使用堿性脫木質(zhì)化劑加工木質(zhì)纖維素材料的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于由木質(zhì)纖維素材料得到糖和木質(zhì)素部分的方法和用于使用得自木質(zhì)纖維素的糖類生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的方法。具體地，本發(fā)明涉及用于改善酶促水解產(chǎn)物中的糖產(chǎn)率的方法，通過引入熱水水解的預處理步驟和堿脫木質(zhì)化步驟來進行。
【專利說明】使用堿性脫木質(zhì)化劑加工木質(zhì)纖維素材料的方法 發(fā)明領域
[0001] 本發(fā)明涉及用于由木質(zhì)纖維素材料得到糖和木質(zhì)素部分的方法并且涉及使用得 自木質(zhì)纖維素的糖類生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的方法。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 木質(zhì)纖維素是地球上最豐富的生物聚合物。木質(zhì)纖維素是木本植物和非木本植物 如草的主要結構性組分。木質(zhì)纖維素生物質(zhì)指由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成的植物生 物質(zhì)。大量木質(zhì)纖維素殘余物由林業(yè)、伐木和制漿和造紙業(yè)和農(nóng)業(yè)活動(例如麥桿、秸桿、甘 蔗渣、谷殼、外殼)和許多農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生。另外，城市廢物含有可以視為木質(zhì)纖維素殘余物的 部分，如廢紙或廢紙板、花園廢棄物或來自建筑業(yè)的廢棄木材。木質(zhì)纖維素殘余物，例如農(nóng) 業(yè)廢物提供了高度可持續(xù)的、非食品的和非-ILUC(間接土地使用改變)的生物燃料的可替 代選擇。此外，歸因于高豐度和低價格，木質(zhì)纖維素殘余物是用于生產(chǎn)生物燃料的優(yōu)選材 料。此外，具有生物質(zhì)生產(chǎn)率的專用木質(zhì)或草本能源作物贏得作為生物燃料使用的興趣。
[0004] 已經(jīng)廣泛地研究了通過微生物發(fā)酵從木質(zhì)纖維素材料中生產(chǎn)生物燃料，尤其乙 醇。利用木質(zhì)纖維素以便微生物學生產(chǎn)生物燃料或生物燃料原料的最大挑戰(zhàn)在于木質(zhì)纖維 素材料的復雜性及其抗生物降解性。在木質(zhì)纖維素中，纖維素(植物干重的20-50% )纖維包 埋在半纖維素（20-40%)、果膠（2-20%)和木質(zhì)素（10-25%)的共價存在的基質(zhì)中，形成非 常抵抗生物降解的結構。另外，半纖維素的糖殘基含有取決于生物質(zhì)的己糖(例如，葡萄糖、 甘露糖和半乳糖)和戊糖(例如，阿拉伯糖和木糖)的不同混合物。
[0005] 某些微生物可以由有機分子例如衍生自木質(zhì)素纖維素的糖類生產(chǎn)脂質(zhì)。某些微生 物典型地為酵母、真菌或細菌可以有效地將木質(zhì)纖維素材料中的C6和C5糖類轉(zhuǎn)化成油。由 異養(yǎng)微生物產(chǎn)生的油通常稱作單細胞油或微生物油。使用異養(yǎng)微生物的單細胞油生產(chǎn)方法 典型地包含在充氧的生物反應器中培養(yǎng)微生物、允許細胞蓄積脂質(zhì)、收獲富含脂質(zhì)的細胞 并且從細胞中回收油?；谖⑸锏闹|(zhì)（即單細胞油)可以用作用于生產(chǎn)生物燃料，例如 生化柴油、可再生柴油或生物噴氣式發(fā)動機燃料。
[0006] 在經(jīng)濟上切實可行的通過微生物發(fā)酵由木質(zhì)纖維素材料生產(chǎn)生物燃料需要將木 質(zhì)纖維素材料的所有主要的碳水化合物成分有效地轉(zhuǎn)化成生物燃料。另一方面，生物燃料 生產(chǎn)的經(jīng)濟上的切實可行性需要必須將木質(zhì)纖維素材料的所有主要碳水化合物成分轉(zhuǎn)化 成適合于微生物產(chǎn)生的糖。一般地，這意味著破壞(水解)半纖維素和纖維素的聚合物結構 以得到單體糖。
[0007] 現(xiàn)有技術公開了幾種方法，它們可以用于由木質(zhì)纖維素材料生產(chǎn)糖。
[0008] 專利公開號US2008/032344 A1公開了用于從木質(zhì)纖維素生物質(zhì)中回收纖維素糖 和近天然木質(zhì)素副產(chǎn)物的方法。該方法包括對原料減小自水解、有機溶劑和酶促水解處理， 以產(chǎn)生包含葡萄糖的纖維素糖溶液，用酵母和/或適合的重組微生物發(fā)酵，產(chǎn)生生物燃料 和/或化學物質(zhì)。
[0009] Cunningham和Carr(1984)已經(jīng)報道了從麥猜中除去半纖維素和木質(zhì)素的各種方 法，得到改良的纖維素殘余物，用于酶促水解。他們還公開了預處理方法，其包含自水解麥 秸，然后用NaOH進行堿處理。用于自水解的麥秸的脫木質(zhì)化的NaOH的量明顯高于本發(fā)明。根 據(jù)Cunningham和Carr的教導，自水解的麥桿的脫木質(zhì)化處理沒有顯著地改善酶處理步驟中 纖維素向葡萄糖的轉(zhuǎn)化，而無自水解步驟的堿處理顯著地改善了酶促水解的結果(參見表1II和IV)。此外，得到的半纖維素和纖維素水解產(chǎn)物無法用于生產(chǎn)植物本發(fā)明中的單細胞 油。
[0010]專利公開號US 2013/143285 A1描述了用于將木質(zhì)纖維素原料轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖的 方法。該方法包括在pH 8-12下對木質(zhì)纖維素原料進行堿處理、稀酸處理且最終進行酶促水 解，產(chǎn)生包含葡萄糖的糖溶液，將其發(fā)酵成發(fā)酵產(chǎn)物。
[0011]專利公開號US 2012/036768A1描述了由木質(zhì)纖維素材料生產(chǎn)可發(fā)酵糖的方法，其 中該方法是將預處理的木質(zhì)纖維素材料進行兩階段酶促水解處理。第一次酶處理包含混合 預處理的材料與第一種酶組合物，產(chǎn)生第一種水解混合物，將其增稠以增加纖維濃度，得到 第二種水解混合物。第二次酶處理包含混合第二種水解混合物與第二種酶組合物，產(chǎn)生包 含可發(fā)酵糖和固體木質(zhì)素相的液體混合物。
[0012] 在由木質(zhì)纖維素材料生產(chǎn)木質(zhì)纖維素糖的過程中的主要挑戰(zhàn)之一在于提供一種 方法，其能夠以成本有效的方式生產(chǎn)高質(zhì)量糖水解產(chǎn)物，它們可以在不進一步純化的情況 下用于生產(chǎn)單細胞油。高質(zhì)量的糖水解產(chǎn)物是指雜質(zhì)例如苯酚和酸的量應當?shù)陀趯τ糜诎l(fā) 酵的微生物產(chǎn)生毒性的濃度。成本效益要求水解劑如酶的消耗應當保持在低水平。例如，這 可以通過使熟化的化學物質(zhì)再循環(huán)實現(xiàn)。經(jīng)濟上的切實可行性要求并不用作微生物發(fā)酵的 原料的側流的質(zhì)量應當盡可能高至能夠?qū)@些物流實施物價穩(wěn)定措施。
[0013] 現(xiàn)有技術工藝水平的木質(zhì)纖維素預處理技術已經(jīng)被設計用于厭氧發(fā)酵(纖維素乙 醇）。微生物油生產(chǎn)不同于厭氧發(fā)酵，因為它是需氧過程(需要氧）。本發(fā)明描述了木質(zhì)纖維 素分級分離方法，其尤其對于需氧生物過程如微生物油生產(chǎn)有益。
[0014] 發(fā)明概述
[0015] 本發(fā)明的一個目的在于提供木質(zhì)纖維素分級分離方法，其能夠生產(chǎn)高質(zhì)量的可用 作使用異養(yǎng)微生物生產(chǎn)微生物油中的碳源的糖水解產(chǎn)物。
[0016] 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種分級分離方法，其具有改善的生產(chǎn)力和纖維素 部分酶促水解的產(chǎn)率。
[0017] 本發(fā)明的第三個目的在于提供生產(chǎn)高質(zhì)量木質(zhì)素部分的分級分離方法。
[0018] 本發(fā)明的第四個目的在于提供一種分級分離方法，其具有改善的需氧發(fā)酵方法成 本效益，這歸因于用于需氧發(fā)酵中惰性物質(zhì)(木質(zhì)素)和抑制劑的量較低。
[0019] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的特征在于獨立權利要求中所定義的特征。
[0020] 在本發(fā)明的第一方面涉及用于分級分離木質(zhì)纖維素材料的方法，該方法包括：
[0021] a)對木質(zhì)纖維素材料進行處理，其中從木質(zhì)纖維素材料中至少部分除去半纖維素 以產(chǎn)生包含第一液相與第一固相的混合物；
[0022] b)使第一固相與第一液相分離；
[0023] c)在堿性脫木質(zhì)化劑的存在下對第一固相進行脫木質(zhì)化處理，以產(chǎn)生包含第二固 相和包含增溶的木質(zhì)素的第二液相的混合物；
[0024] d)使第二固相與第二液相分離；
[0025] e)在能夠水解第二固相的半纖維素和纖維素部分的酶的存在下對第二固相進行 酶促水解處理，以產(chǎn)生包含第三液相和第三固相的混合物。
[0026]本發(fā)明的第二方面涉及通過本發(fā)明方法可得到的酶促水解產(chǎn)物形式的液相(第三 液相）。
[0027]本發(fā)明的第三個方面是通過本發(fā)明方法可得到的濃糖水解產(chǎn)物。
[0028] 第四個方面涉及通過本發(fā)明方法可得到的沉淀的木質(zhì)素部分。
[0029] 本發(fā)明的另一個方面涉及用于生產(chǎn)微生物脂質(zhì)的方法，該方法包括：
[0030] (i)提供包含通過用于分級分離木質(zhì)纖維素材料(第三液相)的方法得到的酶促水 解產(chǎn)物液相或本發(fā)明的濃糖水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基；
[0031 ] (ii)通過給所述培養(yǎng)基接種含油微生物提供發(fā)酵肉湯；
[0032] (iii)溫育所述用所述含油微生物接種的培養(yǎng)基，以使脂質(zhì)蓄積；
[0033] (vi)從所述含油微生物中回收脂質(zhì)。
[0034] 另外的優(yōu)選實施方案在從屬權利要求中呈現(xiàn)。
[0035] 本發(fā)明基于如下發(fā)現(xiàn):通過進行溶解半纖維素的處理和通過在酶促水解步驟前用 堿處理分離木質(zhì)素，總糖產(chǎn)率增加。這是重要的，因為本發(fā)明的目的在于盡可能多地從木質(zhì) 纖維素材料中提取糖。本發(fā)明的另一個優(yōu)點在于酶促水解的效率和需氧發(fā)酵的成本效益得 到顯著改善。
[0036] 本發(fā)明還基于另一個發(fā)現(xiàn):可以使用與現(xiàn)有技術公開相比極低量的堿劑進行堿處 理。
[0037] 本發(fā)明還基于如下發(fā)現(xiàn):在脫木質(zhì)化前從木質(zhì)纖維素材料中分離的半纖維素糖可 以在不經(jīng)任何純化處理的情況下用于微生物發(fā)酵。
[0038]本發(fā)明提供了如下優(yōu)點：
[0039] -高總糖產(chǎn)率，纖維素和半纖維素糖有效地被回收
[0040] -在糖產(chǎn)率和產(chǎn)率方面纖維素部分更有效地酶促水解；
[0041 ]-產(chǎn)生高質(zhì)量木質(zhì)素部分，其能夠?qū)崿F(xiàn)木質(zhì)素物價穩(wěn)定措施；
[0042]-增加需氧發(fā)酵過程的成本效益；
[0043]-由包含少量木質(zhì)素的需氧發(fā)酵產(chǎn)生高質(zhì)量的微生物生物質(zhì)殘余物，從而能夠?qū)?該殘余物用作動物飼料；
[0044]-脫木質(zhì)化的堿性劑消耗減少，且隨后溶解的木質(zhì)素沉淀和酶促水解前pH調(diào)節(jié)中 酸的消耗減少。
[0045] 附圖簡述
[0046] 圖1-4呈現(xiàn)本發(fā)明實施方案的流程圖。
