分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖及其制備方法和其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬于多糖領(lǐng)域。本發(fā)明涉及分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖及其制備方法和其應(yīng)用。本發(fā)明以水或水醇溶液為介質(zhì)，用堿性溶液提取茯苓粉中的茯苓多糖成為茯苓多糖堿提取液。氯乙酸與適當(dāng)過(guò)量的堿性溶液中和后，與茯苓多糖堿提取液混勻，在30℃至90℃逐步升溫的條件下合成分子量分布廣泛(0.6×104至2.0×106道爾頓)的羧甲基取代度大于1.000的羧甲基茯苓多糖。用超濾法分離純化分子量0.6×104至1.0×106道爾頓的組分，優(yōu)選應(yīng)用作為口服制劑的原料；分離純化分子量1.0×106以上至2.0×106道爾頓的組分，優(yōu)選應(yīng)用作為注射制劑的原料。本發(fā)明的制備方法為液相不振蕩工藝，無(wú)需振蕩設(shè)備，且具有簡(jiǎn)便、省料、節(jié)能、環(huán)保等特點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】
分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖及其制備方法和其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于多糖領(lǐng)域，尤其涉及作為新型抗腫瘤生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(BRM)的分子量 分布廣泛的羧甲基茯苳多糖(Carboxymethylpachymaran，CMP)及其制備方法和其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 茯苓為多孔菌科真菌茯苓[Poria C0C0S(SChw.)W0lf]的干燥菌核，自古為傳統(tǒng)中 藥"四君八珍"之一，具有"利水滲濕、健脾寧心"的功效，所含成分茯苓多糖具有β(1-3)結(jié) 合的葡萄糖苷線性結(jié)構(gòu)和β(1-6)結(jié)合的葡萄糖苷支鏈的結(jié)構(gòu)。試驗(yàn)表明，未經(jīng)化學(xué)改性的 茯苓多糖沒(méi)有抗腫瘤活性，茯苓在沸水中的煎煮得率不超過(guò)2%。經(jīng)過(guò)化學(xué)改性后生成的羧 甲基茯苓多糖具有水溶性，利于人體的吸收，而且羧甲基茯苓多糖能誘生與促誘生人血淋 巴細(xì)胞產(chǎn)生干擾素 _α (IFN-α)、干擾素 -γ (IFN- γ )、白細(xì)胞介素-2 (IL-2)、白細(xì)胞介素-6 (IL-6)，腫瘤壞死因子-a(TNF-a)、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)等多種細(xì)胞活性因 子，具有增強(qiáng)免疫、抗腫瘤（主要通過(guò)增強(qiáng)免疫功能和激活免疫監(jiān)視系統(tǒng)來(lái)發(fā)揮抗腫瘤活 性）、抗病毒、抗放射、保肝、改善睡眠、降血糖、抗衰老等藥理學(xué)活性，可廣泛用于腫瘤手術(shù) 后的免疫治療，也可用于腫瘤放化療的輔助治療，顯著增強(qiáng)惡性腫瘤患者的免疫功能，減少 和消除放化療的副反應(yīng)，增強(qiáng)腫瘤患者的免疫功能，促進(jìn)腫瘤患者食欲，改善腫瘤患者睡 目民，提高腫瘤患者的生存質(zhì)量與延長(zhǎng)生命。
[0003] 已有試驗(yàn)證明：羧甲基茯苓多糖按13.2g/kg劑量給小鼠灌胃，無(wú)急性毒性反應(yīng);羧 甲基茯苓多糖按〇. 22-1.73g/kg劑量(所用劑量為人臨床劑量的180倍)給大鼠灌胃12周，無(wú) 毒副反應(yīng)，連續(xù)用藥3個(gè)月安全;毒理試驗(yàn)也證明，羧甲基茯苓多糖無(wú)致突變、致畸胎的結(jié) 果。
[0004] Hamuro等人（1971年)采用異丙醇與水為介質(zhì)，在液固相振蕩條件下合成制取羧甲 基茯苓多糖，因需大型振蕩設(shè)備，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，且需要大量的有機(jī)溶劑(如乙醚、甲 醇、丙酮、醋酸和乙醇)對(duì)羧甲基茯苓多糖進(jìn)行后處理及純化，不僅生產(chǎn)成本較高，還造成環(huán) 境污染。
