF12培養(yǎng)基+4mM谷氨酰胺+4.5g/L葡萄糖+l(T8M亞硒酸鈉中來制備100mLTaub培養(yǎng)基。所有儲備液如下所示制備胰島素儲備液:將適量胰島素溶解于0.01NHC1中制備5mg/ml儲備液。溶液經(jīng)0.2微米除菌級過濾器過濾，等分加入Nalgene冷凍管，4'C保存。轉(zhuǎn)鐵蛋白儲備液將適量轉(zhuǎn)鐵蛋白溶解于MilliO水中制備5mg/ml儲備液。溶液經(jīng)除菌級過濾器過濾，然后等分加入Nalgene冷凍管，〈-2(TC保存。碘塞羅寧0\)儲備液:將適量T3溶解于0.02NNaOH中獲得10"M溶液制備成儲備液。用0.02NNaOH將該儲備液進一步稀釋至濃度為5X10—9M的儲備液，經(jīng)除菌級過濾器過濾，等分加入Nalgene冷凍管，<-2CTC保存。氫化可的松儲備液:將適量氫化可的松溶解于100%乙醇中制備10-3M儲備液，等分加入Nalgene冷凍管。4'C保存各小瓶3-4個月。前列腺素E1儲備液:將適量PGE1溶解于100%無菌乙醇中制備50嗎/mL儲備液，等分加入Nalgene冷凍管，〈-2(TC保存。Na2SeC^儲備液:將適量硒化鈉溶解于WFI水或MilliQ水中制備10'2M儲備液。用水將該儲備液進一步稀釋至濃度為10—5M，經(jīng)除菌級過濾器過濾，4'C保存。伊MZ)CK-S紛應適i^無血著nmZ>潛養(yǎng)基:用含4.5g/L葡萄糖、2.2g/LNaHC03和4mML-谷氨酰胺的10%FBSDMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)得自ATCC(54代)的一冷凍管MDCK細胞，傳代5次(如上所述)，然后接種入無血清的Taub培養(yǎng)基。通過胰蛋白酶消化回收T-75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的血清MDCK細胞。除去消耗的生長培養(yǎng)基，用DPBS(無鈣和鎂)洗滌細胞單層兩次，然后棄去DPBS。加入合適量的預溫熱胰蛋白酶-EDTA(3mL/T-75)，T-培養(yǎng)瓶在37。C，5%<:02培養(yǎng)箱中培育約15分鐘。用手掌拍打燒瓶幾次使細胞完全脫離。加入等體積的利馬豆胰蛋白酶抑制劑來中和胰蛋白酶，取兩份樣品測定細胞懸液的細胞濃度。然后將1.75X106個細胞在新的T75培養(yǎng)瓶中稀釋至35mLTaub培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)瓶置于維持在5%<:02、37土rc的細胞培養(yǎng)箱中。細胞在接種后亞培養(yǎng)3天，或在第3天更換溫完全培養(yǎng)基，然后在接種后第4天亞培養(yǎng)。f潛表適應^養(yǎng)皋游MDC《除去消耗的生長培養(yǎng)基，用DPBS(無鈣和鎂)洗滌細胞單層兩次。加入合適量的預溫熱胰蛋白酶-EDTA(3mL/T-75，7.5mL/T-225)，T-培養(yǎng)瓶在37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培育約15分鐘。用手掌拍打燒瓶幾次以使細胞完全脫離。然后加入等體積的利馬豆胰蛋白酶抑制劑(3mL/T-75，7.5mL/T-225)來抑制胰蛋白酶。用大小合適的移液管上下抽吸細胞懸液使之均勻。取兩份0.5mL細胞懸液樣品作細胞計數(shù)。如果兩次計數(shù)的結(jié)果彼此相差不在15%以內(nèi)，重復細胞計數(shù)。計數(shù)后，在新的培養(yǎng)瓶中用新鮮的預溫Taub培養(yǎng)基稀釋細胞至0.05X1(^個活細胞/mL，總體積為35mL/T75或100mL/T-225。然后37土1。C，5%C02環(huán)境中培育培養(yǎng)瓶。細胞于第3天在新T培養(yǎng)瓶中亞培養(yǎng)，或更換溫完全培養(yǎng)基，于接種后第4天在新T培養(yǎng)瓶中亞培養(yǎng)培養(yǎng)物。制備適應7b"潛孝基游MDCii:潘應i^MC丑庫:如以上實施例2所述制備適應無血清Taub的MDCK細胞系(MDCK-T)的前原始細胞庫，除了2X冷凍培養(yǎng)基是Taub培養(yǎng)基+15%DMSO外。獰,鑒定^^應rfl^錄養(yǎng)基游MDC7^MZ)C7J:-"潘應:如實施例2所述進行MDCK-T細胞的核型、無菌和支原體檢驗，除了用Taub培養(yǎng)基替代含血清的完全培養(yǎng)基外。