[0047]圖5呈現(xiàn)本發(fā)明實施方案的酶促水解的流程圖。
[0048] 圖6呈現(xiàn)24h、48h和72h后、第一次、第二次和第三次依次水解后和固體再循環(huán)和再 經(jīng)過24h反應后分批水解中來自NaOH-脫木質(zhì)化麥桿和自水解麥桿的總糖產(chǎn)率。
[0049]圖7呈現(xiàn)分批水解、依次水解和固體再循環(huán)中NaOH-脫木質(zhì)化麥桿和自水解麥桿水 解中的酶生產(chǎn)力。
[0050]圖8呈現(xiàn)分批水解、依次水解和固體再循環(huán)的體積糖產(chǎn)率。
[0051]圖9呈現(xiàn)在水解(A)、反應體積(B)和反應稠度(C)方面具有50%再循環(huán)率的固體再 循環(huán)反應進程。
[0052]圖10呈現(xiàn)米曲霉(Aspergi 1 lus oryzae)對麥猜水解產(chǎn)物的分批補料發(fā)酵結果。 [0053]圖11呈現(xiàn)來自麥秸自水解的固體殘余物產(chǎn)率。
[0054] 圖12呈現(xiàn)在得自麥秸自水解的10%稠度(g麥桿固體干物質(zhì)/g總物質(zhì)）的液體部分 中總可溶性糖(g/Ι，左側y_軸)和潛在的微生物抑制劑物質(zhì);糠醛、輕甲基糠醛(HMF)和可溶 性酚類(g/Ι，右側y-周）的濃度。
[0055] 表1.來自具有不同脫木質(zhì)化處理的自水解的麥桿的干物質(zhì)產(chǎn)率(DM產(chǎn)率)比較。來 自脫木質(zhì)化麥桿的酶促水解的糖產(chǎn)率依賴于處理條件。基于自水解的麥桿的干物質(zhì)并且基 于自水解的麥桿的碳水化合物含量給出如下的糖產(chǎn)率。
[0056]表2:進料前生長培養(yǎng)基的組成。
[0057]表3: pH設定至5，5的接種培養(yǎng)基的組成。
[0058]表4:發(fā)酵培養(yǎng)基的組成。
[0059]發(fā)明詳述
[0060]在描述本發(fā)明的過程中，為清楚起見可以采用特定的術語。然而，并不打算將本發(fā) 明限制到如此選擇的特定術語，且應當理解，每個特定的術語包括為實現(xiàn)類似目的以類似 方式操作的所有技術等效術語。
[0061 ] 定義
[0062] 木質(zhì)纖維素材料
[0063] 術語"木質(zhì)纖維素生物質(zhì)"或"木質(zhì)纖維素材料"的含義包括、但不限于木本植物或 非木本植物、草本植物或其它包含纖維素和/或半纖維素的材料:材料可以是農(nóng)業(yè)廢物(例 如麥秸、麥桿、谷殼、外殼、谷類秸桿、甘蔗渣、甘蔗尖和葉）、專用能源作物(如柳枝稷、芒屬 (Miscanthus)、蘆竹(Arundo donax)、草蘆（reed canary grass)、柳樹、風眼蓮、能源甘鹿 (energy cane)、能源高粱（energy sorghum))、木材或殘余物(包括鋸木廠和紙衆(zhòng)和/或造 紙廠殘渣或碎片，例如半纖維素、消耗的亞硫酸鹽廢液、廢纖維和/或初沉淤泥）、苔蘚植物 或泥煤或市場造紙廢水。術語木質(zhì)纖維素材料還包含低木質(zhì)素材料，例如巨藻類生物質(zhì)這 樣的材料。此外，該材料還包含半纖維素或來自工業(yè)實踐的纖維素部分。術語木質(zhì)纖維素材 料包括任意種類的纖維素部分。原料或一些部分例如來自不同來源的纖維素、植物種類或 工業(yè)加工的半纖維素和/或纖維素可以彼此混合并且用作根據(jù)本公開的培養(yǎng)微生物生物質(zhì) 的原料。典型地，木質(zhì)纖維素中的木質(zhì)素含量高于5%。木質(zhì)纖維素生物質(zhì)還可以包含淀粉， 例如在全植物情況中。
[0064] 水解
[0065] 術語"水解"在本文中是指通過將水加入到非單體碳水化合物的糖苷鍵或酯鍵上 解聚成糖寡聚體和單體或羧酸。
[0066] 水解產(chǎn)物
[0067]術語"水解產(chǎn)物"或"水解材料"在本文中是指已經(jīng)進行水解的材料。
[0068] 木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物
[0069] 術語"木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物"在本文中是指木質(zhì)纖維素或包含纖維素和/或半纖維 素的木質(zhì)纖維素材料、寡糖類、單糖類和/或二糖類、乙酸、甲酸、其它有機酸、糠醛、羥甲基 糠醛、乙酰丙酸、酚類化合物的水解產(chǎn)物、其它由木質(zhì)素、纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)纖維 素的其它成分水解和/或降解產(chǎn)物、來源于蛋白質(zhì)、金屬的氮化合物和/或木質(zhì)纖維素的非 水解或部分水解片段。
[0070] 芳香化合物、酚類化合物
[0071] 芳香烴在本文中是指具有通過碳原子之間的共價鍵形成的環(huán)結構的在環(huán)結構上 包含交替共輒雙鍵和單鍵的化合物。芳香化合物還可以指具有通過碳原子和非碳原子之間 的共價鍵形成的環(huán)結構的在環(huán)結構上包含交替共輒雙鍵和單鍵的化合物。
[0072] 術語"酚類化合物"在本文中是指包含至少一個芳香烴基的化合物，所述芳香烴基 包含至少一個直接連接至芳香烴基的羥基基團（-OH)。在本申請中，已經(jīng)使用比色分析、根 據(jù)Folin-Ciocalteu方法(Waterhouse ,2002)測定了酸類化合物的濃度。這類化合物包括、 但不限于酚類化合物，例如對-香豆醇、松柏醇、芥子醇、4-羥基苯乙酮、香草乙酮、乙酰丁香 酮、4-羥基苯甲醛、香草醛、丁香醛、4-羥基苯甲酸、香草酸、紫丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、芥 子酸、苯酚、愈創(chuàng)木酚、丁香醇（syringol)、氫醌、兒茶酚、2-甲酚、3-甲酚、4-甲酚、2,6_二甲 酚、2,4_二甲酚、4-乙酚、3,4_二羥基苯甲醛、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基酚、4-乙基-2-甲 酚、4-烯丙基酚、3-甲氧基兒茶酚、2,6_二甲氧基-4-甲酚、香草醇、高香草醛、高草香酸、1-(4-羥基-3-甲氧基苯基）乙醇、1-(4-羥基-3-甲氧基苯基）丙二烯、香草酸甲酯、4-乙基-2， 6-二甲氧基酚、4-甲基兒茶酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-丙酚、4-乙酰基愈創(chuàng)木酚、4-羥基芐醇、 3-羥基-2-甲基-(4H)-吡喃-4-酮、3，5_二羥基-2-甲基-(4H)-吡喃-4-酮、4-丙烯基酚、2,6-二甲氧基-4-丙酚、二氫松柏醇、高丁香醛、3，5-二甲氧基-4-羥基芐醇、2，6-二甲氧基-4-丙 烯基酸、1-(3,5-二甲氧基-4-羥基苯基）乙醇、松柏醛、丁香基丙酮（syringylacetone)、紫 丁香酸甲酯、丙酰丁香酮(propiosyringone)、丁香基乙烯基酮（syringyl vinyl ketone)、 二氫芥子醇、芥子醛(sinapaldehyde)、2,6-二甲氧基酚、l-(4-羥基苯基）乙醇、丁香酚、5-乙基焦沒食子酚、4-丙基愈創(chuàng)木酚、l，4-二羥基-3-甲氧基苯、異丁子香酚、4-羥基苯甲酸甲 酯、愈創(chuàng)木基丙酮、2,6-二甲氧基-4-乙烯基苯酸、丙酰香草酮化1'(^；[0￥311；[110116)、愈創(chuàng)木 基乙烯基酮、4-烯丙基-2,6-二甲氧基苯酚，且包括其可能的異構體、寡聚化和/或聚合木質(zhì) 素、單寧類、多酚類、酚類化合物的混合物、包含非酚類化合物和酚類化合物的共價連接的 化合物。
[0073] 術語"酸類化合物的濃度"是指使用Folin-Ciocal teu方法(Waterhouse，2002)測 定的化合物在水溶液中的濃度(典型地表示為g/1)。
[0074] 水熱處理
[0075]在本發(fā)明的上下文中，術語"水熱處理"是指在超過50°C的溫度下熱處理木質(zhì)纖維 素水性懸浮液。水熱處理可以在加壓反應器中的壓力下或在大氣壓下在不加壓反應器中進 行。當加熱至沸點時或通過加壓氣相可以用得自水的蒸汽生成加壓反應器中的壓力。水熱 處理可以在催化劑的存在下或無催化劑的存在下進行。當對木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的水性懸浮 液在超過120 °C的溫度下在壓力下進行水熱處理時，在無添加的催化劑的情況下進行在無 催化劑的存在下的水熱處理(也稱作"自水解"或"AH"）以水解木質(zhì)纖維素生物質(zhì)。
[0076] "自水解的麥桿"在本文中是指在自水解麥桿后得到的固體部分。自水解的麥桿已 經(jīng)進行洗滌。
[0077] 苛刻度
[0078]術語"苛刻度"在本文中是指用等式1計算且在溫度和反應時間方面描述熱水條件 的因子。
[0079] S = Log(Ro)，
[0080]
，且Tr是基礎溫度（100。〇。
[00811脫木質(zhì)化處理
[0082] "脫木質(zhì)化處理"在本文中是指從木質(zhì)纖維素生物質(zhì)中除去非碳水化合物材料，例 如木質(zhì)素。脫木質(zhì)化處理還指從木質(zhì)纖維素生物質(zhì)中除去非碳水化合物和碳水化合物處理 的處理。
[0083]蒸汽爆裂
[0084]在本發(fā)明的上下文中，術語"蒸汽爆裂"是指這樣的一種處理，其中用高壓蒸汽(在 110°C-250°C、典型地在140-230°C溫度下）、在壓力與添加或不添加化學物質(zhì)(例如酸)的條 件下加熱材料，且將該材料保持在該溫度下一定時間，此后，釋放壓力，導致該物質(zhì)爆裂性 分解。在本文上下文中，將蒸汽爆裂施加于木質(zhì)纖維素材料，且典型地導致木質(zhì)纖維素纖維 的剛性結構破裂，即纖維素纖維束脫纖維。
[0085]堿性脫木質(zhì)化劑
[0086]在本發(fā)明的上下文中，術語"堿性脫木質(zhì)化劑"是指在添加到水中得到具有低于純 水的氫離子活性即pH高于7.0時的化學化合物或化學化合物混合物。堿性脫木質(zhì)化劑可以 選自一組化合物，包含、但不限于氫氧化物，例如LiOH(氫氧化鋰）、NaOH(氫氧化鈉）、Κ0Η(氫 氧化鉀）、Ca(0H) 2(氫氧化鈣）、NH4〇H(氫氧化銨)或可以在水中形成氫氧根離子的化合物例 如液態(tài)或氣態(tài)NH3(氨）、碳酸鹽例如HC0 3-(碳酸氫根離子）、Li2C03(碳酸鋰）、Na2C0 3(碳酸 鈉）、K2C03 (碳酸鉀）、硫化物例如Na2S(硫化鈉)和相應的水合物。
[0087] 堿脫木質(zhì)化處理
[0088]在本發(fā)明的上下文中，術語"堿脫木質(zhì)化處理"是指在有堿脫木質(zhì)化劑、pH(起始 pH)典型地為10-13的存在下進行的木質(zhì)纖維素處理。在堿脫木質(zhì)化處理過程中，過氧化氫 (H202)可以用于與堿脫木質(zhì)化劑組合使用。
[0089]酶促水解
[0090] 在本發(fā)明的上下文中，術語"酶促水解"是指包含纖維素和/或半纖維素的木質(zhì)纖 維素材料。典型地，木質(zhì)纖維素材料的酶促水解處理通過使木質(zhì)纖維素材料在水或緩沖液 的存在下接觸酶的混合物來進行。酶的混合物典型地由1，4-β_葡聚糖酶（內(nèi)切葡聚糖酶 (endoglucanaces)和外切葡聚糖酶或內(nèi)纖維素酶和外纖維素酶）、1，4-β_葡糖苷酶(纖維二 糖酶)和半纖維素-降解酶(半纖維素酶、木聚糖酶、阿拉伯糖酶等)組成，但不限于此。
[0091] 微生物脂質(zhì)或在脂質(zhì)
[0092] 在本發(fā)明的上下文中，"微生物脂質(zhì)"、"脂質(zhì)"或"胞內(nèi)脂質(zhì)"是指脂肪物質(zhì)，其分子 一般包含脂族烴鏈最為組成部分，其在非極性溶劑中溶解，但難溶于水。脂質(zhì)是活細胞內(nèi)大 分子的主要基團。例如，脂質(zhì)是脂肪、油、蠟、蠟酯類、固醇類、萜類化合物、異萜類化合物、類 胡蘿卜素、聚羥基脂肪酸酯類、核酸、脂肪酸、脂肪醇類、脂肪醛類、脂肪酸酯類、磷脂類、糖脂 類、鞘脂類和?；视?，例如三酰甘油、二酰甘油或單酰甘油。本發(fā)明中優(yōu)選的脂質(zhì)是脂肪、 油、蠟、?；视秃椭舅峒捌溲苌?，具體地是三酰甘油和蠟酯類。在本發(fā)明的上下文中， 脂質(zhì)由微生物合成并且蓄積在微生物中（胞內(nèi)脂質(zhì)）。在本發(fā)明的另一個實施方案中，脂質(zhì) 由微生物合成和分泌(胞外脂質(zhì)）。