[0005] 石清東等人（1996年）以乙醇與水為介南，采用在液固相攪拌條件下合成制取羧甲 基茯苓多糖，所制取的羧甲基茯苓多糖的羧甲基取代度(D · S)為0.92,表現(xiàn)為產(chǎn)品的溶解 度較小，雜質(zhì)質(zhì)量較高，以NaCl計(jì)，含氯化物％ <3.0% ;以Pb計(jì)，重金屬％ <0.002%，且較 難分離除去所含雜質(zhì)，大大限制了所研制的羧甲基茯苓多糖的制劑應(yīng)用和臨床應(yīng)用范圍， 如該法制取的羧甲基茯苓多糖不能用于制備注射劑。
[0006] 因此，制備分子量分布廣泛的羧甲基取代度(D · S)大于1.000的羧甲基茯苓多糖， 以提高其溶解度和拓寬其制劑應(yīng)用和臨床應(yīng)用范圍，成為人們迫切需要解決的技術(shù)問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖的制備方法，包括如下步 驟：1)茯苓粉加入到水或水醇混合液中，攪拌均勾后，加入2.0-8. Omol/L的堿性溶液，攪拌 至完全溶解，得茯苓多糖堿化液;2) 1.0-10m〇l/L氯乙酸與適當(dāng)過(guò)量的2.0-10m〇l/L堿性溶 液，充分反應(yīng)后，加入到1)步所得的茯苓多糖堿化液中，在30°C至90°C逐步升溫的條件下合 成反應(yīng)，分離純化生成的羧甲基茯苓多糖，即得。
[0008] 上面近述羧甲基茯苓多糖的分子式為(C6H1Q〇5)n，可由本領(lǐng)域熟知的方法推斷得， 用喊化提取法制得的茯等多糖喊化提取液，相當(dāng)于1)步制得的茯等多糖喊化液;或喊提取 酸沉淀法制得的茯苓多糖粗品，再進(jìn)一步堿化。
[0009] 上面所述堿化提取法是指:茯苓粉加入濃度為2.0-8.0m〇l/L或3.0-8.0m 〇l/L的堿 性溶液攪拌提取，壓濾分離，取濾液，即得茯苓多糖堿化提取液。
[0010] 上面所述堿提取酸沉淀法是指:茯苓粉加入濃度為2.0-3.0m〇l/L或3.0-4.0m 〇l/L 的堿性溶液攪拌提取，壓濾分離，取濾液;濾液加酸(如醋酸、鹽酸、硫酸或硝酸），得酸沉淀 物;沉淀物經(jīng)離心、水洗，即得茯苓多糖粗品。
[0011] 上面所述水醇溶液為本領(lǐng)域熟知的醇溶劑加水制得的溶液，所述醇溶劑選自甲 醇、乙醇、丙二醇的任一種或其組合。
[0012] 本發(fā)明所述堿性溶液由本領(lǐng)域熟知的堿性物質(zhì)加水溶解制得，所述堿性物質(zhì)選自 氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉或碳酸鉀的任一種或其組合，優(yōu)選氫氧化鈉或氫氧化鉀。
[0013] 進(jìn)一步，氯乙酸溶液的濃度為2 · 0-9 · 0m〇l/L，優(yōu)選為3 · 0-8 · 0m〇l/L，更優(yōu)選為5.0_ 7 · 0mol/L，最優(yōu)選為 5 · 5-6 · 5mol/L。
[0014] 進(jìn)一步，所述適當(dāng)過(guò)量是指堿性溶液中堿性物質(zhì)的實(shí)際用量比其與氯乙酸發(fā)生中 和反應(yīng)所需理論用量過(guò)量2.0-20%，優(yōu)選過(guò)量5-15%，更優(yōu)選過(guò)量6-12%，最優(yōu)選過(guò)量8-10%〇
[0015] 進(jìn)一步，2)步反應(yīng)液在30 °C至90 °C條件下進(jìn)行取代反應(yīng)3h至12h，優(yōu)選反應(yīng)溫度為 35 °C至85 °C，更優(yōu)選為40 °C至82 °C，最優(yōu)選為55 °C至80 °C ;優(yōu)選反應(yīng)時(shí)間為3h至12h，更優(yōu)選 為6h至10h。
[0016] 進(jìn)一步，所述分離是指在2)步反應(yīng)生成液中加入1.0-5.0m〇l/L的酸性溶液，調(diào)其 pH值5.0-7.0后，加入3-5倍體積的醇溶劑，析出羧甲基茯苓多糖粗品；所述醇溶劑選自甲 醇、乙醇、丙二醇的任一種或其組合。
[0017] 本發(fā)明所述酸性溶液由本領(lǐng)域熟知的酸性物質(zhì)加水溶解制得，優(yōu)選所述酸性物質(zhì) 選自醋酸、鹽酸、硫酸或硝酸的任一種或其組合，優(yōu)選為鹽酸或硝酸，最優(yōu)選為鹽酸。
[0018] 本發(fā)明合成反應(yīng)的原理為：（C6HiQ〇5)n+nClCH2⑶OH+nNaOH4(C8Hi2〇7)n+nNaCl + nH20，（ C6Hi〇〇5 )n+nC 1 OfcCOOH+nKOH- (C8Hi2〇7)n+nKC 1 +ηΗ20。
[0019] 由于合成反應(yīng)中氯乙酸與堿性溶液的濃度較高，存在氯乙酸與堿性物質(zhì)的其他副 反應(yīng)，生成一定量的氯化鈉、氯乙酸鈉、羥乙酸鈉、氯化鉀、氯乙酸鉀、羥乙酸鉀等小分子雜 質(zhì)。