此外，如實施例2所述檢測了T-75培養(yǎng)瓶中MDCK-T細胞的生長曲線特征和冷適應流感病毒株在MDCK-T細胞中的復制情況，除了用Taub培養(yǎng)基替代含血清的完全培養(yǎng)基外。如以上實施例2所述，通過BioRdiance對88/29代MDCK-T細胞(pre-MCB+20次傳代)進行致瘤性研究。結(jié)果與討論在T-75培養(yǎng)瓶中用無血清Taub培養(yǎng)基融化一冷凍管的MDCK-TpreMCB(64/5代)細胞。融化后細胞存活率是97%，從冷凍管回收到5.25X106個細胞。融化3天后細胞生長達到匯合。細胞的形態(tài)顯示上皮樣細胞，類似于親代MDCK-S細胞(圖9)。圖IO顯示了MDCK-T細胞在TaubSF培養(yǎng)基中的生長曲線。所示結(jié)果是用不同代次(P71/12和P73/14)細胞的兩個實驗的平均值。MDCK-T細胞沒有延滯期，細胞在接種1天后倍增(第1天3.42X106總細胞汀-75培養(yǎng)瓶，第0天1.75X106總細胞/丁75培養(yǎng)瓶)。細胞處于指數(shù)生長期直至第4天，此時它們進入穩(wěn)定期。指數(shù)生長期中細胞的倍增時間是20.4小時。指數(shù)期間(第0天到第4天)它們利用葡萄糖和谷氨酰胺(圖ll和12)，同時產(chǎn)生乳酸和氨。葡萄糖消耗/乳酸產(chǎn)生速率與細胞生長曲線良好相關(guān)(比較圖10和11)。在指數(shù)期的第0到第4天葡萄糖消耗速率是1.78mM/天，乳酸產(chǎn)生速率是2.88mM/天。培養(yǎng)7天時，MDCK-T細胞只消耗了培養(yǎng)基中總共約10mM的葡萄糖。接種后第4天，葡萄糖消耗量與乳酸產(chǎn)生量之比是1.2。第4天后葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生速率降低，此時細胞進入穩(wěn)定期，葡萄糖消耗速率是0.65mM沃，乳酸產(chǎn)生速率是0.46mM/天。在接種后約第4天達到最大細胞密度37±0.24X106個細胞。細胞密度在穩(wěn)定期不降低，維持恒定直至第7天。谷氨酰胺消耗速率和氨產(chǎn)生速率類似于MDCK-T細胞的生長和葡萄糖/乳酸狀況(比較圖10、11和12)。在指數(shù)生長期間(第0天到第4天)，MDCK-T細胞以0.36mM/天的速率消耗谷氨酰胺，當細胞進入穩(wěn)定期時(第4天到第7天)該速率降至0.27mM/天。氨產(chǎn)生以0.22mM/天的速率線性增加直至第7天。接種后第4天時，氨產(chǎn)生與谷氨酰胺消耗之比是0.49。在整個7天期間谷氨酸濃度無顯著改變。按照實施例2檢驗了MDCK-T細胞支持ca/ts流感病毒復制的能力。表2所示結(jié)果表明MDCK-T細胞能支持ca/ts流感病毒復制，(病毒的)復制水平幾乎與MDCK-S細胞觀察到的相同。檢驗了68/9代和88/29代的MDCK-T細胞的核型。G帶染色體分析顯示細胞是狗來源。圖13顯示了IOO個分裂中期細胞中染色體數(shù)的分布。對于低代次68/9細胞，每個分裂中期(細胞)的染色體計數(shù)范圍是52-82條染色體，高代次81/24細胞是54-82條染色體，表明染色體分布未隨傳代而改變。然而，可以看到與MDCK-S細胞(70-84)相比，MDCK-T細胞顯示染色體數(shù)散布更廣(52-84)。檢驗了MDCK-TpreMCB中是否存在任何細菌、真菌或支原體污染。MDCK-Tpre-MCB經(jīng)無菌檢驗(采用直接接種方法檢查細菌和真菌污染的4種培養(yǎng)基的無菌檢驗)，發(fā)現(xiàn)不存在支原體(瓊脂可培養(yǎng)和非瓊脂可培養(yǎng)試驗)。在細菌抑制/真菌抑制檢驗和支原體抑制檢驗中均觀察到測試品不抑制陽性對照生長。將89/29代(pre-MCB+20次傳代)的MDCK-T細胞接種于裸小鼠進行3個月的致瘤性檢驗。在十分之六的樣品測試小鼠中診斷到注射部位有腺瘤發(fā)生。這表明在SFTaub培養(yǎng)基中生長的MDCK細胞有致瘤性。下表4總結(jié)了MDCK-S和MDCK-T細胞的致瘤性、估計的TP50及核型。實施例4在MediV無血清培養(yǎng)基中衍生無血清MDCK細胞實施例3詳述的結(jié)果證明雖然適應在無血清Taub培養(yǎng)基中生長的MDCK細胞(MDCK-T)具有優(yōu)秀的生長特征，并能支持ca/ts流感病毒株復制，但它們有致瘤性。因此，這些結(jié)果表明MDCK細胞可能在參考文獻報道的標準無血清培養(yǎng)基制劑中容易轉(zhuǎn)化。