[0093]在本發(fā)明的相關方面，單細胞油用作脂質(zhì)和脂肪的同義詞。
[0094] 術語"酰基甘油"是指甘油和脂肪酸的酯。酰基甘油最為脂肪和脂肪酸天然存在。 ?；视偷膶嵗ㄈ８视?TAGs，甘油三酯類）、二酰甘油(二脂酰甘油酯類)和單酰甘 油(單酸甘油酯）。
[0095] 糖
[0096] 在本發(fā)明的上下文中，術語"糖"在本文中是指寡聚化、二聚化和單體碳水化合物。 具體地，在本申請中，術語糖是指衍生自木質(zhì)纖維素材料的水溶性寡聚化、二聚化和單體碳 水化合物。所謂術語"聚合糖類"是指為聚合物形式和典型地不溶于水中的碳水化合物。
[0097] 糖產(chǎn)率
[0098] 在本發(fā)明的上下文中，術語"糖產(chǎn)率"在本文中是指來自特定材料的寡聚化、二聚 化和單體碳水化合物的產(chǎn)率。具體地，在本申請中，術語糖產(chǎn)率是指來自木質(zhì)纖維素材料的 寡聚化、二聚化和單體碳水化合物的產(chǎn)率。
[0099]單細胞油生產(chǎn)方法
[0100] "單細胞油生產(chǎn)方法"在本文中是指一種方法，其包含下列步驟:形成或允許合成 脂質(zhì)的微生物生長，并且允許由此得到的微生物質(zhì)產(chǎn)生和/或儲存(蓄積)脂質(zhì);從液相中回 收細胞;并且從細胞中提取或回收脂質(zhì)。在一些情況中，單細胞油還可以是胞外的，例如在 培養(yǎng)過程中或之后在培養(yǎng)基中分泌的或釋放的。
[0101] 需要培養(yǎng)
[0102] 術語"需氧培養(yǎng)"或"需氧發(fā)酵"是指培養(yǎng)，其中微生物利用氧作為能力產(chǎn)生的末端 電子受體(即微生物利用需氧呼吸）。典型地，在生物反應器中，通過添加氧或包含氧的氣體 混合物(典型地為空氣)進行需氧培養(yǎng)，即給生物反應器充氧。當微生物在培養(yǎng)中利用需氧 呼吸時，可以將其稱作"需氧條件下培養(yǎng)"。典型地，這種情況發(fā)生在需氧生物反應器中。
[0103] 含油微生物或產(chǎn)生油的微生物
[0104] 用于本發(fā)明的含油微生物(也稱作產(chǎn)生油的微生物)選自細菌、藍藻菌、真菌例如 酵母和絲狀真菌、古細菌或微藻類。我還是我易于蓄積脂質(zhì)或被遺傳改造以便蓄積脂質(zhì)或 改善脂質(zhì)蓄積。
[0105] 優(yōu)選地，使用能夠利用C6和C5糖的微生物。優(yōu)選地，微生物是酵母。絲狀真菌或細 菌。
[0106] 在本發(fā)明的上下文中，含油微生物（油性微生物）是指能夠蓄積胞內(nèi)脂質(zhì)的微生 物，使得在適合條件下培養(yǎng)時脂質(zhì)占微生物的總生物質(zhì)(每個細胞干重)的至少15% (w/w)。 在一個優(yōu)選的實施方案中，含油微生物能夠蓄積至少20% (w/w)的微生物總生物質(zhì)(每個細 胞干重）。
[0107] 用于本發(fā)明目的的優(yōu)選的微生物包括、但不限于如下列出的種類和屬：
[0108] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，微生物是能夠利用來源于木質(zhì)纖維素材料的糖的含 油微生物。優(yōu)選地，含油微生物能夠利用木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物中的C6糖(六碳糖，例如葡萄 糖、甘露糖和半乳糖)和C5糖(例如木糖和阿拉伯糖）。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，含油微 生物能夠利用木質(zhì)纖維素或部分中的聚合或寡聚碳水化合物。
[0109]優(yōu)選的（絲狀)真菌菌株來自如下屬的種類：曲霉屬(Aspergillus)，例如米曲霉 (Aspergillus oryzae);被抱霉屬（Mortierella)，例如深黃被抱霉（Mortierella 18已匕611；[11&);黑毛菌屬（01&61：0111；[11111);麥角菌屬（(]1&￥；^6口8);枝抱屬（(]1&(1〇8口01^(1；[11111); 小克銀霉屬(0111111；[1^1^1116113);裸孢殼屬化11161'；[06113);鐮刀菌屬(？11831'；[11111);球囊霉屬 (Glomus);毛霉菌屬(Mucor) ;Pseudozyma;腐霉菌屬(Pythium);根霉菌屬(Rhizopus)，例如 稻根霉菌（Rhizopus oryzae);銀耳屬（Tremella);接霉屬（Zygorhynchus);腐質(zhì)霉屬 (Humicola);分枝抱子菌屬（Cladosporium);畸枝霉屬(Malbranchea) ;Umbelopsis，例如 Umbelopsis isabellina和黑粉菌屬(Ustilago)。最優(yōu)選的真菌種類來自曲霉屬和/或被孢 霉屬。優(yōu)選的真菌是能夠有效地產(chǎn)生脂質(zhì)的那些真菌。
[0110] 優(yōu)選的酵母菌株是屬于來自如下屬的種類的那些：地絲菌屬（Geotrichum)、 06卩&^〇1115^6 8、管囊酵母屬(？&(3115^〇1611)、6&1&(31：〇1115^68、漢遜酵母屬(]^118611111&)、白冬抱 酵母屬（1^11。08口01^(1；[11111)、擲抱酵母屬（3口01'0130101115^68)、鎖擲酵母屬（3口01^(1；[01301118)、 Waltomyces、隱球菌屬（Cryptococcus)例如彎曲隱球菌(Cryptococcus curvatus)、紅冬抱 酵母屬（Rhodosporidium)例如圓紅冬抱酵母菌（Rhodosporidium toruloides)或 Rhodosporidium fluviale、紅酵母屬（Rhodotorula)例如膠紅類酵母菌（Rhodotorula glutinis)、子囊菌酵母屬(Yarrowia)例如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、假絲酵 母屬(Candida)例如彎假絲酵母(Candida curvata)、油脂酵母屬(Lipomyces)例如斯氏油 脂酵母（Lipomyces starkeyi)和毛孢子菌屬（Trichosporon)例如皮膚毛孢子菌 (Trichosporon cutaneum)或芽毛抱子菌(Trichosporon pullulans)。大部分優(yōu)選的酵母 來自油脂酵母屬、紅冬孢酵母屬和隱球菌屬。優(yōu)選的酵母是能夠有效地產(chǎn)生脂質(zhì)的那些酵 母。
[0111] 優(yōu)選的細菌是屬于來自紅球菌屬(Rhodococcus)、不動桿菌屬(Acinetobacter)和 鏈霉菌屬(Streptomyces)的種類的那些細菌。優(yōu)選的細菌是能夠有效地產(chǎn)生脂質(zhì)的那些細 菌。
[0112] 大部分優(yōu)選的藻類是微藻，例如來自如下屬的微藻種類，包含Brachiomonas、 Crypthecodinium、小球藻屬（Chlorella)、杜氏藻屬（Dunaliella)、菱板藻屬 (他1^2 8(：11丨&)、似11110(3111〇1^8、微擬球藻(似11110(3111〇1'(^8丨8)、菱形藻屬（附七2 8(311丨&)、原壁 菌屬（Prototheca)、柵藻屬（Scenedesmus)、裂殖壺菌屬（Scihizochytrium)、破囊壺菌 (Traustrochytrium)和吾肯氏壺菌屬(Ulkenia)。優(yōu)選的微藻是能夠非自養(yǎng)地生長和有效 地產(chǎn)生脂質(zhì)的那些微藻。屬于裂殖壺菌屬(3〇1112〇〇115^1'；[11111)、破囊壺菌和07卩1:11600(1;[11；[11111 和吾肯氏壺菌屬的微生物稱作海洋真菌。
[0113]根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，來自木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的碳水化合物主要是單體 形式，且不能利用寡聚化或聚合碳水化合物的微生物用于單細胞油生產(chǎn)。這類產(chǎn)生油的微 生物選自細菌、藍藻菌、真菌例如酵母和絲狀真菌、古細菌或微藻。微生物易于蓄積脂質(zhì)或 被遺傳修飾以便蓄積脂質(zhì)或改善脂質(zhì)蓄積。
[0114]脂質(zhì)回收
[0115] "油回收"或"脂質(zhì)回收"或"從含油微生物中回收脂質(zhì)"是指一種方法，其中通過機 械、化學、熱機械或自動催化方法或通過這些方法的組合從微生物細胞中回收脂質(zhì)(胞內(nèi)脂 質(zhì)）?；蛘撸?油回收"可以指從培養(yǎng)(發(fā)酵)肉湯中回收胞外產(chǎn)生的脂質(zhì)。
[0116]包含脂質(zhì)的單細胞量
[0117] "包含脂質(zhì)的單細胞量"表示具有優(yōu)選至少10%、優(yōu)選至少15% (w/w)或以上的微 生物生物質(zhì)干物質(zhì)的單細胞量和細胞菌絲體。
[0118] 殘留細胞量
[0119] 在本發(fā)明的上下文中，"殘留細胞量"是指固體、半固體或流動材料部分，其包含為 回收胞內(nèi)脂質(zhì)處理的微生物。
[0120] 生物燃料
[0121] 在本發(fā)明的上下文中，"生物燃料"指主要源自生物質(zhì)或生物廢棄物的固態(tài)、液態(tài) 或氣態(tài)燃料并且與源自史前植物和動物的有機殘留物的化石燃料不同。
[0122] 根據(jù)EU法令2003/30/EU，"生物柴油"指從植物油或動物油中產(chǎn)生的甲基酯，其具 有用作生物燃料的柴油品質(zhì)。更廣泛地，生物柴油指來自植物油或動物油的具有柴油品質(zhì) 的長鏈烷基酯，如甲基酯、乙基酯或丙基酯。生物柴油也可以從微生物脂質(zhì)產(chǎn)生，從而微生 物脂質(zhì)可以源自細菌、真菌(酵母或霉菌）、藻類或另一種微生物。
[0123] 可再生柴油
[0124] "可再生柴油"指這樣的燃料，其通過氫處理動物源、植物源或微生物源脂質(zhì)或其 混合物產(chǎn)生的燃料，因而微生物脂質(zhì)可以源自細菌、真菌(酵母或霉菌）、藻類或另一種微生 物?？稍偕裼鸵部梢酝ㄟ^氣化和Fischer-Tropsch合成從源自生物質(zhì)的錯產(chǎn)生。任選地， 除了氫處理之外，可以進行異構化或其它加工步驟?？稍偕裼凸に囈部梢杂脕懋a(chǎn)生噴氣 發(fā)動機燃料和/或汽油?？稍偕裼偷纳a(chǎn)已經(jīng)在專利出版物EP139653UEP1398364、 EP1741767 和 EP1741768 中描述。
[0125] 生物柴油或可再生柴油可以與化石燃料摻合。可以將合適的添加劑如防腐劑和抗 氧化劑添加至燃料產(chǎn)品。
[0126] 潤滑劑
[0127] "潤滑劑"指當作為表面涂層施加至運動部件時減少摩擦的物質(zhì)，如潤滑脂、脂質(zhì) 或油。潤滑劑的兩種其他主要功能是散熱和溶解雜質(zhì)。潤滑劑的應用包括但不限于作為發(fā) 動機油用于內(nèi)燃發(fā)動機中、燃料中的添加劑、用于油驅(qū)動裝置如栗和液壓設備，或用于不同 類型的軸承中。一般，潤滑劑含有75-100%基礎油并且其余是添加劑。合適的添加劑是，例 如，洗滌劑、儲存穩(wěn)定劑、抗氧化劑、腐蝕抑制劑、去霧劑、破乳劑、消泡劑、共溶劑和潤滑性 添加劑(見例如，US7，691，792)。潤滑劑的基礎油可以源自礦物油、植物油、動物油或來自細 菌、真菌(酵母或霉菌）、藻類或另一種微生物?；A油也可以通過氣化和Fischer-Tropsch 合成源自從生物質(zhì)衍生的蠟。粘度指數(shù)用來表征基礎油。典型地，高粘度指數(shù)是優(yōu)選的。
[0128] 根據(jù)本發(fā)明中所述方法產(chǎn)生的脂質(zhì)可以用作產(chǎn)生生物柴油、可再生柴油、噴氣式 發(fā)動機燃料或汽油的原料。生物柴油由脂肪酸甲酯組成并且典型地通過酯交換產(chǎn)生。在酯 交換時，?；视娃D(zhuǎn)化成長鏈脂肪酸烷基（甲基、乙基或丙基)酯?？稍偕裼椭竿ㄟ^脂質(zhì)的 氫處理(加氫脫氧、氫化或氫化加工)生產(chǎn)的燃料。在氫處理時，?；视娃D(zhuǎn)化成相應的烷烴 (石蠟）。烷烴(石蠟)可以通過異構化或通過其他工藝變體進一步修飾?？稍偕裼凸に囈?可以用來產(chǎn)生噴氣式發(fā)動機燃料和/或汽油。此外，可以進行脂質(zhì)的裂化以生產(chǎn)生物燃料。 另外，脂質(zhì)可以在某些應用中直接用作生物燃料。
