一種測(cè)定多糖糖組分的分析方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于多糖的定性和定量分析【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種測(cè)定多糖組分的分析方法。所述測(cè)定多糖糖組分的分析方法包括如下步驟：將待測(cè)多糖與離子液在油浴鍋中充分溶解得到多糖溶解液，待所述多糖溶解液冷卻后倒入再生溶劑中得到沉淀，反復(fù)沖洗，離心得到再生多糖粗產(chǎn)品，通風(fēng)使殘余再生溶劑完全揮發(fā)，干燥后得到再生多糖；將所得再生多糖與酸溶劑置于安培瓶中并密封，將安培瓶放入油浴鍋中進(jìn)行水解反應(yīng)，水解反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行離心，取上清液進(jìn)行檢測(cè)前處理，得到多糖檢測(cè)液；采用離子色譜儀系統(tǒng)，應(yīng)用離子色譜-脈沖安培法分析多糖檢測(cè)液中糖組分的還原糖種類和含量。本發(fā)明分析方法提高了多糖的水解效率，且具有極高的靈敏度。
【專利說明】一種測(cè)定多糖糖組分的分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于多糖中糖組分的定性和定量分析【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種測(cè)定多糖糖組分的改進(jìn)分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002]多糖是自然界中含量最豐富的物質(zhì)之一，對(duì)維持生命活動(dòng)起著至關(guān)重要的作用。在生命過程中，多糖不僅作為能量物質(zhì)和結(jié)構(gòu)物質(zhì)，而且還具有抗腫瘤、抗衰老、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)及降血糖等多種生物活性，廣泛地應(yīng)用于保健食品、醫(yī)藥和臨床上。
[0003]多糖結(jié)構(gòu)分析對(duì)于多糖研究十分重要:揭示多糖構(gòu)效關(guān)系、開發(fā)新型功能多糖。然而，鑒于高分子多糖的復(fù)雜性，沒有直接儀器手段解析多糖結(jié)構(gòu)，目前，常用的方法，均需要將多糖降解為單糖來分析，因此，多糖的糖組成分析方法包括兩個(gè)步驟:多糖酸水解為含單糖的水解液及色譜法檢測(cè)分析單糖。酸水解是將多糖降解為單糖的主要方法，是多糖結(jié)構(gòu)分析的必要步驟。然而，多糖是一個(gè)高結(jié)晶度的高分子聚集體，結(jié)晶多糖分子排列緊密，由于多糖分子聚集體內(nèi)腔的疏水作用以及分子間的空間位阻，酸在糖聚集體中滲透慢，導(dǎo)致水解時(shí)間延長(zhǎng)，因此，多糖水解是一個(gè)高溫強(qiáng)酸性條件下的長(zhǎng)時(shí)間的化學(xué)過程；另一方面，在特定酸性條件下，不同的單糖殘基水解程度不同，位于支鏈的糖苷鍵較主鏈的糖苷鍵易于水解，呋喃糖較吡喃糖易于水解；與糖醛酸相連的則糖苷鍵難水解鑒于天然多糖大部分為非均一的雜多糖，以上易水解和難水解的結(jié)構(gòu)共存，這造成兩方面的矛盾，一方面，易于水解的部分，單糖很快釋放出來；另一方面，難降解部分仍需要高溫強(qiáng)酸下長(zhǎng)時(shí)間處理，這導(dǎo)致已經(jīng)水解的單糖由于受到長(zhǎng)時(shí)間高溫強(qiáng)酸的作用，發(fā)生降解，水解液顏色較深，從而產(chǎn)生損失，不利于定量分析。因此，目前多糖糖組份分析的前期酸水解液普遍存在未水解殘?jiān)?、水解液顏色深，有新的糖衍生物等干擾物生成，不利于后續(xù)的色譜分析?？梢姡茐母呓Y(jié)晶多糖的網(wǎng)狀骨架，降低分子結(jié)晶度將是提高酸水解效率的關(guān)鍵。