[0020] 進(jìn)一步，所述純化是指羧甲基茯苓多糖粗品加水配成1.0-6.0 %或2.0-5.0 %或 3.0-4.0 %的水溶液，加入1.0-5.0m〇l/L的堿性溶液調(diào)pH值9.0-12.0，攪拌至羧甲基茯苓多 糖粗品完全溶解;加入30%H 2〇2溶液，其用量為溶解液總?cè)莘e的0.1%。-1.0%。，進(jìn)行脫色反 應(yīng);加入1.0-5.0mol/L的酸性溶液調(diào)pH值5.0-7.0，超濾去除分子量小于0.6 X 104道爾頓的 羧甲基茯苓多糖及其他小分子雜質(zhì)。
[0021] 進(jìn)一步，堿性溶液的濃度為1.0-4.0mol/L，優(yōu)選為1.5-3.5mol/L，更優(yōu)選為2.0- 3. Omol/L，最優(yōu)選為 2.5mol/L。
[0022] 進(jìn)一步，脫色反應(yīng)的溫度為10°C-70°C，優(yōu)選為15°C-60°C，更優(yōu)選為20°C-50°C。脫 色反應(yīng)的時(shí)間根據(jù)脫色反應(yīng)的完成程度而定，通常為2h至48h，優(yōu)選為5h至40h，更優(yōu)選為 1011至3011，最優(yōu)選為1511至2011。
[0023] 進(jìn)一步，酸性溶液的濃度為1.0-9. Omol/L，優(yōu)選為2.0-8. Omol/L，更優(yōu)選為3.0_ 7 · 0mol/L，最優(yōu)選為 4 · 0-6 · 0mol/L。
[0024] 進(jìn)一步，所述超濾是用DH-UF中空纖維超濾器進(jìn)行超濾。
[0025] 根據(jù)實(shí)際需要，可對(duì)反應(yīng)生成的分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖進(jìn)行分級(jí)分離 純化，以提高其純度。
[0026] 進(jìn)一步，所述分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖的羧甲基取代度（D · S)大于 1.000。
[0027] 進(jìn)一步，分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖分子量分布為0.6 X 104至2.0 X 106道 爾頓。采用超濾器可分離純化為〇 . 6 X 104至1.0 X 106道爾頓與1.0 X 106以上至2.0 X 106道 爾頓的2個(gè)組分。
[0028] 進(jìn)一步，兩個(gè)組分的羧甲基茯苓多糖的聚合度(η)分別為28至4546與4546至9091。 [0029]本發(fā)明通過(guò)提高氯乙酸和堿性水溶液的反應(yīng)濃度，以增加堿化茯苓多糖同氯乙酸 鈉或氯乙酸鉀的有效碰撞，加快羧甲基化反應(yīng)速率，并提高羧甲基茯苓多糖的羧甲基取代 度(D · S)〇
[0030]應(yīng)用本發(fā)明制備方法得到分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖的羧甲基取代度 (D · S)大于1.000,明顯提高其溶解度，減少純化過(guò)程中醇溶劑的用量和殘留在廢水中的醇 溶劑量，大大降低生產(chǎn)成本，利于環(huán)境保護(hù)。
[0031 ]本發(fā)明的制備方法為液相不振蕩工藝，無(wú)需振蕩設(shè)備，方便實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，具有 簡(jiǎn)便、省料、節(jié)能、環(huán)保等特點(diǎn)。
[0032] 本發(fā)明所制備的產(chǎn)品，分子量分布0.6 X 104至1 .OX 106道爾頓的組分優(yōu)選應(yīng)用作 為口服制劑的原料，分子量1.0X106以上至2.0X10 6道爾頓的組分優(yōu)選作為注射制劑的原 料。
[0033] 此外，回收反應(yīng)廢液和超濾的醇溶劑可循環(huán)用于生產(chǎn)。加入適量新配制的石灰水 到回收醇溶劑的廢液中，將其分子量小于0.6Χ10 4道爾頓的羧甲基茯苓多糖、氯乙酸鈉、羥 乙酸鈉、氯乙酸鉀、羥乙酸鉀與石灰水生成鈣鹽沉淀，過(guò)濾回收或除去鈣鹽沉淀，而電解處 理廢液中所含的少量氯化鈉、氯化鉀，使其達(dá)到排放要求，以減少環(huán)境污染和降低生產(chǎn)成 本。
[0034] 本發(fā)明采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖的相對(duì)分子量范 圍，采用酸洗法或酸化法測(cè)定其取代度。酸洗法的具體測(cè)定過(guò)程參見(jiàn)Bolhuis Gerad Κ， Arends-Scholte Anna ff,Stuut Gerrit J，etaldisintegration Efficiency of Sodium Starchglycolates Prepared from Different Native Starchs[J]，Eur J Pharm，1994， 40(5):317-320.