[0129] 采用所述方法產(chǎn)生的脂質(zhì)可以用作潤滑劑（潤滑油）的基礎油或用作生產(chǎn)潤滑劑 基礎油的原料。
[0130] 干物質(zhì)
[0131] "DM"或"干重"在本文中是指干物質(zhì)并且是在進行基本上從材料中除去水的處理 時材料量的測量值(即材料完全干燥）。
[0132] 稠度
[0133] "稠度"在本文中是指固體與懸浮液總重的干重之比。
[0134] 用于分級分離木質(zhì)纖維素材料的方法
[0135] 本發(fā)明的一個目的在于提供分級分離方法，其具有改善的需氧發(fā)酵方法的成本效 益，這歸因于用于需氧發(fā)酵的惰性材料(木質(zhì)素)和糖部分中的抑制劑化合物的低用量。
[0136] 發(fā)明人令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，在不過量應用堿性脫木質(zhì)化劑的情況下可以有效地進行 堿脫木質(zhì)化，條件是木質(zhì)纖維素材料進行水熱處理，例如自水解，然后進行堿脫木質(zhì)化。一 個優(yōu)點在于脫木質(zhì)化中的堿性劑消耗減少且隨后溶解的木質(zhì)素沉淀和pH調(diào)節(jié)中的酸消耗 減少，然后進行酶促水解。
[0137] 本發(fā)明的第一方面涉及對木質(zhì)纖維素材料進行分級分離的方法，該方法包括：
[0138] a)對木質(zhì)纖維素材料進行處理，其中從木質(zhì)纖維素材料中至少部分除去半纖維素 以產(chǎn)生包含第一液相與第一固相的混合物；
[0139] b)使第一固相與第一液相分離；
[0140] c)在堿性脫木質(zhì)化劑的存在下對第一固相進行脫木質(zhì)化處理，以產(chǎn)生包含第二固 相和包含增溶的木質(zhì)素的第二液相的混合物；
[0141] d)使第二固相與第二液相分離；
[0142] e)在能夠水解第二固相的半纖維素和纖維素部分的酶的存在下對第二固相進行 酶促水解處理，以產(chǎn)生包含酶促水解產(chǎn)物形式的第三液相和第三固相的混合物。
[0143] 在另一個步驟中，包含纖維素碳水化合物的第三液相可以與包含木質(zhì)素的第三固 相分離。
[0144] 本發(fā)明方法的一個實施方案圖示在圖1中。本發(fā)明方法的另一個實施方案圖示在 圖2中。圖2中所示的實施方案包括使用酸沉淀得自堿處理的可溶性木質(zhì)素(第一液相)的方 法。
[0145] 從木質(zhì)纖維素材料中部分除去半纖維素糖的步驟
[0146] 在木質(zhì)纖維素分級分離方法的材料步驟a)中，對木質(zhì)纖維素材料進行處理，其中 從木質(zhì)纖維素材料中至少部分除去半纖維素，以便產(chǎn)生第一液相和第一固相。在分級分離 方法的步驟a)中，半纖維素至少部分溶解且在液相中分離(稱作第一液相）。
[0147] 可以從木質(zhì)纖維素處理中直接得到第一液相，其中至少部分半纖維素變成可溶于 水（即處理產(chǎn)生液相）?；蛘?，處理不會產(chǎn)生液相（即在如此高的稠度下進行，使得液相不存 在），且通過洗滌已經(jīng)進行處理的固體物質(zhì)得到第一液相，其中至少部分半纖維素變成可溶 于水?；蛘?，可以從處理中直接產(chǎn)生第一液相，且進一步洗滌固相并且將得到的液體與第一 液相合并。
[0148] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，通過水熱處理從木質(zhì)纖維素材料中只是部分除去 半纖維素。在第二實施方案中，水熱處理在100-250°C、優(yōu)選140-240°C且最優(yōu)選140-200°C 的溫度下進行。水熱處理的強化表現(xiàn)在苛刻度方面，該術語如本文所定義。在一個優(yōu)選的實 施方案中，水熱處理在相當于2.0-4.5、優(yōu)選3.0-4.1、最優(yōu)選3.5-4.0的苛刻度的條件下進 行。
[0149] 在本發(fā)明的一個實施方案中，通過自水解處理從木質(zhì)纖維素材料中至少部分除去 半纖維素。自水解典型地在5-60%干物質(zhì)含量下進行，溫度為140-240°C，持續(xù)l-120min，不 添加酸性化合物，導致5-40 %的干物質(zhì)含量溶于木質(zhì)纖維素材料，包括半纖維素碳水化合 物。典型地，自水解溶解30-100 %的來自木質(zhì)纖維素材料的半纖維素碳水化合物，優(yōu)選〉 50 %、更優(yōu)選>70 %、更優(yōu)選>80 %、甚至更優(yōu)選>90 %。溶解的半纖維素碳水化合物至少部分 為寡聚化形式。更典型地，自水解在10-50%干物質(zhì)含量、在160-220°C下進行，視木質(zhì)纖維 素原料而定。在自水解后，通過任意方法分離固相和液相，例如過濾，例如加壓過濾，或使用 螺旋壓力機?？梢韵礈旃腆w部分以便從固相中除去溶解的半纖維素。
[0150] 根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，使木質(zhì)纖維素材料經(jīng)歷蒸汽或蒸汽爆裂，添加或 不添加酸性化合物，通常溫度在110-250 °C，更典型地在140-230°C的溫度。處理導致半纖維 素碳水化合物溶解。任選地，洗滌來自蒸汽的固體材料以回收溶解的半纖維素碳水化合物。
[0151] 在本發(fā)明的一個實施方案中，首先對木質(zhì)纖維素材料進行水熱處理，然后進行蒸 汽爆裂步驟(示例在圖4中）。在另一個實施方案中，對第一固相進行蒸汽爆裂，然后在堿性 脫木化劑的存在下進行脫木質(zhì)化處理。
[0152] 根據(jù)本發(fā)明，根據(jù)步驟a)的木質(zhì)纖維素處理(其中半纖維素糖變成至少部分溶解 的)能夠有效地從微生物培養(yǎng)中回收半纖維素糖，例如產(chǎn)生單細胞油。
[0153] 堿性脫木質(zhì)化步驟
[0154] 在木質(zhì)纖維素材料的分級分離方法的步驟c)中，對第一固相(包含部分除去半纖 維素材料的木質(zhì)纖維素材料)進行堿脫木質(zhì)化步驟，其中至少部分木質(zhì)素溶解。通過使部分 除去半纖維素材料的木質(zhì)纖維素材料接觸堿性脫木質(zhì)化劑進行堿脫木質(zhì)化。
[0155] 堿處理典型地通過制備包含自水解的木質(zhì)纖維素材料、水性液體和一種或多種堿 性劑或其混合物的自水解的木質(zhì)纖維素材料的懸浮液進行，得到懸浮液的pH高于pH 7。優(yōu) 選地，將堿性物質(zhì)的量添加至得到在處理開始時懸浮液的pH為10-13。典型地，在堿處理過 程中pH下降。
[0156] 將堿性懸浮液保持在這樣的溫度，其中懸浮液包含至少一個液相。溫育不限于任 何確定的溫度，但在等溫或非等溫的寬溫度范圍下進行。溫育優(yōu)選在25°C、優(yōu)選30-160 °C溫 度下進行。
[0157] 任選地進行攪拌以增加溫育過程中的傳熱效率。處理時間根據(jù)預期的溶出物質(zhì)的 程度選擇。優(yōu)選地，處理時間從半小時至20小時。
[0158] 在反應時間后，通過使用任意方法分離第二液相和第二固相，例如、但不限于過 濾，例如加壓過濾，或使用螺旋壓力機。第二固相用于酶促水解以釋放糖，用于進一步的應 用，例如微生物油生產(chǎn)?？梢蕴幚淼诙合嘁猿恋砟举|(zhì)素，例如通過酸處理，且可以通過任 意方法分離沉淀的木質(zhì)素。
[0159] 在本發(fā)明的一個實施方案中，堿性脫木質(zhì)化劑選自氫氧化鈉、碳酸鈉、氫氧化鉀、 碳酸鉀、氫氧化鈣、碳酸鈣、氫氧化鋰、碳酸鋰、氫氧化銨、氨、硫化鈉和相應的水合物。在一 個優(yōu)選的實施方案中，堿性脫木質(zhì)化劑是氫氧化鈉或碳酸鈉。
[0160] 如上所述，發(fā)明人令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，可以在不過量應用脫木質(zhì)化劑的情況下有效 地進行堿脫木質(zhì)化，條件是對木質(zhì)纖維素材料進行水熱處理，例如自水解，然后進行堿脫木 質(zhì)化。水熱處理導致固體部分(包含纖維素、木質(zhì)素和殘留半纖維素）的酸度下降。因此，在 堿處理中，與不進行水熱處理時的情況相比需要的堿劑較少。因此，水熱處理后的堿處理可 以在低于無自水解情況的pH下進行。因此，在木質(zhì)纖維素材料的堿處理之前，水熱處理是有 益的。應用較少量的堿性脫木質(zhì)化劑的一個優(yōu)點在于與在大量堿性土木質(zhì)化劑的存在下的 類似處理相比堿脫木質(zhì)化步驟中糖的損耗較少。
[0161] 因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，脫木質(zhì)化劑的濃度為O.l-lOwt%，更優(yōu) 選0. l-4wt_%，以第一固相中干物質(zhì)的量為基準。在另一個實施方案中，向第一固相中加入 堿性脫木質(zhì)化劑。在另一個實施方案中，向第一固相中加入堿性脫木質(zhì)化劑，得到具有高于 7、優(yōu)選10-13的pH的懸浮液。
[0162] 在另一個實施方案中，脫木質(zhì)化處理在高于25、優(yōu)選30_160°C的溫度下進行。
[0163] 根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，使用銨作為脫木質(zhì)化化學物質(zhì)進行木質(zhì)纖維素材 料的脫木質(zhì)化。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，使用銨纖維膨脹(AFEX)或氨再循環(huán)滲濾，溫度 為 60C-220°C。
[0164] 根據(jù)本發(fā)明，根據(jù)c)步驟的木質(zhì)纖維素處理，堿脫木質(zhì)化能夠有效地進行酶促水 解和有效地回收纖維素糖，以便進行微生物培養(yǎng)，例如生產(chǎn)單細胞油。
[0165] 堿脫木質(zhì)化產(chǎn)物的酶促水解
[0166] 在木質(zhì)纖維素材料的分級分離方法的步驟e)中，使得自堿脫木質(zhì)化步驟的第二固 相進行酶促水解。
[0167] 酶促水解
[0168] 酶促水解由溫育預處理的麥桿或其它底物或原料與酶的混合物組成，所述酶的混 合物典型地由1，4-β_葡聚糖酶（內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶或內(nèi)纖維素酶和外纖維素 酶）、1，4-β_葡糖苷酶(纖維二糖酶)和半纖維素-降解酶(半纖維素酶、木聚糖酶、阿拉伯糖 酶等)組成，但不限于此。酶可以是商購的酶產(chǎn)品，也可以不是商購的酶產(chǎn)品。將預處理的麥 桿與水或緩沖溶液和酶混合物以適合的比例混合?？梢韵蚍磻w系中加入添加劑，例如聚 乙二醇、洗滌劑或其它表面活性劑或蛋白質(zhì)?？梢允褂脩腋∫褐腥我獗壤墓腆w（或"稠 度"），優(yōu)選10-35%或特別是15-25%。根據(jù)用于酶混合物的最佳條件，調(diào)整淤漿的plpH調(diào) 整在添加酶之前和/或過程中通過添加適合濃度的酸或堿進行，例如H 2S〇4、HCl、HN03、NaOH、 NH3或其它酸或堿。在添加酶之后和水解過程中可以再進行pH調(diào)整，或不進行pH調(diào)整。
[0169] 在水解過程中，根據(jù)酶混合物的最佳條件，通常在40-60°C或特別是50°C維持恒 溫。可以將預處理的麥桿、水和/或緩沖溶液和水解懸浮液中另外的成分預熱至反應溫度， 也可以不預熱至反應溫度，然后將它們加入到懸浮液中。在反應通常中通過攪拌、振搖、自 由落下或通過另外的攪拌方式攪拌該懸浮液。
[0170] 在本發(fā)明的一個實施方案中，木質(zhì)纖維素材料的酶促水解處理通過使木質(zhì)纖維素 材料在水或緩沖液的存在下接觸酶的混合物來進行。酶的混合物典型地由1，4-β_葡聚糖酶 (內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶或內(nèi)纖維素酶和外纖維素酶）、1，4-β_葡糖苷酶(纖維二糖 酶)和半纖維素-降解酶(半纖維素酶、木聚糖酶、阿拉伯糖酶等)組成，但不限于此。