[0004]離子液體是近年來興起的一種十分具有良好應(yīng)用前景的綠色溶劑。Rogers研究組首先發(fā)現(xiàn)了氯化1-丁基-3-甲基咪唑([BMIM]C1)可溶解自然界中最為廣泛的多糖纖維素，Dadi等研究表明，纖維素經(jīng)[BMM]Cl離子液體預(yù)處理后可提高糖化速度。鑒于以上研究結(jié)果，將離子液應(yīng)用于多糖水解的預(yù)處理，將降低多糖的結(jié)晶度，促進(jìn)酸在多糖分子間的滲透，從而縮短水解時(shí)間，避免已水解單糖破壞。
[0005]目前報(bào)道單糖測(cè)定的方法主要有氣相色譜法、液相色譜法、親和色譜、酶學(xué)法和毛細(xì)管電泳法等，這些分析方法普遍靈敏度不高、分離效果差，目前通用的方法是氣相色譜法，它解決了以上儀器部分分離單糖各種同分異構(gòu)體的問題，但是該方法需要進(jìn)行復(fù)雜的衍生化處理，同時(shí)，衍生化過程中還造成單糖的損失，給定量分析帶來困難。離子色譜-脈沖安培檢測(cè)糖是近年發(fā)展起來的新方法，該方法無需衍生，就能分析幾乎所有的單糖和大部分寡糖及低聚糖，操作簡(jiǎn)便，無需復(fù)雜樣品前處理，更無需衍生，而且具有極高的靈敏度，通?？梢詸z測(cè)到pmoL級(jí)的糖類物質(zhì)，但結(jié)合酸水解分析高結(jié)晶度的多糖中糖組分和含量，尚未見報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]有鑒于此，本發(fā)明的在于提供一種聯(lián)合離子液預(yù)處理、酸溶劑處理及離子色譜-脈沖安培檢測(cè)法定性和定量分析高結(jié)晶多糖的單糖組分的方法。
[0007]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0008]一種測(cè)定多糖糖組分的分析方法，包括以下步驟:
[0009](I)離子液預(yù)處理及多糖再生:將待測(cè)多糖與離子液在油浴鍋中充分溶解得到多糖溶解液，待所述多糖溶解液冷卻后倒入再生溶劑中得到沉淀，反復(fù)沖洗，離心得到再生多糖粗產(chǎn)品，通風(fēng)使再生多糖粗產(chǎn)品內(nèi)殘余的再生溶劑完全揮發(fā)，干燥后得到再生多糖；
[0010]所述待測(cè)多糖為目前常規(guī)的多糖類型，尤其可為高結(jié)晶的多糖，優(yōu)選的為酵母β-葡聚糖、蟲草多糖、凝結(jié)多糖或龍膽多糖中的一種；
[0011]優(yōu)選的，所述離子液為1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽([Bmim] Cl)、1-乙基-3-甲基咪唑醋酸鹽([Emim] Ac)、1-烯丙基或3-甲基咪唑氯鹽([Amim] Cl)中的一種以上；
[0012]優(yōu)選的，所述待測(cè)多糖與離子液的質(zhì)量比為1: (15?25)；
[0013]優(yōu)選的，所述充分溶解的條件為:溶解溫度為80?100°C，溶解時(shí)間為2?4h ;
[0014]優(yōu)選的，所述多糖溶解液冷卻后的溫度為50°C ；
[0015]優(yōu)選的，所述再生溶劑為無水乙醇或水；
[0016]優(yōu)選的，所述再生溶劑的用量為離子液體積的5?10倍；
[0017]優(yōu)選的，所述干燥的條件為:干燥溫度為50?80°C，真空度為0.05?0.lKPa，干燥時(shí)間為2?5h ;