本發(fā)明開發(fā)了幾種其它無血清培養(yǎng)基制劑，檢驗了它們維持MDCK-S細胞非致瘤性本質(zhì)的能力。MDCK-S細胞適應于稱為MediVSFM101、102和103的各種新的無血清制劑。這些適應無血清的細胞系分別稱為MDCK-SFIOI、-SF102和-SF103，統(tǒng)稱為"MDCK-SF"。制備了適應MDCK-SF的各細胞系的PreMCB。檢驗了MDCK-SF細胞系preMCB的細菌/真菌污染和支原體污染(正等待最終結(jié)果)。也通過核型試驗檢驗了MDCK-SFpreMCB，MDCK-SF101和MDCK-SF102細胞的眾數(shù)染色體數(shù)是78，染色體數(shù)范圍分別是70-82和60-80。此外，從PreMCB小瓶再傳代各無血清培養(yǎng)基(細胞)庫的細胞至少20次，用成年裸小鼠體內(nèi)模型檢驗MDCK-SF103的核型和致瘤性。發(fā)現(xiàn)87代MDCK-SF103的眾數(shù)染色體數(shù)為78，范圍是66-80，可視作非致瘤性。#銀MDCK細胞(ATCC，目錄號CCL曙34，54代)；T-25、T-75、T-225培養(yǎng)瓶(Corning,目錄號430639、430641、431082);Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)粉末(Gibco，GrandIslandNY，制劑號01-5052EF);HamF12營養(yǎng)混合物粉末(Gibco，GrandIslandNY,目錄號21700-075);胎牛血清，經(jīng)Y-射線照射過(JRH，LenexaKS，目錄號12107-500M);L-谷氨酰胺(JRH，LenexaKS，目錄號59202-100M);D-葡萄糖(Amresco，目錄號0188-1KG);無Ca2lBMg2+的Dulbecco磷酸緩沖鹽水(DPBS)粉末(Gibco，GrandIsandNY，目錄號21600-069);胰島素粉末(Serological,目錄號4506);轉(zhuǎn)鐵蛋白(APO形式)(Gibco,GrandIslandNY,目錄號11108-016);前列腺素El(Sigma，St.LouisMS,目錄號P7527);氫化可的松(Mallinckrodt,目錄號8830(-05));碘塞羅寧(Sigma,St.LouisMS,目錄號T5516);鈉硒(SodiumSelenium)(EMD，目錄號6607-31);0,05%胰蛋白酶曙EDTA(Gibco，GrandIslandNY，目錄號25300);利馬豆胰蛋白酶抑制劑(Worthington,目錄號LS002829);二甲基亞砜，DMSO(Sigma,St.LouisMS,目錄號D2650);PBS配制的0.4%w/v臺盼藍染料(Sigma,St.LouisMS，目錄號T8154);改進的Neubaurr血細胞計數(shù)器(HausserScientific,Brightline0.1mm深/Reichert，Brightline0.1mm深)；YSI生物分析儀(YSI，型號2700select);體外化學系統(tǒng)(Orthoclinic,DT60II型)。紀煮^Me^T無逾慮潛養(yǎng)基rMeWr；02浙70J):如下所示，各MediV無血清培養(yǎng)基制劑利用Taub培養(yǎng)基(參見以上實施例2的方法章節(jié))作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基并加入了補充物MediVSFM10hTaub+2.5g/L購自O(shè)rganoTechine的小麥蛋白胨El(目錄號19559)。小麥蛋白胨E1以除菌的250g/L儲備水溶液保存。MediVSFM102:Taub+100X購自GIBCOBRL的化學成分明確的脂質(zhì)濃縮液(目錄號11905)，加入至終濃度為IX。MediVSFM103:Taub+1X購自GIBCO的終濃度脂質(zhì)濃縮液+2.5g/L購自O(shè)rganoTechnie的小麥蛋白胨El。MediSFM跳Taub+1X購自GIBCO的終濃度脂質(zhì)濃縮液+2.5g/L購自O(shè)rganoTechnie的小麥蛋白胨El+0.01一mLEGF(多種來源)。MediSFM105:無轉(zhuǎn)鐵蛋白的Taub+1X購自GIBCO的終濃度脂質(zhì)濃縮液+2.5g/L購自O(shè)rganoTechnie的小麥蛋白胨El+0.01ug/mLEGF+比例介于10:1和70:1之間的檸檬酸鐵銨托酚酮或硫酸鐵銨托酚酮。