[0035] 本發(fā)明的另一目的是提供一種分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖，其制備方法如 前所述。
[0036] 上述所述口服制劑選自口服液、片劑、膠囊、顆粒劑、丸劑、散劑、糖漿劑、合劑。所 述注射劑選自針劑(注射液）、輸液或凍干粉針等?？刹捎帽绢I(lǐng)域熟知的制劑技術(shù)手段制備 得到本發(fā)明的組合物。
[0037] 除非另有說(shuō)明，本發(fā)明所述百分含量均為重量百分含量;所述分子量均為相對(duì)分 子量，其單位均為道爾頓。
[0038] 本發(fā)明所制備的分子量0.6X104至1.0X106道爾頓的羧甲基茯苓多糖可優(yōu)選作為 口服制劑的原料。其日用劑量、日服次數(shù)和服用周期可根據(jù)患者的病情、年齡、性別、體質(zhì)和 其他用藥情況等綜合因素而定。成年人通常日用劑量為300mg-1000mg/日，優(yōu)選為450mg-850mg/日，最優(yōu)選為600mg/日。服用次數(shù)為1-4次/日或2-3次或3次/日。通常連續(xù)用藥4周為 1個(gè)療程，可顯著提高腫瘤患者的T 4/T8比值和自然殺傷(NK)細(xì)胞的活性，協(xié)同殺死、殺傷惡 性腫瘤細(xì)胞，抑制惡性腫瘤的發(fā)展與轉(zhuǎn)移，還可改善各種腫瘤病人的食欲。
[0039] 本發(fā)明所制備的分子量1.0Χ106以上至2.0Χ106道爾頓的羧甲基茯苓多糖可優(yōu)選 應(yīng)用作為注射劑的原料。所制備的注射劑比口服劑更為速效。成年人臨床用藥劑量為30mg_ 180mg/日，優(yōu)選60mg-150mg/日，每日1次，連用7日為1個(gè)療程。
【附圖說(shuō)明】
[0040] 圖1，已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)多糖Dexfran按Ka.V對(duì)數(shù)Log Mw作圖的分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線； [00411圖2，本發(fā)明制得分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖在SephadexG-200層析柱上的 洗脫曲線，根據(jù)測(cè)得的Ka. V值，求得其分子量為0.6 X 104至2.0 X 106道爾頓。
[0042]圖3,本發(fā)明合成反應(yīng)的原理示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0043]以下將結(jié)合實(shí)施例具體說(shuō)明本發(fā)明，本發(fā)明的實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方 案，并非限定本發(fā)明的實(shí)質(zhì)。
[0044] 實(shí)施例1分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖的制備
[0045] 分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖的制備方法如下：
[0046] 1)干茯苓50kg，粉碎成細(xì)粉，投入到浸泡罐中，栗入300L水，攪拌均勻，浸泡12h;
[0047] 2)將250L濃度為2.5mol/L的氫化鈉溶液緩慢栗入浸泡罐中，攪拌反應(yīng)lh，壓濾，取 濾液；
[0048] 3)在中和罐中投入300L濃度為5.0mol/L的氯乙酸溶液后，再緩緩加入300L濃度為 5.5mol/的氫氯化鈉溶液，攪拌至反應(yīng)充分，冷卻至室溫；
[0049] 4)將3)步反應(yīng)液栗入2)步所得濾液中，混勻后，蒸汽加熱升溫至55°C，開(kāi)始計(jì)算反 應(yīng)時(shí)間，每反應(yīng)持續(xù)18min后提高反應(yīng)溫度1°C，直至反應(yīng)溫度75°C持續(xù)18分鐘后冷卻至55 Γ。
[0050] 5)用6mol/的鹽酸溶液調(diào)4)步所得反應(yīng)液的pH值5.0-7.0,加入相當(dāng)于反應(yīng)液3倍 體積的95%乙醇進(jìn)行醇析，過(guò)濾，用90%的乙醇洗滌羧甲基茯苓多糖醇析物；
[0051] 6)羧甲基茯苓多糖醇析物在60°C干燥12h后，105°C干燥2h，得羧甲基茯苓多糖粗 制品 35.0kg.
[0052] 7)將7.5kg羧甲基茯苓多糖粗制品分散于250L雙蒸水中，加入6mol/L的氫氯化鈉 溶液調(diào)pH至10.0-13.0;加入1.25L濃度為30%的H 2〇2溶液，室溫脫色反應(yīng)24h，，去除有色雜 質(zhì)；加入6mol/L的鹽酸溶液調(diào)pH值6.0，3000轉(zhuǎn)/分離心分離30min，取分離液，分離液用DH-UF中空纖維超濾器濾除分子量0.6 ΧΙΟ4以下的羧甲基茯苓多糖，以及氯化鈉、氯乙酸鈉與 羥乙酸鈉等雜質(zhì)后，分離液中加入3倍體積的95%乙醇，進(jìn)行醇析，離心分離，得羧甲基茯苓 多糖醇析物，醇析物用95 %的乙醇洗滌3次，在60 °C干燥12h后，105 °C干燥2h，粉碎，得6. Okg 分子量〇. 6 X 104至2.0 X 1〇6道爾頓的羧甲基茯苓多糖純品。
[0053]分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖具有如下理化性質(zhì)：
[0054]性狀：白色粉末，無(wú)臭，略有引濕性。
[0055]分子式：（C8H12〇7)n聚合度(n): 27<n<9091。
[0056] 分子量:0·6Χ104 至 2.0X106 道爾頓。