[0018](2)酸溶劑水解:將步驟(I)所得再生多糖與酸溶劑混合置于安培瓶中并密封，將密封后的安培瓶放入油浴鍋中進(jìn)行水解反應(yīng)，水解反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行離心，取上清液進(jìn)行檢測(cè)前處理，得到多糖檢測(cè)液；
[0019]優(yōu)選的，所述酸溶劑為三氟乙酸(TFA)、硫酸或鹽酸中的一種以上；
[0020]優(yōu)選的，所述酸溶劑的濃度為2?4mol/L ；
[0021]優(yōu)選的，所述酸溶劑的用量為:每g再生多糖對(duì)應(yīng)使用IOmL的酸溶劑；
[0022]優(yōu)選的，所述水解反應(yīng)的條件為:反應(yīng)溫度為70?120°C，反應(yīng)時(shí)間為2?4h ;
[0023]優(yōu)選的，所述離心的條件為:轉(zhuǎn)速為7000r/min，時(shí)間為IOmin ；
[0024]優(yōu)選的，所述檢測(cè)前處理的具體步驟為:用超純水對(duì)上清液進(jìn)行定容，稀釋后過
0.2 μ m濾膜；
[0025](3)離子色譜-脈沖安培法(HPAEC-PAD)檢測(cè)單糖組分:采用離子色譜儀系統(tǒng)，應(yīng)用離子色譜-脈沖安培法分析多糖檢測(cè)液中單糖組分的還原糖種類和含量；
[0026]優(yōu)選的，所述離子色譜儀系統(tǒng)采用在線脫氣裝置的梯度泵，配25 μ L進(jìn)樣環(huán)的柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器和配有薄膜型安培池的電化學(xué)檢測(cè)器，色譜柱采用CarboPacTM PAl分析柱(4mmX250mm)和CarboPacTM PAl保護(hù)柱(4mmX50mm),柱溫30°C,流動(dòng)相流速固定在
1.0mL/min,進(jìn)樣體積固定在20 μ L ;
[0027]其中，所述離子色譜儀系統(tǒng)中色譜柱的淋洗條件為:水和300mmoL/L的NaOH溶液以二元梯度淋洗方式進(jìn)行色譜分離，在最初的20min，采用體積分?jǐn)?shù)為95%水和5%的300mmoL/L的NaOH溶液二元混合液等度淋洗方式，然后以臺(tái)階改變方式在0.1min內(nèi)將淋洗液變?yōu)?00%的300mmoL/L NaOH溶液，并保持25min。
[0028]本發(fā)明的原理:
[0029]本發(fā)明利用離子液中含有較強(qiáng)的氫鍵受體Cl-或Ac-與待測(cè)多糖分子上的羥基形成氫鍵，同時(shí)帶有強(qiáng)極性基團(tuán)的咪唑陽離子也對(duì)待測(cè)多糖氫鍵的破壞發(fā)揮了很大的促進(jìn)作用，溶劑離子與待測(cè)多糖分子直接發(fā)生較強(qiáng)的氫鍵作用，從而減小結(jié)晶多糖分子內(nèi)與分子間氫鍵，待測(cè)多糖原有的結(jié)晶結(jié)構(gòu)遭到破壞，促進(jìn)酸與待測(cè)多糖之間的滲透與傳質(zhì)，提高待測(cè)多糖的水解效率。
[0030]本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:
[0031](I)離子液作為有效的綠色溶劑，具有不揮發(fā)性、易于回收和再利用等優(yōu)點(diǎn)，而且對(duì)環(huán)境無污染，可以降低生產(chǎn)成本，節(jié)約資源和能源，且能破壞高結(jié)晶多糖的結(jié)構(gòu)，使之易水解。
[0032](2)咪唑型離子液中較高的陰濃度和陽離子活性可以有效的破壞溶質(zhì)中的氫鍵作用，使得水解后溶液比直接酸化或超聲等物理方式預(yù)處理再酸水解的顏色更淺，單糖和寡糖含量聞，不易損失。