伊MDC/C-S激激適i^無逾獰游MgAF潛養(yǎng)基劍^/:用含4.5g/L葡萄糖、2.2g/LNaHC03和4mML-谷氨酰胺的10%FBSDMEM培養(yǎng)基將得自ATCC的一冷凍管MDCK細胞培養(yǎng)傳代5次(如上所述)，然后接種入MediVSFM培養(yǎng)基制劑(MediVSFM101、MediVSFM102或MediVSFM103)。通過胰蛋白酶消化回收T-75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的血清MDCK。除去消耗的生長培養(yǎng)基，用DPBS(無鈣和鎂)洗滌細胞單層兩次，然后棄去DPBS。加入合適量的預溫胰蛋白酶-EDTA(3mL/T-75)，T-培養(yǎng)瓶在37°C，5%(302培養(yǎng)箱中培育約15分鐘。用手掌拍打培養(yǎng)瓶幾次以使細胞完全脫離。加入等體積的利馬豆胰蛋白酶抑制劑中和胰蛋白酶，取兩份樣品測定細胞懸液中細胞的濃度。然后將1.75乂106個細胞在新鮮丁75培養(yǎng)瓶中稀釋到35mL所需的MediVSFM培養(yǎng)基制劑。將培養(yǎng)瓶置于維持在5%C02、37±1。C的細胞培養(yǎng)箱中。細胞在接種后亞培養(yǎng)3天，或在第3天更換為完全培養(yǎng)基，然后在接種后第4天亞培養(yǎng)。采用上述相同的方法細胞或許能適應MediVSF104和MediVSF105。f潛養(yǎng)適應Me^T潛養(yǎng)^游MDC尺激戲:除去消耗的生長培養(yǎng)基，用DPBS(無鈣和鎂)洗滌細胞單層兩次。加入合適量的預溫胰蛋白酶-EDTA(3mL/T-75，7.5mL/T-225)，T-培養(yǎng)瓶在37。C，5%C02培養(yǎng)箱中培育約15分鐘。用手掌拍打燒瓶幾次以使細胞完全脫離。然后加入等體積的利馬豆胰蛋白酶抑制劑(3mL/T-75，7.5mL/T-225)抑制胰蛋白酶。用大小合適的移液管上下抽吸細胞懸液使之均勻。取兩份0.5mL細胞懸液樣品作細胞計數(shù)。如果兩次計數(shù)的結(jié)果彼此相差不在15%以內(nèi)，重復細胞計數(shù)。計數(shù)后，在新的培養(yǎng)瓶中用新鮮的預溫MediVSFM培養(yǎng)基制劑將細胞稀釋至0.05X1(^個活細胞/mL，總體積為35mL/T75或100mL/T-225。然后在37±1°C，5%C02環(huán)境中培育培養(yǎng)瓶。細胞于第3天在新T培養(yǎng)瓶中亞培養(yǎng)(如下所述)，或更換為完全培養(yǎng)基，于接種后第4天在新T培養(yǎng)瓶中亞培養(yǎng)培養(yǎng)物。注意MDCK-SF細胞一直在它們要適應的同樣MediVSFM培養(yǎng)基制劑中亞培養(yǎng)。劍備適應Me,WM錄養(yǎng)基劍^/游MDC《潘應JVeMC丑庫:如以上實施例1所述制備適應無血清的MDCK細胞系的前原始細胞庫，除了2X冷凍培養(yǎng)基是合適的MediVSFM培養(yǎng)基制劑+15%DMSO外。獰,鑒定適應MeAFSFM潛養(yǎng)皋游MDC^MDC尺-SF)潘應:按照本文(例如實施例2)所述的方法檢驗MDCK-SFpreMCB的核型、無菌和支原體，除了利用合適的MediVSFM培養(yǎng)基制劑替代含血清的完全培養(yǎng)基外。此外，如實施例2所述檢測了T-75培養(yǎng)瓶中MDCK-SF細胞的生長曲線特征和MDCK-SF細胞中冷適應流感病毒株的復制情況，除了利用合適的MediVSFM培養(yǎng)基制劑替代含血清的完全培養(yǎng)基外。此外，如以上實施例2所述，通過商業(yè)承包者(例如，BioReliance)對傳代額外次數(shù)(例如，pre-MCB+20次傳代)的MDCK-SF細胞進行致瘤性研究。結(jié)果與討論檢驗了71/9代的MDCK-SF101和MDCK-SF102細胞和87代的MDCK-SF103細胞的細胞核型。圖14顯示了100個分裂中期MDCK-T、MDCK-SF101和MDCK-SF102細胞中染色體數(shù)的分布，圖19顯示了MDCK-SF103細胞中染色體數(shù)的分布。可以看到與MDCK-SF101、MDCK-SF102或MDCK-SF103細胞(染色體數(shù)分別是70-82、60-80和66-80)相比，MDCK-T細胞顯示染色體數(shù)散布更廣(52-84)。