[0057] IR[KBr] (cm-1):3700-3000，2900，1600，7，1425·2，1324·9，1078·0，891·0。
[0058] UV(0.1mol/L HC1 溶液、出0、0.10111〇1/1似0!1溶液）：無(wú)吸收峰。
[0059] 13C-NMR[H2D](ppm):180.078,104.870,87.697,86.667,84.935,83.145,77.851, 76.490,
[0060] 75.669,73.273,72.296,70.345,62.975 〇
[0061] [a]20D:-1.7〇-1.90(C = 5，H2〇)。
[0062] 1 % 水溶液的 pH值 5 · 0-7 · 0。
[0063] 水份百分含量<8.0%。
[0064] 以氯化鈉計(jì)，氯化物<0 · 01 % ;以Pb計(jì)，重金屬％<0.0001%，以As計(jì)，砷％< 0.0001%。
[0065] 實(shí)施例2分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖分子量的測(cè)定
[0066] 測(cè)定條件:儀器為L(zhǎng)KB柱層析系統(tǒng)，SephadexG-200柱。移動(dòng)相為0.2mol/L的NaCl溶 液(pH值7.0)緩沖溶液，流速0.5ml/min，進(jìn)樣量(W/V) lmg/ml，恒溫10°C。示差折射自動(dòng)檢 測(cè)，記錄儀記錄峰位。
[0067] 標(biāo)準(zhǔn)曲線：用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)多糖Dexfran T2000(Mw2000000)、T500 (Mw500000)、T40(Mw40000)、T20(Mw20000)、T10(Mw100 00)、T5(Mw5000)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，按 Ka.v對(duì)數(shù)Log Mw作圖，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。
[0068]本發(fā)明制得的分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖在Sephadex G200層析柱上的洗 脫曲線參見(jiàn)圖2,根據(jù)測(cè)得的Ka.V值，求得其分子量(Mw)為0.6X104至2.0X106道爾頓。
[0069] 實(shí)施例3酸化法測(cè)定分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖的羧甲基取代度(D · S)
[0070] 精密稱取分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖樣品0.4020g，置于150ml的燒杯中， 80°C水浴加熱，攪拌使溶解，冷卻后，用2mol/L的鹽酸溶液調(diào)pH至4.0，加入無(wú)水乙醇100ml， 攪拌均勻，靜置過(guò)夜，離心分離醇析物，醇析物用95%的乙醇反復(fù)洗滌，至洗滌液中不含氯 離子。洗凈醇析物用〇. 1000m〇l/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液40.00ml溶解，待溶液呈透明狀后，立即用 0.1000m 〇l/L的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液反滴定，至酚酞指示劑的紅色剛退去，記錄反滴定所消耗 0.1000m〇l/L的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積為21.30ml。
[0071]按照下式計(jì)算分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖的羧甲基取代度(D · S):
[0072]
[0073] 式中：A為中和lg酸式分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖樣品所消耗的NaOH的m mol 數(shù)；
[0074] CNaciH為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(0 · 1000mol/L);
[0075] VNaciH為加入0 · 1000mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積數(shù)(40 · 00ml);
[0076] Chq為反滴定用的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(0.1000m〇l/L);
[0077] Vhq為反滴定所消耗0.1000m〇l/L的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積數(shù)(21.60ml);
[0078] m為樣品的質(zhì)量(g);
[0079] 0.162為茯苓多糖的失水葡萄糖單元的m mol質(zhì)量；
[0080] 0.058為失水葡萄糖單元中一個(gè)羥基被羧甲基取代后，失水葡萄單元m mol質(zhì)量的 凈增值。
[0081] 本發(fā)明所得分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖的羧甲基取代度(D · S)為1.005， 計(jì)算過(guò)程如下：
[0082]
[0083]
[0084]實(shí)施例4羧甲基茯苓多糖口服液的制備