[0033](3)離子色譜-脈沖安培檢測(cè)定性和定量分析高結(jié)晶多糖糖組分的方法操作簡(jiǎn)便，無需復(fù)雜樣品前處理，更無需衍生，而且具有極高的靈敏度。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1為實(shí)施例2方法處理得到的蟲草多糖檢測(cè)液的離子色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0035]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0036]實(shí)施例1
[0037]—種測(cè)定多糖糖組分的方法，具體步驟如下:
[0038]1、離子液預(yù)處理及多糖再生:稱取0.2g在70°C真空度為0.098kPa的真空干燥箱中恒溫干燥2h的酵母β -葡聚糖，與4g的再生溶劑[BMM]C1混合在油浴鍋中充分溶解2h，得到酵母β -葡聚糖溶解液；將酵母β -葡聚糖溶解液加入到5倍離子液容積的無水乙醇中再生，反復(fù)沖洗，離心沉降，得到再生酵母β-葡聚糖粗產(chǎn)品，將再生酵母β-葡聚糖粗產(chǎn)品置于通風(fēng)櫥中充分揮發(fā)再生溶劑，再在溫度50°C、真空度0.1KPa環(huán)境中干燥時(shí)間5h后得到再生酵母β-葡聚糖；
[0039]2、酸溶劑水解:將步驟I所得再生酵母β -葡聚糖與2ml的4moL/L的TFA混合放入安培瓶中并密封，于油浴鍋中100°c下水解4h后，轉(zhuǎn)速7000r/min離心IOmin后取上清液，將上清液用超純水定容至IOOmL,稀釋10倍后過0.2 μ m的濾膜，得到多糖檢測(cè)液；
[0040]3、HPAEC-PAD檢測(cè):用離子色譜-脈沖安培法對(duì)對(duì)照組溶液及步驟2所得的多糖檢測(cè)液進(jìn)行檢測(cè)分析多糖中糖組分的還原糖種類和含量；所述對(duì)照組溶液為將同樣的酵母β -葡聚糖不經(jīng)過步驟I的離子液預(yù)處理及多糖再生，而是直接進(jìn)行步驟2的酸溶劑水解處理得到的檢測(cè)液；
[0041]所述離子色譜儀系統(tǒng)采用在線脫氣裝置的梯度泵，配25 μ L進(jìn)樣環(huán)的柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器和配有薄膜型安培池的電化學(xué)檢測(cè)器，色譜柱采用CarboPacTM PAl分析柱(4mm X 250mm)和CarboPacTM PAl保護(hù)柱(4mm X 50mm),柱溫30 °C,流動(dòng)相流速固定在1.0mL/min，進(jìn)樣體積固定在20 yL ;所述離子色譜儀系統(tǒng)中色譜柱的淋洗條件為:水和300mmoL/L NaOH溶液以二元梯度淋洗方式來進(jìn)行色譜分離，在最初的20min，采用體積分?jǐn)?shù)為95%水和5%的300mmoL/L的NaOH溶液二元混合液等度淋洗方式，然后以臺(tái)階改變方式在0.1min內(nèi)將淋洗液變?yōu)?00%的300mmoL/L NaOH溶液，并保持25min。
[0042]經(jīng)過HPAEC-PAD定性和定量分析，對(duì)照組溶液中的酵母β-葡聚糖還原糖為55.23g/100g，本發(fā)明方法所得多糖檢測(cè)液多糖中酵母β_葡聚糖還原糖含量提高了17.2g/100g ;經(jīng)本發(fā)明方法得到的多糖檢測(cè)液中葡萄糖含量比對(duì)照組溶液的葡萄糖含量增加了 44.5%;對(duì)照組溶液中葡萄糖濃度為691.6mg/L，本發(fā)明方法所得多糖檢測(cè)液中葡萄糖濃度達(dá)到999.4mg/Lo