MDCK-SF101、MDCK-SF102和MDCK-SF103細胞中染色體數(shù)的散布更接近非致瘤性MDCK-S血清培養(yǎng)的細胞中所見的(70-84)，這表明MediVSFIOI、MediVSF102和MediVSF103培養(yǎng)基制劑能更好地維持在這些制劑中生長的MDCK細胞的正常染色體數(shù)。圖16顯示了MDCK-SF103細胞在MediVSF103培養(yǎng)基中的代表性初級生長曲線。MDCK-SF103細胞具有約l天的延滯期。細胞處于指數(shù)生長期直至第4天，此時它們進入穩(wěn)定期。指數(shù)期間(第0天到第4天)它們利用葡萄糖和谷氨酰胺(圖17和18)，同時產(chǎn)生乳酸和氨。葡萄糖消耗/乳酸產(chǎn)生速率與細胞生長曲線良好相關(guān)(參見圖16和17)。在接種后約第4天達到最大細胞密度約17X106。細胞密度在穩(wěn)定期不降低，維持相當恒定直至第7天。谷氨酰胺消耗速率和氨產(chǎn)生速率類似于MDCK-SF103細胞的生長和葡萄糖/乳酸狀況(參見圖18)。氨產(chǎn)生線性增加直至第7天，而在7天期間谷氨酸濃度無明顯改變。按照以下實施例7所述檢驗了MDCK-SF103細胞支持幾種重配流感病毒復制的能力。圖20A所示結(jié)果表明MDCK-SF103細胞能支持測試的各流感病毒株的復制。如上所述，將MDCK-SF103細胞接種于裸小鼠進行3個月的致瘤性檢驗。測試制品在成年裸小鼠模型(RioReliance研究號AB09EU.001000.BSV)中認為無致瘤性。表4:MDCK細胞在不同培養(yǎng)基中傳代的致瘤性和核型<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>ND:未做實施例5感染培養(yǎng)的人上皮細胞為評估MDCK和雞蛋產(chǎn)生的疫苗在人源細胞中復制后的生物化學、生物學和結(jié)構(gòu)相似性，將疫苗在相關(guān)的人二倍體細胞，例如正常人支氣管上皮細胞(NHBE)中傳代一次。該次傳代用于模擬人氣道中的一次感染，從而能比較子代病毒(最終負責引發(fā)有效免疫應答的病毒)。對這些材料進行疫苗的血凝素(結(jié)合與融合的)和神經(jīng)氨酸酶活性研究，也評估了其它生物化學和結(jié)構(gòu)研究，包括電子顯微鏡、傳染性顆粒與總顆粒之比和病毒基因組等價物?？傊?，這些比較用于證明細胞衍生的疫苗與有效且安全的雞蛋生產(chǎn)疫苗具有可比性。商業(yè)承包者(例如，BioReliance,Rockville,MD)可常規(guī)實施本領(lǐng)域熟知方法來檢驗細菌和真菌污染的存在。表5總結(jié)了可實施的分析研究。表5:初步研究比較細胞生產(chǎn)的和雞蛋生產(chǎn)的疫苗<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>實施例6.原始細胞庫的產(chǎn)生、檢驗和特征鑒定為制成原始細胞庫(MCB)，可通過有限稀釋法生物學克隆上述一個或多個preMCB(參見，實施例2-4)細胞以確保產(chǎn)生的細胞衍生自唯一的遺傳組成(geneticconstellation)。然后篩選各克隆的各種表型，包括倍增時間和相對致瘤性以及病毒產(chǎn)量。在此概念實驗(conceptexperiment)的最初證據(jù)中，在含F(xiàn)CS的培養(yǎng)基中獲得54個MDCK克隆。傳代這些克隆，用低感染復數(shù)的ca甲型/新喀里多尼亞/20/99感染各克隆。感染幾天后，取出上清液，通過TCID5o檢測上清液中的病毒量。少數(shù)克隆產(chǎn)生的病毒滴度高于未克隆的親代細胞產(chǎn)生的。利用生物學和生理學特性優(yōu)秀的克隆建立原始細胞庫(MCB)。進一步檢驗MCB以確保沒有偶然物質(zhì)的證據(jù)。例如，進行幾種利用病毒物質(zhì)的PCR和/或抗體特異性檢驗的一種或多種，如下表6所示。表6:MCB的檢驗方案通用檢驗<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>實施例7.疫苗材料的方法和配制采用與生產(chǎn)目前批準的脊髓灰質(zhì)炎疫苗所用技術(shù)類似的可擴大規(guī)模的微載體技術(shù)，將其應用于在MDCK細胞中生產(chǎn)流感病毒。葡聚糖制成的球形珠能支持MDCK細胞在2-10L生物反應器中良好生長。