[0085]在潔凈區(qū)配料室中，將100L的去離子水栗入潔凈的搪玻璃配料罐中，投入2.0kg的 羧甲基茯苓多糖純品，羧甲基茯苓多糖純品的分子量(Mw)為0.6 X 104至1.0 X 106道爾頓，羧 甲基茯苓多糖的羧甲基取代度為1.005;配料罐的夾層輸入蒸汽，80°C加熱溶解，冷卻、壓 濾、濾液栗入另一洗凈的搪玻璃反應(yīng)罐中，加入甜蜜素1.5kg、山犁酸1.5kg，攪拌均勻，溶配 液在潔凈區(qū)進(jìn)行自動(dòng)罐裝，l〇ml/瓶，灌裝畢，封口，置蒸汽消毒柜中115°C滅菌30min，即得。 [0086]實(shí)施例5羧甲基茯苓多糖凍干粉針的制備
[0087]在潔凈區(qū)配料室中，將100L雙蒸餾水栗入潔凈的搪玻璃配料罐中，投入600g的羧 甲基茯苓多糖純品和1200g注射用氯化鈉，羧甲基茯苓多糖純品的分子量(Mw)為大于1.0 X 106至2.0 X 106道爾頓，羧甲基的取代度為1.005;配料罐的夾層輸入蒸汽，將其加熱至80°C， 保溫30min，攪拌使溶解。冷卻至室溫，用孔徑<1μπι的陶瓷濾捧進(jìn)行粗濾，粗濾液再用孔徑 <0.5μπι的玻璃濾球進(jìn)行精濾。精濾液按5ml/瓶在無(wú)菌區(qū)自動(dòng)灌裝，灌裝畢，置于無(wú)菌室中， 先后在-25°C和_70°C條件下進(jìn)行冷凍真空干燥，無(wú)菌密封，即得。
[0088] 羧甲基茯苓多糖凍干粉針經(jīng)高溫(40。(：、60。(：、80。(：）、高濕(冊(cè)92.5%、冊(cè)75%、25 °C)及光照(5000LX)等影響因素試驗(yàn)后，外觀性狀、澄明度、pH值、含量及無(wú)菌檢查均符合要 求。經(jīng)加速試驗(yàn)(40 °C、RH75 % )3個(gè)月的考察結(jié)果，外觀性狀、澄明度、pH值、含量及無(wú)菌檢查 均符合要求。經(jīng)室溫留樣考察1、3、5、12、18、24個(gè)月，經(jīng)定期取樣檢查，各項(xiàng)指標(biāo)均符合要 求。
[0089]以下通過(guò)試驗(yàn)例驗(yàn)證本發(fā)明制得分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖的多種藥理 作用。除非另有說(shuō)明，本發(fā)明試驗(yàn)例的給藥劑量標(biāo)準(zhǔn)均以純品計(jì)。
[0090] 試驗(yàn)例1分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖的增強(qiáng)免疫作用
[0091] 羧甲基茯苓多糖按50mg/kg劑量每日皮下注射昆明種小鼠1次，連用10日，與對(duì)照 組醋酸可的松相比，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬率增加84.57% (P<0.01)，吞噬指數(shù)增加 110.0%(P<0.05)〇
[0092]羧甲基茯苓多糖按50mg/kg劑量每日皮下注射荷S18Q肉瘤的瑞士小鼠1次，連用10 日，與對(duì)照組生理鹽水相比，能使小鼠的腹腔巨噬細(xì)的吞噬率與吞噬指數(shù)分別增加70.83% (卩<0.01)與112.0%(卩<0.01)。
[0093]羧甲基茯苳多糖按50mg/kg劑量每日皮下注射帶Lewis肺癌的C57純系小鼠 1次，連 用10日，與對(duì)照組生理鹽水相比，能使帶Lewis肺癌的C57純系小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬率 與吞噬指數(shù)分別增加 142.47% (Ρ<0· 01)與 136.36% (Ρ<0· 05)。
[0094]對(duì)ΝΙΗ小鼠按（120-480 )mg/kg劑量灌胃給予羧甲基茯苓多糖，可對(duì)抗腫瘤化療藥 物環(huán)磷酰胺(Cy)引起的免疫抑制，使NIH小鼠的胸腺、脾臟的重量增加，溶血素抗體的含量 升高，改善和消除環(huán)磷酰胺對(duì)其的抑制作用，增強(qiáng)腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能，提高NK細(xì)胞的 活性，提升白細(xì)胞介素-2(IL-2)至正常水平，使荷瘤的NIH小鼠的腫瘤壞死因子(TNF)的含 量明顯增加。
[0095]羧甲基茯苓多糖按(25-200 )mg/kg劑量每日腹腔注射注小鼠1次，連用4日，與對(duì)照 組生理鹽水相比，小鼠脾細(xì)胞的PFC及SRFC明顯增加(P<0.01)。
[0096] 羧甲基茯苓多糖按100mg/kg劑量每日腹腔注射1次，連用4日，與對(duì)照組生理鹽水 相比，小鼠對(duì)BSA誘發(fā)的DTH反應(yīng)明顯增強(qiáng)(P < 0.01)。
[0097] 羧甲基茯苓多糖(0.05-500)μg/ml濃度對(duì)C57BL/6J和BALB/C小鼠雙向混合脾淋巴 細(xì)胞培養(yǎng)的增殖有明顯的促進(jìn)作用，與不加羧甲基茯苓多糖的雙向混合脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液 比，Ρ<0·05〇
[0098] 羧甲基茯苓多糖(5-100) yg/m濃度與昆明種小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，上清液 腫瘤壞死因子-a(TNF-a)分泌增多，與不加羧甲基茯苓多糖的腹腔巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)液的對(duì) 照組比：P<〇.〇5。
[0099] 試驗(yàn)例2分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖的抗腫瘤作用