[0043]用比色管觀察對(duì)照組溶液及本發(fā)明方法處理所得的酵母β -葡聚糖檢測(cè)液，對(duì)照組溶液呈淡黃褐色，酵母β_葡聚糖檢測(cè)液呈澄清。
[0044]實(shí)施例2
[0045]一種測(cè)定多糖糖組分的方法，具體步驟如下:
[0046]1、離子液預(yù)處理及多糖再生:稱取0.2g在50°C真空度為0.098kPa的真空干燥箱中恒溫干燥3h的蟲草多糖，與3g的再生溶劑[Emim]Ac混合在油浴鍋中充分溶解3h，得到蟲草多糖溶解液；將蟲草多糖溶解液加入到10倍離子液容積的去離子水中再生，反復(fù)沖洗，離心沉降，得到再生蟲草多糖粗產(chǎn)品，將再生蟲草多糖粗產(chǎn)品置于通風(fēng)櫥中充分揮發(fā)再生溶劑，再在溫度75°C、真空度0.0SKPa環(huán)境中干燥時(shí)間4h后得到再生蟲草多糖；
[0047]2、酸溶劑水解:將步驟I所得再生蟲草多糖與2mL的2mol/L的H2SO4溶液放入安培瓶中并密封，于油浴鍋中100°c下水解2h后，轉(zhuǎn)速7000r/min離心IOmin后取上清液，將上清液用超純水定容至IOOmL,稀釋10倍后過0.2 μ m的濾膜，得到多糖檢測(cè)液；
[0048]3、HPAEC-PAD檢測(cè):用離子色譜-脈沖安培法對(duì)對(duì)照組溶液及步驟2所得的多糖檢測(cè)液進(jìn)行檢測(cè)分析多糖中糖組分的還原糖種類和含量；所述對(duì)照組溶液為將同樣的蟲草多糖不經(jīng)過步驟I的離子液預(yù)處理及多糖再生，而是直接進(jìn)行步驟2的酸溶劑水解處理得到的檢測(cè)液；
[0049]所述離子色譜儀系統(tǒng)采用在線脫氣裝置的梯度泵，配25 μ L進(jìn)樣環(huán)的柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器和配有薄膜型安培池的電化學(xué)檢測(cè)器，色譜柱采用CarboPacTM PAl分析柱(4mm X 250mm)和CarboPacTM PAl保護(hù)柱(4mm X 50mm),柱溫30 °C,流動(dòng)相流速固定在1.0mL/min，進(jìn)樣體積固定在20 yL ;所述離子色譜儀系統(tǒng)中色譜柱的淋洗條件為:水和300mmoL/L NaOH溶液以二元梯度淋洗方式來進(jìn)行色譜分離，在最初的20min，采用體積分?jǐn)?shù)為95%水和5%的300mmoL/L的NaOH溶液二元混合液等度淋洗方式，然后以臺(tái)階改變方式在0.1min內(nèi)將淋洗液變?yōu)?00%的300mmoL/L NaOH溶液，并保持25min。
[0050]經(jīng)過HPAEC-PAD定性和定量分析，對(duì)照組溶液中的多糖水解產(chǎn)物中糖組分主要有葡萄糖和甘露糖，此外還有少量的麥芽糖和麥芽三糖，而本發(fā)明方法得到的多糖檢測(cè)液中麥芽糖和麥芽三糖未檢出。對(duì)照組溶液中蟲草多糖還原糖為44.23g/100g,本發(fā)明方法所得多糖檢測(cè)液中蟲草多糖還原糖含量提高了 18.20g/100g ;本發(fā)明方法處理后的多糖檢測(cè)液檢出葡萄糖含量比對(duì)照組溶液中的葡萄糖含量增加了 68.9% ;對(duì)照組溶液中葡萄糖濃度為540.2mg/L，本發(fā)明方法處理所得的多糖檢測(cè)液中葡萄糖濃度達(dá)到912.3mg/L。[0051]本實(shí)施例方法處理得到的蟲草多糖檢測(cè)液的離子色譜圖如圖1所示。
[0052]用比色管觀察對(duì)照組溶液及本發(fā)明方法處理所得的蟲草多糖檢測(cè)液，對(duì)照組溶液呈淡黃褐色，蟲草多糖檢測(cè)液呈澄清。