[0171] 通過使得自堿脫木質(zhì)化步驟的第二固相進行酶促水解步驟，來自固體材料的糖溶 解。通過任意方法進行的固-液分離在酶處理之后進行，在水解過程中形成包含溶解的糖的 第三液相，且包含木質(zhì)素和殘留聚合糖(殘留纖維）的第三液相也稱作酶促水解產(chǎn)物，其可 以用于生產(chǎn)微生物脂質(zhì)。
[0172] 可以將分離自步驟a)(例如，通過水熱處理或自水解）中的材料的部分半纖維素糖 導入系統(tǒng)并且與得自脫木質(zhì)化步驟的固相(第二固相)材料一起進行酶促水解。
[0173] 因此，可以將至少部分第一液相加入并且與第二固相混合，然后將該混合物進行 步驟e)的酶促水解處理。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，將至少部分第一液相與第二固 相合并，并且進行酶促水解處理。
[0174] 或者，第一液相的酶促水解與第二固相分開進行。
[0175] 根據(jù)本發(fā)明，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)纖維素處理方法包括依次的如下步驟:木質(zhì)纖 維素進行處理，通過這種處理，半纖維素糖變成至少部分溶解的(例如自水解），且然后對得 自該粗話了的固相進行堿脫木質(zhì)化步驟(例如使用NaOH處理），得到更高總（總體)糖產(chǎn)率。 高總糖產(chǎn)率有益于微生物方法例如生產(chǎn)單細胞油的成本效益。
[0176] 在本發(fā)明的一個實施方案中，酶促水解作為分批水解進行。
[0177] 分批水解
[0178] 分批水解是指水解反應，其中反應成分混合成懸浮液或淤漿或糊狀物，并且溫育 適合的時間期限，此后，通過過濾、離心或其它分離方式分離固體，并且需要可溶性糖的液 流，包括葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖等及其寡聚體?？梢栽诜磻^程中添加反 應成分或其它物質(zhì)，也可以不添加它們。然而，在反應結束前，液流不與淤漿分離。
[0179] 分批反應還可以作為連續(xù)方法進行。在一種連續(xù)的分批水解中，使分級分離的(預 處理的）木質(zhì)纖維素材料、液體、酶、pH-調(diào)節(jié)劑和其它反應成分的恒流進料入反應器，同時 從反應器中取出淤漿恒流，從其中分離液流。在一種連續(xù)的分批水解中，反應器可以再分成 串聯(lián)的兩個或多個反應器，或不再分成串聯(lián)的兩個或多個反應器，通過這種方式，淤漿恒定 流動，特別是用于改善原料的停留時間分布。在理念上，固體材料與液體僅在反應后分離， 但在反應過程中不進行分離。因此，不進行分離，以便從其它反應器中流出淤漿，除外淤漿 來自最后的反應器，且由此不再從淤漿中除去液流，而是從最終流出的淤漿中分離液流。然 而，另外進料反應成分可以在該過程中任意點進行。如果液體分離在兩個反應器之間，則應 當將反應器定義為單獨的反應步驟，且應當將水解過程定義為依次(分步)水解。
[0180]在第二實施方案中，酶促水解作為依次水解進行，例如圖5中所示例的。
[0181] 依次水解
[0182] 依次水解、也稱作分步水解或兩階段、三階段或多階段水解等由串聯(lián)的分批反應 順序組成，液流與淤漿分離，且濃縮固體流進料至下一個批次反應，并且與新鮮水和/或緩 沖溶液混合。可以向第二、第三個或隨后的反應中添加新鮮的酶和其它反應成分，也可以不 進行該步驟。依次反應的流程圖呈現(xiàn)在圖5中。
[0183] 與對分批反應描述的類似，依次水解作為連續(xù)過程進行且依次水解的單一反應步 驟可以再分入串聯(lián)的單獨的反應器，通過這種方式，淤漿恒定流動。液體分離和添加新鮮液 體可以在兩個反應之間進行，也可以不在兩個反應器之間進行。在理念上，如果液體分離且 液體被兩個反應器之間的新鮮液體替代或不被其替代，則應當將反應器定義為單獨的反應 步驟。
[0184] 在另一個實施方案中，酶促水解作為固體再循環(huán)水解進行，例如示例在圖5中。
[0185] 酶促水解中殘留固體的再循環(huán)(或"固體再循環(huán)"）
[0186] 使用殘留固體再循環(huán)或"固體再循環(huán)"的水解方法包括水解反應，此后，液流與淤 漿分離，且濃縮的固體流的比例再循環(huán)回同一反應器（圖5)。再循環(huán)的殘留固體的比例稱作 再循環(huán)率且表示為圖5和等式2和3中的r。在恒定原料進料速率下，根據(jù)等式2中呈現(xiàn)的幾何 結構的串聯(lián)，固體再循環(huán)延長了固體材料的反應時間，其中tn是η個隨后的再循環(huán)反應后固 體的平均反應時間，to是單個反應的反應時間，或淤漿在反應器中的停留時間，且r是再循 環(huán)率。最終，以恒定進料和再循環(huán)率和恒定停留時間進行的再循環(huán)方法將達到穩(wěn)態(tài)，此時， 固體材料的平均反應時間可以根據(jù)等式3計算。
[0189] 例如，24h反應中50 %的再循環(huán)率，固體的平均反應時間在穩(wěn)態(tài)時為48h。
[0190] 再循環(huán)反應可以作為分批反應進行，此后，固體再循環(huán)發(fā)生或作為連續(xù)過程發(fā)生， 其中該方法的成分恒定進料至反應器，淤漿恒定流出物出現(xiàn)且流出淤漿分離至液體和濃縮 殘留固體流，且恒流的殘留固體再循環(huán)回反應器。再循環(huán)反應可以再分入單獨的串聯(lián)反應 器，不再分入單獨的串聯(lián)反應器，以便改善停留時間分布，且方法成分再進料至這些反應器 可以進行，也可以不進行。在固體再循環(huán)反應之后或之前或過程中可以包括另外的依次反 應步驟，也可以不包括這些步驟。
[0191] 步驟e)中得到的液體酶促水解產(chǎn)物可以進行濃縮水解產(chǎn)物的步驟，例如通過蒸 發(fā)，得到濃縮水解產(chǎn)物。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明的方法還包括濃縮第三液相的步 驟。優(yōu)選地，第三液相的濃縮通過蒸發(fā)進行。
[0192] 液體酶促水解產(chǎn)物(第三液相）
[0193] 包含纖維素糖的液相可以用于制備培養(yǎng)基，例如用于生產(chǎn)如本文所述的微生物脂 質(zhì)的方法中的培養(yǎng)基。
[0194] 因此，本發(fā)明的第二方面涉及可通過本發(fā)明方法得到的酶促水解產(chǎn)物形式的液相 (第三液相）。
[0195] 或者，可以將液相酶促水解產(chǎn)物濃縮至得到具有較高濃度糖的液體。因此，本發(fā)明 的另一個方面提供可通過本發(fā)明方法得到的濃糖水解產(chǎn)物。
[0196] 來自第一液相(包含半纖維素糖單體）的酶促水解產(chǎn)物和第三液相的酶促水解產(chǎn) 物(包含纖維素糖）的酶促水解產(chǎn)物可以用于單獨的培養(yǎng)肉湯或彼此混合作為用于生產(chǎn)單 細胞油的碳源。
[0197] 沉淀的木質(zhì)素部分(得自第二液相）
[0198] 可以如圖2中所示例的通過用酸處理包含可溶性木質(zhì)素的第二液相得到沉淀的木 質(zhì)素并且分離沉淀的純木質(zhì)素。
[0199] 因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，該方法包括通過降低溶液的pH從第二液相中 沉淀木質(zhì)素的另外的步驟，并且通過任意適合的分離方法如過濾回收沉淀的木質(zhì)素。
[0200] 本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過本發(fā)明方法得到的木質(zhì)素部分是特別純的（參見 實施例9)。
[0201] 因此，第四個方面涉及可通過本發(fā)明方法得到的沉淀的木質(zhì)素部分。
[0202] 分離的木質(zhì)素部分可以因比熱值附加應用的價值而使用，例如用于樹脂(例如酚 醛樹脂應用)或聚合物應用。任選地，洗滌和/或進一步處理分離的木質(zhì)素部分，以便在用于 增值應用之前純化。
[0203] 微生物脂質(zhì)的生產(chǎn)方法
[0204] 本發(fā)明的另一個方面涉及用于生產(chǎn)微生物脂質(zhì)的方法，該方法包括：
[0205] (i)提供包含通過用于木質(zhì)纖維素材料(主要包含纖維素碳水化合物)分級分離的 方法得到的第三液相或本發(fā)明的濃糖水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基；
[0206] (ii)通過給所述培養(yǎng)基接種含油微生物提供發(fā)酵肉湯；
[0207] (iii)溫育所述接種所述含油微生物的培養(yǎng)基，以使脂質(zhì)蓄積；
[0208] (iv)從所述含油微生物中回收脂質(zhì)。
[0209] 本發(fā)明的方法也稱作單細胞油生產(chǎn)方法。本發(fā)明的方法可以是用于生產(chǎn)本文所述 的生物燃料的方法的組成部分，其中所述油或至少部分的油以微生物油的形式通過本文所 述方法提供。
[0210] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，所述培養(yǎng)基包含衍生自纖維素和/或半纖維素的木 質(zhì)纖維素糖。根據(jù)本發(fā)明，木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的半纖維素和/或纖維素部分用作用于同一方 法(生物反應器系統(tǒng)）的微生物油生產(chǎn)(單細胞油）的原料。該方法優(yōu)選使用能夠利用C6(例 如葡萄糖、甘露糖、半乳糖)和C5 (例如木糖、阿拉伯糖)糖的含油微生物。
[0211] 根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，所述培養(yǎng)基包含衍生自木質(zhì)纖維素的半纖維素。 根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，半纖維素糖在進料至單細胞油生產(chǎn)方法時是至少部分寡聚 化的形式。
[0212] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選的用于生產(chǎn)上述權利要求的微生物脂質(zhì)的方法的實施方案 中，該方法包括下列步驟：
[0213] a)對木質(zhì)纖維素材料進行處理，其中從木質(zhì)纖維素材料中至少部分除去半纖維素 以產(chǎn)生包含第一液相和第一固相的混合物；
[0214] b)使第一固相與第一液相分離；
[0215] c)在堿性脫木質(zhì)化劑的存在下對第一固相進行脫木質(zhì)化處理，以產(chǎn)生包含第二固 相和包含增溶的木質(zhì)素的第二液相的混合物；
[0216] d)使第二固相與第二液相分離；
[0217] e)對第二固相進行酶促水解處理，以水解第二固相的半纖維素和纖維素部分，以 產(chǎn)生包含具有酶促水解產(chǎn)物的第三液相和第三固相的混合物；
[0218] f)使第三液相與第三固相分離；
[0219] (i)提供包含步驟f)的酶促水解產(chǎn)物的第三液相和任選地第一液相或其酶促水解 產(chǎn)物的培養(yǎng)基；
[0220] (ii)通過給培養(yǎng)基接種含油微生物提供發(fā)酵肉湯；
[0221] (iii)溫育所述接種所述含油微生物的培養(yǎng)基，以使脂質(zhì)蓄積；
[0222] (iv)從所述含油微生物中回收脂質(zhì)。
[0223] 通過用于生產(chǎn)微生物脂質(zhì)的方法使用的微生物是含油微生物。含油微生物（如本 文所述)能夠蓄積胞間脂質(zhì)，使得在適合的條件下培養(yǎng)時，脂質(zhì)占微生物總生物質(zhì)的至少 15% (w/w)(每個細胞干重）。在一個優(yōu)選的實施方案中，含油微生物能夠蓄積至少20% (w/ w)的微生物的總生物質(zhì)(每個細胞干重）。在本發(fā)明的一個實施方案中，用于生產(chǎn)脂質(zhì)的含 油微生物選自酵母和絲狀真菌。優(yōu)選地，用于生產(chǎn)微生物脂質(zhì)的方法在需氧條件下進行。因 此，在本發(fā)明的一個實施方案中，步驟(iii)中的溫育作為例如本文所述的需氧培養(yǎng)進行。