發(fā)現(xiàn)在SFMV103中生長的親代MDCK細胞能在兩種轉(zhuǎn)瓶中以分批方式在Cytodex1微載體上生長至密度為2Xl(^個核/mL，MDCK細胞在最高10L規(guī)模的生物反應器中能生長至>lXl()S個細胞/mL(數(shù)據(jù)未顯示)。最初的中試規(guī)模運作證明這些MDCK細胞以無血清方法能產(chǎn)生高滴度的疫苗流感病毒株，發(fā)現(xiàn)該滴度等于或大于T-培養(yǎng)瓶中利用血清培養(yǎng)細胞獲得的生產(chǎn)力。如圖20A所示，250mL轉(zhuǎn)瓶中Cytodex珠中生長的MDCK細胞產(chǎn)生了高滴度的H1N1、H3N2和乙型疫苗毒株。對于臨床生產(chǎn)，可以20L或150L規(guī)模在MDCK細胞中生產(chǎn)流感病毒，而對于商品化規(guī)模，可利用2,500L生物反應器進行生產(chǎn)。圖20B概述了可用于將細胞培養(yǎng)規(guī)模放大至商品化生產(chǎn)水平的一種方法。首先將工作細胞庫依次從T-75培養(yǎng)瓶放大至T-225培養(yǎng)瓶，再放大至l升轉(zhuǎn)瓶，再到20升，再到300升生物反應器，最后放大至2500升生物反應器。當獲得最佳細胞密度時，用原始病毒株接種培養(yǎng)細胞。然后從培養(yǎng)上清液中大量收集病毒。細胞培養(yǎng)的流感疫苗的純化方法模仿雞蛋的流感疫苗的純化方法(參見，例如PCT公布WO05/014862和2005年10月4日提交的PCT專利申請PCT/US05/035614)。從細胞中純化病毒疫苗材料可包括以下任一種或所有方法均漿、離心澄清、超濾、吸附到硫酸鋇上并洗脫、正切線流過濾、密度梯度超離心、層析和除菌過濾。也可包括其它純化步驟。例如，首先通過離心(如1000-2000Xg)足夠時間(如10-30分鐘)除去細胞碎片和其它大的顆粒物質(zhì)從而澄清受感染培養(yǎng)物的粗制培養(yǎng)液?；蛘?，培養(yǎng)基經(jīng)0.8pm醋酸纖維素濾膜過濾以除去完整的細胞和其它大的顆粒物質(zhì)。然后任選離心(如15,000Xg，約3-5小時)澄清的培養(yǎng)基上清液以沉淀流感病毒。將病毒沉淀物重懸在合適緩沖液，例如pH7.4的STE(0.01MTris-HCl;0.15MNaCl;0.0001MEDTA)或磷酸緩沖鹽水(PBS)中后，可利用蔗糖(60%-12%)或酒石酸鉀(50%-10%)密度梯度離心濃縮病毒。連續(xù)或分步梯度(例如介于12%-60%之間的蔗糖梯度分成四個12%步驟)均合適。以某速度離心各梯度充足時間以使病毒濃縮成回收的可見條帶。或者，對于最大規(guī)模商品化應用，利用以連續(xù)方式操作的區(qū)帶離心機轉(zhuǎn)頭密度梯度離心淘選病毒。純化細胞的病毒疫苗材料包括的特征是在(純化)方法的早期利用Benzonase⑧，一種非特異性核酸內(nèi)切酶。雖然根據(jù)評估細胞DNA致瘤性的研究，MDCK細胞DNA不具有致瘤危險，但Benzonase③處理實際上能消除任何潛在的或假設(shè)的風險。在一種純化方法中，Benzonase處理后，通過直接流體過濾(DFF)也能除去散裝材料中任何殘留的完整哺乳動物細胞而澄清材料。然后通過正切線流過濾(TFF)濃縮過濾后的散裝液，然后進行其它純化步驟。包括已良好用于其它病毒系統(tǒng)的親和層析以及離子交換層析和/或羥基磷灰石層析在內(nèi)的純化方法可用于細胞培養(yǎng)流感疫苗的生產(chǎn)。然后利用所開發(fā)的方法獲得的高度純化病毒材料生產(chǎn)疫苗材料。例如，為用于減毒活疫苗生產(chǎn)(如FluMist),可采用過濾更換病毒材料的緩沖液制成最終制劑，然后經(jīng)除菌步驟。用于這種制劑的緩沖液是含有氨基酸賦形劑，例如精氨酸和200mM蔗糖的pH7.0-7.2的磷酸鹽或組氨酸緩沖液。如果需要穩(wěn)定化，也可加入蛋白水解物，例如豬明膠。將疫苗材料配制為長期保存穩(wěn)定的制劑是理想的?？捎糜谘娱L保存時間的一種方法是噴霧干燥，一種在干熱空氣流下將制劑料液噴霧霧化成細小液滴的快速干燥方法。細小液滴蒸發(fā)得到溶質(zhì)構(gòu)成的干粉(參見，例如美國專利公布2004/0042972)。與常規(guī)的凍干方法相比，噴霧干燥的優(yōu)點是易于放大和生產(chǎn)成本(低)。或者，可采用本領(lǐng)域已知的方法將疫苗材料配制為冷藏穩(wěn)定液體制劑。例如，2005年10月4日提交的PCT專利申請PCT/US2005/035614描述了配制冷藏穩(wěn)定的減毒流感疫苗的方法和組合物?？