[0053]實(shí)施例3
[0054]一種測(cè)定多糖糖組分的方法，具體步驟如下:
[0055]1、離子液預(yù)處理及多糖再生:稱取0.2g在60°C真空度為0.098kPa的真空干燥箱中恒溫干燥4h的凝結(jié)多糖，與5g的再生溶劑[Amim]Cl混合在油浴鍋中充分溶解4h，得到凝結(jié)多糖溶解液；將凝結(jié)多糖溶解液加入到5倍離子液容積的無水乙醇中再生，反復(fù)沖洗，離心沉降，得到再生凝結(jié)多糖粗產(chǎn)品，將再生凝結(jié)多糖粗產(chǎn)品置于通風(fēng)櫥中充分揮發(fā)再生溶劑，再在溫度80°C、真空度0.05KPa環(huán)境中干燥時(shí)間2h后得到再生凝結(jié)多糖；
[0056]2、酸溶劑水解:將步驟I所得再生凝結(jié)多糖與2mL的4mol/L的鹽酸溶液放入安培瓶中并密封，于油浴鍋中100°c下水解4h后，轉(zhuǎn)速7000r/min離心IOmin后取上清液，將上清液用超純水定容至IOOmL,稀釋10倍后過0.2 μ m的濾膜，得到多糖檢測(cè)液；
[0057]3、HPAEC-PAD檢測(cè):用離子色譜-脈沖安培法對(duì)對(duì)照組溶液及步驟2所得的多糖檢測(cè)液進(jìn)行檢測(cè)分析多糖中糖組分的還原糖種類和含量；所述對(duì)照組溶液為將同樣的凝結(jié)多糖不經(jīng)過步驟I的離子液預(yù)處理及多糖再生，而是直接進(jìn)行步驟2的酸溶劑水解處理得到的檢測(cè)液；
[0058]所述離子色譜儀系統(tǒng)采用在線脫氣裝置的梯度泵，配25 μ L進(jìn)樣環(huán)的柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器和配有薄膜型安培池的電化學(xué)檢測(cè)器，色譜柱采用CarboPacTM PAl分析柱(4mm X 250mm)和CarboPacTM PAl保護(hù)柱(4mm X 50mm),柱溫30 °C,流動(dòng)相流速固定在1.0mL/min，進(jìn)樣體積固定在20 yL ;所述離子色譜儀系統(tǒng)中色譜柱的淋洗條件為:水和300mmoL/L NaOH溶液以二元梯度淋洗方式來進(jìn)行色譜分離，在最初的20min，采用體積分?jǐn)?shù)為95%水和5%的300mmoL/L的NaOH溶液二元混合液等度淋洗方式，然后以臺(tái)階改變方式在0.1min內(nèi)將淋洗液變?yōu)?00%的300mmoL/L NaOH溶液，并保持25min。
[0059]經(jīng)過HPAEC-PAD定性和定量分析，對(duì)照組溶液的多糖水解產(chǎn)物中糖組分主要為葡萄糖，還有少量的麥芽糖和麥芽三糖，此外存在痕量的低聚糖等其它糖，而本發(fā)明方法處理得到的多糖檢測(cè)液中麥芽糖和麥芽三糖未檢出；對(duì)照組溶液中凝結(jié)多糖還原糖為53.67g/100g，本發(fā)明方法所得多糖檢測(cè)液中凝結(jié)多糖還原糖含量提高了 19.72g/100g ；本發(fā)明方法處理后的多糖檢測(cè)液檢出葡萄糖含量比對(duì)照組溶液中的葡萄糖含量增加了68.32% ;對(duì)照組溶液中葡萄糖濃度為552.6mg/L，本發(fā)明方法處理所得的多糖檢測(cè)液中葡萄糖濃度達(dá)到930.lmg/L。
[0060]用比色管觀察對(duì)照組溶液及本發(fā)明方法處理所得的凝結(jié)多糖檢測(cè)液，對(duì)照組溶液呈淺黃褐色，凝結(jié)多糖檢測(cè)液呈澄清。
[0061]實(shí)施例4
[0062]一種測(cè)定多糖糖組分的方法，具體步驟如下:
[0063]1、離子液預(yù)處理及多糖再生:稱取0.2g在70°C真空度為0.098kPa的真空干燥箱中恒溫干燥3h的龍膽多糖，與4g的再生溶劑[BMM]C1混合在油浴鍋中充分溶解2h，得到龍膽多糖溶解液；將龍膽多糖溶解液加入到5倍離子液容積的無水乙醇中再生，反復(fù)沖洗，離心沉降，得到再生龍膽多糖粗產(chǎn)品，將再生龍膽多糖粗產(chǎn)品置于通風(fēng)櫥中充分揮發(fā)再生溶劑，再在溫度70°C、真空度0.06KPa環(huán)境中干燥時(shí)間3h后得到再生龍膽多糖；
[0064]2、酸溶劑水解:將步驟I所得再生龍膽多糖與2mL的2mol/L的三氟乙酸溶液放入安培瓶中并密封，于油浴鍋中100°c下水解2h后，轉(zhuǎn)速7000r/min離心IOmin后取上清液，將上清液用超純水定容至IOOmL,稀釋10倍后過0.2 μ m的濾膜，得到多糖檢測(cè)液；
[0065]3、HPAEC-PAD檢測(cè):用離子色譜-脈沖安培法對(duì)對(duì)照組溶液及步驟2所得的多糖檢測(cè)液進(jìn)行檢測(cè)分析多糖中糖組分的還原糖種類和含量；所述對(duì)照組溶液為將同樣的龍膽多糖不經(jīng)過步驟I的離子液預(yù)處理及多糖再生，而是直接進(jìn)行步驟2的酸溶劑水解處理得到的檢測(cè)液；
[0066]所述離子色譜儀系統(tǒng)采用在線脫氣裝置的梯度泵，配25 μ L進(jìn)樣環(huán)的柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器和配有薄膜型安培池的電化學(xué)檢測(cè)器，色譜柱采用CarboPacTM PAl分析柱(4mm X 250mm)和CarboPacTM PAl保護(hù)柱(4mm X 50mm),柱溫30 °C,流動(dòng)相流速固定在
1.0mL/min，進(jìn)樣體積固定在20 yL ;所述離子色譜儀系統(tǒng)中色譜柱的淋洗條件為:水和300mmoL/L NaOH溶液以二元梯度淋洗方式來進(jìn)行色譜分離，在最初的20min，采用體積分?jǐn)?shù)為95%水和5%的300mmoL/L的NaOH溶液二元混合液等度淋洗方式，然后以臺(tái)階改變方式在0.1min內(nèi)將淋洗液變?yōu)?00%的300mmoL/L NaOH溶液，并保持25min。
[0067]經(jīng)過HPAEC-PAD定性和定量分析，對(duì)照組溶液的多糖水解產(chǎn)物中糖組分主要為葡萄糖，還有少量的麥芽糖和麥芽三糖，此外存在痕量的低聚糖等其它糖，而本發(fā)明方法處理得到的多糖檢測(cè)液中麥芽糖和麥芽三糖含量明顯低于對(duì)照組溶液中的含量；對(duì)照組溶液中龍膽多糖還原糖為58.13g/100g，本發(fā)明方法處理所得多糖檢測(cè)液中龍膽多糖還原糖含量提高了 15.43g/100g ;本發(fā)明方法處理后的多糖檢測(cè)液檢出葡萄糖含量比對(duì)照組溶液中的葡萄糖含量增加了 54.38% ;本發(fā)明方法處理后的多糖檢測(cè)液檢出甘露糖含量比對(duì)照組溶液中甘露糖含量增加了 57.24%。
[0068]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種測(cè)定多糖糖組分的分析方法，其特征在于包括以下步驟: (1)離子液預(yù)處理及多糖再生:將待測(cè)多糖與離子液在油浴鍋中充分溶解得到多糖溶解液，待所述多糖溶解液冷卻后倒入再生溶劑中得到沉淀，反復(fù)沖洗，離心得到再生多糖粗產(chǎn)品，通風(fēng)使再生多糖粗產(chǎn)品內(nèi)殘余的再生溶劑完全揮發(fā)，干燥后得到再生多糖； (2)酸溶劑水解:將步驟(I)所得再生多糖與酸溶劑混合置于安培瓶中并密封，將密封后的安培瓶放入油浴鍋中進(jìn)行水解反應(yīng)，水解反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行離心，取上清液進(jìn)行檢測(cè)前處理，得到多糖檢測(cè)液； (3)離子色譜-脈沖安培法檢測(cè)單糖組分:采用離子色譜儀系統(tǒng)，應(yīng)用離子色譜-脈沖安培法分析多糖檢測(cè)液中單糖組分的還原糖種類和含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定多糖糖組分的分析方法，其特征在于在步驟(I)中: 所述離子液為1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽、1-乙基-3-甲基咪唑醋酸鹽、1-烯丙基或3-甲基咪唑氯鹽中的一種以上； 所述待測(cè)多糖與離子液的質(zhì)量比為1: (15?25)； 所述充分溶解的條件為:溶解溫度為80?100°C，溶解時(shí)間為2?4h ; 所述多糖溶解液冷卻后的溫度為50°C ； 所述再生溶劑為無水乙醇或水； 所述再生溶劑的用量為離子液體積的5?10倍； 所述干燥的條件為:干燥溫度為50?80°C，真空度為0.05?0.1KPa,干燥時(shí)間為2?5h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定多糖糖組分的分析方法，其特征在于在步驟(2)中: 所述酸溶劑為三氟乙酸、硫酸或鹽酸中的一種以上； 所述酸溶劑的濃度為2?4mol/L ； 所述酸溶劑的用量為:每g再生多糖對(duì)應(yīng)使用IOmL的酸溶劑； 所述水解反應(yīng)的條件為:反應(yīng)溫度為70?120°C，反應(yīng)時(shí)間為2?4h ; 所述離心的條件為:轉(zhuǎn)速為7000r/min,時(shí)間為IOmin ； 所述檢測(cè)前處理的具體步驟為:用超純水對(duì)上清液進(jìn)行定容，稀釋后過0.2μπι濾膜。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定多糖糖組分的分析方法，其特征在于在步驟(3)中:所述離子色譜儀系統(tǒng)采用在線脫氣裝置的梯度泵，配25 μ L進(jìn)樣環(huán)的柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器和配有薄膜型安培池的電化學(xué)檢測(cè)器，色譜柱采用CarboPacTM PAl分析柱(4mmX250mm)和CarboPacTM PAl保護(hù)柱(4mmX 50mm),柱溫30°C,流動(dòng)相流速固定在1.0mL/min,進(jìn)樣體積固定在20 μ L0
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的測(cè)定多糖糖組分的分析方法，其特征在于:所述離子色譜儀系統(tǒng)中色譜柱的淋洗條件為:水和300mmoL/L的NaOH溶液以二元梯度淋洗方式進(jìn)行色譜分離，在最初的20min，采用體積分?jǐn)?shù)為95%水和5%的300mmoL/L的NaOH溶液二元混合液等度淋洗方式，然后以臺(tái)階改變方式在0.1min內(nèi)將淋洗液變?yōu)?00%的300mmoL/L NaOH溶液，并保持25min。
【文檔編號(hào)】G01N27/48GK104007201SQ201410236122
【公開日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月29日
【發(fā)明者】王兆梅, 廖偉, 李滿鳳 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)