[0224] 當描述本發(fā)明的實施方案時，顯然并沒有描述所有可能的實施方案的組合和變 更。盡管如此，但是唯一的事實在于一些措施描述在彼此不同的從屬權利要求中或描述在 不同實施方案中，這并不表示這些措施的組合不能使優(yōu)點更突出。本發(fā)明涵蓋所述實施方 案的所有可能的組合和變更。
[0225] 本文的術語"包含"、"含有"和"包括"在每種情況下都被
【申請人】預期為任選地被術 語"由…組成"替換。
[0226] 條目
[0227] 在下文中通過非限制性條目描述本發(fā)明。
[0228] 條目1.用于分級分離木質(zhì)纖維素材料的方法，該方法包括：
[0229] a)對木質(zhì)纖維素材料進行處理，其中從木質(zhì)纖維素材料中至少部分除去半纖維素 以產(chǎn)生包含第一液相與第一固相的混合物；
[0230] b)使第一固相與第一液相分離；
[0231] c)在堿性脫木質(zhì)化劑的存在下對第一固相進行脫木質(zhì)化處理，以產(chǎn)生包含第二固 相和包含增溶的木質(zhì)素的第二液相的混合物；
[0232] d)使第二固相與第二液相分離；
[0233] e)在能夠水解第二固相的半纖維素和纖維素部分的酶的存在下對第二固相進行 酶促水解處理，以產(chǎn)生包含第三液相和第三固相的混合物。
[0234] 條目2.條目1的方法，其中至少部分第一液相與第二固相合并并且進行酶促水解 處理。
[0235] 條目3.條目1的方法，其中通過水熱處理從木質(zhì)纖維素材料中只是部分除去半纖 維素。
[0236] 條目4.條目1的方法，其中通過自水解處理從木質(zhì)纖維素材料中只是部分除去半 纖維素。
[0237] 條目5.上述條目中任一項的方法，其中所述堿性脫木質(zhì)化劑選自氫氧化鈉、碳酸 鈉、氫氧化鉀、碳酸鉀、氫氧化鈣、碳酸鈣、氫氧化鋰、碳酸鋰、氫氧化銨、氨、硫化鈉和相應的 水合物。
[0238] 條目6.上述條目中任一項的方法，其中脫木質(zhì)化劑的濃度為O.l-lOwt%，優(yōu)選 0.1-4wt_%，以第一固相干物質(zhì)的量為基準。
[0239] 條目7.上述條目中任一項的方法，其中將所述堿性脫木質(zhì)化劑加入到第一固相 中，得到具有高于7，優(yōu)選10-13的pH的懸浮液。
[0240] 條目8.上述條目中任一項的方法，其中脫木質(zhì)化處理在高于25°C，優(yōu)選30-160°C 的溫度下進行。
[0241] 條目9.上述條目中任一項的方法，其中水熱處理在100-250°C，優(yōu)選140-240°C且 最優(yōu)選140-200°C的溫度下進行。
[0242] 條目10.上述條目中任一項的方法，其中水熱處理在相當于2.0-4.5,更優(yōu)選3.0-? 1且最優(yōu)選 3.5-4.0的苛刻度的條件下進行。
[0243] 條目11.上述條目中任一項的方法，其中在所述脫木質(zhì)化處理前對第一固相進行 蒸汽爆裂。
[0244] 條目12.上述條目中任一項的方法，其中所述酶促水解作為分批水解進行。
[0245] 條目13.上述條目中任一項的方法，其中所述酶促水解作為依次水解進行。
[0246] 條目14.上述條目中任一項的方法，其中所述酶促水解作為固體再循環(huán)水解進行。
[0247] 條目15.上述條目中任一項的方法，其中通過降低溶液的pH從第二液相中沉淀木 質(zhì)素，并且通過任意適合的分離方法例如過濾回收沉淀的木質(zhì)素。
[0248] 條目16.上述條目中任一項的方法，還包含濃縮第三液相的步驟。
[0249] 條目17.可通過上述條目任一項的方法得到的酶促水解產(chǎn)物形式的液相。
[0250] 條目18.可通過條目16的方法得到的濃湯水解產(chǎn)物。
[0251 ]條目19.可通過權條目15的方法得到的沉淀的木質(zhì)素部分。
[0252] 條目20.用于生產(chǎn)微生物脂質(zhì)的方法，該方法包括：
[0253] (i)提供包含條目17的第三液相或條目18的濃糖水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基；
[0254] (ii)通過給所述培養(yǎng)基接種含油微生物提供發(fā)酵肉湯；
[0255] (iii)溫育所述接種所述含油微生物的培養(yǎng)基，以使脂質(zhì)蓄積；
[0256] (iv)從所述含油微生物中回收脂質(zhì)。
[0257] 條目21.上述條目的用于生產(chǎn)微生物脂質(zhì)的方法，該方法包括：
[0258] a)對木質(zhì)纖維素材料進行處理，其中從木質(zhì)纖維素材料中至少部分除去半纖維素 以便產(chǎn)生包含第一液相和第一固相的混合物；
[0259] b)使第一固相與第一液相分離；
[0260] c)在堿性脫木質(zhì)化劑的存在下對第一固相進行脫木質(zhì)化處理，以產(chǎn)生包含第二固 相和包含增溶的木質(zhì)素的第二液相的混合物；
[0261] d)使第二固相與第二液相分離；
[0262] e)對第二固相進行酶促水解處理，以水解第二固相的半纖維素和纖維素部分，以 產(chǎn)生包含具有酶促水解產(chǎn)物的第三液相和第三固相的混合物；
[0263] f)使具有酶促水解產(chǎn)物的第三液相與第三固相分離；
[0264] (i)提供包含步驟f)的酶促水解產(chǎn)物的第三液相的培養(yǎng)基；
[0265] (ii)通過給培養(yǎng)基接種含油微生物提供發(fā)酵肉湯；
[0266] (iii)溫育所述接種所述含油微生物的培養(yǎng)基，以使脂質(zhì)蓄積；
[0267] (iv)從所述含油微生物中回收脂質(zhì)。
[0268] 條目22.條目20或21任一項的方法，其中用于生產(chǎn)脂質(zhì)的微生物選自酵母和絲狀 真菌。 實施例
[0269] 本發(fā)明通過下列非限制性實施例示例。本發(fā)明適用于非實施例中示例的木質(zhì)纖維 素原料。應當理解，上述描述和實施例中給出的實施方案僅用于示例，且各種改變和變型均 可能在本發(fā)明范圍內(nèi)。
[0270] 實施例1
[0271]麥秸的自水解(具有預先調(diào)整的pH)
[0272] 通過混合預先研磨至通過1mm篩的20g麥猜和180g水制備懸浮液。用乙酸將該懸浮 液調(diào)整至pH 4.5。將該懸浮液轉(zhuǎn)入高壓反應器，然后使用加熱套在連續(xù)攪拌下等溫加熱至 170°C-200°C溫度。記錄在加熱過程中的溫度數(shù)據(jù)并且用于計算自水解苛刻度(等式1)。將 反應器冷卻至約50°C，并且手動回收懸浮液用于過濾。使固體部分與液體部分分離，并且使 用HPLC測定糠醛和羥甲基糠醛(HMF)。稀酸水解后測定寡聚化和聚合糖轉(zhuǎn)化成單糖類的液 體部分中糖的總濃度(g/Ι)。用水(〇.5dm3)洗滌固體部分并且加壓。稱重得到的共同殘余 物，采樣用于肝物質(zhì)測定，并且將固體殘余物的產(chǎn)率（％ )計算為固體殘余物與稱重用于自 水解處理的麥猜重量比（100%*g干麥猜/g干固體殘余物）。使用Folin-Ciocalteu方法與愈 創(chuàng)木?K gu i a i aco 1)作為標準品測定液體中的可溶性酸類物質(zhì)。
[0273] 如圖11和圖12中所示的結果概括了結果。固體殘余物的產(chǎn)率隨水解苛刻度而降 低，其中在最高苛刻度下產(chǎn)率為67% (Log(RO) =4.4)(圖11)。在液體部分中的單糖濃度首 先增加，且然后隨自水解苛刻度的增加而降低。當自水解苛刻度為Log(RO) = 3.8時，得到最 大糖濃度(23. lg/Ι)。超過自水解苛刻度，液體部分中的糖濃度顯著下降且糠醛和HMF的濃 度突然增加，分別達到4.8g/l和0.3g/l的濃度。與糠醛和HMF突然生成相反，可溶性酚類的 濃度隨自水解苛刻度的增加從〇. 5g/l逐步增加至2. Og/Ι。
[0274] 本實施例顯示在自水解苛刻度(Log(RO))方面的最佳自水解條件可以選擇以避免 糠醛、HMF和可溶性酚類的過量形成，同時維持液體部分中的單糖濃度。
[0275] 實施例2
[0276] 通過混合33.8kg搗碎的包含11 %濕度的麥猜與350kg自來水制備懸浮液，得到 8.5 %稠度。將該懸浮液加熱至約60 °C，并且通過在攪拌的Nutsche Fi 1 ter中過濾使液體部 分與固體分離。將固體部分(31.2kg干物質(zhì))與水混合，得到5 %稠度的192.4kg懸浮液。將該 懸浮液加熱至180°C并且冷卻至室溫，得到S = 4.15的苛刻度。在沉降式離心機中使液體部 分與固體部分分離。用水洗滌固體部分，并且使用沉降式離心機回收洗滌的不溶性部分"自 水解的麥桿"（15.3kg干物質(zhì)），且儲存在冷藏箱中。基于HPLC分析，液體部分(6.3kg干物質(zhì)） 包含半纖維素-衍生的糖，約為其干物質(zhì)的一半。
[0277] 本實施例顯示自水解能夠使半纖維素與木質(zhì)纖維素材料分離，然后對包含纖維素 的固體部分進行酶促水解。
[0278] 分離液體和固體部分和任選地洗滌固體部分使自水解中釋放的可溶性酚類和有 機酸與自水解的固體部分分離。作為結果，隨后脫木質(zhì)化步驟中消耗的堿性脫木質(zhì)化化學 物質(zhì)以協(xié)同作用方式減少。
[0279] 由本實驗產(chǎn)生的固體部分隨后用于脫木質(zhì)化試驗，導致固體部分具有低木質(zhì)素和 高碳水化合物含量。
[0280] 實施例3
[0281] 通過在100dm3容器中混合10.5kg 7.3%濕度的磨碎的麥桿和54. lkg自來水制備 懸浮液。在室溫儲存18h后，將64.2kg懸浮液稱重入水平圓柱狀250dm3攪拌的高壓反應器。 封閉反應器并且在75min內(nèi)加熱至140°C，維持在140°C5h并且在30min內(nèi)冷卻至室溫。從反 應器中取出水熱處理的懸浮液，并且通過過濾分離固體部分。用自來水洗滌固體部分，并且 使用水壓機加壓。加壓的固體部分(20.9kg)具有42.7 %干物質(zhì)含量。
[0282] 由本實驗生產(chǎn)的固體部分用于隨后的脫木質(zhì)化試驗，導致固體部分具有低木質(zhì)素 和高碳水化合物含量。
[0283] 自水解的麥桿的脫木質(zhì)化
[0284] 自水解的麥桿包含相當大量的木質(zhì)素，其導致酶促水解中的抑制作用。由于這一 原因，在堿性條件中提取來自自水解的固體材料，以除去木質(zhì)素，然后進行酶促水解。
[0285] 實施例4
[0286] 通過在安裝攪拌單元的180dm3不銹鋼反應器中混合20.5kg(8kg干物質(zhì)）來自實施 例2的自水解的麥桿與262g顆粒NaOH和蒸餾水制備懸浮液。通過將反應器在30min內(nèi)加熱至 95 °C、然后在95 °C與連續(xù)攪拌下等溫處理lh處理6.6 %稠度的懸浮液。通過用離心機過濾使 提取的固體部分與液體部分分離，用自來水洗滌，加壓，并且將NaOH-提取的AH-麥桿 (23.64kg，27%干物質(zhì)含量)儲存在6°C下。將包含1.62kg溶解的來自自水解的麥桿的材料 的液體部分（"NaOH脫木質(zhì)化溶液"）儲存在6 °C下。
[0287] 用等于6FPU(濾紙單位)/g DM纖維素酶活性的35yl/g Flashzyme Plus(Roal 0y, Finland)的酶劑量酶促水解NaOH-提取的AH-麥桿由自水解的麥桿碳水化合物得到65.0% 糖產(chǎn)率。與來自不進行脫木質(zhì)化的自水解的麥桿碳水化合物的61.0%產(chǎn)率相比，這是改善 的結果。
[0288]將糖產(chǎn)率計算為NaOH-提取的AH-麥桿的酶促水解中釋放的單體的總量與在酸水 解中類似重量中釋放的單糖總量之比乘以來自脫木質(zhì)化處理的NaOH-提取的AH-麥桿的干 物質(zhì)產(chǎn)率。
[0289]本實施例顯示在酶促水解中，當在用堿處理(NaOH)進行酶促水解前除去木質(zhì)素 時，相同的酶用量產(chǎn)生了更高產(chǎn)率的糖。本實施例還顯示部分木質(zhì)素溶于堿性液體部分且 可以通過沉淀回收木質(zhì)素。
[0290] 實施例5