[0100]羧甲基茯苓多糖（100-300)11^/1^劑灌胃，對(duì)1?!1小鼠的518()肉瘤的抑制率為 47·76%-61·94%，而 20mg/kg 劑量的 5-Fu 抑制率為 59.70%，兩者對(duì)比 Ρ<0·05。
[0101] 羧甲基茯苓多糖（150-300)mg/kg劑量灌胃，對(duì)NIH小鼠的EAC瘤株的抑制率為 39 · 22%-59 · 80%，與對(duì)照組生理鹽水比，Ρ值<0 · 05。
[0102] 羧甲基茯苓多糖(25-500)mg/kg劑量每日腹腔注射1次，連用10日，對(duì)ICR/JCL小鼠 腫瘤Uw抑制率為75.5%-92.7%，與對(duì)照組生理鹽水比，P<0.01。
[0103] 羧甲基茯苓多糖（50-200)mg/kg劑量隔日灌胃，12日后對(duì)昆明種小鼠肝癌H22的抑 制率為39.03%-62.24%，與對(duì)照組生理鹽水比，P<0.05。
[0104] 羧甲基茯苓多糖25mg/kg劑量每日腹腔注射1次，連用10日，對(duì)C57純系小鼠 Lewis肺 癌的抑制率為32.0%，與對(duì)照組生理鹽水比，P<0.01。
[0105]羧甲基茯苓多糖(0.1-50)μg/ml濃度對(duì)體外培養(yǎng)的昆明種小鼠的S18Q肉瘤與肝癌 H22細(xì)胞的生長(zhǎng)均有明顯的抑制作用，與不加羧甲基茯苓多糖的體外培養(yǎng)的S18Q肉瘤與肝癌 H22細(xì)胞對(duì)照組比，P<0.05。
[0106]試驗(yàn)例3分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖的抗病毒作用
[0107]用（0.1-1.0 )mg/kg濃度的羧甲基茯苓多糖預(yù)處理人胚肺細(xì)胞24小時(shí)，棄上清液， 再加不同濃度的濾泡性口腔炎病毒(VSV-Indiana株），于37°C孵育24小時(shí)，VSV-Indiana在 人胚肺細(xì)胞上所呈現(xiàn)的CPE情況，與不加羧甲基茯苓多糖的對(duì)照組比，有顯著區(qū)別，O.lmg/ ml為有效間接抗病毒濃度，1. Omg/ml濃度抗病毒效果更顯著，在人胚肌細(xì)胞上與人胚肺細(xì) 胞上所呈現(xiàn)的間接抗病毒作用是一致的。
[0108]羧甲基茯苓多糖對(duì)因感染單純皰疹病毒I型(HSV-I)而引起的豬腎傳代細(xì)胞病變 具有保護(hù)作用，在感染（1〇-1〇〇)1'(：105()(半細(xì)細(xì)胞培養(yǎng)感染量)的!^-1的情況下，2.〇1^/1111 濃度的羧甲基茯苓多糖對(duì)HSV-I致豬腎傳代細(xì)胞的細(xì)胞病變(CPE)具有直接的抑制作用，在 感染HSV-I 100TCID5Q的情況下，羧甲基茯苓多糖的ID5Q為0.5mg/ml。
[0109]試驗(yàn)例4分子量分布廣泛的羧甲基茯多糖的抗放射作用
[0110] 羧甲基茯苓多糖能對(duì)抗6<3C〇-r射線所致小鼠末梢白細(xì)胞的抑制，試驗(yàn)組的小鼠按 100mg/kg劑量每日腹腔注射1次，連用7日，然后 6()C〇-r射線照射14.9min(50.4倫琴/min)，總 放射量750倫琴，再繼續(xù)給藥5日，試驗(yàn)組的小鼠的未梢白細(xì)胞數(shù)與生理鹽水對(duì)照組比，增加 69.41%，Ρ<0·05〇
[0111] 試驗(yàn)例5分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖的保肝作用
[0112] 羧甲基茯苓多糖對(duì)四氯化碳中毒小鼠的肝臟有保護(hù)作用，試驗(yàn)組小鼠用羧甲基茯 苓多糖按（100、200)mg/kg劑量每日腹腔注射1次，連用5日，對(duì)照組小鼠每日腹腔注射等容 積的生理鹽水，連用5日，第5日下午，各組小鼠均由皮下注射0.15%四氯化碳花生油溶液 0.2!111/。16小時(shí)后處死小鼠，取血測(cè)定血清谷-丙轉(zhuǎn)氨酶，試駔組小鼠血清谷-丙轉(zhuǎn)氨酶分別 降低27.32%與41.03%，與生理鹽水對(duì)照組比，P<0.01。
[0113]大鼠肝部分切除手術(shù)前按100mg/kg劑量每日腹腔注射1次，連用4日，然后部分切 除大鼠的肝左葉與中葉(約占全肝的65%-75%)，手術(shù)后再連續(xù)給藥3日，停藥2日后處死大 鼠，取肝稱重，大鼠的肝臟再生度與再生肝重/體重分別增加73.29%與18.95%，與生理鹽 水對(duì)照組比，Ρ<〇·〇1與Ρ<〇·〇〇1。
[0114] 試驗(yàn)例6分子式分布廣泛的羧甲基茯苓多糖對(duì)睡眠的改善作用
[0115] 試驗(yàn)組瑞士小鼠按100mg/kg劑量每日腹腔注射羧甲基茯苓多糖1次，連用7日，對(duì) 照組瑞士小鼠每日腹腔注射等容積的生理鹽水，連用7日，第7日各組均按50mg/kg劑量腹腔 注射硫噴妥鈉注射液，然后觀察各組小鼠翻正反射消失持續(xù)的時(shí)間，試驗(yàn)的結(jié)果證明，羧甲 基茯苓多糖能增強(qiáng)硫噴妥納對(duì)小鼠中樞的抑制，羧甲基茯苓多糖試驗(yàn)組的小鼠翻正反射消 失持續(xù)的時(shí)間為硫噴妥鈉對(duì)照組的4.69倍，與硫噴妥鈉對(duì)照組比，P<0.05。
[0116] 試驗(yàn)例7分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖誘生與促誘生人血淋巴細(xì)胞活性因子 作用
[0117] 用不同濃度（1.25-100)μg/ml的羧甲基茯苓多糖誘生與促誘生人血淋巴細(xì)胞干擾 素 -α (Interferon-α，IFN-α)，誘生效價(jià)提高6倍，促誘生效價(jià)比常規(guī)誘生提高10-20倍。