稍诩兓桨钢屑尤胩卣麒b定步驟來監(jiān)測生產(chǎn)?？刹捎玫奶卣麒b定步驟包括但不限于熒光聚焦試驗(FFA，參見例如上文)，該試驗采用簡單的抗體結(jié)合與熒光染色方法來測定病毒傳染力?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員己知的許多方法測定總蛋白和DNA來測定最初雜質(zhì)的殘留百分比。可通過計算單位劑量疫苗的病毒傳染力(例如，傳染力/mg)來測定該制劑的比活性。實施例8.臨床前動物模型雪貂是用于評估減毒流感疫苗和組成疫苗的病毒株的減毒程度和免疫原性的可靠動物模型。MCB生產(chǎn)的細胞衍生流感病毒株的性能與雞蛋生產(chǎn)的相同毒株作比較。在受控研究中直接比較這些材料能高標準地確保這些病毒產(chǎn)物的可比性。為評估兩種疫苗感染或?qū)崿F(xiàn)"進入"雪貂的能力，輕度麻醉雪貂后鼻內(nèi)接種細胞或雞蛋生產(chǎn)的病毒制品。接種后，在幾個時間點收集鼻洗滌液，采用幾種可用方法之一評估病毒量來評估在雪貂上呼吸道中病毒復制的動力學和水平。用各種劑量進行實驗包括多種毒株和不同的三價混合物來歸納細胞培養(yǎng)生產(chǎn)病毒株與雞蛋生產(chǎn)病毒株的相對傳染力。也采用這些相同的研究來評估流感病毒株的免疫原性，這是與病毒初始感染能力天然相關(guān)的特性。在接種后各時間點(周)對動物放血并收集鼻洗滌液；利用這些樣品評估針對感染的血清抗體應答和鼻IgA應答?？衫眠@些數(shù)據(jù)、傳染力、血清抗體和粘膜抗體應答的峰值來比較和評估細胞生產(chǎn)疫苗與雞蛋生產(chǎn)疫苗的相對傳染力。預計最可能的結(jié)果是細胞和雞蛋生產(chǎn)的疫苗毒株具有相似的傳染力和免疫原性。如果細胞生產(chǎn)的疫苗比雞蛋生產(chǎn)的疫苗顯示更高的傳染力或更高的免疫原性，則作進一步研究來評估降低劑量的可能性。在雪貂模型中進行了許多免疫原性和復制研究來評估一個單位人用劑量的細胞培養(yǎng)生產(chǎn)疫苗的效力。用C"/^^"病毒株感染通常能在雪貂中引發(fā)強烈且快速的抗體應答。此外，常規(guī)檢驗了各ca/"A^病毒株，這些病毒株顯示通過在這些雪貂的鼻咽中復制達到較高滴度但在肺中的水平檢測不到而表現(xiàn)出減毒(fl")的表型。也評估了這些細胞培養(yǎng)物生長對這些生物學特性的影響。然而，因為fl"表型是這些病毒株遺傳組成的固有部分，不可能觀察到任何差異。將一份人用劑量給予這些雪貂后，評估了這些病毒株的生長動力學和交叉反應性。用雞蛋衍生材料生產(chǎn)的減毒活疫苗可引發(fā)能與某遺傳譜系內(nèi)多種病毒株交叉反應的血清抗體；估計細胞衍生的疫苗具有相同能力。這些可比性評估可有效了解初級病毒產(chǎn)品可能的生物化學和/或生物物理學差異，通過將病毒在人細胞中首次傳代或動物研究檢測證明這些遺傳外差異對ca/^/a"病毒株性能的影響。根據(jù)目前的序列信息，用MDCK細胞生產(chǎn)估計不會影響cfl/^A^病毒株的免疫原性性能。雪貂是經(jīng)充分證明的流感動物模型，慣常用于評估c"/to^"病毒株的減毒表型和免疫原性。一般利用8-10周齡的雪貂來評估減毒性能，通常研究設(shè)計評估每個測試或?qū)φ战Mn=3-5只雪貂。利用8周齡-6月齡的雪貂進行免疫原性研究，通常每種測試品或?qū)φ战M需要11=3-5只雪貂。這些數(shù)量可提供足夠的信息從而能獲得各組之間統(tǒng)計學有效或在觀察上至關(guān)重要的比較。大多數(shù)研究觀察到流感樣癥狀，但不一定。雪貂不表現(xiàn)出食欲或體重降低、鼻或眼排出物；觀察到流感樣疾病癥狀是該研究的必需部分，不許使用諸如鎮(zhèn)痛劑干預。與主治獸醫(yī)討論后合適處置有其它不適癥狀，例如開放性潰瘍或體重明顯喪失的雪貂。雖然參考具體實施方式公開了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可設(shè)計出本發(fā)明的其它實施方式和變化形式而不脫離本發(fā)明的真實構(gòu)思和范圍。附加的權(quán)利要求書應解釋為包含了所有這些實施方式及等價變化形式。例如，可以各種組合使用上述所有技術(shù)和設(shè)備。如同每份出版物、專利、專利申請或其它文獻單獨表明出于所有目的納為參考的程度一樣，本申請引用的所有出版物、專利、專利申請或其它文獻出于所有目的全文納為參考。此外，2004年12月23日提交的美國臨時申請?zhí)?0/638,166和2005年1月5日提交的60/641,139出于所有目的全文納入本文作為參考。