[0291] 通過在安裝磁攪拌器的玻璃反應器中混合來自實施例2的自水解的麥桿(403g， 1568干物質(zhì)）與405(^自來水和37.5 8固體他2〇)3制備3.6%稠度的懸浮液。將該反應器在 30min內(nèi)加熱至95-100°C并且在95-100°C與連續(xù)攪拌該懸浮液下處理4h。通過過濾使 812gNa2C03-提取的具有15%干物質(zhì)含量的固體部分（"Na2C03-提取的AH-麥桿"）與液體部 分(3325g)分離，用自來水洗滌，加壓，并且儲存在6°C下。（DM脫木質(zhì)化的麥桿/DM自水解的 麥桿）的產(chǎn)率為78%。液體部分(Na2C03脫木質(zhì)化溶液)具有pH 9.8并且儲存在6°C下。所用 碳酸鹽的用量高于NaOH，因為碳酸鹽是比氫氧化物弱的堿。
[0292] 用等于6FPU(濾紙單位)/g DM纖維素酶活性的35yl/g Flashzyme Plus(Roal 0y, Finland)的酶劑量酶促水解Na2C03-提取的AH-麥桿由自水解的麥桿碳水化合物得到59.1 % 糖產(chǎn)率。這低于來自自水解的麥桿碳水化合物的NaOH-提取的AH-麥桿的65.0%糖產(chǎn)率或來 自不進行脫木質(zhì)化的自水解的麥桿碳水化合物的61.0%糖產(chǎn)率。
[0293] 將糖產(chǎn)率計算為酶促水解中釋放的單糖總量與從酸水解中的類似重量的AH-麥桿 中是否的單糖總量之比乘以來自脫木質(zhì)化處理的Na2C03-提取的AH-麥桿的干物質(zhì)產(chǎn)率。 [0294]與進行沒有脫木質(zhì)化的酶促水解的自水解的麥桿相比，Na2C03_脫木質(zhì)化的優(yōu)點 在于得到了額外的木質(zhì)素部分(Na2C03脫木質(zhì)化溶液）。
[0295] 本實施例顯示當在酶促水解之前用堿(Na2C03)處理除去木質(zhì)素時，相同用量的酶 產(chǎn)生更高的糖產(chǎn)率。本實施例還顯示部分木質(zhì)素溶于堿性液體部分且可以通過沉淀回收木 質(zhì)素。
[0296] 實施例6
[0297] 通過混合來自實施例3的10.Okg(4.41kg干物質(zhì)）自水解的麥桿與自來水(29.5kg) 和3.401g 50%(w/w)Na0H水溶液制備懸浮液。在類似的反應器中并且在如上述實施例3中 所述的加熱條件下處理該懸浮液。通過過濾分離固體部分（"NaOH-脫木質(zhì)化的麥桿"），在洗 滌后具有30.4%干物質(zhì)含量。液體部分（"NaOH脫木質(zhì)化溶液"）具有pH 13.0并且儲存在6°C 下。
[0298] 實施例7
[0299] 本實施例的目的在于研究堿處理自水解的麥桿對酶促水解和來自自水解的麥桿 的糖產(chǎn)率的作用。為了達到這一目的，通過混合15g來自實施例1的自水解的麥桿的干物質(zhì) 與去離子水和表1中列出的化學物質(zhì)制備7.5%稠度的懸浮液。不同的堿性化學物質(zhì)用于調(diào) 整pH，然后加熱至所示的值。用微波爐將該懸浮液快速加熱至90°C。過濾熱懸浮液以分離固 體和液體部分。用水洗滌固體部分，并且將濾餅攪拌至均勻，且測定其干物質(zhì)含量。用在pH 5的0.05M醋酸鈉緩沖液中10%稠度的350yL(6FPU/g)的分解纖維素的制品Flashzyme Plus (Roal，F(xiàn)inland)在山梨酸鉀的存在下水解洗滌固體部分（10g干物質(zhì)）。水解在置于設定在 50°C的恒溫溫育器中的250mL錐形瓶中進行，通過200rpm振搖使反應持續(xù)72h。通過HPLC從 液體部分中測定釋放的單體糖。得到的干物質(zhì)和糖產(chǎn)率如表1中所示。
[0300] 本實施例顯示自水解的麥桿的脫木質(zhì)化增加了從通過酶促水解的自水解的麥桿 的糖產(chǎn)率，甚至在考量脫木質(zhì)化處理中的干物質(zhì)損耗時也是如此。脫木質(zhì)化處理的另一個 優(yōu)點在于生成用于進一步加工的可溶性木質(zhì)素部分。
[0301] 本實施例的令人驚奇的發(fā)現(xiàn)在于在自水解的麥桿脫木質(zhì)化過程中僅需要少量堿 性化學物質(zhì)。另一個令人驚奇的發(fā)現(xiàn)在于分離自固體部分的液體部分的pH相對較低，這意 味著通過降低pH需要少量酸從溶液中沉淀木質(zhì)素。
[0302]有關自水解的和/或脫木質(zhì)化的麥桿的酶促水解的實施例
[0303] 實施例8
[0304] NaOH-脫木質(zhì)化的麥桿(來自實施例6的材料)與自水解的麥桿(來自實施例1的材 料)的比較在三種不同的酶促水解方法中進行，包括分批水解、依次水解和以恒定過程進料 的固體再循環(huán)。使用酶混合物，其包含85 %纖維素酶(Econase CE，Roal 0y)、10%纖維二糖 酶（1^〇￥〇叾：71116 188,3丨81]1&/^〇￥〇25〇1168)和5%木聚糖酶（6(]140,6611611(3〇1')。在口!15和50。〇溫 度下在振蕩器中以200rpm進行反應。
[0305]分批水解
[0306]對10%稠度和8%稠度的NaOH-脫木質(zhì)化的麥桿和自水解的麥桿進行分批水解(其 中"稠度"是不溶性固體在反應淤漿中的比例，w/w)。使用包含9FPU/g預處理的麥桿DM的酶 活性的酶劑量。糖產(chǎn)率(作為材料中總聚合碳水化合物的百分比釋放的無水糖)如圖6中所 示。24h、48h和72h水解后，來自8%和10%稠度的NaOH-脫木質(zhì)化麥桿的糖產(chǎn)率平均為50%、 65 %和74%，而使用自水解的麥桿，8%和10%稠度的產(chǎn)率分別平均為49 %、56 %和59 %，表 明較高的糖產(chǎn)率可以得自使用與來自自水解的麥桿相同的酶用量的NaOH-脫木質(zhì)化麥桿。 產(chǎn)率在較低稠度下一般稍高。
[0307] NaOH-脫木質(zhì)化麥桿的48h和72h分批水解的圖8中所示的容積效率分別為1.32g/ 1/h(每升反應淤漿每小時的糖克數(shù))和0.82g/l/h，這與分別得自自水解的麥桿的0.74g/l/ h和0.42g/l/h的容積效率相比明顯較高。
[0308] 反應的酶生產(chǎn)力(使用1升沒得到的kg糖)如圖7中所示。NaOH-脫木質(zhì)化麥桿的72h 分批水解中的酶生產(chǎn)力為4 · 2kg/l酶，其與使用自水解的麥桿的2 · 2kg/l酶生產(chǎn)力相比幾乎 倍增。
[0309] 本實施例表示與分批酶促水解中自水解的麥桿相比，較高糖產(chǎn)率、酶生產(chǎn)力和容 積效率得自脫木質(zhì)化麥桿。
[0310]依次水解
[0311] NaOH-脫木質(zhì)化麥桿和自水解的麥桿通過由3個依次的24h反應組成的三步水解來 水解。在反應之間。使液體與固體分離。并且將固體殘余物與新鮮的液體和酶混合。整個過 程中的固體比例（"總稠度"或"進料稠度"）在前2次反應中為10%，且在3次反應中為8%。因 為在2次反應之間將總液體量分開，所以第一次、第二次和第三次反應的實際稠度分別為 14,3%、12,5%和10,6%，且自水解的麥桿的NaOH-脫木質(zhì)化麥桿分別為14.4%、12.9%和 12.8%。如"NaOH-脫木質(zhì)化麥桿的分批水解"中所述使用類似的酶混合物和劑量。總酶劑量 的三分之二(66.6 % )適用于第一次反應且三分之一(33.3 % )適用于第二次反應。
[0312 ]糖產(chǎn)率(作為在材料中的總聚合碳水化合物的百分比的釋放的無水糖，如圖6中所 示，在第一次、第二次和第三次反應后來自NaOH-脫木質(zhì)化麥桿的分別為35 %、57 %和70 %， 且來自自水解的麥桿的分別為36%、55%和65%。盡管第一次反應后來自自水解的麥桿的 產(chǎn)率稍高，但是來自NaOH-脫木質(zhì)化麥桿的產(chǎn)率顯然在第二次和第三次反應后占優(yōu)勢。2次 和3次依次24h反應后的總容積效率（圖8)Na0H-脫木質(zhì)化麥桿使用分別為1.74g/l/h和 1.61g/l/h，明顯分別高于來自自水解的麥桿的1 · 10g/l/h和0.94g/l/h產(chǎn)率。使用NaOH-脫 木質(zhì)化麥桿的3次24h反應后的酶生產(chǎn)力為4.4kg/l酶，這明顯地高于使用自水解的麥桿的 2.4kg/l酶生產(chǎn)力（圖7)。
[0313] 本實施例表示與依次酶促水解中的自水解的麥桿相比，較高的糖產(chǎn)率、酶生產(chǎn)力 和容積效率得自脫木質(zhì)化麥桿。
[0314] 使用固體再循環(huán)水解
[0315]在固體再循環(huán)方法中水解NaOH-脫木質(zhì)化麥桿和自水解的麥桿。進行多次后續(xù)的 反應，其中以10%的稠度混合新鮮預處理的麥桿、酶和液體。向新鮮反應成分的混合物中混 入50%的分離的來自在先反應的固體殘余物。固體殘余物的再循環(huán)導致實際反應稠度增 加，使用NaOH-脫木質(zhì)化麥桿增加至12.3%，且使用自水解的麥桿增加至13.2%。進行6次后 續(xù)再循環(huán)反應，以便達到穩(wěn)態(tài)。其中反應體積、稠度和水解產(chǎn)率在兩次后續(xù)反應之間保持恒 定。當達到穩(wěn)態(tài)時，將未再循環(huán)的部分固體殘余物與恒定量的新鮮液體混合，以10.5 %的稠 度使用NaOH-脫木質(zhì)化麥桿和13.1 %的稠度使用自水解的麥桿再進行24h反應。在單獨的再 循環(huán)反應中總固體比例(或"總稠度"或"進料稠度"）為10%，在包括再循環(huán)反應和額外反應 的方法中為8 %。
[0316]作為無水糖的糖產(chǎn)率作為材料中總聚合碳水化合物的百分比釋放，圖6。在不含任 何再循環(huán)材料的起始反應中，使用NaOH-脫木質(zhì)化麥桿和自水解的麥桿分別為51 %和50 %。 在使用50%再循環(huán)固體殘余物的6次后續(xù)反應后，NaOH-脫木質(zhì)化麥桿和自水解的麥桿的水 解產(chǎn)率使用分別增加至57 %和55 %。在額外反應后，使用NaOH-脫木質(zhì)化麥桿和自水解的麥 桿的總糖產(chǎn)率分別為69%和65%，由此顯示NaOH-脫木質(zhì)化麥桿一般產(chǎn)率較高。使用NaOH-脫木質(zhì)化的麥桿和自水解的麥桿的單獨的再循環(huán)反應的容積效率分別為1.99g/l/h和 1.17g/l/h，且包括額外的反應，分別為1.77g/l/h和0.99g/l/h，表明使用NaOH-脫木質(zhì)化麥 桿的容積效率較高。使用NaOH-脫木質(zhì)化的麥桿和自水解的麥桿的單獨的再循環(huán)反應的酶 生產(chǎn)力分別為3.2kg/l和2. Okg/Ι，而當包括額外反應時，分別為3.8kg/l和2.4kg/l，這顯示 與自水解的麥桿相比，NaOH-脫木質(zhì)化麥桿的酶生產(chǎn)力明顯較高。
[0317] 后續(xù)反應中水解的進程呈現(xiàn)在圖9a中。反應體積進程呈現(xiàn)在圖9b中。反應稠度進 程呈現(xiàn)在圖9c中。
[0318] 本實施例表示在使用固體再循環(huán)的酶促水解方法中，與自水解的麥桿相比，較高 的糖產(chǎn)率、酶生產(chǎn)力和容積效率得自脫木質(zhì)化麥桿。
[0319] 實施例8的結論
[0320] 1.在所有不同方法的酶促水解過程中，NaOH-脫木質(zhì)化麥桿比自水解的麥桿的總 糖產(chǎn)率一般較高。
[0321] 2.因為在所有不同的方法中，NaOH-脫木質(zhì)化的麥桿容積效率高于自水解的麥桿， 所以與自水解的麥桿相比，NaOH-脫木質(zhì)化麥桿水解過程中得到糖產(chǎn)率需要較小的反應器 和分離器。
[0322] 3.因為在所有不同方法中，使用NaOH-脫木質(zhì)化麥桿高于使用自水解的麥桿的酶 生產(chǎn)力，所以使用NaOH-脫木質(zhì)化麥桿的每kg得到的糖的酶成本低于使用自水解的麥桿的 每kg得到的糖的酶成本。
[0323] 4.等量的預處理的麥桿用于本實施例?？梢酝贫ü腆w再循環(huán)和依次水解產(chǎn)生等同 的水解產(chǎn)率，但容積效率比分批水解提高。
[0324] 實施例9.木質(zhì)素質(zhì)量
[0325] 在如實施例8中所述的3步依次水解中以20 %的進料稠度與9FPU的酶劑量水解自 水解的麥桿(來自實施例2的材料），其中酶混合物如實施例9中所述。得到糖產(chǎn)率(作為在材 料中總聚合碳水化合物百分比釋放的無水糖），為64.4%，它等于自水解的麥桿DM的 34.8%。從沒水解中殘留的固體包含27.2%的糖、55.5%的木質(zhì)素和8.8%的灰分。