[0118] 用l〇〇μg/ml濃度的羧甲基茯苓多糖誘生與促誘生人外周血淋巴細(xì)胞干攏素 -γ (1]1七6^61'〇11-1'，]^^-1')、白細(xì)胞介素-2(111七61'16111<:;[11-2，11^-2)、白細(xì)胞介素-6 (Interleukin-6，IL-6)與腫瘤壞死因子-a(Tumor necrosis factor-a，TNF_a)，誘生效價(jià) 分別提高10.9、0.8、0.5、4.0倍，促誘生效價(jià)分別比常規(guī)誘生提高(0.4-0.6)、（1.2-2.8)、 (0·5-0·8)、（·5-1·1)倍。
[0119] 用lOOμg/ml濃度的羧甲基茯苓多糖誘生與促誘生人外周血淋巴細(xì)胞粒-巨噬細(xì)胞 集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony-stimularting factor，GM_CSF)，效價(jià)可 達(dá)8X104U/ml 以上。
[0120] 綜上所述，羧甲基茯苓多糖主要通過(guò)如下作用機(jī)理發(fā)揮其多種藥理作用：
[0121] 1)依賴宿主的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)機(jī)體免疫力（特異性與非特異性），抑制與殺傷腫瘤 細(xì)胞。通過(guò)激活補(bǔ)體，誘生多種淋巴細(xì)胞活性因子，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞與B淋 巴細(xì)胞的活性，多途徑協(xié)同增效發(fā)揮抗腫瘤、抗病毒作用。
[0122] 2)抑制腫瘤細(xì)胞DNA、RNA合成，直接殺死殺傷腫瘤細(xì)胞。
[0123] 3)提高腫瘤細(xì)胞膜上的唾液酸(SA)含量、抑制PT轉(zhuǎn)換、降低花生四烯酸(C2Q)等含 量，多途徑抑制腫瘤細(xì)胞的分裂與增殖。
[0124] 4)增強(qiáng)肝臟S0D活性，清除氧自由基，化解致癌物質(zhì)，防止正常細(xì)胞DNA變異。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖的制備方法，其特征在于:包括如下步驟：1) 茯苓粉加入到水或水醇混合液中，攪拌均勻后，加入2.0-8. Omol/L的堿性溶液，攪拌至完全 溶解，得茯苓多糖堿化液;2) 2.0-1 Omo 1 /L氯乙酸與適當(dāng)過(guò)量的2.0-1 Omo 1 /L堿性溶液充分 反應(yīng)后，加入到1)步所得的茯苓多糖堿化液中，在30°C至90°C逐步升溫的條件下進(jìn)行合成 反應(yīng)，分離純化生成的羧甲基茯苓多糖，即得，其羧甲基取代度大于1.000;所述適當(dāng)過(guò)量是 指堿性溶液中堿性物質(zhì)的實(shí)際用量比其與氯乙酸中和所需理論用量過(guò)量2.0-20%。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多 糖，其分子量分布范圍為0.6 X 104至2.0 X 106道爾頓。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多 糖分離純化得到分子量分布0.6 X 104至1.0 X 106道爾頓的組分。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多 糖分離純化得到分子量分布1.0 X 1〇6以上至2.0 X 106道爾頓的組分。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述茯苓多糖堿化液可用茯苓粉加入 到水或水醇混合液中，攪拌均勻后用2.0-8.0%mol/L的堿性溶液攪拌提取，壓濾分離，取濾 液，即得。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述氯乙酸溶液的濃度為2.0-10·0mol/L。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述適當(dāng)過(guò)量是指堿性溶液中堿性物 質(zhì)的實(shí)際用量比其與氯乙酸中和所需理論用量過(guò)量2.0_20% 〇。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述茯苓多糖堿化液與氯乙酸鈉溶液 在適當(dāng)過(guò)量的堿液中合成反應(yīng)，反應(yīng)溫度優(yōu)選55°C持續(xù)18min以后每升1°C持續(xù)18min，直至 升溫到75°C持續(xù)18min后冷卻至55°C。9. 一種根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法得到的分子量分布0.6 X 104至1.0 X 106道爾頓 的羧甲基茯苓多糖的組分作為羧甲基茯苓多糖口服制劑的原料的應(yīng)用。10. -種根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法得到的分子量分布1.0 X 106以上至2.0 X 106道 爾頓的羧甲基茯苓多糖的組分作為羧甲基茯苓多糖注射制劑的原料的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P1/14GK106008736SQ201610489621
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年6月28日
【發(fā)明人】陳春霞
【申請(qǐng)人】陳勇, 陳雄, 陳一雄, 陳春霞