權(quán)利要求1.一種細胞培養(yǎng)組合物，其包含非致瘤性MDCK細胞，該細胞是細胞系MDCK(ATCCCCL34)的衍生物。2.如權(quán)利要求l所述的細胞培養(yǎng)組合物，其特征在于，所述組合物不含血清。3.如權(quán)利要求1所述的細胞培養(yǎng)物組合物，其特征在于，所述非致瘤性MDCK細胞是黏著的。4.如權(quán)利要求l、2或3所述的細胞培養(yǎng)組合物，其特征在于，所述非致瘤性MDCK細胞衍生自細胞系MDCK-S(ATCCPTA-6500)。5.如權(quán)利要求1所述的細胞培養(yǎng)組合物，其特征在于，所述非致瘤性MDCK細胞適應于在無血清培養(yǎng)基中生長。6.如權(quán)利要求5所述的細胞培養(yǎng)組合物，其特征在于，所述非致瘤性MDCK細胞來自以下細胞系MDCK-SF101(ATCCPTA-6501);MDCK-SF102(ATCCPTA-6502);和MDCK-SF103(PTA-6503)。7.—種生產(chǎn)流感疫苗的方法，所述方法包括a.感染如權(quán)利要求1或6所述細胞培養(yǎng)組合物中的MDCK細胞；b.培育所述細胞培養(yǎng)組合物；和c.從所述細胞培養(yǎng)物組合物中分離流感病毒。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述MDCK細胞是黏著的。9.一種用權(quán)利要求7所述方法生產(chǎn)的流感病毒。10.—種用藥學上可接受的載體或賦形劑配制的含權(quán)利要求9所述流感病毒多肽的免疫原性組合物。11.一種預防動物感染流感的方法，所述方法包括給予該動物如權(quán)利要求IO所述的免疫原性組合物。12.—種用如權(quán)利要求8所述方法生產(chǎn)的流感病毒。13.—種選自以下的非致瘤性MDCK細胞系MDCK-S(ATCCPTA-6500);MDCK-SFIOI(ATCCPTA-6501);MDCK-SF102(ATCCPTA-6502);和MDCK-SF103(ATCCPTA-6503)。14.一種制備黏著的非致瘤性MDCK細胞系的方法，該細胞系能用含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)以及能被流感病毒感染，所述方法包括以下步驟a.使MDCK(ATCCCCL34)細胞適應于在成分明確的培養(yǎng)基和血清中生長；b.維持生長條件；和c.建立細胞庫。15.—種通過權(quán)利要求14所述方法制備的細胞系。16.—種制備黏著的非致瘤性MDCK細胞系的方法，該細胞系能用無血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)以及能用流感病毒感染，所述方法包括以下步驟a.使MDCK(ATCCCCL34)細胞適應于在選自以下的無血清培養(yǎng)基中生長含有脂質(zhì)的TaubSF;含有小麥水解物的TaubSF;含有脂質(zhì)和小麥水解物的TaubSF;含有脂質(zhì)、小麥水解物和EGF的TaubSF;和含有脂質(zhì)、小麥水解物、EGF、托酚酮但不含轉(zhuǎn)鐵蛋白的TaubSF;b.維持生長條件；和c.建立細胞庫。17.—種通過如權(quán)利要求16所述方法制備的細胞系。18.—種選自以下的培養(yǎng)基制劑MediVSF101;MediVSF102;MediVSF103;MediVSF104和MediVSF105。19.一種維持動物細胞非致瘤特性的方法，所述方法包括在如權(quán)利要求18所述的培養(yǎng)基中培育所述動物細胞。全文摘要本發(fā)明提供MDCK衍生的、新的黏著的非致瘤性細胞系，所述細胞系能在有或沒有血清存在下生長。本發(fā)明細胞系可用于生產(chǎn)疫苗材料(例如，病毒)。更具體地說，本發(fā)明細胞系通?？捎糜谏a(chǎn)流感病毒，特別是ca/ts流感病毒。本發(fā)明還提供使MDCK細胞適應和生長的方法和培養(yǎng)基制劑從而使其維持非致瘤性。此外，本發(fā)明提供用本發(fā)明新型細胞系生產(chǎn)疫苗材料(例如，流感病毒)的方法。文檔編號C12N5/00GK101189326SQ200580048006公開日2008年5月28日申請日期2005年12月16日優(yōu)先權(quán)日2004年12月23日發(fā)明者A·薩布拉馬尼安,J·M·貝瑞,R·施瓦茨,X·施申請人:米迪繆尼疫苗股份有限公司