[0326]用0.2M NaOH提取自水解的麥桿（來自實施例2的材料）（40.7g干物質(zhì)）。提取在 7.7%稠度下在攪拌的玻璃反應器中在95-100°C進行4h。通過過濾使液體部分與提取的固 體部分分離。用12M硫酸將得到的液體部分(657.6g)酸化至pH 4.9,以便沉淀溶解的木質(zhì) 素。通過離心使與沉淀的木質(zhì)素液體部分分離，用酸水洗滌，凍干。得到的木質(zhì)素部分占原 始存在于自水解的麥桿中的木質(zhì)素的35.9%。與酶促水解后殘留固體的55.5%木質(zhì)素含量 和8.8%灰分含量相，木質(zhì)素部分具有90.9%的總木質(zhì)素含量(酸不溶性木質(zhì)素和酸溶性木 質(zhì)素的總和)和4.0%灰分。
[0327] 本實施例顯示脫木質(zhì)化處理的優(yōu)點在于任選地分離固體木質(zhì)素部分，其具有明顯 高于酶促水解殘余物的木質(zhì)素含量的木質(zhì)素含量。與燃燒相比，較高純度的木質(zhì)素對于木 質(zhì)素在高價值應用中的用途是有利的。
[0328] 木質(zhì)纖維素糖在生產(chǎn)脂質(zhì)中的用途
[0329] 實施例10 [0330]水解產(chǎn)物的制備 [0331]自水解液體C
[0332]進行麥秸的自水解反應和隨后的半纖維素寡糖的分離以產(chǎn)生用于發(fā)酵的液體部 分和對酶促水解敏感的固體部分。為了達到這一目的，將35.7kg麥秸(89.8%干物質(zhì)含量） 與240kg水混合，在500dm3攪拌爸式反應器中得到11.6 %稠度的懸浮液。將該懸浮液加熱至 180°C，然后離去至低于100°C。從反應器中排出水熱處理的懸浮液，并且使用沉降式離心機 使第一液體部分與固體部分分離。用酸水洗滌懸浮液的固體部分，用磷酸調(diào)整至pH 4。在沉 降式離心機中使固體部分與第二液體部分分離。在降膜式蒸發(fā)器中合并第一和第二液體部 分，得到18.3kg濃自水解液體，形成自水解液體C，其包含部分地呈寡聚形式的半纖維素糖 并且具有42 %干物質(zhì)含量和38° Bx折射干物質(zhì)。將洗滌的固體部分(具有23.0 %干物質(zhì)含量 的96.7kg)用作進行酶促水解的進料材料，以產(chǎn)生用于培養(yǎng)的纖維素水解產(chǎn)物。
[0333] 通過經(jīng)添加40g/l活性炭處理液體、在4°C適度混合20小時并且最終使用400um過 濾布過濾掉碳除去包含的部分酚類化合物，即自水解液體濃縮物。
[0334] 由來自自水解實驗的包含纖維素的固體部分(洗滌后）制備來自麥秸的酶促水解 產(chǎn)物，其中制備自水解液體C。將來自形成自水解液體C(具有23.1 %干物質(zhì)含量的17.3kg) 的自水解處理的洗滌的固體部分稱重入40dm3攪拌爸式反應器并且與14.7kg水和10mL 50 % NaOH( w/w)混合，得到12.5 %稠度和pH 5的懸浮液。加熱反應器并且維持在50 °C和 216ml酶混合物，其包含82%纖維素(EconaseCE，Roal0y)、10%纖維二糖酶(Novozyme 188,3丨811^/^〇￥〇25〇1168)和7%木聚糖酶(6(]140,6611611〇〇1')。在酶處理過程中，每1小時定期 將該懸浮液攪拌3次，持續(xù)SminjSh停留時間后，給該懸浮液補充占起始酶劑量10 %和具有 類似各酶比例的新鮮的酶混合物。在50 °C 72h停留時間后，通過使用水壓機過濾使液體部分 與固體部分分離。用水將固體部分洗滌1次，并且再使液體部分與固體部分分離。合并液體 部分，并且通過減壓蒸發(fā)濃縮。纖維素水解產(chǎn)物濃縮物(1.57kg)包含220g/l的總糖。
[0335] 將包含單體糖的纖維素水解產(chǎn)物照此用于培養(yǎng)。
[0336] 單細胞油生產(chǎn)
[0337] 實驗使用產(chǎn)生脂質(zhì)的真菌菌株米曲霉菌進行。通過添加12ml無菌水形成生長在 TOA-平板上的生成孢子的真菌并且用接種環(huán)刮取至液體中。24ml孢子懸浮液直接用于發(fā)酵 罐接種。培養(yǎng)基組成呈現(xiàn)在表5中。純化的自水解液體C(半纖維素溶液，半纖維素糖)和來自 同一實驗的纖維素水解產(chǎn)物用于培養(yǎng)。培養(yǎng)在Biostat B+51發(fā)酵罐以31體積進行，且在此 過程中，將攪拌設定在500rpm，使用3M NaOH將pH保持在5,5,充氣為lvvm，且在生長過程中 的溫度為35°C，在脂質(zhì)生產(chǎn)過程中，將其降至28°C。
[0338] 表2:生長培養(yǎng)基的組成
[0340]在接種后，需要約30h，然后真菌開始活躍地生長。在培養(yǎng)過程中，分小批量加入半 纖維素溶液，并且在95h培養(yǎng)后，將進料改變成纖維素水解產(chǎn)物。在培養(yǎng)過程中，總計加入 236g半纖維素和484g纖維素水解產(chǎn)物。在發(fā)酵結束時保持不使用加入的部分糖。當培養(yǎng)結 束時的167h時，存在16g/l生物質(zhì)，其中43%是脂質(zhì)?？梢酝贫?，由麥猜半纖維素和纖維素糖 生產(chǎn)微生物油是成功的。
[0341 ]實施例11使用半纖維素糖生產(chǎn)微生物油 [0342]水解產(chǎn)物自水解脂質(zhì)D的制備
[0343] 通過在100dm3容器中混合10.5kg磨碎的麥秸(92.7%干物質(zhì)含量可）和54. lkg自 來水制備懸浮液。在室溫儲存18h后，將64.2kg懸浮液稱重入水平圓筒狀250dm3攪拌的高壓 反應器。封閉反應器并且在75min內(nèi)加熱至140°C，保持在140°C下5h并且在30min內(nèi)冷卻至 室溫。手動從反應器中排出水熱處理的懸浮液，并且通過過濾使第一液體部分與第一固體 分離。用自來水將第一固體部分洗滌2次，使用水壓機加壓，得到洗滌的固體部分。洗滌的固 體部分(20.9kg)具有42.7%的干物質(zhì)含量。將第一液體部分與洗滌水合并，并且在降膜式 蒸發(fā)器中濃縮至11.5 % (w/w)干物質(zhì)含量。在稀酸水解后(4%w/w硫酸，121°C，lh)通過高效 液相色譜法(HPLC)測定濃縮的液體自水解的液體D包含49.3 %來自濃縮液體的總感物質(zhì)的 總糖?？偺呛恐械臒o水木糖、無水阿拉伯糖、無水葡萄糖和無水半乳糖的相對比例分別為 57%、19%、13% 和 11%〇
[0344] 此后，包含部分為寡聚化形式的半纖維素糖的自水解液體D照此無需純化用于培 養(yǎng)實驗。
[0345] 單細胞油生產(chǎn)
[0346] 實驗使用產(chǎn)生脂質(zhì)的真菌菌株米曲霉菌進行。通過添加12ml無菌水從生長在TOA-平板上的從生成孢子的真菌形成孢子懸浮液并且用接種環(huán)刮取至液體中。24ml孢子懸浮液 用于6個燒瓶接種。培養(yǎng)基組成呈現(xiàn)在表3中。將接種的燒瓶在30°C160rpm振搖溫育1天，且 然后用于發(fā)酵罐接種。
[0347] 表3:接種培養(yǎng)基的組成，pH設定至5，5。
[0349]使用自水解液體D(包含半纖維素糖，部分為寡聚化形式）且基于使用Folin-Ciocalteu方法(Waterhouse ,2002)的分析其包含4,2g/l酸類化合物。培養(yǎng)在Biostat B+51 發(fā)酵罐中以31體積進行，且在此過程中，將攪拌設定在400rpm，使用3M NaOH將pH保持在5， 5，抽吸為1 vvm且溫度為30°C。培養(yǎng)基組成呈現(xiàn)在表4中。
[0350]表4:發(fā)酵培養(yǎng)基的組成
[0352] 結果：
[0353] 在培養(yǎng)過程中，分小批量進入半纖維素溶液。總計加入150g半纖維素。在發(fā)酵結束 時保持不使用加入的部分糖。當發(fā)酵結束時的142h時，存在14g/l生物質(zhì)，其中21 %是脂質(zhì)。 可以推定，由麥秸半纖維素糖(部分為寡聚化形式)生產(chǎn)微生物油是成功的，無需純化水解 產(chǎn)物(不使用糖濃縮中使用的蒸發(fā)）。在發(fā)酵過程中，酚類化合物的濃度為2,8g/L。
【主權項】
1. 用于分級分離木質(zhì)纖維素材料的方法，該方法包括： a) 對木質(zhì)纖維素材料進行處理，其中從木質(zhì)纖維素材料中至少部分除去半纖維素以產(chǎn) 生包含第一液相與第一固相的混合物； b) 使第一固相與第一液相分離； c) 在堿性脫木質(zhì)化劑的存在下對第一固相進行脫木質(zhì)化處理，以產(chǎn)生包含第二固相和 包含增溶的木質(zhì)素的第二液相的混合物； d) 使第二固相與第二液相分離； e) 在能夠水解第二固相的半纖維素和纖維素部分的酶的存在下對第二固相進行酶促 水解處理，以產(chǎn)生包含第三液相和第三固相的混合物。2. 權利要求1的方法，其中通過水熱處理從木質(zhì)纖維素材料中至少部分除去半纖維素。3. 根據(jù)權利要求1的方法，其中通過自水解處理從木質(zhì)纖維素材料中至少部分除去半 纖維素。4. 根據(jù)上述權利要求任一項的方法，其中所述堿性脫木質(zhì)化劑選自氫氧化鈉、碳酸鈉、 氫氧化鉀、碳酸鉀、氫氧化鈣、碳酸鈣、氫氧化鋰、碳酸鋰、氫氧化銨、氨、硫化鈉和相應的水 合物。5. 根據(jù)上述權利要求任一項的方法，其中基于第一固相中干物質(zhì)的量計，脫木質(zhì)化劑 的濃度為〇· l_l〇wt%，優(yōu)選0· l_4wt_%。6. 根據(jù)上述權利要求任一項的方法，其中將所述堿性脫木質(zhì)化劑加入到第一固相中， 得到具有高于7，優(yōu)選在10和13之間的pH的懸浮液。7. 根據(jù)上述權利要求任一項的方法，其中水熱處理在相當于在2.0和4.5之間，更優(yōu)選 在3.0和4.1之間且最優(yōu)選在3.5和4.0之間的苛刻度的條件下進行。8. 根據(jù)上述權利要求任一項的方法，其中在所述脫木質(zhì)化處理前對第一固相進行蒸汽 爆裂。9. 根據(jù)上述權利要求任一項的方法，其中通過降低溶液的pH從第二液相中沉淀木質(zhì) 素，并且通過任意適合的分離方法諸如過濾來回收沉淀的木質(zhì)素。10. 根據(jù)上述權利要求任一項的方法，還包含濃縮第三液相的步驟。11. 通過上述權利要求任一項的方法可得到的酶促水解產(chǎn)物形式的液相。12. 通過權利要求10的方法可得到的濃糖水解產(chǎn)物。13. 通過權利要求9的方法可得到的沉淀的木質(zhì)素部分。14. 用于生產(chǎn)微生物脂質(zhì)的方法，該方法包括： (i)提供包含權利要求11的第三液相或權利要求12的濃糖水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基； (i i)通過給所述培養(yǎng)基接種含油微生物提供發(fā)酵肉湯； (iii) 溫育所述用所述含油微生物接種的培養(yǎng)基，以使脂質(zhì)蓄積； (iv) 從所述含油微生物中回收脂質(zhì)。15. 根據(jù)上述權利要求的用于生產(chǎn)微生物脂質(zhì)的方法，該方法包括： a) 對木質(zhì)纖維素材料進行處理，其中從木質(zhì)纖維素材料中至少部分除去半纖維素以產(chǎn) 生包含第一液相和第一固相的混合物； b) 使第一固相與第一液相分離； c) 在堿性脫木質(zhì)化劑的存在下對第一固相進行脫木質(zhì)化處理，以產(chǎn)生包含第二固相和 包含增溶的木質(zhì)素的第二液相的混合物； d) 使第二固相與第二液相分離； e) 對第二固相進行酶促水解處理，以水解第二固相的半纖維素和纖維素部分以產(chǎn)生包 含第三固相和酶促水解產(chǎn)物的第三液相的混合物； f) 使酶促水解產(chǎn)物的第三液相與第三固相分離； (i)提供包含步驟f)的酶促水解產(chǎn)物的第三液相的培養(yǎng)基； (i i)通過給培養(yǎng)基接種含油微生物提供發(fā)酵肉湯； (iii) 溫育所述用所述含油微生物接種的培養(yǎng)基，以使脂質(zhì)蓄積； (iv) 從所述含油微生物中回收脂質(zhì)。
【文檔編號】C12P19/02GK105980573SQ201480067023
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2014年12月11日
【發(fā)明人】H·瓦伊尼奧, V·皮赫拉亞涅米, M·西波寧, O·帕斯蒂寧, I·萊赫托邁基, S·拉克索, O·米呂邁基, P·科斯基寧
【申請人】耐思特公司